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CN111918878B - 抗gitr抗体及其用途 - Google Patents

抗gitr抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及特异性结合GITR的新型抗体和抗体片段以及含有所述抗体或抗体片段的组合物。此外，本发明涉及编码所述抗体或其抗体片段的核酸及包含其的宿主细胞，以及相关用途。此外，本发明涉及这些抗体和抗体片段的治疗和诊断用途。

Description

抗GITR抗体及其用途
本发明涉及特异性结合GITR的新型抗体和抗体片段以及含有所述抗体或抗体片段的组合物。此外，本发明涉及编码所述抗体或其抗体片段的核酸及包含其的宿主细胞，以及相关用途。此外，本发明涉及这些抗体和抗体片段的治疗和诊断用途。
背景技术
糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(glucocorticoid induced tumornecrosis factor receptor，GITR)，亦称作CD357及GITR-D，最早是在多柔比星处理的小鼠T细胞中被发现的(Nocentin，PNAS.1997；94：6216-6221)，是肿瘤坏死因子受体(tumornecrosis factor receptor，TNFR)超家族的第18个成员(TNFRSF18)，其他成员包括CD40，CD27，4-1BB，OX40等。GITR由其同源配体，GITR配体(GITRL)活化，可以激活下游的NF-kappaB信号通路。
GITR在静息T细胞中以低水平表达；在T细胞活化后，表达显著上调。GITR在调节性T细胞(Treg)中高水平组成型表达，并且当这些细胞被活化时，表达进一步上调(Nocentini和Riccardi，E.J.Immunol.2005，35：1016-1022)。
GITR配体(GITRL)主要在抗原递呈细胞(APC，包括巨噬细胞、B细胞、树突状细胞及内皮细胞)上表达。APC上的GITRL与应答T细胞上GITR的结合触发GITR信号传导，刺激效应性T细胞激活并抑制Treg细胞的活性。由此，GITR对效应T细胞和调节性T细胞具有若干作用，包括：共刺激和活化效应T细胞，降低Treg细胞对效应T细胞的抑制等(Nocentini，Eur.J.Immunol.2007，37：1165-1169)。
这些作用意味着GITR信号通路的活化可以导致免疫应答的增强。因此，能够活化GITR信号通路的物质可以激活机体免疫应答，进而增加机体抗肿瘤和感染的能力等，同时GITR分子在肿瘤微环境中Treg细胞中高表达，因此利用GITR抗体的ADCC活性清除GITR分子高表达的Treg细胞可以进一步增强肿瘤杀伤活性。
现有技术研究了多种GITR的抗体(参见CN103951753A、CN105829343A、CN106459203A、WO2016196792A1、WO2017068186A9等)。这样的抗体是GITR的激动剂(即，是激活型抗体)，可诱导或增强GITR信号传导，在治疗需要增强免疫应答的多种GITR相关疾病或病症中是有效的。由于这样的抗GITR抗体是激活型抗体，故相对于其与抗原的结合亲和力，其激活活性的高低是其发挥活性(例如。免疫增强活性)更为关键的指标。
因此，需要开发具有更好的激活活性，更好ADCC效应，以及具有更好的疗效，例如抗肿瘤作用的抗体。
发明内容
本发明因此提供了一种新的结合GITR的抗体，以及其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明的抗GITR抗体具有以下一个或多个特性：
(i)以高亲和力与GITR结合；
(ii)与细胞表面的GITR有效结合；
(iii)具有激动剂活性，例如能够有效激活NF-kappaB信号通路；
(iv)有效激活T细胞(例如CD4 T细胞)；
(v)能够有效介导ADCC效应；
(vi)具有更好的抗肿瘤活性，例如能够降低受试者中的肿瘤体积，同时不影响受试者的体重；
(vii)与抗PD-1抗体组合能够更好地抑制肿瘤活性，例如能够降低受试者中的肿瘤体积，同时不影响受试者体重。
在一些实施方案中，本发明提供了结合GITR的抗体或其抗原结合片段，包含如SEQID NO：17、18、19或20所示的序列的3个重链CDR(HCDR)，和/或如SEQ ID NO：21、22、23或24所示的序列的3个轻链CDR(LCDR)。
在一些实施方案中，本发明提供了编码本发明抗体或其片段的核酸，包含所述核酸的载体，包含所述载体的宿主细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了制备本发明抗体或其片段的方法。
在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明抗体的免疫缀合物、药物组合物和组合产品。
本发明还提供了利用本发明抗体在受试者中介导ADCC或激活NF-kappaB信号通路的方法，以及预防或治疗癌症或感染的方法。
本发明还涉及在样品中检测GITR的方法。
在下面的附图和具体实施方案中进一步说明本发明。然而，这些附图和具体实施方案不应被认为限制本发明的范围，并且本领域技术人员容易想到的改变将包括在本发明的精神和所附权利要求的保护范围内。
附图说明
图1显示了流式细胞术测定嵌合抗体与表达人GITR的CHO-S细胞株(CHO-hGITR)的结合能力。
图2显示了流式细胞术测定人源化抗体与表达人GITR的CHO-S细胞株(CHO-hGITR)的结合能力。
图3显示了流式细胞术测定人源化抗体与表达食蟹猴GITR的CHO-S细胞株(CHO-cynoGITR)的结合能力。
图4显示了MOA法测定人源化抗体激活Hela-GITR-NF-Kappa B luciferace细胞株能力。
图5显示了人源化抗体激活CD4 T细胞释放IL-2能力检测。
图6显示了人源化抗体激活CD4 T细胞释放IFN-γ能力检测。
图7显示了MOA法测定人源化抗体ADCC活性。
图8显示了HZ37G5分子体内药效检测。
图9显示了HZ22F4分子体内药效检测。
图10显示了小鼠体重检测。
发明详述
I.定义
在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会由所附权利要求书限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项。
如本文所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组合的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
如本文所用，术语“GITR”是指“糖皮质激素诱导的TNF相关基因和/或多肽”，在本领域中也称为TNF受体超家族18(TNFRSF18)，指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人、食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然GITR，除非另有说明。该术语涵盖“全长”，未加工的GITR以及因细胞中的加工所致的任何形式的GITR。该术语还涵盖GITR的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。人GITR氨基酸序列可参见GenBank登记号Q9Y5U5。一个具体的人GITR多肽的氨基酸序列可见于SEQ ID NO：41中。一个具体的食蟹猴GITR多肽的氨基酸序列见SEQ ID NO：42。
本文所用的术语“抗GITR抗体”、“抗GITR”、“GITR抗体”或“结合GITR的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲合力结合(人或食蟹猴)GITR蛋白或其片段以致所述抗体可以用作靶向(人或食蟹猴)GITR中的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗GITR抗体与非(人或食蟹猴)GITR蛋白结合的程度低于所述抗体与(人或食蟹猴)GITR结合的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％或以上，如例如通过放射性免疫测定(RIA)或生物光干涉测定法或MSD测定法测量的。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体(例如scFv)；单结构域抗体；双价或双特异性抗体或其片段；骆驼科抗体；和由抗体片段形成的双特异性抗体或多特异性抗体。
如本文所用，术语“表位”指抗原(例如，GITR)中与抗体分子特异性相互作用的部分。
与参照抗体“结合相同或重叠表位的抗体”是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％以上的所述参照抗体与其抗原的结合，反言之，参照抗体在竞争测定中阻断50％以上的该抗体与其抗原的结合。
与参照抗体竞争结合其抗原的抗体是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合。反言之，参照抗体在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗体是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等，1983，Methods in Enzymology 9：242-253)。
抑制(例如竞争性抑制)参照抗体与其抗原的结合的抗体是指这样的抗体，其抑制50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合。反言之，参照抗体抑制50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。抗体与其抗原的结合可以亲和力(例如平衡解离常数)衡量。测定亲和力的方法是本领域已知的。
与参照抗体显示相同或相似的结合亲和力和/或特异性的抗体是指这样的抗体，其能够具有参照抗体的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的结合亲和力和/或特异性。这可以通过本领域已知的任何测定结合亲和力和/或特异性的方法进行测定。
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342：877-883，Al-Lazikani等人，“Standard conformations for thecanonical structures of immunoglobulins”，Journal of Molecular Biology，273，927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services，National Institutes of Health(1987))，AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database (IMGT)(在万维网上imgt.cines.fr/上)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagationclustering)的North CDR定义。
例如，根据不同的CDR确定方案，每一个CDR的残基如下所述。
Figure BDA0002703456550000041
CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统(Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991))的编号位置。
在一个实施方案中，本发明抗体的CDR通过AbM规则确定边界，例如如表1所示。
然而，应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。
具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。然而，尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat，Chothia，AbM、Contact和North方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。
术语“PD-1轴结合拮抗剂”是指如下的分子，其抑制PD-1轴结合配偶与一种或多种它的结合配偶相互作用，从而去除源自PD-1信号传导轴上的信号传导的T细胞功能障碍-一项结果是恢复或增强T细胞功能(例如增殖，细胞因子生成，靶细胞杀伤)。如本文中使用的，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂(例如抗PD-1抗体)，PD-L1结合拮抗剂(例如抗PD-L1抗体)和PD-L2结合拮抗剂(例如抗PD-L2抗体)。
术语“PD-1结合拮抗剂”指如下的分子，其降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-1与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-L1，PD-L2)相互作用的信号转导。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1结合一种或多种它的结合配偶的分子。在一个特定方面，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1结合PD-L1和/或PD-L2。例如，PD-1结合拮抗剂包括降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-1与PD-L1和/或PD-L2相互作用的信号转导的抗PD-1抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，寡肽和其它分子。在一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂降低由或经由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白质介导的负面共刺激信号(经由PD-1介导信号传导)，从而使得功能障碍性T细胞不太功能障碍性(例如增强对抗原识别的效应器应答)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体。在一个具体实施方案中，PD-1结合拮抗剂是WO2015/095423中公开的MDX-1106(nivolumab)、MK-3475(pembrolizumab)、CT-011(pidilizumab)或AMP-224。在一个实施方案中，抗PD-1抗体是“Antibody C”(WO2017/133540)。
术语“PD-L1结合拮抗剂”指如下的分子，其降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-L1与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1，B7-1)相互作用的信号转导。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1结合它的结合配偶的分子。在一个特定方面，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1结合PD-1和/或B7-1。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂包括降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-L1与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1，B7-1)相互作用的信号转导的抗PD-L1抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，寡肽和其它分子。在一个实施方案中，PD-L1结合拮抗剂降低由或经由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白质介导的负面共刺激信号(经由PD-L1介导信号传导)，从而使得功能障碍性T细胞不太功能障碍性(例如增强对抗原识别的效应器应答)。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一个具体方面，抗PD-L1抗体是WO2015/095423中公开的YW243.55.S70、MDX-1105、MPDL3280A或MEDI4736。
术语“PD-L2结合拮抗剂”指如下的分子，其降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-L2与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1)相互作用的信号转导。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2结合一种或多种它的结合配偶的分子。在一个特定方面，PD-L2结合拮抗剂抑制PD-L2结合PD-1。在一些实施方案中，PD-L2拮抗剂包括降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-L2与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1)相互作用的信号转导的抗PD-L2抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，寡肽和其它分子。在一个实施方案中，PD-L2结合拮抗剂降低由或经由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白质介导的负面共刺激信号(经由PD-L2介导信号传导)，从而使得功能障碍性T细胞不太功能障碍性(例如增强对抗原识别的效应器应答)。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是免疫粘附素。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如NK细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型免疫球蛋白使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337或美国专利No.6,737,056(Presta)中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括PBMC和NK细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等人，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。本文实施例中提供了用于评估ADCC活性的一种例示性测定法。
术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。
“化疗剂”包括在治疗癌症中有用的化学化合物。化疗剂的例子参见WO2015/031667中所公开的那些，包括但不限于抗肿瘤剂，包括烷化剂；抗代谢物；天然产物；抗生素；酶；杂类试剂；激素和拮抗剂；抗雌激素；抗雄激素；以及非类固醇抗雄激素等。
术语“小分子药物”是指低分子量的能够调节生物过程的有机化合物。
“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合结构域(例如抗体可变域)联合，而且可以使用多种测定法来评估，例如本文所公开的那些。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羰基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。
“IgG形式的抗体”是指抗体的重链恒定区所属于的IgG形式。所有同一型的抗体的重链恒定区都是相同的，不同型的抗体之间的重链恒定区不同。例如，IgG1形式的抗体是指其重链恒定区Ig结构域为IgG1的Ig结构域。
本文所述的术语“治疗剂”涵盖在预防或治疗肿瘤(例如癌症)和感染(例如慢性感染)中有效的任何物质，包括化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂。
术语“有效量”指本发明的抗体或片段或缀合物或组合物的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；它的大小、年龄和一般健康；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。
“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。抗体或抗体片段或其缀合物或组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体片段或其缀合物或组合物的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率，肿瘤体积等)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约50％、60％或70％和仍更优选地至少约80％或90％。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价化合物抑制可度量参数(例如，癌症)的能力。
“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换地使用且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸内容上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。
“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于下述抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体是指包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。
术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”，“癌性”，“细胞增殖性病症”，“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
术语“感染性疾病”是指病原体引发的疾病，包括例如病毒感染、细菌感染、真菌感染或者原生动物例如寄生虫感染。
术语“慢性感染”是指这样的感染，其中传染原(例如，病原体如病毒、细菌、原生动物例如寄生虫、真菌或诸如此类)已经在感染的宿主中诱导了免疫应答，但尚未如在急性感染过程中一样被从宿主中清除或消除。慢性感染可以是持续性的、潜伏性的或缓慢的。尽管急性感染(如流感)通常被免疫系统在数天或数周内解决，持续性的感染可以相对低的水平持续数月、数年、数十年或一生(例如，乙型肝炎)。相比之下，潜伏性的感染的特征是长期的无症状活动，被一段时间的迅速增加的高度感染和升高的病原体水平不时打断(例如单纯疱疹)。最后，缓慢感染的特征是疾病症状的逐渐和连续增加，诸如长期的潜伏期，随后在临床症状出现后是延长的和进展的临床过程开始。
“免疫缀合物”是与一个或多个其它物质(包括但不限于细胞毒性剂或标记)缀合的抗体。
本文所使用的术语“标记”是指被直接或间接缀合或融合至试剂(诸如多核苷酸探针或抗体)并且促进其所缀合或融合的试剂的检测的化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或在酶促标记的情况下可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。术语旨在涵盖通过将可检测物质偶联(即，物理连接)至探针或抗体来直接标记探针或抗体以及通过与直接标记的另一种试剂反应来间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二级抗体进行的一级抗体的检测和具有生物素的DNA探针的末端标记，使得其可以用荧光标记的链霉抗生素蛋白来检测。
“个体”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体是这样的抗体，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。
“分离的编码抗GITR抗体或其片段的核酸”是指一个或多个核酸分子，其编码抗体重链或轻链(或其片段)，包括在单一载体或分开的载体中的这样的核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。
如下进行序列之间序列同一性的计算。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。
可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch ((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。
还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法，((1989)CABIOS，4：11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。
额外地或备选地，可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。
术语“药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂、载体或稳定剂等。
术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
术语“组合产品”是指一种剂量单位形式的固定组合或非固定组合或用于组合施用的部分的试剂盒，其中两种或更多种治疗剂可以独立地在同一时间或在时间间隔内分开施用，尤其是在这些时间间隔允许组合伴侣展示协作，例如，协同效应时。术语“固定组合”是指本发明抗体和组合伴侣(例如其他治疗剂，例如抗PD1抗体、抗PDL1抗体或抗PDL2抗体)以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”意指本发明抗体和组合伴侣(例如其他治疗剂，例如抗PD1抗体、抗PDL1抗体或抗PDL2抗体)作为分开的实体同时、并行或依次施用于患者，没有特定的时间限制，其中这样的施用提供了患者体内两种化合物的治疗有效水平。后者也适用于鸡尾酒疗法，例如施用三种或更多种治疗剂。在一个优选的实施方案中，药物组合是非固定组合。
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂以治疗如本公开所述的癌症或感染。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，例如以具有固定比例的活性成分的单一胶囊。或者，这种施用包括对于各个活性成分在多种或在分开的容器(例如片剂、胶囊、粉末和液体)中的共同施用。粉末和/或液体可以在施用前重构或稀释至所需剂量。此外，这种施用还包括以大致相同的时间或在不同的时间以顺序的方式使用每种类型的治疗剂。在任一情况下，治疗方案将提供药物组合在治疗本文所述的病症或病状中的有益作用。
用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。
用于本文时，“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。
术语“抗感染活性剂”包括在施用浓度和给药间隔下特异性抑制或消除微生物生长但对宿主不致命的任何分子，所述微生物诸如病毒、细菌、真菌或原生动物，例如寄生虫。用于本文时，术语抗感染活性剂包括抗生素、抗菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗原生动物剂。在一个具体方面中，抗感染活性剂在施用浓度和给药间隔对宿主是无毒的。
抗细菌的抗感染活性剂或抗菌剂可广泛的分类为杀菌的(即，直接杀死)或抑菌的(即，阻止分裂)。抗菌的抗感染活性剂可进一步再分类为窄谱抗菌剂(即，仅影响小类细菌亚型，例如，革兰氏阴性等)或广谱抗菌剂(即，影响广泛种类)。
术语“抗病毒剂”包括抑制或消除病毒生长、致病和/或存活的任何物质。
术语“抗真菌剂”包括抑制或消除真菌生长、致病和/或存活的任何物质。
术语“抗原生动物剂”包括抑制或消除原生动物生物体(例如寄生虫)生长、发病和/或存活的任何物质。
术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
“受试者/患者样品”指从患者或受试者得到的细胞或流体的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、细针吸出物、支气管灌洗液、胸膜液(胸水)、痰液、尿液、手术标本、循环中的肿瘤细胞、血清、血浆、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。
II.抗体
在一些实施方案中，本发明的抗GITR抗体或其片段以高亲和力结合GITR(例如人GITR或食蟹猴GITR)，例如，以以下平衡解离常数(KD)与GITR结合，所述KD小于大约10nM，优选地，小于或等于大约7nM，更优选地小于或等于大约6nM，更优选地小于或等于大约5nM、4.9nM、4.8nM、4.7nM、4.6nM、4.5nM、4nM、或3nM，最优选地，所述KD小于或等于大约2.5nM、2.4nM、2.3nM、2.2nM、2.1nM。在一些实施方案中，本发明的抗GITR抗体以1nM-6nM，优选地1.5nM-5nM、1.7nM-5nM、1.8nM-5nM、1.9nM-5nM的KD结合GITR。在一些实施方案中，GITR为人GITR。在一些实施方案中，抗体结合亲和力是使用生物光干涉测定法(例如Fortebio亲和测量)测定的。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段结合表达GITR的细胞，例如，以小于或等于大约2nM、1.9nM、1.5nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM的EC50。在一些实施方案中，所述结合用流式细胞术(例如FACS)测定。在一些实施方案中，表达GITR的细胞为表达GITR的CHO细胞(例如CHO-S细胞)。在一些实施方案中，GITR为人GITR或食蟹猴GITR。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段通过与细胞表面的GITR分子结合而激活GITR下游的NF-kappaB信号通路。在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段激活能力优于已知的抗GITR抗体，例如专利申请US20130183321A1(GITR，INC.(Cambridge，MA，US))中报道的GITR抗体。在一个实施方案中，已知的抗GITR抗体分子的轻链和重链序列在US20130183321A1中分别为SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：54。在一些实施方案中，本发明的GITR抗体分子相比对照抗体分子，能够显著有效激活NF kappa B信号通路。在一些实施方案中，所述激活是通过荧光素酶检测获得的。
在一些实施方案中，本发明抗体或其片段提高效应T细胞功能，例如激活效应T细胞。在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段能够增强效应T细胞的增殖。在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段提高干扰素(例如IFN-γ)分泌/表达。在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段提高白细胞介素(例如IL-2)分泌/表达。在一些实施方案中，T细胞是CD4 T细胞。
在一些实施方案中，本发明的GITR抗体或其片段能够激活调节T细胞(例如Treg细胞)中的GITR信号通路，进而通过介导ADCC效应消除细胞。由此，一方面解除效应T细胞自身的抑制信号，增强CD4T细胞和/或CD8T细胞的活性，另一个方面消除调节T细胞对效应T细胞的抑制作用，从而最大程度地激活效应T细胞，增强针对肿瘤细胞的免疫应答反应。在一些实施方案中，通过检测NF-AT信号激活来检测抗体的ADCC活性。在一些实施方案中，所述NF-AT信号的激活由荧光报告基因的表达体现。在一些实施方案中，本发明的GITR抗体分子相比已知的抗GITR抗体分子，能够显著有效激活NF-AT信号通路。在一些实施方案中，本发明的GITR抗体分子相比已知的抗GITR抗体分子，能够显著有效介导ADCC效应。在一些实施方案中，本发明的GITR抗体分子相比已知的抗GITR抗体分子，能够显著有效抑制或消除调节T细胞。在一些实施方案中，本发明的效应T细胞是CD4 T细胞。在一些实施方案中，已知的抗GITR抗体分子是例如专利申请US20130183321A1(GITR，INC.(Cambridge，MA，US))中报道的抗GITR抗体。在一个实施方案中，已知的抗GITR抗体分子的轻链和重链序列在US20130183321A1中分别为SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：54。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段(任选地与治疗方式和/或其它治疗剂，例如PD-1轴结合拮抗剂组合)能够预防或治疗肿瘤。在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段能够用于抑制或减小肿瘤生长(例如减小肿瘤体积)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段还能够用于维持肿瘤患者体重。在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段能够与治疗方式和/或其它治疗剂，例如PD1-轴结合拮抗剂组合抑制或减小肿瘤生长(例如减小肿瘤体积)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段能够与治疗方式和/或其它治疗剂，例如PD1-轴结合拮抗剂组合维持肿瘤患者体重。在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段(任选地与治疗方式和/或其它治疗剂，例如PD-1轴结合拮抗剂组合)能够抑制或减小肿瘤生长(例如减小肿瘤体积)，同时不影响肿瘤患者体重。优选地，肿瘤为胃肠道肿瘤。优选地，肿瘤为癌症，例如胃肠道癌症，例如胃癌、直肠癌、结肠癌、结肠直肠癌等。在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段(任选地与PD-1轴结合拮抗剂组合)能够预防或治疗感染，例如慢性感染，包括细菌感染、真菌感染、病毒感染、原生动物感染等。
在一些实施方案中，本发明的抗GITR抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含
(i)表B所列任一抗体的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)，或
(ii)相对于(i)的序列，在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。
在一些实施方案中，本发明的抗GITR抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含：
(i)表B所列任一抗体的VL中所含的三个互补决定区域(CDR)；或
(ii)相对于(i)的序列，在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。
在一些实施方案中，本发明的抗GITR抗体或其抗原结合片段包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中
(a)所述VH包含
(i)表B所列任一抗体的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)，或
(ii)相对于(i)的序列，在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列；和/或
(b)所述VL包含：
(i)表B所列任一抗体的VL中所含的三个互补决定区域(CDR)；或
(ii)相对于(i)的序列，在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。
在优选的实施方案中，VH包含选自SEQ ID NO：17、18、19或20所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。
在优选的实施方案中，VL包含选自SEQ ID NO：21、22、23或24所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。
在优选的实施方案中，本发明抗GITR抗体或其抗原结合片段包含
(i)如SEQ ID NO：17或19所示的重链可变区的3个互补决定区HCDR，以及如SEQ IDNO：21或23所示的轻链可变区的3个互补决定区LCDR，或者
(ii)如SEQ ID NO：18或20所示的重链可变区的3个互补决定区HCDR，以及如SEQID NO：22或24所示的轻链可变区的3个互补决定区LCDR。
在一些实施方案中，本发明的抗GITR抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中
(i)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含选自SEQID NO：1、2、3或4的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR1包含与选自SEQ IDNO：1、2、3或4的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；HCDR2包含选自SEQ ID NO：5或6的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR2包含与选自SEQ ID NO：5或6的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；HCDR3包含选自SEQ ID NO：7或8的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR3包含与选自SEQ ID NO：7或8的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；
和/或
(ii)其中所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含选自SEQ ID NO：9或10的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR1包含与选自SEQ IDNO：9或10的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；LCDR2包含选自SEQ ID NO：11、12、13或14的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR2包含与选自SEQ ID NO：11、12、13或14的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；LCDR3包含选自SEQ ID NO：15或16的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR3包含与选自SEQ ID NO：15或16的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，本发明提供抗GITR抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中
(a)所述VH包含
(i)表A所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的组合；或
(ii)(i)的HCDR组合的变体，所述变体在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)；
和/或
(ii)所述VL包含
(i)表A所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的组合；或者
(ii)(i)的LCDR组合的变体，所述变体在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)。
在优选的实施方案中，本发明提供抗GITR抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述抗体或其抗原结合片段所包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的组合如下表(表A)所示：
表A：本发明抗体或其抗原结合片段中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的示例性组合
Figure BDA0002703456550000111
Figure BDA0002703456550000121
在一些实施方案中，本发明的抗GITR抗体或其抗原结合片段包含重链可变区VH和/或轻链可变区VL，其中，
(a)重链可变区VH
(i)包含与选自SEQ ID NO：17、18、19或20的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者
(ii)包含选自SEQ ID NO：17、18、19或20的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO：17、18、19或20的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中；
和/或
(b)轻链可变区VL
(i)包含与选自SEQ ID NO：21、22、23或24的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)包含选自SEQ ID NO：21、22、23或24的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO：21、22、23或24的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在优选的实施方案中，本发明提供抗GITR抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述抗体或其抗原结合片段所包含的重链可变区VH和轻链可变区VL的组合如下表(表B)所示：
表B：本发明抗体或其抗原结合片段中重链可变区VH和轻链可变区VL的示例性组合
Figure BDA0002703456550000122
在一些实施方案中，本发明的抗GITR抗体或其抗原结合片段包含重链和/或轻链，其中
(a)重链
(i)包含与选自SEQ ID NO：25、26、27或28的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)包含选自SEQ ID NO：25、26、27或28的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO：25、26、27或28的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在重链的CDR区中，更优选地，所述氨基酸改变不发生在重链可变区中；
和/或
(b)轻链
(i)包含与选自SEQ ID NO：29、30、31或32的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)包含选自SEQ ID NO：29、30、31或32的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO：29、30、31或32的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在轻链的CDR区中，更优选地，所述氨基酸改变不发生在轻链可变区中。
在优选的实施方案中，本发明提供抗GITR抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中所述抗体或其抗原结合片段所包含的重链和轻链的组合如下表(表C)所示：
表C：本发明抗体或其抗原结合片段中重链和轻链的示例性组合
Figure BDA0002703456550000131
在一些实施方案中，本发明抗GITR抗体或其片段的重链和/或轻链还包含信号肽序列，例如METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO：43)。
在本发明的一个实施方案中，本文所述的氨基酸改变包括氨基酸的置换、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换，优选地保守置换。
在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸改变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地，本发明所述的氨基酸改变发生在重链可变区外和/或轻链可变区外的区域。
在一些实施方案中，置换为保守性置换。保守置换是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸置换，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸置换，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸置换，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸置换。示例性的置换如下表D所示：
表D
原始残基 示例性置换 优选的保守氨基酸置换
Ala(A) Val、Leu、Ile Val
Arg(R) Lys、Gln、Asn Lys
Asn(N) Gln、His、Asp、Lys、Arg Gln
Asp(D) Glu、Asn Glu
Cys(C) Ser、Ala Ser
Gln(Q) Asn、Glu Asn
Glu(E) Asp、Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn、Gln、Lys、Arg Arg
Ile(I) Leu、Val、Met、Ala、Phe、正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸、Ile、Val、Met、Ala、Phe Ile
Lys(K) Arg、Gln、Asn Arg
Met(M) Leu、Phe、Ile Leu
Phe(F) Trp、Leu、Val、Ile、Ala、Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val、Ser Ser
Trp(W) Tyr、Phe Tyr
Tyr(Y) Trp、Phe、Thr、Ser Phe
Val(V) Ile、Leu、Met、Phe、Ala、正亮氨酸 Leu
在某些实施方案中，置换发生在抗体的CDR区。通常，获得的变体相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力)具有修饰(例如，改善)和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体。
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体经改变以增加或降低抗体经糖基化的程度。对抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一或多个糖基化位点而方便地实现。当抗体包含Fc区时，可以改变附着于其的糖类。在一些应用中，除去不想要的糖基化位点的修饰可以是有用的，例如除去岩藻糖模块以提高抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等(2002)JBC277：26733)。在其它应用中，可以进行半乳糖苷化修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在某些实施方案中，可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体，以便增强例如抗体治疗癌症或细胞增殖性疾病的有效性。Fc区变体可包括在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。关于Fc变体的实例参见美国专利号7,332,581，美国专利号6,737,056，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312和Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)，美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人J.Immunol.164：4178-4184(2000)，美国专利号7,371,826，Duncan&Winter,Nature 322：738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351。
在某些实施方案中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫代MAb”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基置换。可以如，例如美国专利号7,521,541中所述地生成半胱氨酸改造的抗体。
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二烷、聚-1，3，6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。
在一些实施方案中，本发明的抗GITR抗体或其抗原结合片段具有以下一个或多个特性：
(i)显示与表3所列的任一抗体对GITR相同或相似的结合亲和力和/或特异性；
(ii)抑制(例如，竞争性抑制)表3所列的任一抗体与GITR的结合；
(iii)与表3所示的任一抗体结合相同或重叠的表位；
(iv)与表3所示的任一抗体竞争结合GITR；
(v)具有表3所列的任一抗体分子的一个或多个生物学特性。
在一些实施方案中，本发明的抗GITR抗体是IgG1形式的抗体或IgG2形式的抗体或IgG4形式的抗体。
在一些实施方案中，抗GITR抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中，抗GITR抗体是人源化的。用于使抗体人源化的不同方法是技术人员已知的，如由Almagro&Fransson综述的，其内容通过提述完整并入本文(Almagro JC和Fransson J(2008)Frontiers inBioscience13：1619-1633)。
在一些实施方案中，抗GITR抗体是人抗体。可使用本领域中已知的各种技术来制备人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol 5：368-74(2001)以及Lonberg，Curr.Opin.Immunol 20：450-459(2008)。
在一些实施方案中，抗GITR抗体是嵌合抗体。
在一些实施方案中，至少部分的抗GITR抗体的框架序列是人共有框架序列。在一个实施方案中，本发明的抗GITR抗体还涵盖其抗体片段，优选地选自以下的抗体片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体(例如scFv)或(Fab’)2、单结构域抗体、双抗体(dAb)或线性抗体。
在某些实施方案中，抗GITR抗体分子处于双特异性或多特异性抗体分子形式。在一个实施方案中，双特异性抗体分子具有针对GITR的第一结合特异性和针对PD-1或PD-L1或PD-L2的第二结合特异性。在一个实施方案中，双特异性抗体分子与GITR和PD-1结合。在另一个实施方案中，双特异性抗体分子与GITR和PD-L1结合。在又一个实施方案中，双特异性抗体分子与GITR和PD-L2结合。多特异性抗体分子可以具有任何针对前述分子的结合特异性的组合。多特异性抗体分子例如可以是三特异性抗体分子，其包含针对GITR的第一结合特异性和针对以下一种或多种的分子的第二及第三结合特异性：PD-1、PD-L1或PD-L2。
II.本发明的核酸以及包含其的宿主细胞
在一方面，本发明提供了编码以上任何抗GITR抗体或其片段的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。
在一方面，本发明提供了编码以上任何抗GITR抗体或其片段的核酸。所述核酸可以包含编码抗体的轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列的核酸，或包含编码抗体的轻链和/或重链的氨基酸序列的核酸。示例性的编码抗体重链可变区的核酸序列包含与选自SEQ ID NO：33、34、35或36的核酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸序列，或者包含选自SEQ ID NO：33、34、35或36的核酸序列。示例性的编码抗体轻链可变区的核酸序列包含与选自SEQ ID NO：37、38、39或40的核酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸序列，或者包含选自SEQ ID NO：37、38、39或40的核酸序列。
在一个实施方案中，提供包含所述核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。在一个实施方案中，载体是pTT5载体。
在一个实施方案中，提供包含所述载体的宿主细胞。用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，特别当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见，例如，美国专利号5,648,237，5,789,199和5,840,523，还见Charlton，Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，编辑，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，抗体可以从可溶级分中的细菌细胞糊状物分离，并且可以进一步纯化。
在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。例如，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是关于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。例如，糖基化途径已经进行“人源化”的真菌和酵母菌株导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)，和Li等，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293HEK或293F或293细胞，如例如Graham等，J.Gen Viro1.36：59(1977)中所描述的)等。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：216(1980)、CHO-S细胞等；以及骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2/0。关于适合产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述见例如Yazaki和Wu，Methodsin Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，ed.，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
在一个实施方案中，本发明提供制备抗GITR抗体或其片段(优选的抗原结合片段)的方法，其中所述方法包括在适于表达编码所述抗体或其片段(优选的抗原结合片段)的核酸的条件下培养所述宿主细胞，以及任选地分离所述抗体或其片段(优选地抗原结合片段)。在某个实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞回收抗GITR抗体或其片段(优选地抗原结合片段)。
在一个实施方案中，提供了制备抗GITR抗体的方法，其中所述方法包括，在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。为了重组产生抗GITR抗体，分离编码抗体(例如上文所描述的抗体)的核酸，并将其插入一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针进行)。
III.测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗GITR抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，Western印迹，等来进行。可使用本领域已知方法来测定对GITR的结合，本文中公开了例示性方法。在一些实施方案中，使用生物光干涉测定法(例如Fortebio亲和测量)或MSD测定法。
另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与本文中公开的任何抗GITR抗体竞争对GITR的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与本文中公开的任何抗GITR抗体所结合表位相同或重叠的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法见Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”，Methods in MolecularBiology vol.66(Humana Press，Totowa，NJ)。
本发明还提供了用于鉴定具有生物学活性的抗GITR抗体的测定法。生物学活性可以包括例如结合GITR(例如结合人和/或食蟹猴GITR)，提高GITR介导的信号转导(例如提高NFkappa-B信号通路)，通过ADCC消减表达GITR的细胞(例如Treg细胞)，增强T效应细胞功能(例如CD4效应T细胞)(例如通过提高效应T细胞的细胞因子生成(例如干扰素如IFN-γ或白细胞介素如IL2))。还提供在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。
在某些实施方案中，对本发明的抗体测试此类生物学活性。
可以使用本领域已知的方法来测定T细胞活化。例如，通过T细胞活化后释放的细胞因子，例如干扰素(如IFN-γ)或白细胞介素(例如IL2)的水平来测定。还可以使用本领域公知的方法来测定GITR信号传导(例如NF-kappaB信号通路)，从而测定T细胞的活化。在一个实施方案中，生成表达人GITR和报告基因(包含融合至报告基因(例如β荧光素酶)的NF-kappa B启动子)的转基因细胞。对细胞添加抗GITR抗体导致NF-kappa B转录升高，这使用针对报告基因的测定法(例如荧光素酶报告基因测定法)来检测。
可以使用本领域已知的方法来测定抗体的ADCC效应。例如通过NF-AT信号激活。在一个实施方案中，获得ADCC效应细胞(包含融合至报告基因(例如β荧光素酶)的NF-AT启动子)的转基因细胞。对效应细胞与高表达GITR的细胞进行共培养，同时添加抗GITR抗体导致效应细胞NF-AT转录升高，这使用针对报告基因的测定法(例如荧光素酶报告基因测定法)来检测。
供任何上述体外测定法使用的细胞包括天然表达GITR或经改造而表达GITR细胞系。此类细胞包括天然表达GITR的T细胞，Treg细胞和活化后的记忆T细胞。此类细胞还包括表达GITR和并非正常情况下表达GITR的编码GITR DNA转染的细胞系。
可以理解的是，能够使用本发明的免疫缀合物替换或补充抗GITR抗体来进行任何上述测定法。
可以理解的是，能够使用抗GITR抗体和别的活性剂来进行任何上述测定法。
IV.免疫缀合物
在一些实施方案中，本发明提供了免疫缀合物，其包含本文中提供的任何抗GITR抗体和其它物质，例如细胞毒性剂。在一些实施方案中，其它物质例如治疗剂，如细胞毒性剂或免疫抑制剂或化疗剂。细胞毒性剂包括任何对细胞有害的药剂。适合于形成免疫缀合物的细胞毒性剂(例如化疗剂)的例子是本领域中已知的。例如，细胞毒性剂包括但不限于：放射性同位素；生长抑制剂；酶及其片段如核酸水解酶；抗生素；毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；和已知的各种抗肿瘤或抗癌剂。
在一些实施方案中，所述免疫缀合物用于预防或治疗肿瘤，例如胃肠道肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤为癌症，例如胃肠道癌症，例如胃癌、直肠癌、结肠癌、结肠直肠癌等。在一些实施方案中，所述免疫缀合物用于预防或治疗感染，例如慢性感染，例如细菌感染、病毒感染、真菌感染、原生动物感染等。
V.药物组合物和药物制剂
在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的任何抗GITR抗体或其片段(优选地其抗原结合片段)或其免疫缀合物的组合物，优选地组合物为药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含药用辅料。在一个实施方案中，组合物，例如，药物组合物，包含本发明的抗GITR抗体或其片段或其免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂(例如化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂，优选地PD-1轴结合拮抗剂，例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体)的组合。
在一些实施方案中，所述组合物用于预防或治疗肿瘤，例如胃肠道肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤为癌症，例如胃肠道癌症，例如胃癌、直肠癌、结肠癌、结肠直肠癌等。在一些实施方案中，所述组合物用于预防或治疗感染，例如慢性感染，例如细菌感染、病毒感染、真菌感染、原生动物感染等。
本发明还包括包含抗GITR抗体或其免疫缀合物的组合物(包括药物组合物或药物制剂)和包含编码抗GITR抗体的多核苷酸的组合物(包括药物组合物或药物制剂)。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种结合GITR的抗体或其片段或一种或多种编码一种或多种结合GITR的抗体或其片段的多核苷酸。这些组合物还可以包含合适的药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。
适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些具有石油、动物、植物或合成起源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“Handbook of PharmaceuticalExcipients”，第五版，R.C.Rowe，P.J.Seskey和S.C.Owen，PharmaceuticalPress，London，Chicago。若期望的话，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放配制剂等的形式。口服配制剂可以包含标准载体，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。
可以通过将具有所需纯度的本发明的抗GITR抗体与一种或多种任选的药用辅料(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备包含本文所述的抗GITR抗体的药物制剂，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。
示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本发明的药物组合物或制剂还可以包含一种或多种其它活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它抗癌活性成分，例如化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂，例如PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体)等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
关于包含本发明抗体的药物制剂/药物组合物的其它组分，还可以参见WO2015/031667或WO2015/187835等中公开的那些。
VI.组合产品
在一些实施方案中，本发明还提供了组合产品，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段，或其免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂(例如化疗剂、其他抗体、细胞毒性剂、疫苗、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂等)。在一些实施方案中，其它抗体例如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体。
在一些实施方案中，所述组合产品用于预防或治疗肿瘤，例如胃肠道肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤为癌症，例如胃肠道癌症，例如胃癌、直肠癌、结肠癌、结肠直肠癌等。在一些实施方案中，所述组合产品用于预防或治疗感染，例如慢性感染，例如细菌感染、病毒感染、真菌感染、原生动物感染等。
VII.用途
本发明一方面提供了在受试者中激活NF-KappaB信号通路的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的抗GITR的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物、药物组合物或组合产品。
本发明还一方面提供了在受试者中提高效应T细胞功能，例如激活效应T细胞的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的抗GITR的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物、药物组合物或组合产品。在一些实施方案中，所述功能是效应T细胞增殖增强。在一些实施方案中，所述激活T细胞表现为干扰素或白细胞介素分泌/表达增加。在一些实施方案中，白细胞介素是IL2。在一些实施方案中，干扰素是IFN-γ。
本发明还一方面提供给了在受试者中介导ADCC而消除调节T细胞的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的抗GITR的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物、药物组合物或组合产品。在一些实施方案中，所述调节T细胞是Treg细胞。
本发明一方面还提供了在受试者中预防或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗GITR抗体或其片段、免疫缀合物、药物组合物或组合产品。
本发明一方面还提供了在受试者中预防或治疗感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗GITR抗体或其片段、免疫缀合物、药物组合物或组合产品。
本发明还提供了在受试者中预防或治疗与Treg增殖有关的其它病状或病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗GITR抗体或其片段、免疫缀合物、药物组合物或组合产品。
受试者可以是哺乳动物，例如，灵长类，优选地，高级灵长类，例如，人类(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的风险的患者)。在一个实施方案中，受试者患有本文所述疾病(例如，如本文所述的肿瘤或感染性疾病)或具有患有本文所述疾病的风险。在某些实施方案中，受试者接受或已经接受过其它治疗，例如化疗治疗和/或放射疗法。备选地或组合下，受试者因感染而免疫受损或具有因感染而免疫受损的风险。
在一些实施方案中，本文所述的肿瘤，例如癌症，包括但不限于实体瘤、血液学癌、软组织肿瘤和转移性病灶。在一些实施方案中，本文所述的用于治疗的癌症包括但乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、宫颈癌、脑癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌或胃癌等实体瘤，以及血癌例如白血病和淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症为胃肠道癌症，例如胃癌、直肠癌、结肠癌、结肠直肠癌等。
可以使用本文所述的抗体分子实现对转移性癌(例如，表达GITR或PD1的转移性癌)的治疗。
在一个实施方案中，肿瘤是表达升高水平的GITR和/或PD1的癌症。
在一些实施方案中，本文所述的癌症是结肠癌及其转移性癌症。
在一些实施方案中，所述感染是急性的或慢性的。在一些实施方案中，所述慢性感染是持续性的感染、潜伏的感染或缓慢感染。在一些实施方案中，所述慢性感染是由选自细菌、病毒、真菌和原生动物的病原体导致的。
在其他方面，本发明提供抗GITR抗体或其片段在生产或制备药物中的用途，所述药物用于治疗本文提及的相关疾病或病症。
在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段或免疫缀合物或组合物或产品会延迟病症和/或与病症相关的症状的发作。
在一些实施方案中，本文所述的预防或治疗方法还包括向所述受试者或个体组合施用本文公开的抗体分子或药物组合物或免疫缀合物，以及一种或多种其它疗法，例如治疗方式和/或其它治疗剂。
在一些实施方案中，治疗方式包括外科手术(例如肿瘤切除术)；放射疗法(例如，外粒子束疗法，它涉及其中设计照射区域的三维适形放射疗法)、局部照射(例如，指向预选靶或器官的照射)或聚焦照射)等。
在一些实施方案中，治疗剂选自化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂。
示例性的疫苗包括但不限于癌症疫苗。疫苗可以是基于DNA的疫苗、基于RNA的疫苗或基于病毒转导的疫苗。癌症疫苗可以是预防性的或治疗性的。
示例性的抗感染活性剂包括但不限于，抗病毒剂、抗真菌剂、抗原生动物剂、抗菌剂，例如核苷类似物齐多夫定(AST)、更昔洛韦、膦甲酸或cidovir，如上文所述。
示例性的其它抗体包括但不限于抗PD-1抗体、抗PDL1抗体或抗PDL2抗体。本领域已知多种抗PD-1抗体、抗PDL1抗体或抗PDL2抗体，参见例如WO2007/005874、WO2009/101611、WO2009/114335、WO2010/027827和WO2011/066342等。
在一些实施方案中，本文中描述的抗体组合可以分别施用，例如，作为单独的抗体分别施用，或连接时(例如作为双特异性或三特异性抗体分子)施用。
更多的可以与抗GITR抗体或其片段组合的疗法或治疗剂可以参见WO2015/031667。
此类组合疗法涵盖组合施用(例如两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的治疗剂和/或药剂之前，同时，和/或之后发生本发明的抗体的施用。在一个实施方案中，抗GITR抗体的施用和别的治疗剂的施用彼此在约一个月内，或约一，两或三周内，或约1，2，3，4，5，或6天内发生。
待采用的含抗GITR抗体的药物组合物的治疗有效量将例如取决于治疗背景和目标。本领域技术人员将理解用于治疗的适当剂量水平将部分地根据以下因素而变化：递送的分子、所针对使用的适应症、施用途径、以及患者的体重、身体表面积或器官大小和/或情况(年龄和一般健康状态)。在某些实施方案中，临床医师可滴定剂量并且更改施用途径以获得最佳治疗效果。
给药频率将取决于在所用制剂中的具体抗GITR抗体的药代动力学参数。通常，临床医师施用组合物直到达到获得预期效果的剂量。本发明的抗体因此可以单一剂量施用，或者在一定时间内以两次或更多次剂量(其可包含相同或不同量的所需分子)施用，或者通过植入装置或导管连续输注施用。适当的剂量可通过使用适当的剂量反应数据确定。在某些实施方案中，可在延长的时间期限内向患者施用抗体。在某些实施方案中，抗体是每两周、每月、每两个月、每三个月、每四个月、每五个月或每六个月给药。
药物组合物的施用途径是根据已知方法，例如，经口、通过静脉内注射、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门脉内或病灶内途径；通过持续释放系统或通过植入装置。在某些实施方案中，组合物可通过弹丸注射或通过连续输注或通过植入装置施用。
组合物还可经由植入膜、海绵或其上吸收或胶囊包封所需分子的另一种适当的材料被局部施用。在某些实施方案中，当使用植入装置时，所述装置可被植入到任何合适的组织或器官中，并且可经由扩散、定时释放的大丸剂、或连续施用递送所需分子。
可以理解的是，能够使用本发明的免疫缀合物替换或补充抗GITR抗体来进行任何治疗。
VIII.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文中提供的任何抗GITR抗体或其抗原结合片段可以用于检测GITR在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测，示例性的检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如，FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测定法、PCR-技术(例如，RT-PCR)。在某些实施方案中，生物样品是血、血清或生物来源的其他液体样品。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。在一些实施方案中，生物样品来自过度增生性或癌性病灶。
在一个实施方案中，提供用于诊断或检测方法的抗GITR抗体。在另一个方面中，提供检测GITR在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，方法包含检测GITR蛋白在生物样品中的存在。在某些实施方案中，GITR是人GITR。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的抗GITR抗体在允许抗GITR抗体与GITR结合的条件下接触，并检测在抗GITR抗体和GITR之间是否形成复合物。复合物的形成表示存在GITR。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗GITR抗体被用于选择适合利用抗GITR抗体的治疗的受试者，例如其中GITR是用于选择所述受试者的生物标记物。
在一个实施方案中，可以使用本发明抗体诊断癌症或肿瘤，例如评价(例如，监测)对象中本文所述疾病(例如，癌症或肿瘤)的治疗或进展、其诊断和/或分期。在某些实施方案中，提供标记的抗GITR抗体。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。示例性标记包括但不限于，放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰(dansyl)，伞形酮(umbelliferone)，荧光素酶(luceriferase)，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HR)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶解酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，以及利用过氧化氢氧化染料前体的酶如HR，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶(microperoxidase)，生物素/亲和素，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。
在本文中提供的任何发明的一些实施方案中，样品是在用抗GITR抗体治疗之前获得的。在一些实施方案中，样品是在用癌症药物治疗之前获得的。在一些实施方案中，样品是在癌症已经转移之后获得的。在一些实施方案中，样品是福尔马林固定、石蜡包膜(FFPE)的。在一些实施方案中，样品是活检(例如芯活检)，手术标本(例如来自手术切除的标本)，或细针吸出物。
在一些实施方案中，在治疗之前，例如，在起始治疗之前或在治疗间隔后的某次治疗之前检测GITR。
在一些实施方案中，提供了一种治疗肿瘤或感染的方法，所述方法包括：对受试者(例如，样品)(例如，包含癌细胞的受试者样品)检验GITR的存在，因而确定GITR值，将GITR值与对照值比较，并且如果GITR值大于对照值，则向受试者施用治疗有效量的任选与一种或多种其他疗法组合的抗GITR抗体(例如，本文所述的抗GITR抗体)，因而治疗肿瘤或感染。
IX本发明的示例性抗GITR抗体
Figure BDA0002703456550000231
Figure BDA0002703456550000241
本发明的这些以及其它方面和实施方案在附图(附图简述紧随其后)和以下的发明详述中得到描述并且示例于以下实施例中。上文以及整个本申请中所论述的任何或所有特征可以在本发明的各种实施方案中组合。以下实施例进一步说明本发明，然而，应理解实施例以说明而非限定的方式来描述，并且本领域技术人员可以进行多种修改。
实施例
实施例1.杂交瘤细胞的制备
杂交瘤技术是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞(B淋巴细胞)的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。本实验通过人GITR蛋白免疫小鼠，再获取小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，获得能够表达阳性抗体的杂交瘤细胞。
杂交瘤融合
实验动物及免疫信息
Figure BDA0002703456550000251
电融合皿准备：用70％乙醇彻底浸泡电融合皿，并于超净台中吹干备用。
分离脾细胞：颈脱位将小鼠处死，用75％酒精消毒体表5min，随即放入超净台内小鼠解剖板上，左侧卧位，用7号针头固定四肢。无菌打开腹腔取出脾脏，用基础培养基(配置方法如下表)洗涤，并仔细去掉周围附着的结缔组织。随后将脾脏转移到另一个盛有基础培养基的平皿中。以弯头针头压住脾脏，用小针头在脾脏上插孔，并用镊子挤压，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液。细胞悬液经70μM细胞筛网过滤后用30ml基础培养基洗一遍，1200rpm离心6min。
Figure BDA0002703456550000252
裂解红细胞：去除上清，用10ml RBC裂解缓冲液(GIBCO)重悬细胞。然后再加入20ml RBC裂解缓冲液。悬液静置5min后1100rpm离心6min。去上清后用10ml基础培养基重悬细胞，然后再加入30ml基础培养基，1100rpm离心6min。去除上清后，细胞重悬于20ml基础培养基中并计数。
电融合：用20ml基础培养基重悬小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞(ATCC)并计数。将SP2/0和脾细胞以1∶2～1∶1的比例混合，1000rpm离心6min。去除上清后将混合的细胞重悬于10ml融合缓冲液(BTXpress)中。再加入15ml融合缓冲液，1000rpm离心5min，去除上清。重复上述步骤一遍后，用适量融合缓冲液重选细胞，调整混合细胞密度至1×107个细胞/ml。电融合仪的参数设置如下。每个电融合皿中加入2ml细胞悬液进行电融合。
Condition Mouse(SP2/0-ECF-F)
Alignment： 60v，30sec
Membrane breaking： 1500V，30μs，3X
Post-fusion pulse： 60V，3sec
电融合后铺板：细胞于电融合皿中室温静置5min。将细胞转移入离心管中，用筛选培养基(配置方法如下表)稀释细胞至1～2×104个细胞/ml。96孔板中每孔加入100μl细胞悬液。融合后第7天更换筛选培养基。培养第10天(或更久，根据细胞生长状态)后进行筛选。通过FACS(C6(BD Biosciences))检测筛选出表达特异性抗GITR抗体的杂交瘤细胞。
Figure BDA0002703456550000261
阳性杂交瘤细胞亚克隆
亚克隆步骤：准备一块96孔板，第2至第8列每孔加入200μl如上所述的基础培养基。将上述融合筛选出的阳性孔的细胞制成细胞悬液并加入第1列。将第1列细胞悬液取100μl加入第2列，充分混匀后取100μl加入下一列。重复上述步骤，直至最后一列体积变为300μl；静置96孔板15min，显微镜下观察计数。取100个细胞对应的体积加入20ml如上所述的基础培养基中，并混匀铺板，每孔200μl。一周后显微镜下观察，判断并标记出单克隆孔，待测挑出阳性孔。
细胞冻存：观察细胞状态，等细胞生长良好，活力＞90％时，1000rpm离心5min，去除上清。用冻存液(45.5％FBS，44.5％RPMI-1640，10％DMSO)重悬细胞至1×107个细胞/ml，分装至冻存管，放入程序降温盒中，-80℃冻存。
实施例2.嵌合抗体的生产和纯化
本发明利用分子生物学技术，获得抗GITR阳性杂交瘤细胞中的抗体序列，并利用其构建人鼠嵌合抗体。
杂交瘤测序
RNA抽提：新鲜细胞，300g离心5min，去除上清，沉淀中加入500μl LY缓冲液(Biomiga)(在使用前每1ml加入20μlβ巯基乙醇)，混匀至澄清。加入到DNA去除管中，13000rpm离心2min，收集流穿液。按1/2的比例向流穿液中加入100％乙醇，混匀5次至澄清。将澄清的溶液加入到RNA收集管中，13000rpm离心1min去除液体，加入500μl RB(RecoveryBuffer，回收缓冲液)(Takara)，13000rpm离心30s，再加入500μl RNA洗涤缓冲液(Biomiga)(用之前加入乙醇)，离心30s，重复一遍上述过程后，离心彻底挥发去除乙醇后，向收集柱中加入30μl DEPC水，12000g离心2min，收集洗脱液。测定RNA浓度。
利用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)反转录获得cDNA：
配置反应体系I如下：
Figure BDA0002703456550000271
65℃温育5min后，迅速置冰上冷却。向反应体系I中加入下列反转录体系，总量为20μl：
Figure BDA0002703456550000272
缓慢混匀后按下列条件进行反转录翻译：42℃60min→95℃5min，然后放冰上冷却，获得cDNA。
将cDNA连接T载体：
PCR分别扩增重链和轻链可变区，PCR反应体系如下：
Figure BDA0002703456550000273
PCR反应条件如下：
Figure BDA0002703456550000274
取4.5μl上述PCR反应获得的PCR产物，加入0.5μl pMD20-T载体(Clontech)，5μlLigation Mighty Mix(Takara)，轻轻混匀，于37℃反应2h，获得连接产物。
表6.小鼠抗GITR抗体的重链可变区(VH)引物(Primer Mix 1)
Figure BDA0002703456550000275
Figure BDA0002703456550000281
表7.小鼠抗GITR抗体的轻链可变区(VL)引物(Primer Mix 2)：
Figure BDA0002703456550000282
转化细胞：
-80℃取出TOP10感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司)，冰上融化，取上述获得的连接产物5μl加入到融化的TOP10感受态细胞中，混匀后冰上孵育30min。42℃热激90s后迅速冰上冷却2min，向EP管中补加900μl LB培养基(生工生物工程(上海)股份有限公司)，37℃，220rpm摇床培养1h。3000g离心2min，吸除800μl上清，用剩余的培养基将菌体重悬并涂布在氨苄青霉素抗性的平板上。于37℃培养过夜，挑克隆测序。
构建嵌合抗体
PCR扩增已经测序的实施例1中杂交瘤产生的鼠抗GITR抗体VH及VL区
PCR体系如下：
Figure BDA0002703456550000283
Figure BDA0002703456550000291
*对于VH扩增，应用Primer Mix 1，对于VL扩增，应用Primer Mix 2；
^为上述测序正确的pMD20-T质粒
切胶回收PCR扩增产物。
同源重组反应：
同源重组体系如下：
Figure BDA0002703456550000292
37℃反应30min，获得重组产物。重组产物转化TOP10感受态细胞，并挑取单克隆测序，选择包含插入方向正确的质粒的克隆作为阳性克隆，保存阳性克隆。
嵌合抗体的表达和纯化
从上文获得的阳性克隆中提取包含抗GITR抗体的质粒。
根据所需转染体积传代293F细胞(Invitrogen)，转染前一天将细胞密度调整至1.5×106个细胞/ml。转染当天细胞密度约为3×106个细胞/ml。取终体积1/10的F17培养基(Gibco，A13835-01)作为转染缓冲液，加入适当的质粒，混匀。加合适的聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences，23966)到质粒中(质粒与PEI的比例在293F细胞中为1∶3)，混匀后室温孵育10min，获得DNA/PEI混合物。用DNA/PEI混合物重悬细胞后，36.5℃，8％的CO2。24h后补加转染体积2％的FEED(Sigma)，于36.5℃，120rpm，8％的CO2条件下培养。连续培养至第6天或者细胞活力≤60％时，收集细胞上清进行纯化。
将纯化使用的重力柱使用0.5M NaOH过夜处理，玻璃瓶等用蒸馏水洗净后在180℃干烤4h，获得纯化柱。纯化前将收集的培养基4500rpm离心30min，弃掉细胞。再将上清使用0.22μl的滤器过滤。每管装填1ml Protein A，并使用10ml结合缓冲液(磷酸钠20mM.NaCl150mM，PH7.0)平衡。将过滤后的上清加入纯化柱后使用15ml结合缓冲液再平衡。加5ml洗脱缓冲液(柠檬酸+柠檬酸钠0.1M，PH3.5)，收集洗脱液，每1ml的洗脱液加入80μl Tris-HCl。将收集的抗体超滤浓缩交换到PBS(Gibco，70011-044)中，并检测浓度。
本发明获得的2个嵌合抗体(CH22F4和CH37G5)的CDR、轻链可变区和重链可变区，轻链和重链的氨基酸序列，以及序列编号请参见上表1-3。
本发明所用的对照抗体为专利申请US20130183321A1(GITR，INC.(Cambridge，MA，US))中报道的GITR抗体，其轻链和重链序列在US20130183321A1中分别为SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：54，下文中将其简称为TRX518。
实施例3生物膜薄层干涉技术测定本发明的嵌合抗体与抗原的结合动力学
采用生物膜薄层干涉测定技术(ForteBio)测定本发明抗体结合人GITR的平衡解离常数(KD)。ForteBio亲和力测定按照现有的方法(Estep，P等人，High throughputsolution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitopebinning.MAbs，2013.5(2)：第270-8页)进行。
实验开始前半个小时，根据样品数量，取合适数量的AMQ(Pall，1506091)(用于样品检测)或AHQ(Pall，1502051)(用于阳性对照检测)传感器浸泡于SD buffer(PBS 1×，BSA0.1％，Tween-20 0.05％)中。
取100μl的SD缓冲液、抗体(CH22F4、CH37G5和TRX518)、抗原(包括人GITR、及食蟹猴GITR，均自Acrobiosystems购买)分别加入到96孔黑色聚苯乙烯半量微孔板(Greiner，675076)中。根据样品位置布板，选择传感器位置。仪器设置参数如下：运行步骤：Baseline、Loading～1nm、Baseline、Association和Dissociation；各个步骤运行时间取决于样品结合和解离速度，转速为400rpm，温度为30℃。使用ForteBio分析软件分析KD值。
在以上测定法所述的实验中，抗体CH22F4、CH37G5的亲和力如表8所示：
表8.ForteBio检测抗原抗体结合的亲和力常数(平衡解离常数)
Figure BDA0002703456550000301
在以上试验中，嵌合抗体CH22F4、CH37G5的KD值分别为1.96E-09M、2.04E-09M，与对照组的TRX518相比，本研究中的抗体具有更优的KD值。
实施例4嵌合抗体和过表达人GITR的CHO-S细胞的结合实验
本研究利用流式细胞仪检测了梯度稀释的本发明的嵌合抗体与表面过表达人GITR的CHO-S稳定细胞株的结合情况。
将编码人GITR(SEQ ID NO：41)的cDNA克隆到pCHO1.0载体(Invitrogen)中，将获得的质粒转染到CHO-S细胞(Invitrogen，ExpiCHOTM Expression System Kit，货号：A29133)，产生过表达人GITR的CHO-S细胞(CHO-hGITR)。
将CHO-hGITR细胞计数，并稀释至2×106个细胞/ml，向U型底96孔板中加入100μl/孔。400g离心5min，去除细胞培养基。将样品(分别是嵌合抗体CH22F4、CH37G5，以及TRX518)(抗体稀释方法为：最高抗体浓度为400nM，三倍稀释在PBS中，总共测试了12个浓度)加入U型板并重悬细胞，100μl/孔，冰上静置30min。400g离心5min去除上清，PBS洗细胞1遍。400g离心5min去除PBS，每孔加入100μl抗人Fc的PE标记的二抗(SoutherBiotech；2040-09)(1∶200稀释于PBS中)，在冰上避光孵育30min。400g离心5min去除上清，PBS洗细胞1遍。用80μl1×PBS重悬细胞，FACS检测。
在以上测定法所述的实验中，抗体CH22F4、CH37G5和CHO-hGITR细胞的结合情况如图1所示。
在以上试验中，抗体CH22F4、CH37G5均结合CHO-S细胞上过表达的人GITR分子，EC50分别为0.4568nM、0.9069nM，与TRX518相比，结合能力相似。
实施例5嵌合抗体的人源化
将实施例2得到的嵌合抗体进行人源化。并经过以下步骤进行人源化：
①确定CDR环结构；
②在人种系序列数据库为重链和轻链的每个V/J区域找到最接近的同源序列；
③筛选与重链轻链最匹配的人种系以及最低量的回复突变；
④将嵌合抗体的CDR区构建至人的骨架区上；
⑤使用序列和结构特征，确定骨架区中起到维持CDR功能的氨基酸位置；
⑥在确定为重要的序列位置进行回复突变(返回到输入氨基酸类型)；
⑦优化风险位点的氨基酸。
本发明获得的2个人源化抗体(HZ22F4和HZ37G5)的CDR、轻链可变区和重链可变区，轻链和重链的氨基酸序列请参见如上文所述的表1-3。
实施例6 ForteBio测定人源化抗体与抗原的结合动力学
采用ForteBio测定法测定本发明的人源化抗体结合人GITR的平衡解离常数(KD)。ForteBio亲和力测定方法同实施例3，例外是使用的抗体是人源化抗体HZ22F4和HZ37G5。在以上测定法所述的实验中，抗体HZ22F4和HZ37G5的亲和力如表9所示：
表9.ForteBio检测抗原抗体结合的亲和力常数
Figure BDA0002703456550000311
在以上试验中，本文所述的人源化抗体HZ22F4、HZ37G5的KD值分别为4.58E-09M、4.83E-09M，与对照抗体相比，本研究中的人源化抗体具有更优的KD值。
实施例7人源化抗体和过表达人GITR的CHO-S细胞的结合实验
本研究利用流式细胞仪检测了梯度稀释的本发明的人源化抗体与CHO-hGITR细胞的结合情况。试验方法同实施例4，例外是使用的抗体是人源化抗体HZ22F4和HZ37G5。结合情况如图2所示。
在以上试验中，人源化抗体HZ22F4、HZ37G5结合CHO-S细胞上过表达的人GITR，EC50分别为0.5492nM、1.974nM，与TRX518相比，具有相似或更优的EC50数值，即相似或更优的结合能力。
实施例8人源化抗体和过表达食蟹猴GITR的细胞的结合实验
本研究利用流式细胞仪检测了梯度稀释的本发明的人源化抗体与表面过表达食蟹猴GITR的CHO-S稳定细胞株的结合情况。
将编码食蟹猴GITR(SEQ ID NO：42)的cDNA克隆到pCHO1.0载体(Invitrogen)上，将质粒转染到CHO-S细胞(Invitrogen，ExpiCHOTM Expression System Kit，货号：A29133)，产生过表达食蟹猴GITR的CHO-S细胞(CHO-cynoGITR)。其余部分试验方法同实施例4，例外是使用的抗体是人源化抗体HZ22F4和HZ37G5，结合情况如图3所示。
在以上试验中，人源化抗体HZ22F4、HZ37G5结合CHO-S细胞上过表达的食蟹猴GITR，EC50分别为0.3533nM、0.9931nM，与TRX518相比，具有相似或更优的结合能力。
实施例9MOA方法检测抗体的生物学活性
针对GITR的激活性抗体可以与细胞表面GITR分子结合激活下游NF-kappa B信号通路。本研究使用内部构建的Hela-GITR-NF kappa B luciferase(以下简称Hela-GITR)的检测细胞株，通过检测荧光报告基因的表达反应出NF-kappa B信号的激活情况，从而检测本发明抗体的激活作用。
Hela-GITR-NF kappa B luciferase细胞株的构建
将编码人GITR(序列见SEQ ID NO：41)的cDNA克隆到pCHO1.0载体(Invitrogen)上，将获得的质粒和NF-kappaB luciferace报告基因质粒(Promega)共转染到Hela细胞(ATCC，货号：CCL-2TM)，产生过表达人GITR同时带有NF-kappaB luciferace报告基因系统的Hela细胞(Hela-GITR)。
取对数生长期的Hela-GITR细胞，弃培养上清，PBS(Gibco)洗一遍细胞。加入适量Trypsin(Gibco)于37℃、5％CO2消化2min。加入4倍Trypsin体积的含10％FBS的DMEM培养基(ATCC)，转移细胞至50ml离心管并计数，400g，离心5min。加入DMEM培养基(ATCC)，重悬细胞至1×105个细胞/mL。将细胞加入96孔白色细胞培养板(Nunclon)，50μl/孔。同时每孔加入50μl样品(本发明制备的人源化抗体HZ22F4、HZ37G5)及阳性对照TRX518)，(抗体稀释方法为：最高抗体浓度为80nM，三倍稀释在测定缓冲液(2％FBS DMEM培养基)中，总共测试了10个浓度)。于37℃/5％CO2培养箱中培养6小时。
检测：提前将Bio-GloTM缓冲液(promega)融化，加入Bio-GloTM底物(promega)，混匀，获得Bio-GloTM试剂。向如上所述培养了6个小时的细胞中加入Bio-GloTM试剂，100μl/孔。立即读数。
在以上试验中，实验结果如图4所示，抗体HZ22F4、HZ37G5均可以有效激活NFkappa B信号通路，EC50分别为0.3394nM、0.3208nM、与TRX518(1.139nM)相比，具有显著更优的激活能力。
实施例10 CD4 T激活细胞实验
本研究将抗体和激活过的CD4 T细胞共同孵育，通过检测体系中IL-2和IFN-γ的相对表达量，从而反应出不同抗体对CD4 T细胞的激活作用。
PBMC分离：取捐赠者新鲜血液50ml，添加2.5倍PBS，轻轻加入到FiColl(Thermo)，分4管，400g离心30min，升速度为7，减速度为0。离心结束，轻轻取出离心管，吸取中间白色云雾状细胞群至PBS中，PBS洗2次。
CD4+T细胞分离：取如上所述分离的PBMC细胞，按照EasySep Human CD4+ T CellEnrichment Kit(stem cell)说明书分离富集CD4+ T细胞，并使用T细胞培养基(配方见下表)重悬。
Figure BDA0002703456550000321
CD4+ T细胞激活：取上述分离获得的CD4+ T细胞，并用T细胞培养基调整细胞密度为1*106/ml，按照细胞：beads(1∶1)加入Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Invitrogen)，于37℃，5％CO2培养箱中培养一周。
T细胞激活实验：取Nunc 96孔平底板(Nunclon)，100μl/孔加入PBS稀释的0.25μg/ml的Purified NA/LE Mouse抗人CD3 Clone UCHT1(BD Biosciences)，37℃包被2小时，去除包被液。将上述激活一周的CD4+ T细胞去除beads，用T细胞培养基清洗两次，并将细胞密度调整为1*106/ml，每孔体积100μl细胞悬液加入上述96孔平底板中，，同时加入本发明的抗体(HZ22F4，HZ37G5)以及TRX518 100μl(抗体稀释方法为：最高抗体浓度为400nM，三倍稀释在T细胞培养基中，总共测试了10个浓度)以及Purified NA/LE Mouse抗人CD28 CloneCD28(BD Biosciences)(终浓度为2μg/ml)，培养3和5天，分别用Human IL-2 Kit 1000Test和Human IFN gamma 1000 test试剂盒(均购自cisbio)检测IL-2和IFN-γ的相对表达量(以DeltaF％计)。
实验结果如表10和11及图5、6所示。本发明的抗体均可以在体外有效激活CD4+T细胞。其中表中的数据单位为DeltaF％平均值。
表10.IL2的相对表达量(DeltaF％平均值)
Figure BDA0002703456550000331
表11.IFN-γ的相对表达量(DeltaF％平均值)
Figure BDA0002703456550000332
实施例11 ADCC效应实验
针对GITR的IgG1亚型抗体可以与Treg表面高表达的GITR分子结合，进而介导ADCC效应清除Treg。本研究使用Promega的Jurkat-ADCCNF-AT luciferase效应细胞株(以下简称ADCC效应细胞)作为检测细胞株与作为靶细胞的CHO-hGITR细胞(如上所述)和本发明的抗体共孵育，通过检测荧光报告基因的表达反应出NF-AT信号的激活情况，从而检测抗体的ADCC活性。
取对数生长期的ADCC效应细胞(根据Promega公司说明培养)，离心去上清，PBS洗2遍，用检测培养基(5％low IgG血清的1640培养基(Gibco))重悬调整细胞密度为2*107/ml，取如上所述制备并孵育的CHO-hGITR靶细胞，离心去上清，用检测培养基重悬调整细胞密度为2*106/ml，将上述细胞按1∶1比例混合，并加入到96孔白色细胞培养板(Nunclon)，50μl/孔。同时每孔加入50μl样品(本发明制备的人源化抗体HZ22F4、HZ37G5)及阳性对照抗体(TRX518)，(抗体稀释方法为：最高抗体终浓度为66.66nM，三倍稀释在检测培养基中，总共测试了12个浓度)。于37℃/5％CO2培养箱中培养12小时。
检测：提前将Bio-GloTM缓冲液(promega)融化，加入Bio-GloTM底物(promega)，混匀，得到Bio-GloTM试剂。向如上所述培养了12个小时的细胞中加入Bio-GloTM试剂，100μl/孔。立即读数。
在以上试验中，实验结果如图7所示，抗体HZ22F4、HZ37G5均可以有效激活ADCC下游的NF-AT信号通路，EC50分别为0.02958nM、0.04056nM、与TRX518相比，具有显著更优的EC50数值。
实施例12抗肿瘤药效试验
本实验采用MC38细胞接种hGITR转基因小鼠测定本发明的GITR抗体的抗肿瘤作用。
人GITR转基因小鼠：
雌性C57Bl/6背景的人GITR转基因小鼠(约5周大)购自百奥赛图实验动物技术有限公司。小鼠在到达后驯化7天，随后开始研究。
细胞：
小鼠MC38细胞购自南京银河生物医药有限公司，并严格按照说明书进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，在无菌PBS中重悬细胞并调整细胞密度为5×106个/ml。在第0天取0.2ml细胞悬液皮下接种至人GITR转基因小鼠右侧腹部区域中来建立MC38-hGITR荷瘤小鼠模型。
给药：
肿瘤细胞接种6天后检测各只小鼠瘤体积，挑选出瘤体积在87.4mm3～228.4mm3范围内的小鼠按瘤体积平均分组(每组5只小鼠)分组，给药剂量和方式如表12所示，其中Antibody C为抗PD-1的单克隆抗体“Antibody C”(WO2017/133540)。分别在接种后第6、10、13、17天给药，在给药期间监测各组小鼠瘤体积和体重变化，监测频率均为2次/周，连续监测5周。在每次给药前测定体重和肿瘤体积，接种后第24天计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI％＝100％*(h-IgG对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积)/(h-IgG对照组肿瘤体积-h-IgG对照组给药前肿瘤体积)，其中h-IgG对照组给药前肿瘤体积平均值为106mm3。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W2/2。采用电子天平测定体重。
表12.实验设计表
Figure BDA0002703456550000341
*每隔3或4天给药，共4次。
^h-IgG购自Equitech-Bio，货号：SLH56-0001。
肿瘤抑制率结果如图8，9和表13所示：在接种后第24天，HZ37G5和HZ22F4单药均显示很好的肿瘤抑制率，分别为：53％和50％，优于TRX518组的36％。HZ37G5和HZ22F4与抗PD-1抗体Antibody C联合用药，肿瘤抑制效果均明显优于Antibody C，HZ37G5，HZ22F4，以及TRX518单药组。其中HZ37G5和Antibody C联合用药组，以及HZ22F4和Antibody C联合用药组5只小鼠均有4只肿瘤完全消失。同时我们对小鼠体重进行检测，结果如图10所示小鼠体重无显著差异。因此，本发明的针对GITR分子的抗体对肿瘤有明显的抑制效果，且当所述抗体与PD-1抗体联合用药对肿瘤的抑制效果更加显著。
表13.第24天肿瘤抑制率
Figure BDA0002703456550000342
Figure IDA0002703456610000011
Figure IDA0002703456610000021
Figure IDA0002703456610000031
Figure IDA0002703456610000041
Figure IDA0002703456610000051
Figure IDA0002703456610000061
Figure IDA0002703456610000071
Figure IDA0002703456610000081
Figure IDA0002703456610000091
Figure IDA0002703456610000101
Figure IDA0002703456610000111
Figure IDA0002703456610000121
Figure IDA0002703456610000131
Figure IDA0002703456610000141
Figure IDA0002703456610000151
Figure IDA0002703456610000161
Figure IDA0002703456610000171
Figure IDA0002703456610000181
Figure IDA0002703456610000191
Figure IDA0002703456610000201
Figure IDA0002703456610000211
Figure IDA0002703456610000221

Claims (56)

1.结合GITR的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区的3个互补决定区HCDR，以及轻链可变区的3个互补决定区LCDR，其中
(i)HCDR1由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成，HCDR2由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成，HCDR3由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成，LCDR1由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成，LCDR2由SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列组成，且LCDR3由SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列组成；或
(ii)HCDR1由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成，HCDR2由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成，HCDR3由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成，LCDR1由SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列组成，LCDR2由SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列组成，且LCDR3由SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列组成；或
(iii)HCDR1由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成，HCDR2由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成，HCDR3由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成，LCDR1由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成，LCDR2由SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列组成，且LCDR3由SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列组成；或
(iv)HCDR1由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成，HCDR2由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成，HCDR3由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成，LCDR1由SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列组成，LCDR2由SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列组成，且LCDR3由SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列组成。
2.权利要求1所述的的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其中重链可变区包含与选自SEQ ID NO:17、18、19或20的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成。
3.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含重链可变区，其中，重链可变区包含SEQ ID NO:17、18、19或20的氨基酸序列或由其组成。
4.权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，其中，轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:21、22、23或24的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成。
5.权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，其中，轻链可变区包含SEQ ID NO:21、22、23或24的氨基酸序列或由其组成。
6.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中
重链可变区含有SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或由其组成，和轻链可变区含有SEQID NO:21所示的氨基酸序列或由其组成；
重链可变区含有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或由其组成，和轻链可变区含有SEQID NO:22所示的氨基酸序列或由其组成；
重链可变区含有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或由其组成，和轻链可变区含有SEQID NO:23所示的氨基酸序列或由其组成；或
重链可变区含有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或由其组成，和轻链可变区含有SEQID NO:24所示的氨基酸序列或由其组成。
7.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含与选自SEQ ID NO:25、26、27或28的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成。
8.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含选自SEQ ID NO:25、26、27或28的氨基酸序列或由其组成。
9.权利要求1或7或8所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含与选自SEQ ID NO:29、30、31或32的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成。
10.权利要求1或7或8所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含选自SEQ ID NO:29、30、31或32的氨基酸序列或由其组成。
11.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中
所述重链包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或由其组成，且所述轻链包含SEQ IDNO:29所示的氨基酸序列或由其组成；或
所述重链包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或由其组成，且所述轻链包含SEQ IDNO:30所示的氨基酸序列或由其组成；或
所述重链包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或由其组成，且所述轻链包含SEQ IDNO:31所示的氨基酸序列或由其组成；或
所述重链包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列或由其组成，且所述轻链包含SEQ IDNO:32所示的氨基酸序列或由其组成。
12.权利要求1或6所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有以下一个或多个特性：
(i)显示与权利要求11所述的任一抗体对GITR相同结合亲和力和/或特异性；
(ii)竞争性抑制权利要求11所述的任一抗体与GITR的结合；
(iii)与权利要求11所述的任一抗体结合相同或重叠的表位。
13.权利要求1、6或11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有以下一个或多个特性：
(i)结合人GITR；
(ii)具有激动剂活性；
(iii)能够有效介导ADCC效应；
(iv)能够激活T细胞；
(v)具有抗肿瘤活性，同时不影响受试者的体重；
(vi)与抗PD-1抗体组合能够抑制肿瘤活性，同时不影响受试者体重。
14.权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述激动剂活性是指能够有效激活NF-kappaB信号通路。
15.权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述T细胞是CD4 T细胞。
16.权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗肿瘤活性是指能够降低受试者中的肿瘤体积。
17.权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抑制肿瘤活性是指能够降低受试者中的肿瘤体积。
18.权利要求1、6或11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是IgG1形式或IgG2形式或IgG4形式的抗体或抗原结合片段。
19.权利要求1、6或11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单克隆抗体。
20.权利要求1、6或11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人源化的抗体或人抗体或嵌合抗体。
21.权利要求1、6或11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是选自以下的抗体片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体、(Fab’)2或双抗体dAb。
22.权利要求21所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述单链抗体是scFv。
23.权利要求1、6或11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为双特异性或多特异性抗体分子。
24.权利要求23所述的抗体或其抗原结合区片段，其中所述双特异性抗体分子与GITR和PD-1、PD-L1或PD-L2结合。
25.分离的核酸，其编码权利要求1至24中任一项的结合GITR的抗体。
26.包含权利要求25的核酸的载体。
27.权利要求26的载体，其中所述载体是表达载体。
28.包含权利要求25的核酸或权利要求26或27的载体的宿主细胞。
29.权利要求28的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核的或真核的。
30.权利要求28的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。
31.权利要求30的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是293细胞或CHO细胞。
32.制备结合GITR的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适于表达编码权利要求1至24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核酸或权利要求25所述的核酸的条件下培养权利要求28-31中任一项所述的宿主细胞，任选地分离所述抗体或其抗原结合片段，任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述结合GITR的抗体或其抗原结合片段。
33.免疫缀合物，其包含权利要求1至24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和其它物质。
34.权利要求33的免疫缀合物，其中所述其它物质是细胞毒性剂或标记。
35.药物组合物，其包含权利要求1至24中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求31或32的免疫缀合物。
36.权利要求35所述的药物组合物，其还包含一种或多种其它治疗剂。
37.权利要求36所述的药物组合物，其中所述其它治疗剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体。
38.权利要求35至37中任一项所述的药物组合物，其还包含药用辅料。
39.组合产品，其包含权利要求1至24中任一项的结合GITR的抗体或其抗原结合片段或权利要求33或34的免疫缀合物或权利要求35至38中任一项的药物组合物，以及一种或多种其它治疗剂。
40.权利要求39的组合产品，其中所述其它治疗剂选自化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂。
41.权利要求40的组合产品，其中所述免疫调节剂是PD-1轴结合拮抗剂。
42.权利要求41的组合产品，其中所述PD-1轴结合拮抗剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体。
43.权利要求1至24中任一项的结合GITR的抗体或其抗原结合片段、或权利要求33或34的免疫缀合物、或权利要求35至38中任一项的药物组合物，或权利要求39至42中任一项的组合产品在制备药物中的用途，其中所述药物用于预防或治疗受试者肿瘤或感染。
44.权利要求43的用途，其中所述肿瘤为癌症。
45.权利要求44的用途，其中所述癌症为胃肠道癌症。
46.权利要求44的用途，其中所述癌症为胃癌、直肠癌、结肠癌、或结肠直肠癌。
47.权利要求43的用途，其中所述感染为细菌感染、病毒感染、真菌感染或原生动物感染。
48.权利要求43的用途，其中所述感染为慢性感染。
49.权利要求47的用途，其中所述感染为慢性感染。
50.权利要求41至49中任一项所述的用途，其中所述药物与一种或多种疗法联合施用。
51.权利要求50的用途，其中所述疗法为治疗方式和/或其它治疗剂。
52.权利要求51的用途，其中所述治疗方式包括手术治疗和/或放射疗法，和/或其它治疗剂选自化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂。
53.权利要求52的用途，其中所述免疫调节剂是PD-1轴结合拮抗剂。
54.权利要求53的用途，其中所述PD-1轴结合拮抗剂为抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体。
55.权利要求1至22中任一项的任何结合GITR的抗体或其抗原结合片段在制备检测试剂中的用途，所述检测试剂用于检测样品中GITR，其中所述检测包括
(a)将样品与权利要求1至22中任一项的任何结合GITR的抗体或其抗原结合片段接触；和
(b)检测结合GITR的抗体或其抗原结合片段与GITR间的复合物的形成。
56.权利要求55的用途，其中所述抗体是被可检测地标记的。
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