CN111956865B - 一种神经保护材料、复层神经修复导管及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种神经保护材料，所述神经保护材料的表面以及内部为多孔结构，所述多孔结构的平均孔隙小于20微米，且分布于所述神经保护材料表面的孔中至少部分是开放的孔；所述神经保护材料由胶原和壳聚糖的酸混合溶液制得。本申请还提供了一种复层的神经修复导管，外层采用所述神经保护材料，内层为海绵状的纳米纤维结构。本申请提供的神经保护材料，具有更适合的孔隙结构，有利于氧气以及小分子营养物质进入，保证营养物质的内外交换，并阻隔成纤维细胞的长入，避免对受损神经细胞造成影响。

Description

一种神经保护材料、复层神经修复导管及其制备方法

技术领域

本申请涉及组织工程和生物制造材料技术领域，具体涉及一种神经保护材料、复层神经修复导管及其制备方法。

背景技术

在临床治疗中，神经缺损处缝合后的吻合口和非实质性损伤处非常容易出现成纤维细胞长入引起组织增生，进而阻碍了神经细胞的再生恢复。

细胞的形状、代谢、功能、迁移、增殖和分化依赖于其所在在细胞外基质环境，人体细胞的平均直径在10-20μm之间，并且研究表明，当孔隙小于10μm为半透过性，仅允许红细胞、氧气以及小分子营养物质通过。因此，适宜的孔隙尺寸，对能保证营养物质的内外交换，并同时有效阻止成纤维细胞通过是主要影响因素，而理想的管壁孔隙直径应该在5-30微米之间，更准确的说是在10-20微米之间。一种理想的组织支架，应该具有天然细胞外基质的基本结构特点，(1)它是高度多孔的，具有相互连接和分层结构的孔，特别是，尺寸为数百微米的大孔将维持支架的结构稳定性，支持细胞增殖，ECM沉积和组织形成；尺寸为数十微米或更小的中孔将促进营养物质的扩散并促进形成血管化，而微米或更小尺寸的小孔会对某些细胞行为产生影响，如基因表达；(2)纤维直径在几十到几百纳米之间；(3)具有适当的机械性能和柔韧性；(4)支架的形状可以很容易地定制，也可以很好地保留在细胞培养过程中。

目前的神经保护产品，如美国AxoGen公司的

nerve protector产品，为脱细胞猪小肠粘膜材料，用于保护受伤的神经并加强神经重建，同时防止软组织附着，孔隙为20-30μm，但脱细胞产品存在异体反应，贴附性差，需要缝合固定。美国SaluMedica公司的Salubridge产品采用合成的不可降解的聚乙烯醇，该产品最终将以异物的形式长时间存在体内，存在很大的潜在风险。

胶原和壳聚糖是临床上已经认可的生物材料，具有良好的生物相容性好、可降解性，并且目前已经有较多将二者共混的研究。然而，采用现有的制备方法制备获得胶原/壳聚糖共混支架材料，要使其孔隙在10-20微米之间仍具有较大难度。

此外，现有的天然可降解的神经导管产品多为中空结构，已经上市的国内外神经修复产品，多为中空结构，使用过程中易出现塌陷，同样影响神经细胞的生长，并且目前的神经导管产品也不能。然而尽管现有技术中提供了一些内部填充有纤维材料的神经导管，例如专利CN104739473A在神经导管内包裹长的纳米纤维，能够引导细胞线性生长；专利CN107715174A提供了一种仿生组织工程支架，其孔隙壁表面分布有短纳米纤维。但上述方案仍无法更好的仿生细胞外基质环境。

发明内容

为了解决上述问题，本申请旨在提供一种可允许氧气和小分子营养物质运输而阻隔成纤维细胞长入的神经保护材料，并将该神经保护材料应用于神经导管中，制得的神经导管可以有效防止塌陷，并能更好的模拟细胞外基质环境。

一方面，本申请提供了一种神经保护材料，所述神经保护材料的表面以及内部为多孔结构，所述多孔结构的平均孔隙小于20微米，且分布于所述神经保护材料表面的孔中至少部分是开放的孔；所述神经保护材料由胶原和壳聚糖的酸混合溶液制得。

进一步地，所述多孔结构的平均孔隙为大于5微米且小于20微米。

其中，上述神经保护材料为近似海绵的多孔材料，其内部的孔平均孔隙大于10微米且小于20微米，与人体细胞大小非常接近，在作为神经材料应用时更贴近人体细胞环境，并且有利于氧气和营养分子的扩散，同时还能够提供很好的力学强度。所述神经保护材料表面同时具有开放的孔和闭合的孔，可以理解为半开孔结构，其中，位于表面的孔的平均孔隙小于15微米，优选的，表面开放的孔的孔径大于等于8微米且小于15微米，更优选地，孔径平均在10微米左右。位于表面开放的孔，一方面更有利于吸附氧气和小分子营养物质穿过，及时地为受损神经细胞提供氧气和营养物质；另一方面，其较小的孔径还可以同时起到阻隔外部成纤维细胞长入，和提高力学强度的作用。

另一方面，本申请提供了上述神经保护材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将胶原和壳聚糖用酸溶液溶解，制备总浓度80-130mg/ml的混合浆液；

步骤2：将所述混合浆液于2-5℃下静置至少20h，使其充分溶胀；

步骤3：将溶胀后的混合浆液冷冻干燥，交联。

优选的，所述步骤1中胶原和壳聚糖用酸溶液溶解获得的混合浆液总浓度为100-130mg/ml，更优选100-110mg/ml。

优选的，所述步骤2中将混合浆液置于3-4℃下静置24-48h，在溶胀的同时除气泡。

上述方法步骤简单，可操作性强，能够制得上述神经保护材料。

进一步地，所述胶原为I型胶原；所述壳聚糖的脱乙酰度为80％-95％，粘度为50-800mPa·s；所述酸溶液为摩尔浓度0.5-0.6M的醋酸溶液。

进一步地，所述胶原和壳聚糖在混合浆液中的比例为(9:1)～(1:9)。优选的，胶原和壳聚糖在混合浆液中的比例为(8:2)～(3:8)。其中，在本申请提供的方法中，具有上述比例范围的混合浆液均能够制备获得截面孔隙在10-20微米的神经保护材料。

进一步地，所述步骤3还包括将溶胀后的混合浆液在冷冻干燥前，使其形成薄膜或空心管结构的步骤；优选的，所述薄膜的膜厚度和/或空心管的管壁厚度为0.1-1mm。

在一种实施方式中，可以将溶胀后的混合浆液用刮涂机制成0.1-1mm的神经保护膜，该保护薄膜厚度较小，在实际应用中可便于进行多层包裹，避免缝合，也不会对内部神经再生时出现肿胀造成压力；在另一种实施方式中，还可以将溶胀后的混合浆液灌入模具中，制成空心的神经导管。

另一方面，本申请还提供了一种复层神经修复导管，所述导管包括：采用上述神经保护材料制成的管体，和填充于所述管体内的海绵状纳米纤维结构，所述海绵状纳米纤维结构的内部分布有多个微孔隙，所述微孔隙的平均孔径大于20微米且小于100微米。

优选的，所述海绵状纳米纤维结构，其纳米纤维以纳米纤维片的形式分散在冷冻干燥后的微孔隙间。由于人体的细胞外基质环境更近似于网状结构，因此上述海绵状纳米纤维结构类似细胞外基质胶原纤维，并且具有更大的比表面积，相较于常见的定向纤维丝的支架形式能够更好的模拟细胞基质环境，为细胞长入提供条件，并使得内层的海绵状纤维结构能够促进细胞黏附、生长、增殖、分化和迁移。

与此同时，上述复层导管，相较于现有的单一空心导管，还能够有效防止塌陷，提高利用率。

另一方面，本申请还提供了一种上述复层神经修复导管的制备方法，包括以下步骤：将纳米纤维分散液注入由上述神经保护材料制成的管体内，冷冻干燥，交联。

进一步地，所述纳米纤维分散液采用以下方法制得：

步骤a：将纺丝溶液利用静电纺丝制备纳米纤维膜，并将纳米纤维膜裁剪成纤维片；

步骤b：将所述纤维片加入至胶原浆液中，均质，获得纳米纤维分散液。

进一步地，所述纺丝溶液是将聚乳酸溶于三氟乙酸中制备得到，优选的，所述聚乳酸的分子量为100k-200kDa；所述静电纺丝的条件为静电高压15-30kV，推进速度0.8-2.4ml/h，接收距离15-30cm，纺丝时间60-120min，优选，静电高压20kV，推进速度1.8ml/h，接收距离20cm，纺丝时间90min；所述纳米纤维膜中，纳米纤维的长度为100-150微米，纳米纤维的直径为300-500nm；所述裁剪后的纤维片尺寸为(5-10)mm×(5-10mm)；所述胶原浆液是将I型胶原溶于醋酸中得到，所述胶原浆液的浓度为5-8mg/ml；所述纤维片和胶原的质量比为(0.4-0.6):1；和/或，所述均质的条件为在10000-15000转/分钟下均质10-30min。

其中，将聚乳酸纺丝纤维与胶原混合制得的材料，可以改善聚乳酸材料的生物相容性。

在一种优选的实施方式中，所述复层神经修复导管采用以下方法制得：

步骤a：先将神经保护材料制成空心的导管，干燥；将分子量为100k-200kDa的聚乳酸溶于三氟乙酸，制得纺丝溶液，静电纺丝形成纳米纤维膜，并将纳米纤维膜于40℃下真空干燥，裁剪成尺寸为(5-10)mm×(5-10mm)的纳米纤维片；

步骤b：以0.05M醋酸溶解胶原至胶原浓度5mg/ml，加入裁剪后的纳米纤维片，且纳米纤维片质量和胶原质量比为0.5:1，均质，获得纳米纤维分散液；将纳米分散液注入至由神经保护材料制成的导管中，冷冻干燥，交联，获得复层神经修复导管。

进一步地，所述冷冻干燥的程序包括：S1，在常压、温度为-30～-40℃条件下预冷冻处理30-60min；S2，在气压150-250μbar、温度-20～0℃条件下干燥处理18-20h；S3，在气压150-250μbar、温度10～25℃条件下干燥处理4-6h；优选的，在步骤S1前还包括在温度-40℃条件下速冻不少于4h的步骤。

优选的，所述复层神经修复导管在冷冻干燥时，需要先在温度-40℃条件下速冻不少于4h，然后再按照S1～S3进行程序性冷冻干燥。所述神经保护材料在进行冻干时，可以直接进行S1～S3的程序性冷冻干燥，无需预冷冻的步骤。

进一步地，所述交联采用高温真空固定交联，优选的，所述高温真空固定交联的条件为：压力-0.15～-0.05MPa，温度为100-110℃的条件下固定20-30h，更优选地，高温真空固定交联的条件为：在-0.09MPa、温度为105±2℃的条件下固定24h。

其中，本申请提供的神经保护材料和/或神经修复导管，其孔径以及孔结构的形成，是由原料材料本身、原料浓度以及整体的方法步骤共同影响的，特别是在特定的冻干工艺步骤下。而现有技术中还未能够提供具有如此孔隙以及结构的神经材料，因此本申请提供的神经保护材料和/或神经修复导管，尽管制备方法简单，但为更适合人体外基质环境的神经材料的选择提供了可靠依据。

通过本申请能够带来如下有益效果：

1、本申请提供的神经保护材料，其特殊的孔结构和孔隙有利于氧气以及小分子营养物质进入，保证营养物质的内外交换，并阻隔成纤维细胞的长入，形成瘢痕作用，避免对受损神经细胞造成影响，并且制备方法简单可操作性强。

2、本申请提供的复层神经修复导管，外层使用神经保护材料，内层的纳米纤维海绵状结构同时保留了纳米级静电纺丝纤维结构和微米级的冷冻干燥孔隙结构，更加模拟细胞外基质环境，并且对外层管体起到支架加固作用，避免导管过早地出现塌陷现象。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为实施例1获得的神经保护材料表面的扫描电镜图；

图2为实施例1获得的神经保护材料截面的扫描电镜图；

图3为对比例1获得的神经保护材料表面的扫描电镜图；

图4为对比例1获得的神经保护材料截面的扫描电镜图；

图5为对比例4获得的神经保护材料表面的扫描电镜图；

图6为实施例2获得的复层神经导管侧面外观图；

图7为实施例2获得的复层神经导管截面外观图；

图8为实施例2内层结构截面的放大图。

具体实施方式

为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面再结合说明书附图以示例的方式进行详细说明。

需说明，在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请，但是，本申请还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本申请的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。

另外，在本申请的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。

在本申请中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。但注明直接连接则说明连接地两个主体之间并不通过过度结构构建连接关系，只通过连接结构相连形成一个整体。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。

在本申请中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

如无特殊说明，下述各实施例中的材料和试剂均可通过商业途径获得。

实施例1神经保护材料的制备

本实施例制备了一种神经保护材料，所述材料采用以下方法制备：

步骤1:将从牛跟腱中提取的I型胶原蛋白，以及脱乙酰度80％-95％且粘度50-800mPa·S的壳聚糖，分别研磨成粉末备用；

步骤2：用摩尔浓度为0.5M的醋酸溶液同时将I型胶原蛋白和壳聚糖溶解，获得混合浆液，调节混合浆液的总浓度为80-130mg/ml；

步骤3：将混合浆液置于4℃的冰箱静止24-48h，使混合浆液充分溶胀；

步骤4：将溶胀后的混合浆液用刮涂机制成厚度0.1-1.0mm的神经保护膜；

步骤5：将神经保护膜采用以下程序性冷冻干燥：

步骤6：高温真空交联：-0.09MPa、温度为105±2℃，24h。

采用上述方法分别制备8个实施例，分别是实施例1-1至实施例1-11，其区别在于，混合浆液中，胶原和壳聚糖的质量比例不同，具体设置见表1。

对比例1～对比例3

对比例1～对比例3与实施例1的步骤大致相同，区别仅在于对比例1～对比例3使用不同浓度的纯胶原溶液进行制备。

对比例4

对比例4与实施例1的步骤大致相同，区别仅在于对比例4使用纯壳聚糖溶液进行制备。

对比例5

对比例5与实施例1的步骤大致相同，区别仅在于对比例5未设置步骤3，即未经溶胀的步骤，直接将混合浆液刮涂成膜后冷冻干燥。

对比例6

对比例6与实施例1的步骤大致相同，区别仅在于使用0.3M的醋酸溶液。

性能评价：

孔隙评价：使用日本日立公司提供的TM4000扫描电子显微镜观察所得材料的截面及表面结构，并通过Image J软件进行孔隙分析。

孔隙率计算：各实施例取3片，体积为V₀，质量m₀，浸没预无水乙醇中，密度为ρ，2h后用滤纸吸干表面无水乙醇，称量记录质量m₁，孔隙率计算公式为：(m₁-m₀)/ρ×V₀，每个样本测量3次取平均值。

上述各示例的测试数据见表1：

表1

结合图1-5和表1可知，使用上述制备方法能够制备获得神经保护材料，不同含量的壳聚糖和胶原混合保护膜为多孔结构，更类似细胞外基质结构，80-130mg/ml范围内的混合保护膜其截面平均孔隙小于20微米，表面为主要为闭孔状态，部分开孔。而使用纯胶原冷冻干燥后获得的材料截面为层状间隙结构，表面致密基本没有孔；使用纯壳聚糖的材料表面基本闭孔，并且脆性大，无法使用；而未经过溶胀步骤或醋酸浓度浓度不适当的材料无法制成膜。

实施例2复层神经导管的制备

本实施例提供了一种复层神经导管，采用以下方法制备：

步骤a：将实施例1的步骤3中的混合浆液灌入导管的模具中，冷冻干燥，制成导管；将分子量为100k-200kDa的聚乳酸溶于三氟乙酸，制得纺丝溶液，静电纺丝形成纳米纤维膜，其中静电纺丝的条件为：静电高压20kV，接收距离20cm，推进速度1.8ml/h，纺丝时间90min；将纳米纤维膜于40℃下真空干燥24h，裁剪成尺寸为(5-10)mm×(5-10mm)的纳米纤维片；

步骤b：以0.05M醋酸溶解I型胶原蛋白至胶原浓度5mg/ml，加入裁剪后的纳米纤维片，且纳米纤维片质量和胶原的质量比为0.5:1，在均质机中以13000r.p.m.均质混合15min，获得纳米纤维分散液；利用注射器将纳米分散液注入至由步骤a的导管中，纳米分散液的注入量以另一端有少量分散液露出为宜；冷冻干燥后，在-0.09MPa、温度为105±2℃下高温真空交联24h，获得复层神经修复导管，其中，冷冻干燥的步骤包括先在-40℃冰箱中速冻不少于4h，再采用如实施例1的程序性冷冻干燥步骤进行。

实施例2制得的复层神经修复导管截面结构如图5-6所示，从图中可以看出，内层具有纳米纤维海绵状结构，并且，该纳米纤维海绵状结构的孔大小并不均匀，平均孔径大约为40微米。

该结构中，清晰可见的纳米纤维分布在冷冻干燥后的微米级孔隙中，同时保留了纳米级静电纺丝纤维结构和微米级的冷冻干燥孔隙，更加模拟细胞外基质环境，并且对外层管体起到支架加固作用，避免导管过早地出现塌陷现象。

以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

Claims (4)

1.一种复层神经修复导管，其特征在于，所述导管包括：采用神经保护材料所制成的管体，和填充于所述管体内的海绵状纳米纤维结构，所述海绵状纳米纤维结构的内部分布有多个微孔隙，所述微孔隙的平均孔径大于20微米且小于100微米；

所述神经保护材料的表面以及内部为多孔结构，所述多孔结构的平均孔隙为大于5微米且小于20微米，且分布于所述神经保护材料表面的孔中至少部分是开放的孔；

所述神经保护材料由胶原和壳聚糖的酸混合溶液制得，制备方法包括以下步骤：

步骤1：将胶原和壳聚糖用酸溶液溶解，制备总浓度80-130mg/ml的混合浆液；所述胶原和壳聚糖在混合浆液中的比例为（8:2）~（3:8），所述胶原为I型胶原；所述壳聚糖的脱乙酰度为80%-95%，粘度为50-800mPa·s；所述酸溶液为摩尔浓度0.5-0.6M的醋酸溶液；

步骤2：将所述混合浆液于2-5℃下静置至少20h，使其充分溶胀；

步骤3：将溶胀后的混合浆液冷冻干燥，交联；

所述冷冻干燥的程序包括：S1，在常压、温度为-30～-40℃条件下预冷冻处理30-60min；S2，在气压150-250μbar、温度-20～0℃条件下干燥处理18-20h；S3，在气压150-250μbar、温度10～25℃条件下干燥处理4-6h；

步骤S1前还包括在温度-40℃条件下速冻不少于4h的步骤；

所述交联采用高温真空固定交联，所述高温真空固定交联的条件为：压力-0.15～-0.05MPa，温度为100-110℃的条件下固定20-30h；

所述步骤3还包括将溶胀后的混合浆液在冷冻干燥前，使其形成薄膜或空心管结构的步骤；

所述复层神经修复导管的制备方法，包括以下步骤：将纳米纤维分散液注入由所述神经保护材料制成的管体内，冷冻干燥，交联；

所述纳米纤维分散液采用以下方法制得：

步骤a：将纺丝溶液利用静电纺丝制备纳米纤维膜，并将纳米纤维膜裁剪成纤维片；

步骤b：将所述纤维片加入至胶原浆液中，均质，获得纳米纤维分散液。

2.根据权利要求1所述的复层神经修复导管，其特征在于，所述薄膜的膜厚度和/或空心管的管壁厚度为0.1-1mm。

3.根据权利要求1所述的复层神经修复导管，其特征在于，所述纺丝溶液是将聚乳酸溶于三氟乙酸中制备得到，所述聚乳酸的分子量为100k-200kDa；

所述静电纺丝的条件为静电高压15-30kV，推进速度0.8-2.4ml/h，接收距离15-30cm，纺丝时间60-120min；

所述纳米纤维膜中，纳米纤维的直径为300-500nm；

所述裁剪后的纤维片尺寸为(5-10)mm×(5-10mm)；

所述胶原浆液是将I型胶原溶于醋酸中得到，所述胶原浆液的浓度为5-8mg/ml；

所述纤维片和胶原的质量比为（0.4-0.6）:1；

和/或，所述均质的条件为在10000-15000 转/分钟下均质10-30min。

4.根据权利要求3所述的复层神经修复导管，其特征在于，所述静电纺丝的条件为静电高压20kV，推进速度1.8ml/h，接收距离20cm，纺丝时间90min。

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