CN111944165B - 一种多酚类酪氨酸酶抑制剂及其提取方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物化工技术领域，公开了一种多酚类酪氨酸酶抑制剂，属水解类多酚，该抑制剂的分子结构中含大量的没食子酰基和六羟基二苯甲酰基，且不含有杂环结构，因此较缩合类多酚而言，该抑制剂含有更多的酚羟基和苯环结构，使得其能够通过氢键‑疏水作用力协同作用的方式与更多蛋白质相结合，因而具有更强的酪氨酸酶抑制活性。本发明还提供了该抑制剂的提取方法，是由橡椀为原料，通过有机溶剂萃取、柱分离纯化获得，基于多酚与体积排阻色谱(葡聚糖凝胶)之间的氢键作用力与流动相极性的关系，对橡椀多酚中的大分子物质进行选择性洗脱。此外，本发明还降低了多酚类酪氨酸酶抑制剂生产成本，为橡椀提供了行之有效的高值化利用途径。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种多酚类酪氨酸酶抑制剂及其提取方法和应用。
背景技术
黑色素是一种生物色素，可以减少紫外线对人体的伤害，其含量与分布决定了皮肤、毛发和眼睛的颜色。然而，当黑色素异常过量地表达时，就会导致人体的局部皮肤过黑及色素沉着，从而产生由于雀斑、黄褐斑、老年斑甚至黑色素瘤，严重影响人们的健康和外貌。酪氨酸酶，又称为多酚氧化酶，广泛的分布于细菌、真菌、植物、动物以及人体中，是一种含铜金属氧化还原酶，属于铜Ⅲ型蛋白酶家族。酪氨酸酶的活性位点含有两个铜离子，铜离子通过N原子分别与三个组氨酸残基相连，外源性的氧分子与之结合成过氧化物，并桥接这两个铜离子中心，构成酪氨酸酶催化氧化反应活性中心。酪氨酸酶是黑色素合成的关键限速酶，在酪氨酸代谢生成黑色素的整个生化反应过程中起到决定性作用。
开发酪氨酸酶抑制剂，不仅可以为治疗色素沉着过度、黑色素瘤等疾病提供药物基础，也可以为美白类化妆品、护肤品等高附加值日化用品提供。目前最常用的酪氨酸酶抑制剂主要以熊果苷、曲酸、没食子酸、对苯二酚等分子量小于500Da的化合物为主。除此以外，从植物中提取并分离获得的其它物质，也是酪氨酸酶抑制剂的主要来源，包括鞣花酸、儿茶素、槲皮素、大豆异黄酮等。但由于其安全性、有效性和生产成本等现实问题，目前仅有少部分酚类抑制剂在实际生产中使用。而寻找绿色安全、来源丰富、高效价廉的酪氨酸酶抑制剂，是目前的药品、化妆品生产企业的迫切需求。
同时，橡树是壳斗科栋属乔木的一种，我国暖温带落叶阔叶林和亚热带常绿阔叶林的主要树种之一，是家具、地板、工业用木料的优质原材料，我国拥有大量的橡木资源。橡椀(Valonea)橡树果实的外壳，橡椀壳中富含水解类多酚，是一种含量丰富的林化产品。通过传统的热水萃取法可得到纯度为77.64％，重量占橡椀果壳干重28.45％的橡椀多酚。但由于缺乏资源化利用技术，橡椀属于橡树木材加工副产物，除了作为焚烧材料、制作制革用栲胶外，至今无其它有效利用途径。
发明内容
本发明提出一种多酚类酪氨酸酶抑制剂及其提取方法和应用，以解决现有技术中存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。
为了克服上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种多酚类酪氨酸酶抑制剂，结构式为式(1)或式(1)的衍生物：
其中，n1、n2、n3均为正整数，且满足n1、n2、n3的三者之和为21至56。
在植物次生代谢产生的众多化合物中，酚类物质是十分重要的一类，其含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素。其中多酚是多羟基酚类物质的简称，通常特指分子量大于500Da的聚合物。按照化学结构特点，多酚主要分为两大类，包括水解类多酚和缩合类多酚。缩合类多酚以黄椀-3-醇为结构单元(包括儿茶素、表儿茶素、棓儿茶素、表棓儿茶素、阿福豆素、表阿福豆素等)，结构单元间通过C-C键相互连接，自然界中含量最大的缩合类多酚为原花青定和原翠雀定。水解类多酚则以没食子酸或鞣花酸为结构单元，单元间通过糖苷键和酯键相互连接形成，最具代表性的水解类多酚为单宁酸。
已经明确的是，部分缩合类多酚具有显著的酪氨酸酶抑制活性，能够对皮肤黑色素沉积起到显著的治疗作用，包括老鼠簕叶单宁(原花青定)、秋茄果单宁(原翠雀定)、人心果单宁(原天竺葵定、原花青定、原翠雀定混合型)、黄葛树单宁(原花青定型)等。水解类多酚也在自然界中广泛分布，如五棓子、橡木、栎木、栗木、柯子等植物或植物组织中，水解类多酚的含量最高能达到植物组织干重的50％以上，是一种优质的多酚资源，但至今未见有关在水解类多酚中发现酪氨酸酶抑制剂的报道。
作为上述方案的进一步改进，制备所述多酚类酪氨酸酶抑制剂的原料主要为橡椀。
作为上述方案的进一步改进，所述多酚类酪氨酸酶抑制剂的平均聚合度为21.3-55.5(以没食子酸计)，平均分子量为3625-9433Da。
作为上述方案的进一步改进，所述多酚类酪氨酸酶抑制剂的结构单元中的没食子酰基和六羟基二酚的摩尔比为(2.3-22.4):1。
一种多酚类酪氨酸酶抑制剂的提取方法，包括以下步骤：
1)粗提取：取橡椀粉碎并置于有机溶剂中浸泡，过滤，将滤液进行旋转蒸馏，收集粗提液；
2)萃取：向步骤1)所得的粗提液中加入萃取剂，振荡，静置，收集提取液；
3)洗脱分离：采用体积排阻色谱法，将步骤2)所得的提取液进行洗脱，得所述多酚类酪氨酸酶抑制剂。
作为上述方案的进一步改进，步骤1)中，所述有机溶剂选自体积分数分别为10-90％的丙酮-水溶液、10-90％的甲醇-水溶液、10-90％的乙醇、10-90％的乙腈-水溶液中的至少一种。
作为上述方案的进一步改进，步骤1)中，所述浸泡的时长为12-72h。经步骤1)所得粗提液的主要成分包括多酚、多糖、色素、脂类物质、泥沙、纤维素等。
作为上述方案的进一步改进，步骤2)中，所述萃取剂选自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、异戊醇、四氯化碳中的至少一种；所述萃取剂与所述粗提液的体积比为(1-5):1。步骤2)利用萃取剂对粗提液进行萃取，以去除脂类物质，其中，萃取时长为6-36h。
作为上述方案的进一步改进，步骤3)中，所述洗脱包括第一次洗脱和第二次洗脱，第一次洗脱采用洗脱剂A，第二次洗脱采用洗脱剂B；所述洗脱剂A选自体积分数为10-45％的甲醇-水溶液、10-80％的乙醇-水溶液、10-80％的乙腈-水溶液中的至少一种；所述洗脱剂B选自体积分数为50-80％的甲醇-水溶液、10-95％的丙酮-水溶液中的至少一种。其中，经洗脱剂A进行第一次洗脱后，除去了糖、色素和分子量小于2000Da的多酚类物质，随后使用洗脱剂B进行第二次洗脱并收集组分，经干燥后即得所述多酚类酪氨酸酶抑制剂。
此外，步骤3)中所采用的体积排阻色谱柱的型号选自Sephadex G-10、SephadexG-15、Sephadex G-25、Sephadex G-50、Sephadex G-75、Sephadex G-100、Sephadex G-150、SephadexG-200、Sephadex LH-20、TOYOPEARL HW、TOYOPEARL DW和TSKgel PW中的至少一种。
体积排阻色谱中常用的填料为葡聚糖，申请人发现，葡聚糖填料分子的侧链中含有大量的羟基，葡聚糖为基质的填料在对蛋白质等物质进行分离的过程中，起到分离的机理并不仅局限于分子筛，而是分子筛和吸附-解吸附色谱共同作用的结果：当流动相仅为水时，体积排阻色谱柱中的多酚无法按照分子量的大小顺序流出色谱柱，仅当流动相为极性有机溶剂时，多酚才能够从填料中解吸附并流出色谱柱。发明人按照有机溶剂的极性规律，配制了不同极性特点的混合液体作为流动相，观察到当且仅当流动相为丙酮、甲醇这两种强极性溶剂时，才能够破坏大分子量多酚组分与葡聚糖之间的氢键结合作用，使大分子量多酚从葡聚糖凝胶上解吸附并流出色谱柱。原理在于，多酚与葡聚糖之间能够通过氢键作用相互结合，而部分有机溶剂具有破坏氢键的作用，当且仅当溶剂的极性到达一定范围时，能够对吸附在葡聚糖填料中的多酚进行选择性解吸附处理。
将如上任一项所述的多酚类酪氨酸酶抑制剂应用于制备治疗色素沉着过度或黑色素瘤的药物，或应用于制备美白类化妆品中。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了一种多酚类酪氨酸酶抑制剂，该抑制剂属于水解类多酚，其分子结构中含有大量的没食子酰基和六羟基二苯甲酰基，且不含有杂环结构，因此较缩合类多酚而言，该抑制剂含有更多的酚羟基和苯环结构，使得其能够通过氢键-疏水作用力协同作用的方式与更多蛋白质相结合，因而具有更强的酪氨酸酶抑制活性(显著高于没食子酸)。
(2)本发明还提供了该多酚类酪氨酸酶抑制剂的提取方法，是由橡椀为原料，通过有机溶剂萃取、柱分离纯化获得，基于多酚与体积排阻色谱(葡聚糖凝胶)之间的氢键作用力与流动相极性的关系，对橡椀多酚中的大分子物质进行选择性洗脱，在进一步纯化获得高聚合度多酚的同时，也更进一步提高了多酚类酪氨酸酶抑制剂的酪氨酸酶抑制活性。
(3)此外，本发明以副产物橡椀为原料并从中提取多酚类酪氨酸酶抑制剂，极大限度的降低了多酚类酪氨酸酶抑制剂生产成本，同时也为橡椀提供了行之有效的高值化利用途径。
附图说明
图1是实施例1所得的多酚类酪氨酸酶抑制剂的核磁共振碳谱图；
图2是实施例1所得的多酚类酪氨酸酶抑制剂的红外光谱图；
图3是实施例1所得的多酚类酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶活力的抑制活性曲线；
图4实施例1所得的多酚类酪氨酸酶抑制剂的酶促反应速率与酪氨酸酶量的关系曲线；
图5是实施例1所得的多酚类酪氨酸酶抑制剂的反应速率与底物浓度双倒数曲线；
图6为实施例1所得的多酚类酪氨酸酶抑制剂的添加量与酪氨酸酶的荧光强度关系曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明所作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时，下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或提取方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或提取方法。
实施例1
将干燥的橡椀粉碎后，置于10％的丙酮-水溶液(体积份数，下同)中浸泡12小时，过滤后将滤液在35℃条件下旋转蒸馏8小时，收集粗提液，随后利用二氯甲烷对提取液进行萃取处理，萃取剂与提取液的比例为1:1，萃取时间为6小时，随后收集提取液，将提取液加入至Sephadex G-10色谱柱中，使用10％的甲醇-水溶液进行第一次洗脱，除去糖、色素和分子量小于2000Da的多酚类物质，随后使用50％的甲醇-水溶液进行第二次洗脱并收集组分，干燥后即得多酚类酪氨酸酶抑制剂。
实施例2
将干燥的橡椀粉碎后，置于90％的丙酮-水溶液中浸泡36小时，过滤后将滤液在35℃条件下旋转蒸馏8小时，收集粗提液，随后利用氯仿对提取液进行萃取处理，萃取剂与提取液的比例为5:1，萃取时间为36小时，随后收集提取液，将提取液加入至Sephadex G-15色谱柱中，使用90％的甲醇-水溶液进行第一次洗脱，除去糖、色素和分子量小于2000Da的多酚类物质，随后使用95％的丙酮-水溶液进行第二次洗脱并收集组分，干燥后即得多酚类酪氨酸酶抑制剂。
实施例3
将干燥的橡椀粉碎后，置于10％的甲醇-水溶液中浸泡72小时，过滤后将滤液在35℃条件下旋转蒸馏8小时，收集粗提液，随后利用乙酸乙酯对提取液进行萃取处理，萃取剂与提取液的比例为4:1，萃取时间为12小时，随后收集提取液，将提取液加入至Sephadex G-25色谱柱中，使用10％的乙醇-水溶液进行第一次洗脱，除去糖、色素和分子量小于2000Da的多酚类物质，随后使用50％的甲醇-水溶液进行第二次洗脱并收集组分，干燥后即得多酚类酪氨酸酶抑制剂。
实施例4
将干燥的橡椀粉碎后，置于90％的甲醇-水溶液中浸泡64小时，过滤后将滤液在35℃条件下旋转蒸馏8小时，收集粗提液，随后利用异戊醇对提取液进行萃取处理，萃取剂与提取液的比例为2:1，萃取时间为48小时，随后收集提取液，将提取液加入至Sephadex G-50色谱柱中，使用45％的乙醇-水溶液进行第一次洗脱，除去糖、色素和分子量小于2000Da的多酚类物质，随后使用80％的甲醇-水溶液进行第二次洗脱并收集组分，干燥后即得多酚类酪氨酸酶抑制剂。
实施例5
将干燥的橡椀粉碎后，置于10％的乙醇水溶液中浸泡24小时，过滤后将滤液在35℃条件下旋转蒸馏8小时，收集粗提液，随后利用四氯化碳对提取液进行萃取处理，萃取剂与提取液的比例为5:1，萃取时间为6小时，随后收集提取液，将提取液加入至Sephadex G-75色谱柱中，使用10％的乙腈-水溶液进行第一次洗脱，除去糖、色素和分子量小于2000Da的多酚类物质，随后使用10％的丙酮-水溶液进行第二次洗脱并收集组分，干燥后即得多酚类酪氨酸酶抑制剂。
实施例6
将干燥的橡椀粉碎后，置于90％的乙醇水溶液中浸泡12小时，过滤后将滤液在35℃条件下旋转蒸馏8小时，收集粗提液，随后利用乙酸乙酯对提取液进行萃取处理，萃取剂与提取液的比例为1:1，萃取时间为36小时，随后收集提取液，将提取液加入至Sephadex G-100色谱柱中，使用80％的乙腈-水溶液进行第一次洗脱，除去糖、色素和分子量小于2000Da的多酚类物质，随后使用80％的丙酮进行第二次洗脱并收集组分，干燥后即得多酚类酪氨酸酶抑制剂。
实施例7
将干燥的橡椀粉碎后，置于10的乙腈-水溶液中浸泡72小时，过滤后将滤液在35℃条件下旋转蒸馏8小时，收集粗提液，随后利用氯仿对提取液进行萃取处理，萃取剂与提取液的比例为2:1，萃取时间为24小时，随后收集提取液，将提取液加入至Sephadex G-150色谱柱中，使用45％的甲醇-水溶液进行第一次洗脱，除去糖、色素和分子量小于2000Da的多酚类物质，随后使用40％的丙酮-水溶液进行第二次洗脱并收集组分，干燥后即得多酚类酪氨酸酶抑制剂。
实施例8
将干燥的橡椀粉碎后，置于90％的乙腈-水溶液中浸泡48小时，过滤后将滤液在35℃条件下旋转蒸馏8小时，收集粗提液，随后利用四氯化碳对提取液进行萃取处理，萃取剂与提取液的比例为4:1，萃取时间为32小时，随后收集提取液，将提取液加入至Sephadex G-200色谱柱中，使用10％的甲醇-水溶液进行第一次洗脱，除去糖、色素和分子量小于2000Da的多酚类物质，随后使用60％的丙酮-水溶液进行第二次洗脱并收集组分，干燥后即得多酚类酪氨酸酶抑制剂。
实施例9
将干燥的橡椀粉碎后，置于70％的丙酮-水溶液中浸泡18小时，过滤后将滤液在35℃条件下旋转蒸馏8小时，收集粗提液，随后利用异戊醇对提取液进行萃取处理，萃取剂与提取液的比例为3:1，萃取时间为24小时，随后收集提取液，将提取液加入至Sephadex LH-20色谱柱中，使用25％的甲醇-水溶液进行第一次洗脱，除去糖、色素和分子量小于2000Da的多酚类物质，随后使用70％的丙酮-水溶液进行第二次洗脱并收集组分，干燥后即得多酚类酪氨酸酶抑制剂。
实施例10
将干燥的橡椀粉碎后，置于50％的甲醇-水溶液中浸泡24小时，过滤后将滤液在35℃条件下旋转蒸馏8小时，收集粗提液，随后利用氯仿对提取液进行萃取处理，萃取剂与提取液的比例为3:1，萃取时间为33小时，随后收集提取液，将提取液加入至TOYOPEARL HW色谱柱中，使用60％的乙醇-水溶液进行第一次洗脱，除去糖、色素和分子量小于2000Da的多酚类物质，随后使用60％的丙酮-水溶液进行第二次洗脱并收集组分，干燥后即得多酚类酪氨酸酶抑制剂。
实施例11
将干燥的橡椀粉碎后，置于60％的乙醇-水溶液中浸泡36小时，过滤后将滤液在35℃条件下旋转蒸馏8小时，收集粗提液，随后利用二氯甲烷对提取液进行萃取处理，萃取剂与提取液的比例为5:1，萃取时间为6小时，随后收集提取液，将提取液加入至TOYOPEARL DW色谱柱中，使用40％的乙腈-水溶液进行第一次洗脱，除去糖、色素和分子量小于2000Da的多酚类物质，随后使用40％的丙酮-水溶液进行第二次洗脱并收集组分，干燥后即得多酚类酪氨酸酶抑制剂。
实施例12
将干燥的橡椀粉碎后，置于70％的乙腈-水溶液中浸泡38小时，过滤后将滤液在35℃条件下旋转蒸馏8小时，收集粗提液，随后利用氯仿对提取液进行萃取处理，萃取剂与提取液的比例为4:1，萃取时间为36小时，随后收集提取液，将提取液加入至TSKgel PW色谱柱中，使用70％的乙腈-水溶液进行第一次洗脱，除去糖、色素和分子量小于2000Da的多酚类物质，随后使用80％的丙酮-水溶液进行第二次洗脱并收集组分，干燥后即得多酚类酪氨酸酶抑制剂。
对比例1
对比例1为市售的没食子酸(分析纯，Sigma Aldrich，美国)。
核磁共振
在以氘代甲醇-重水(50:50，v：v)为溶剂的条件下，将实施例1所得多酚类酪氨酸酶抑制剂的进行核磁共振，得到图1，从图1可以看出，该多酚类酪氨酸酶抑制剂的核磁共振碳谱(13CNMR)在165ppm、164ppm、159ppm、145ppm、144ppm、136ppm、124ppm、115ppm、114ppm、110ppm、70ppm、63ppm、57ppm以及55ppm处具有化学位移，其中，165ppm、164ppm和159ppm为没食子酰基、六羟基二苯甲酰基结构中的C7，145ppm和144ppm为六羟基二苯甲酰基结构中A环与B环C3、C5或没食子酰基连接酚羟基的C3和C5，136ppm为六羟基二苯甲酰基中A环和B环的C1，115ppm、114ppm和110ppm为六羟基二苯甲酰基分子A环、B环上的C1、C2和C6，70ppm、63ppm、57ppm和55ppm为葡萄糖母核上的碳原子。
红外检测
在以溴化钾压片的条件下，将实施例1所得的多酚类酪氨酸酶抑制剂进行红外检测，得到图2，从图2可以看出，傅里叶红外光谱(FT-IR)在3373cm-1、2929cm-1、1708cm-1、1615cm-1、1532cm-1、1448cm-1、1337cm-1、1223cm-1、1110cm-1、1032cm-1、829cm-1和593cm-1处具有吸收峰，其中，3373cm-1为酚羟基O-H伸缩振动吸收峰；2929cm-1为C-H伸缩振动吸收峰；1708cm-1为羰基C＝O伸缩振动；1615cm-1与1532cm-1处的吸收峰为芳环骨架C＝C-C伸缩振动；1448cm-1为亚甲基C-H形变离开苯环平面导致；1337cm-1与1223cm-1为芳环C-O键伸缩振动。1032cm-1为附近出现的较宽且峰强较强的吸收峰为甲氧基C-O键；950-600主要为芳环C-H键弯曲振动。
酪氨酸酶抑制活性
本发明还对多酚类酪氨酸酶抑制剂的酪氨酸酶抑制活性进行了考察：利用多巴速率氧化法测定了多酚类酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶活力的抑制能力，并计算获得了其半抑制浓度(IC50)，如图3所示，从图3可以发现，多酚类酪氨酸酶抑制剂的酪氨酸酶半抑制浓度仅为1.2mM，远远小于单宁酸(IC50＝4.0mM)、没食子酸(IC50＝389.6mM)和苹果单宁(IC50＝12.6mM)这几种被普遍报道具有显著酪氨酸酶活性抑制功能的水解类多酚，同时也比市场上的曲酸、维生素C、熊果苷等酪氨酸酶抑制剂等强很多。
酶促反应速率与酪氨酸酶量的关系
同时，本发明还基于Linweaver-Burk双倒数作图法，测定了多酚类酪氨酸酶抑制剂酶促反应速率与酪氨酸酶量的关系，得到图4，从图4可以观察到，随着样品浓度的增加，拟合直线的斜率不断降低，表明样品不能使有效的酪氨酸酶完全失活，而只是使其催化速率下降，是一种典型可逆性抑制剂。即说明多酚类酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制作用方式是可逆抑制作用方式。可逆抑制剂是抑制剂通过与酶分子的非共价键结合，使酶活性降低或丧失，这种抑制作用可通过物理方法，如透析、超滤、色谱等方法去除抑制剂，并可实现酶的恢复。多酚类酪氨酸酶抑制剂的结构单体均带有酚羟基，表明氢键和疏水作用是多酚类酪氨酸酶抑制剂与酪氨酸酶相互作用的主要驱动力。多酚类酪氨酸酶抑制剂嵌入酶的空腔并与周围的氨基酸残基主要以非共价相互作用，没有让直接使酪氨酸酶失活，所以可认为多酚类酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制机理主要是非共价键结合的可逆抑制。
反应速率与底物浓度关系
图5为实施例1所得的多酚类酪氨酸酶抑制剂的反应速率与底物浓度双倒数曲线，利用双倒数方程中1/v对1/[S]作双倒数曲线图，测得1/v-1/[S]的关系为一组相交于第二象限的直线，如图5所示，横轴截距和纵轴截距都因抑制剂的浓度的变化而改变，即Km和Vm都随着抑制剂浓度的改变而改变。随着多酚类酪氨酸酶抑制剂溶液浓度的增大，图中的直线横截距减小，纵截距逐渐增大，即当多酚类酪氨酸酶抑制剂的浓度增大时，体系的最大反应速率Vmax逐渐减小，米氏常数值Km逐渐增大。表明橡椀多酚不仅可以与游离酶(E)结合，还可以与底物-酶复合物(ES)相结合。酪氨酸酶是在黑色素形成过程中的关键酶，其中催化L-dopa氧化成多巴醌，多酚类酪氨酸酶抑制剂为多羟基酚类化合物，其含有较多的酚羟基，骨架与L-dopa相似，因此多酚类酪氨酸酶抑制剂会与底物L-dopa上的-OH基团竞争酶的活性位点。从酪氨酸酶的三维结构来看，铜离子对酪氨酸酶的活性有重要影响，活性中心上的两个铜离子微小变化都导致活性的丧失，多酚类酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的强烈抑制作用主要是由于单宁上的羟基与活性中心的铜形成螯合物。可认为多酚类酪氨酸酶抑制剂主要通过竞争酶活性中心的铜表现出酪氨酸酶抑制活性。
荧光淬灭实验
采用荧光淬灭实验研究多酚类酪氨酸酶抑制剂与蛋白质之间的相互作用机理。蛋白质是一种内源荧光物质，通常激发波长在280nm时，蛋白质的内源荧光发射基团在340nm处会有发射峰。以F0/F对[Q]作图，如图6所示，可知当激发波长280nm为时，酪氨酸酶在340nm处有一个最大荧光发射峰，随着在体系中不断加入多酚类酪氨酸酶抑制剂，酪氨酸酶的荧光强度有规律地减弱，发生了剂量-反应关系，表明抑制剂与酪氨酸酶发生了相互作用并引起荧光淬灭现象，这些结果为多酚类酪氨酸酶抑制剂是酪氨酸酶有效结合剂提供了重要证据。峰的形状、位置基本保持不变，说明两者之间无明显的共价作用，荧光强度降低的原因可能是由于通过非共价键结合。多酚类酪氨酸酶抑制剂的加入导致了荧光发射光谱的急剧下降，在化合物添加的浓度为10μM时，荧光强度降低了74.3％，说明多酚类抑制剂与酪氨酸酶中色氨酸残基的相互作用优于单宁酸和没食子酸等其他潜在的酪氨酸酶抑制剂，表明多酚类酪氨酸酶抑制剂与酪氨酸酶中的色氨酸残基结合效果最好，是一种很好的酶促荧光淬灭剂。
采用凝胶渗透色谱(GPC)对实施例1-12的多酚类酪氨酸酶抑制剂和对比例1没食子酸的平均分子量和聚合度进行测定，利用酸水解-高效液相色谱分析测试其结构单元(没食子酰基：六羟基二酚)摩尔比，结合核磁共振碳谱对所得化合物的结构进行了鉴定，所得结果如表1所示。
表1
从表1可以看出，本发明制备的抑制剂的平均分子量为3625-9433Da，平均聚合度为21.3-55.5(以没食子酸计)，结构单元中的没食子酰基和六羟基二酚的摩尔比为(2.3-22.4):1。且其结构(式1)中n1、n2、n3的三者之和为21至56。
同时，为了考察本发明制备的抑制剂对酪氨酸酶的活性抑制能力，根据普鲁士蓝法，对实施例1-12的多酚类酪氨酸酶抑制剂的得率进行了考察，利用多巴速率氧化法测定了橡椀多酚对酪氨酸酶活力的抑制能力，并计算获得了其半抑制浓度(IC50)，结果如表2所示。
表2
| 得率(g/100g原料) | IC 50(mM) | |
| 实施例1 | 4.34 | 1.3 |
| 实施例2 | 5.68 | 1.1 |
| 实施例3 | 4.52 | 1.1 |
| 实施例4 | 5.96 | 1.2 |
| 实施例5 | 5.13 | 1.0 |
| 实施例6 | 4.62 | 0.9 |
| 实施例7 | 5.19 | 0.8 |
| 实施例8 | 7.77 | 0.9 |
| 实施例9 | 6.31 | 1.0 |
| 实施例10 | 5.25 | 1.1 |
| 实施例11 | 4.82 | 0.9 |
| 实施例12 | 5.93 | 1.0 |
| 对比例1 | -- | 389.6 |
由表2可以看出，实施例1-12的多酚类酪氨酸酶抑制剂的得率为4.34-7.77g/100g原料，其半抑制浓度(IC 50)为0.8-1.3mM，远远小于在化妆品行业中常用作抑制剂的没食子酸(对比例1)。说明本发明所得的多酚类酪氨酸酶抑制剂具有非常优异的酪氨酸酶抑制效果。
对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下还可以做出若干简单推演或替换，而不必经过创造性的劳动。因此，本领域技术人员根据本发明的揭示，对本发明做出的简单改进都应该在本发明的保护范围之内。上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。
Claims (9)
1.一种多酚类酪氨酸酶抑制剂，其特征在于，其结构式为式(1)：
其中，n1、n2、n3均为正整数，且满足n1、nn2、n3的三者之和为21至56。
2.根据权利要求1所述的多酚类酪氨酸酶抑制剂，其特征在于，制备所述多酚类酪氨酸酶抑制剂的原料为橡椀。
3.根据权利要求1所述的多酚类酪氨酸酶抑制剂，其特征在于，所述多酚类酪氨酸酶抑制剂是以没食子酸进行计算，其平均聚合度为21.3-55.5，平均分子量为3625-9433Da。
4.根据权利要求1所述的多酚类酪氨酸酶抑制剂，其特征在于，所述多酚类酪氨酸酶抑制剂的结构单元中的没食子酰基和六羟基二酚的摩尔比为(2.3-22.4):1。
5.权利要求1-4任一项所述的多酚类酪氨酸酶抑制剂的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)粗提取：取橡椀粉碎并置于有机溶剂中浸泡，过滤，将滤液进行旋转蒸馏，收集粗提液；
2)萃取：向步骤1)所得的粗提液中加入萃取剂，振荡，静置，收集提取液；
3)洗脱分离：采用体积排阻色谱法，将步骤2)所得的提取液进行洗脱，得所述多酚类酪氨酸酶抑制剂；
步骤3)中，所述洗脱包括第一次洗脱和第二次洗脱，第一次洗脱采用洗脱剂A，第二次洗脱采用洗脱剂B；所述洗脱剂A选自体积分数为10-45％的甲醇-水溶液、10-80％的乙醇-水溶液、10-80％的乙腈-水溶液中的至少一种；所述洗脱剂B选自体积分数为50-80％的甲醇-水溶液、10-95％的丙酮-水溶液中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，步骤1)中，所述有机溶剂选自体积分数分别为10-90％的丙酮-水溶液、10-90％的甲醇-水溶液、10-90％的乙醇、10-90％的乙腈-水溶液中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，步骤1)中，所述浸泡的时长为12-72h。
8.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，步骤2)中，所述萃取剂选自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、异戊醇、四氯化碳中的至少一种；所述萃取剂与所述粗提液的体积比为(1-5):1。
9.一种多酚类酪氨酸酶抑制剂的应用，其特征在于，将权利要求1-4任一项所述的多酚类酪氨酸酶抑制剂应用于制备治疗色素沉着过度或黑色素瘤的药物，或应用于制备美白类化妆品。
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