CN111925959B - 一种多重耐药海豚葡萄球菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多重耐药海豚葡萄球菌及应用。Staphylococcus delphini 245‑1，该菌株于2020年6月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址是广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏号GDMCC NO：61071。本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明提供了一种携带多重耐药基因cfr的多重耐药海豚葡萄球菌及其应用。该菌株对6种抗生素特别是利奈唑胺耐药，可做为筛选新型功能微生物/药物/抗菌材料的模型材料，具有良好的应用前景。

Description

一种多重耐药海豚葡萄球菌及应用

技术领域：

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种携带cfr多重耐药基因的海豚葡萄球菌及应用。

背景技术：

葡萄球菌(Staphylococcus spp.)是人和动物最常见的病原体之一。几乎所有的动物都对葡萄球菌易感，中间葡萄球菌作为一个典型的代表，常引起伴侣动物和马属动物的皮肤感染，偶尔会感染人类。近年，根据表型鉴定分类，中间葡萄球菌至少包含了3个不同的种，包括中间葡萄球菌、伪中间葡萄球菌和海豚葡萄球菌，这3种细菌共同组成了中间葡萄球菌群(Staphylococcus intermedius group)。这其中，海豚葡萄球菌是于1988年首次分离于海豚的皮肤化脓灶中，通过核酸杂交实验证实了其与其他凝固酶阳性细菌存在差异。自首次发现海豚葡萄球菌以来，有来自不同国家、不同物种的海豚葡萄球菌被相继分离并鉴定。该菌曾分离于鸽、马、驴、骆驼、獾、白鼬等动物中，也曾在我国农村慢性鼻窦炎患者的鼻腔分泌物中被分离鉴定。

伴随着抗生素的大量使用，细菌耐药性问题日趋严重，成为全球公共卫生体系面临的一个严峻挑战。日前，WHO已将细菌耐药性问题列为21世纪威胁人类健康的最重要因素之一。值得注意的是，耐药基因是导致细菌出现耐药的主要原因，如vanA耐药基因的水平转移，导致耐甲氧西林金黄色葡萄球菌出现万古霉素耐药。细菌耐药性情况的不断加剧，为抗感染的治疗加深了难度，为了寻求解决办法，致力于研究新型抗耐药菌药物和制剂刻不容缓。我们从环境或临床获得的耐药菌株成为了寻求新的抗菌药物研究实验的必要材料，例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、产ESBLs或AmpC酶的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌；多重耐药的铜绿假单胞菌、热带念珠菌等。cfr基因是目前发现的唯一一种可同时介导对五种化学结构不同的抗菌药物(酰胺醇类、林可霉素类、截短侧耳素类、恶唑烷酮类和链阳菌素A类)耐药的多重耐药基因，也是迄今为止发现的第一种可介导恶唑烷酮类药物耐药的可转移耐药基因。目前，携带cfr基因的葡萄球菌虽然在国内外都有过相关报道(Locke et al.,2012；Mendes et al.,2013；Sharkey et al.,2016；Su et al.,2018)，但从未在海豚葡萄球菌中被发现。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种多重耐药—海豚葡萄球菌(Staphylococcusdelphini)245-1，该菌株于2020年6月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址是广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏号GDMCCNO：61071。

本发明人在研究中发现了一株多重耐药的海豚葡萄球菌，该菌株中含有携带cfr基因，在国内外均未见报道，其是寻求细菌耐药机制的重要材料，可用于筛选新型功能微生物/药物/抗菌材料。

本发明的第二个目的是提供海豚葡萄球菌245-1在筛选功能微生物、药物或抗菌材料中的应用。

所述的功能微生物、药物或抗菌材料是抑制海豚葡萄球菌245-1的功能微生物、药物或抗菌材料。

所述的功能微生物、药物或抗菌材料是抑制利奈唑胺耐药细菌的功能微生物、药物或抗菌材料。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明提供了一种携带多重耐药基因cfr的多重耐药海豚葡萄球菌及其应用。该菌株对6种抗生素特别是利奈唑胺耐药，可做为筛选新型功能微生物/药物/抗菌材料的模型材料，具有良好的应用前景。

Staphylococcus delphini 245-1，该菌株于2020年6月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址是广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏号GDMCC NO：61071。

附图说明：

图1为多重耐药海豚葡萄球菌245-1菌株的菌落形态图；

图2为多重耐药海豚葡萄球菌245-1菌株的镜检观察形态图；

图3为多重耐药海豚葡萄球菌245-1菌株的API Staph生化鉴定示意图；

图4为多重耐药海豚葡萄球菌245-1菌株的16srRNA序列进化树分析图，其中lclQuery_129551代表海豚葡萄球菌245-1。

图5为多重耐药海豚葡萄球菌245-1菌株的耐药表型结果，A：K(卡那霉素),C(氯霉素)，DA(克林霉素)，S(链霉素)；B：CIP(环丙沙星)，NOR(诺氟沙星)，E(红霉素)，TEL(泰利菌素)；C：AMP(氨苄西林)，AMC(阿莫西林/克拉维酸)，FEP(头孢吡肟)，FOX(头孢西丁)；D：AK(阿米卡星)，P(青霉素)，CAZ(头孢他啶)，CN(庆大霉素)；E：RD(利福平)，TE(四环素)，SXT(复方新诺明)，LZD(利奈唑胺)；F：TEC(替考拉宁)，FD(夫西地酸)，QD(喹奴普汀/达福普汀)，F(呋喃妥因)。

图6为多重耐药海豚葡萄球菌245-1菌株的cfr基因的PCR扩增图；

图7为多重耐药海豚葡萄球菌245-1菌株的cfr基因的遗传背景分析图。

具体实施方式：

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

一种对多种抗生素耐药的海豚葡萄球菌，命名为多重耐药海豚葡萄球菌(Staphylococcus delphini)245-1；该菌株于2020年6月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址是广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏号GDMCC NO：61071。

实施例1多重耐药海豚葡萄球菌245-1菌株的分离、鉴定和培养

一、菌株的分离

海豚葡萄球菌245-1分离自中国广州市番禺区某农贸市场的速冻鸭腿食品中，对采集的样品同时进行定性和定量检测，取样25g(mL)加入225mL生理盐水的无菌均质袋中均质摇匀，制成1:10的样品液，并从中取1mL加入到装有9mL 10％氯化钠胰酪胨大豆肉汤的试管中，制成1:100的样品液，按照上述方法制成1:1000的样品液；每个梯度3个平行，将样品液放置于恒温培养箱中37℃培养48h后，将每个梯度浓度的样品液分别划线于葡萄球菌显色板培养基上(图1)，37℃中培养24-48h。将目标菌落从NA平板上转接到脑心浸液营养肉汤(BHI)中，于37℃过夜复苏。在无菌条件下将菌液加入终浓度为40％甘油管中，保存于-40℃冰箱，并进行冻干管保存。由此获得菌株245-1。

二、菌株的鉴定：

纯化后的菌株245-1进行形态特征、生理生化、血清型以及分子生物学等方面的鉴定。

1、染色镜检：将菌株245-1涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。本发明的海豚葡萄球菌245-1显示为革兰氏阳性，显微镜下成原型葡萄串状(图2)。

2、血浆凝固酶实验：接种菌株245-1单菌落至5mLBHI培养液中，于37℃培养18-24h。吸取培养液1mL，加入血浆凝固酶中，于37℃培养。2.5h后，每一小时观察一次是否凝结，若6h后没凝固，培养过夜再观察验证。

3、API Staph鉴定：从显色平板上刮取粉色菌株245-1单个菌落，用生理盐水制备成浊度适当的细胞悬浮液，使用API Staph生化鉴定试剂条鉴定(图3)。

4、16srDNA分析：通过细菌基因组DNA提取试剂盒(日本Takara)对菌株245-1进行核酸提取，然后继续使用16srRNA基因PCR，使用通用的细菌引物27F-1492R引物(5’-AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3’和5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)进行PCR扩增，送检测序。测序结果如果SEQ ID NO.1所示。

建立基于16S rRNA基因的系统发育树，在NCBI核酸数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)中下载临近菌株的16S rRNA序列，计算遗传距离，利用N-J法建立近缘种的系统发育树，发育树显示245-1与Staphylococcus delphiniNCTC12225遗传关系最近，显示相似度为99.6％，如图4所示。

综合判断该菌落的外观、形态、革兰氏染色及16s结果可鉴定菌株245-1为海豚葡萄球菌，将其命名为：海豚葡萄球菌(Staphylococcus delphini)245-1，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号GDMCC NO：61071；保藏日期为2020年6月4日，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。

实施例2多重耐药海豚葡萄球菌245-1菌株的药敏特征分析

利用梯度稀释法和KB法进行海豚葡萄球菌245-1菌株的药敏确证。梯度稀释法以Staphylococcus aureus ATCC29213作为质控菌株，KB法以Staphylococcus aureusATCC25923作为质控菌株。两种方法均参考按照美国临床实验试标准委员会(CLSI)上的方法和标准进行测定。

梯度稀释法：每组平行操作3次，得出浓度平均值。选择无菌96孔平底微量培养板，在每排第一孔中加入200μLMH肉汤培养基作为阴性对照；在每排第二孔中加入100μL本发明海豚葡萄球菌245-1耐药菌菌液和100μLMH肉汤培养基作为阳性对照；在每排第3-12各孔中加入MH肉汤培养基100μL，然后于每排第3孔加入待测药物100μL，混合均匀，并取出100μL移至第4孔中，以此类推直至第12孔混匀后吸取100μL弃去，最后于各孔中加入混匀后的本发明的海豚葡萄球菌245-1(5×10⁵cfu/mL)的菌悬液100μL。将培养板置于37℃恒温箱中培养18h观察结果，测定其MIC值。选择黑色背景观察，以溶液清晰透亮的最低浓度孔中的药物浓度为MIC。

KB法：经NA平板活化后加入生理盐水稀释至终浓度为1×10⁷cfu/mL涂布于MH平板上，待菌液干了之后将抗生素纸片贴在培养基表面，37℃培养24h。采用游标卡尺测定抑菌圈大小，精确至0.01mm。

进一步的，选取抗生素阿莫西林克拉维酸、氨苄西林、头孢吡肟、青霉素、头孢他啶、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、氯霉素、克林霉素、红霉素、泰利霉素、环丙沙星、诺氟沙星、四环素、利奈唑胺、利福平、复方新诺明、喹奴普汀/达富普汀、替拉考宁、呋喃妥因、褐霉素、氟苯尼考、肽妙菌素、万古霉素和达托霉素进行药敏确证，其中阿莫西林克拉维酸、氨苄西林、头孢吡肟、青霉素、头孢他啶、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、泰利霉素、环丙沙星、诺氟沙星、四环素、复方新诺明、喹奴普汀/达富普汀、替拉考宁、呋喃妥因和褐霉素采用KB法进行确证，其余抗生素用梯度稀释法进行。

KB实验结果如图5所示。经实验，本发明的海豚葡萄球菌245-1对氯霉素(MIC 128μg/mL)、氟苯尼考(MIC 256μg/mL)、肽妙菌素(MIC 128μg/mL)、克林霉素(MIC 4μg/mL)、卡那霉素(MIC 16μg/mL)和利奈唑胺(MIC 8μg/mL)均能产生耐药，判定该菌为多重耐药的海豚葡萄球菌。

实施例3多重耐药海豚葡萄球菌245-1菌株的耐药基因的检测

针对海豚葡萄球菌245-1多重耐药谱的特性，选取了多重耐药基因cfr对海豚葡萄球菌245-1进行PCR检测。引物与扩增方法参考先前文献报道。所使用的引物由北京六合华大基因科技有限公司合成(引物序列见表1)。反应体系(25μL)包含：12.5μl 2×DreamTaqmastermix，9.5μL超纯水，1μL模板DNA，各1μL上、下游引物。PCR扩增条件如下：94℃预变性5min，94℃变性45s，65℃[△T-1℃]退火45s，72℃延伸90s，进行15个循环；94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸90s，进行20个循环；最后72℃延伸10min。10μL的PCR产物上样于2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离(120V，40min)，使用2000bp DNA Marker。

表1多重耐药基因cfr和lsa(E)引物及扩增片段

经实验，多重耐药海豚葡萄球菌245-1携带多重耐药基因cfr(图6)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例4多重耐药海豚葡萄球菌245-1菌株的cfr多重耐药基因的遗传背景分析

对本发明的海豚葡萄球菌245-1进行了三代全基因组测序分析，发现染色体中包含了多个抗生素耐药基因(ARGs)，包括fexA(氯霉素抗性)、aacA-aphD和aadD(氨基糖苷类抗性)、ble(博来霉素抗性)以及cfr基因，与其耐药表型结果一致。对这些ARGs进一步的分析发现cfr和另外4个ARGs定位在一个新型的Tn558突变转座子上。此Tn558突变转座子(20,264bp)由一个区域(13,611bp)插入至Tn558中所形成(图7)。此插入区域由多重耐药区(12,287-bp)和一个1,326-bp的重复序列(duplicated region,DR_B)所组成，其插入到Tn558的转座酶基因tnpC中。在这个插入区域的左和右的连接处未发现有重复的靶序列(duplicated target sequence)。cfr基因即位于此插入序列的多重耐药区，其中还包括有ARGs(aacA-aphD、aadD和ble)、插入序列(IS257和IS21-558)、解离酶基因(res)、转座酶基因(tnp)以及两个orfs(orf1和orf2)。

实施例5多重耐药海豚葡萄球菌245-1菌株的应用

海豚葡萄球菌245-1的具体应用方法主要体现在两个方面：(1)cfr基因可同时对五种化学结构不同的抗菌药物(酰胺醇类、林可霉素类、截短侧耳素类、恶唑烷酮类和链阳菌素A类)产生耐药，特别是属于恶唑烷酮类抗生素的利奈唑胺(Linezolid)，被认为是治疗由葡萄球菌特别是耐药性革兰氏阳性菌(如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌)所引起的感染的良药，近年来效果一直较为显著，而cfr基因的出现大大加速了利奈唑胺耐药性的扩散传播。该多重耐药基因在海豚葡萄球菌中的出现，对于探讨海豚葡萄球菌的耐药发生机制，治疗因多重耐药海豚葡萄球菌引起的感染的新策略的研究具有重要指导意义，可作为寻求细菌耐药机制的重要材料。(2)另一个用途为筛选功能微生物/药物/抗菌材料，筛选方法如下：

1)功能微生物的筛选

于实验前一天取出放置于冰箱-4℃保存的本发明海豚葡萄球菌245-1，待放至室温，用接种环分别挑取少量菌落，分别接种于MH琼脂培养基上，在35℃恒温箱中培养18-24h。于新长出菌落的MH琼脂培养基上，用接种环挑取少量活化菌落于已灭菌的干燥试管中，用无菌生理盐水稀释配制成1.5×10⁸cfu/mL的菌悬液(标准比浊管对照)，备用。同时，选择合适的培养基活化益生菌，挑取1～2个单菌落放入5mLBHI培养基中37℃摇床培养18h，制成原液，置于冰箱中-4℃保存备用。使用时，用无菌棉签蘸蘸取已制备好的标准细菌浓度为1.5x10⁸cfu/mL的菌悬液，用涂布棒均匀涂布至相应的营养琼脂平板。将灭菌的牛津杯放置在涂布后的MH琼脂培养基上，向牛津杯内加入培养的益生菌原液200μL；取等体积BHI培养基作为阴性对照。平板于37℃、营养琼脂培养基pH 7.2～7.4、避光培养24h，测量产生的抑菌环的直径大小。

取抑菌效果较好的功能菌接种于相应的培养基上，同前面方法制成原液。将高压灭菌的BHI液体培养基分装到多个三角瓶内，用盐酸和氢氧化钠多次少量加入分装好的BHI液体培养基调节培养基pH值。分别将温度(℃)设置为32、35和37℃，初始pH设置为4、5.5和7，接种量设置为10％、25％和50％，培养时间设置为24、36和48h，进行3水平4因素正交实验。利用正交实验选出的最佳培养条件，培养功能益生菌菌株，以培养原液作为种子液。同时按前面拮抗实验方法，制备本发明耐药菌株海豚葡萄球菌245-1稀释菌液，并加入到营养平板涂布均匀后，将灭菌后的牛津杯放置营养平板上，分别向牛津杯内加入培养的功能益生菌菌株种子液200μL，检测益生菌菌株对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用。对照采用BHI培养基，对照菌株种子液制备方法同拮抗初筛实验。

2)药物筛选

精密称取一定量的待测药物，用合适溶媒(如质量浓度为5％的DMSO或质量浓度为5％的DMF)溶解，配制成30mg/mL的溶液待用。再用合适溶媒(如质量浓度为5％的DMSO或质量浓度为5％的DMF)配制成浓度为2000μg/mL的溶液，用来测定其最低抑菌浓度(minimuminhibitory concentration，MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidalconcentration，MBC)，置于冰箱中-4℃保存备用。实验前一天，取出于冰箱-4℃保存的本发明耐药菌株海豚葡萄球菌245-1，待放至室温，用接种环分别挑取少量菌落，分别接种于MH琼脂培养基上，在35℃恒温箱中培养18-24h。于新长出菌落的MH琼脂培养基上，用接种环挑取少量活化菌落于已灭菌的干燥试管中，用无菌生理盐水稀释配制成1.5×0⁸cfu/mL的菌悬液(标准比浊管对照)，备用。测定MIC值时，用无菌生理盐水再次稀释，使之浓度为5.0×10⁵cfu/mL。供KB纸片扩散法用时，配制成浓度为1.5×10⁸cfu/mL的菌悬液。

按照美国临床实验试标准委员会(CLSI)上的方法和标准进行测定，实验前一天，待测标准细菌接种于MH琼脂培养基，在35℃恒温箱中培养18-24h，使活化。以合适溶媒为溶剂(如质量浓度为5％的DMSO或质量浓度为5％的DMF)，使待测药物溶解，放置待用。用无菌棉签蘸取已制备好的标准细菌浓度为1.5×10⁸cfu/mL的菌悬液，用涂布棒均匀涂布至相应的MH琼脂培养基。将灭菌的牛津杯放置在涂布后的MH琼脂培养基上，用微量移液器向牛津杯内加入50μL配好的药液(30mg/mL)；置35℃恒温箱中培养18-24h，测量抑菌圈大小。取等体积BHI培养基加入溶媒作为空白对照。

选取对耐药菌株敏感(抑菌圈直径不小于10mm)的待测药物，根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的微量液基稀释法来测定菌株对不同药物的MIC值，每组平行操作3次，得出浓度平均值。选择无菌96孔平底微量培养板，在每排第一孔中加入200μL MH肉汤培养基作为阴性对照；在每排第二孔中加入100μL本发明耐药菌菌液和100μL MH肉汤培养基作为阳性对照；在每排第3-12各孔中加入MH肉汤培养基100μL，然后于每排第3孔加入待测药物100μL，混合均匀，并取出100μL移至第4孔中，以此类推直至第12孔混匀后吸取100μL弃去，最后于各孔中加入混匀后的本发明耐药菌(5×10⁵cfu/mL)的菌悬液100μL。将培养板置于35℃恒温箱中培养18h观察结果，测定其MIC值。选择黑色背景观察，以溶液清晰透亮的最低浓度孔中的药物浓度为MIC值。

当确定MIC值后，取MIC值前3-5个孔的细菌和MH肉汤培养基混合物，转种在MH琼脂培养基上，置35℃的培养箱中，培养22h后取出观察，平均数小于5个的最低药物浓度即确定为该化合物的MBC。

3)抗菌材料筛选

抗菌材料取决于选取的抗菌剂，目前，抗菌剂按其化学组成可分为无机系、有机系和复合类三大类。无机系抗菌剂主要可分为重金属类(Au、Ag、Hg、Cu、Zn、Ba、Bi、Ta等金属及其化合物)、光催化类(如TiO2、ZnO、CdS、WO3、Fe2O3、PnS、SnO2、ZnS、SiO2等)两大类；有机系抗菌剂则包括天然抗菌剂和化学合成有机抗菌剂两大类，天然抗菌剂主要有壳聚糖、鱼精蛋白、桂皮油和罗汉柏油等，大都是从动植物中提炼精制的,具有耐候性优良、毒性低、使用安全等优点,其主要缺点是耐热性较差，药效持续时间短。化学合成有机抗菌剂主要包括季胺盐类、双胍类、醇类、酚类、醛类、有机酸类、酯类、醚类、过氧化物类、卤素类、咪唑类、噻唑类、腈类、吡啶类等。为了克服无机抗菌剂毒性及有机抗菌剂易洗脱、耐热性能的不足，采用有机和/或无机及亲水性物质复配的方式。在复配体系中，有机、无机抗菌剂等的固有抗菌活性可能会显著提高。一般有机抗菌剂可以同亲水性物质形成共聚物。无机抗菌剂包括含银、铜、锌离子一种或多种的载体型抗菌剂，或采用具有光催化活性的无机金属氧化物或硫化物如TiO2等。

本发明菌株用于抗菌材料的筛选依据GB15979附录C产品性能、抗菌性能与稳定性测试方法进行。具体方法如下：将本发明海豚葡萄球菌245-124h斜面培养物用PBS洗下，制成菌悬液(要求的浓度为：100μL滴于对照样品上或样液内，回收菌数为1×10⁴-9×10⁸cfu/片或mL)。取被试样品(2.0cm×3.0cm)或样液5mL和对照样品(与试样同质材料，同等大小，但不含抗菌材料，且经灭菌处理)各4片，分成4组置于4个灭菌平皿内(或4管)。取上述菌悬液分别在每个被试样片和对照样片上滴加100μL，均匀涂布，开始计时，作用2、5、10、20min，用无菌镊分别将样品投入含5mL相应中和剂的试管内，充分混匀，作适当稀释，然后取其中2-3个稀释度，分别吸取0.5mL，置于两个平皿，用凉至40-45℃的营养琼脂培养基15mL作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35℃±2℃培养48h，作活菌菌落计数。

试验重复3次，按式(C1)计算抑菌率：

X＝(A-B)/A×100％....................(Cl)

式中：X抑菌率，％；A-对照样品平均菌落数；B-被试样品平均菌落数。

对于溶出性抗菌材料，当抑菌率≥50％-90％时，表明该材料具有抑菌作用；当抑菌率＞90％，显示相关材料具较强的抑菌作用。对于非溶出性抗菌材料，不加样片组的菌落数在1×10⁴-9×10⁸cfu/mL之间，且样品振荡前后平均菌落数差值在10％以内，试验有效；被试样片组抑菌率与对照样片组抑菌率的差值>26％，样品具有抗菌作用。

抗菌材料的稳定性测试方法为：

1)自然留样:将原样品置室温下至少1年，每半年进行抑菌或杀菌性能测试。

2)加速试验:将原样品置54-57℃恒温箱内14天或37-40℃恒温箱内3个月，保持相对湿度＞75％，进行抑菌或杀菌性能测试。

抗菌材料经自然留样，其杀菌率或抑菌率达到上述规定的标准值，产品的杀菌或抑菌作用在室温下的保持时间即为自然留样时间。

产品经54℃加速试验，其杀菌率或抑菌率达到上述规定的标准值，产品的杀菌或抑菌作用在室温下至少保持一年。

产品经37℃加速试验，其杀菌率或抑菌率达到上述规定的标准值，产品的杀菌或抑菌作用在室温下至少保持二年。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120> 一种多重耐药海豚葡萄球菌及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1454

<212> DNA

<213> 海豚葡萄球菌(Staphylococcus delphini)

<400> 1

gggcaggggc ggtgctatac atgcagtcga gcgaacagat aaggagcttg ctcctttgac 60

gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctacc tataagactg gaataactcc 120

gggaaaccgg ggctaatgcc ggataacatg ttgaaccgca tggttctaca gtgaaagacg 180

gtcttgctgt cacttataga tggacccgcg ccgtattagc tagttggtgg ggtaacggcc 240

taccaaggcg acgatacgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg gaactgagac 300

acggtccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatggg cgaaagcctg 360

acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt cttcggatcg taaagctctg ttgttaggga 420

agaacaaatg tgtaagtaac tgtgcacatc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480

aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg 540

cgtaaagcgc gcgtaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg 600

agggtcattg gaaactggaa aacttgagtg cagaagagga aagtggaatt ccatgtgtag 660

cggtgaaatg cgcagagata tggaggaaca ccagtggcga aggcggcttt ctggtctgca 720

actgacgctg atgtgcgaaa gcgtggggat caaacaggat tagataccct ggtagtccac 780

gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg 840

cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg 900

gacccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccaa 960

atcttgacat cctttgacaa ctctagagat agagctttcc tcttcggagg acaaagtgac 1020

aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080

gcgcaaccct tgaacttagt tgccatcatt cagttgggca ctctaagttg actgccggtg 1140

acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga tttgggctac 1200

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aaagttgttc tcagttcgga ttgtagtctg caactcgact acatgaagct ggaatcgcta 1320

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cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagc cggtggagta accatttgga gctagccgtc 1440

gaaggtgaca aagt 1454

<210> 2

<211> 1050

<212> DNA

<213> 海豚葡萄球菌(Staphylococcus delphini)

<400> 2

atgaatttta ataataaaac aaagtatggt aaaatacagg aatttttaag aagtaataat 60

gagcctgatt atagaataaa acaaataacc aatgcgattt ttaaacaaag aattagtcga 120

tttgaggata tgaaggttct tccaaaatta cttagggagg atttaataaa taattttgga 180

gaaacagttt tgaatatcaa gctcttagca gagcaaaatt cagagcaagt tacgaaagtg 240

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acaggcgaca ttggattgaa aaaaaaccta actgtagatg agataacaga tcaagtttta 420

tacttccatt tattaggtca tcaaattgat agcatttctt ttatgggaat gggtgaagct 480

ctagccaacc gtcaagtatt tgatgctctt gattcgttta cggatcctaa tttatttgca 540

ttaagtcctc gtagactttc tatatcaacg attggtatta tacctagtat caaaaaaata 600

acccaggaat atcctcaagt aaatcttaca ttttcattac actcacctta tagtgaggaa 660

cgcagcaaat tgatgccaat aaatgataga tacccaatag atgaggtaat gaatatactc 720

gatgaacata taagattaac ttcaaggaaa gtatatatag cttatatcat gttgcctggt 780

gtaaatgatt ctcttgagca tgcaaacgaa gttgttagcc ttcttaaaag tcgctataaa 840

tcagggaagt tatatcatgt aaatttgata cgatacaatc ctacaataag tgcacctgag 900

atgtatggag aagcaaacga agggcaggta gaagcctttt acaaagtttt gaagtctgct 960

ggtatccatg tcacaattag aagtcaattt gggattgata ttgacgctgc ttgtggtcaa 1020

ttatatggta attatcaaaa tagccaatag 1050

Claims (4)

1.海豚葡萄球菌(Staphylococcus delphini)245-1，保藏号GDMCC NO：61071。

2.权利要求1所述的海豚葡萄球菌245-1在筛选功能微生物、药物或抗菌材料中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的功能微生物、药物或抗菌材料是抑制海豚葡萄球菌245-1的功能微生物、药物或抗菌材料。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的功能微生物、药物或抗菌材料是抑制利奈唑胺耐药细菌的功能微生物、药物或抗菌材料。

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