CN111912697B - 一种病原微生物的快速浓缩装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种病原微生物的快速浓缩装置及方法。该装置包括电极和用于使样品通过的微通道，微通道包括浓缩通道和样品通道，浓缩通道和样品通道之间设置有过滤元件，电极包括正电极和负电极，正电极包括若干个子正电极，样品流入微通道后，在电极的作用下，样品中的病原微生物在浓缩通道的正电极一侧区域化富集形成浓缩样品。本发明通过精准的电控制，使含有病原微生物的样本纯化速度和效率大幅提高。通过子正电极施加电压的控制，可以精准而高效地实现病原微生物的浓缩，从而为实现一体化、自动化、快速、连续采样和检测提供了良好的基础。

Description

一种病原微生物的快速浓缩装置及方法

技术领域

本发明属于病原微生物检测技术领域，具体涉及一种能够快速、高效浓缩病原微生物的装置及方法。

背景技术

呼吸道传染病时常爆发，过去十几年有新冠肺炎、SARS、中东呼吸综合症、禽流感等。传染病若无有效控制，将会引起病毒大流行，从而对人类健康、社会经济带来造成极大的威胁。传染病的主要防治是传染病的预防措施可以分为控制传染源、切断传播途径和保护易感人群三个方面。而传染源的鉴定又成为了其中的重中之重。尤其是在地铁、火车站、机场等人流密度极大的区域，若能及时发现传染源并将其隔离，则可极为有效地降低传染病爆发的可能性。因此，希望可以开发一种简单快速的检测设备，该设备可收集呼出气体并检测其是否携带病原体。病原体是指可造成人或者动植物感染疾病的微生物、寄生虫或其它媒介。因而，需要对气体中的病原体进行检测。

对于气体中病毒的检测包含采样及检测两部分。气体中微生物采集方法主要四类方法，分别为重力采样、惯性撞击、过滤阻留、静电沉着。其主要思路是使用空气采样器将空气中的微生物转移到一定的介质上，可以是液体、固体或半固体。由于收集到的病毒较少，因此需要先培养病毒，再采用测序、化学发光或光学等手段进行检测。

重力采样法利用微生物气溶胶的重力作用，在一定时间内将微生物粒子收集到培养皿内，然后在适宜的温度下培养生长成菌落，进行生物学的观察和研究。惯性采样法是利用抽气泵抽气，迫使含有微生物粒子的空气通过采样器上的喷嘴，以形成高速喷射气流，在离喷嘴时迫使喷射气流发生偏转，粒径大于或者等于切割粒径D50(收集效率为50％时的粒子空气动力学直径，μm)的粒子，由于惯性作用，被收集到采样介质上；而比D50小的粒子由于惯性小，则随气流发生偏转而逃逸。静电采样器是利用静电作用力，当带电粒子进入电场后，在电场力的作用下发生偏转，从而将其收集到极板上。

然而，这些方法都存在一定的缺陷。重力采样法对于空气中的粒径小以及数量少的病菌等采样效率极低，且受到气流的影响较大。惯性采样法同样不好收集粒径较小的病菌粒子，且由于采样操作时的气流喷射，容易损伤微生物。过滤式采样器可以将病菌粒子阻留在滤材上，从而收集粒子，然而，若连续长时间的采样则会使得滤膜上的微生物脱水，从而失去活性。静电采样器结构简单、压降小，可采集空气样本量大、浓缩倍数高、对细颗粒物捕集效率高，且能够较好地保持微生物形态和生物活性。然而，长时间采样，介质如琼脂以及液滴等的蒸发会导致采样器内湿度的变化影响收集效率。

病毒只能在宿主细胞内繁殖。受感染的细胞可以将病毒直接传播到周围的空气(一次气溶胶化)或流体和表面，从而成为空气传播(二次气溶胶化)的来源。任何病毒都可能发生二次气溶胶化，主要是当空气流动时会遇到已被污染的表面或流体，其中的病毒将会分散到空气中。事实上，几乎任何被感染的生物体或材料，甚至是海水中气泡的破裂，都能在空气中产生携带病毒的微粒。

最重要的气溶胶来源是人类自身，气溶胶介导的人源感染可发生在日常生活的每一天。例如，简单地将含有传染性颗粒物的马桶冲洗一下，就能使空气中的病毒浓度达到显著水平。污水处理厂和污水喷头也可以产生病毒气溶胶。也有相关研究调研农场动物通过空气传播病毒。口蹄疫病毒是研究最广泛的空气传播的动物病毒之一，该病毒可在感染的猪和反刍动物污染的空气中被检测到。这种单链RNA病毒属于小RNA病毒，可在被感染动物^[7]的所有体液中排出。因此对空气中致病原的检测，十分的必要。

迄今为止使用的病毒浓缩方法主要依赖于如下几种方法。

1.通过负电荷过滤器过滤水中存在的负电荷衣壳的病毒，要求之前对水进行酸化或盐碱化处理。该方法难以对浑浊样本及大体积样本进行处理，且需要回收过程对诸多条件进行调节。

2.使用无需样品预处理的电正性过滤器。该法同样难以对浑浊样本及大体积样本进行处理，且涉及设备耗材较为昂贵。

对于这两种类型的过滤，病毒颗粒的回收主要受从过滤器中回收保留病毒所需的洗脱步骤而不是过滤本身的影响。

3.超滤是一种基于病毒的尺寸而进行的过滤，难以用于高浊度的样品进行病毒浓缩。

4.使用有机/无机絮凝剂进行病毒絮凝/沉淀，以便后续沉降。但该方法无法对大体积样本进行浓缩，且多需要对样本进行预处理。

5.超离心和离心超滤，主要依赖于病毒大小进行浓缩，但仅适用于小体积样品，并需要昂贵的离心设备。

电负性、电正性过滤和超滤是主要的浓缩方法，而超离心、超滤和絮凝沉淀是次要的浓缩方法。正电过滤是一次或二次浓缩的方法。

研究人员对不同方法的可用性能数据进行了分析，结果表明，在应用不同方法、不同类型的样本或不同测试体积时，没有统计差异。脊髓灰质炎病毒在几乎所有评估方法中的回收率都很高，而腺病毒或轮状病毒的回收率较低，并且没有提供关于流行病毒(如人类多瘤病毒或乳头状瘤病毒)或植物病毒(如胡椒轻度斑驳病毒)的信息。因为需要一种可对大体积样本中病毒进行快速浓缩的方法。

若想实现实时检测，则无法采用采样后培养的策略，因而对采样后样本中病原体的浓度要求较高。然而，在传染病早期，病患呼出的气体中病原体浓度有限，若想及时发现这些潜在传染源，则需要提高样本中病原体浓度，主要是将呼出气体中病原体进行富集。且富集后的样本，可直接与下游检测装置连接，从而实现实时监测。目前已有的病原体富集策略获取的样本中获得的病原体数量及质量均不足以支持下游检测装置的开发。

发明内容

本发明目的是提供一种病原微生物的快速浓缩装置及方法，能够对流体中的病原微生物颗粒进行便捷高效地浓缩。

为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：

本发明首先提供一种病原微生物快速浓缩装置，包括电极和用于使样品通过的微通道，所述微通道包括浓缩通道和样品通道，所述浓缩通道和样品通道之间设置有过滤元件，所述电极包括正电极和负电极，所述正电极包括若干个子正电极，若干个子正电极间隔阵列布置于靠近浓缩通道的一侧，所述负电极设置于靠近样品通道的一侧，浓缩过程中，单个子正电极上施加有大于零的波动电压，与之邻近的子正电极的电压与所述波动电压交替变化，在邻近的子正电极之间形成变化的电势差，所述样品流入微通道后，在所述电极的作用下，样品中的病原微生物在浓缩通道的正电极一侧区域化富集形成浓缩样品。

更进一步的，所述微通道的出入口处设置有驱动电极对。

更进一步的，所述大于零的波动电压的波动形式包括矩形波、和/或三角波、和/或正弦波、或前三种波的叠加波。

更进一步的，所述过滤元件为半透膜、和/或微柱阵列、和/或凝胶聚合物，为带有空隙的过滤结构。

更进一步的，所述浓缩通道的宽度小于样品通道的宽度。

更进一步的，所述样品通道的宽度L₁和浓缩通道的宽度L₂满足：

L_A V₁/L₂ V₂≥X

其中，V₁为样品通道的流速，V₂为浓缩通道的流速，X为浓缩样品的浓度与浓缩前样品的浓度的比值。

更进一步的，所述微通道的材质为聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚乙烯Tygon、聚全氟乙丙烯共聚物FEP或聚四氟乙烯PTFE、COC/COP环烯烃类共聚物、聚碳酸酯PC。

本发明还提供一种病原微生物快速浓缩方法，包括：

样品进入微通道，在正电极和负电极的作用下，病原微生物逐渐向正电极一侧偏移，病原微生物经过滤元件进入浓缩通道；

在单个子正电极上施加大于零的波动电压，与之邻近的子正电极的电压与所述波动电压交替变化，在邻近的子正电极之间形成变化的电势差，病原微生物在邻近的两个子正电极之间往复运动，并逐渐在邻近的两个子正电极的中间区域富集；

在浓缩通道的出口获得浓缩样品。

更进一步的，所述单个子正电极设置有若干个，其中部分或全部单个子正电极上施加有波动电压，在其中的几个子正电极之间形成波动变化的电场，形成一个或多个富集区域；并可在富集过程中逐步减少提供电压的电极数量，形成更少的富集区，以进一步富集。

本发明的有益效果是：

本发明通过精准的电控制，使含有病原微生物的样本纯化速度和效率大幅提高。本发明以很小的电压即可使病原微生物颗粒产生偏转，根据COMSOL仿真结果，偏转率可达100％，病原微生物的理论回收率极高。通过子正电极施加电压的控制，可以精准而高效地实现病原微生物的浓缩，从而为实现一体化、自动化、快速、连续采样和检测提供了良好的基础。本发明能够极大程度的降低由于复杂的吸附和洗脱步骤而造成的检测误差。

附图说明

图1为实施例的装置的结构原理图；

图2为实施例的装置的立体结构示意图；

图3为1s的病原微生物粒子轨迹仿真示意图；

图4为4s的病原微生物粒子轨迹仿真示意图；

图5为电势分布仿真示意图；

图6为5秒时不同电压条件下的100nm直径病原微生物粒子回收效率仿真结果图；

图7为20V条件下5秒时不同直径病原微生物粒子回收效率仿真结果图；

图8为实施例中在一组邻近的子正电极(子正电极A、子正电极B)上施加的电压示意图；

图9为图8中t1时刻的电场分布图；

图10为图8中t2时刻的电场分布图；

图11为病原体颗粒在图8中子正电极A和子正电极B之间的富集状态图。

附图标记：1、样品通道，2、浓缩通道，3、病原微生物，4、负电极，5、正电极，6、过滤元件，7、废液样品池，8、检测单元。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本实施例的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。

本实施例提供一种如图1-2所示的病原微生物快速浓缩装置。该病原微生物3(本实施例中，病原微生物包括细菌、病毒、支原体、衣原体等)快速浓缩装置包括用于使样品通过的微通道，该微通道包括浓缩通道2和样品通道1。浓缩通道和样品通道之间设置有过滤元件6(该过滤元件可以是半透膜、和/或微柱阵列、和/或凝胶聚合物，和/或其它带有空隙的过滤结构的过滤元件)。电极包括正电极5和负电极4(负电极可采用接地方式)，正电极包括若干个子正电极(例如，图1和图2中设置有5个子正电极)，若干个子正电极间隔阵列布置于靠近浓缩通道2的一侧，负电极设置于靠近样品通道1的一侧，浓缩过程中，单个子正电极上施加有大于零的波动电压，与之邻近的子正电极的电压与所述波动电压交替变化，在邻近的子正电极之间形成变化的电势差。需要说明的是，此处所说的“邻近”并非指物理位置上的相邻，而是指具有交替变化的电压关系的最相邻的两个子正电极，例如，当某一个或某几个子正电极接地时，邻近的两个子正电极之间可能跨越了一个或某几个子正电极。样品流入微通道后，在电极的作用下(电势分布如图5所示)，样品中的病原微生物3在浓缩通道2的正电极一侧区域化富集形成浓缩样品。浓缩样品可以与如图1所示检测系统的检测单元8连接，废液样品可以收集至如图1所示的废液样品池7中，进行无害化处理。该病原微生物快速浓缩装置可实现对低浓度的病原体样本的快速精准浓缩，并为实时检测提供良好的基础。

本发明中所述大于零的波动电压的波动形式包括矩形波、和/或三角波、和/或正弦波等，本实施例中，该波动电压优选为如图9所示的矩形波状电压。病原微生物颗粒在流道中受力主要有四种，一是受流体流动提供的曳力、二是电场驱动的静电力、三是由热运动提供的布朗力、四是不均匀电场导致病原微生物颗粒极化而产生的介电泳力。当上述交变电压为矩形波状交变电压时，病原微生物颗粒将主要受到静电力和曳力，该方形电压的特点为频率低、电压变化为瞬变，因此在样本流道和纯化流道中的电场基本是匀强电场，而瞬态变化不会导致电场的不均匀变化，所以病原微生物颗粒受到介电泳力基本忽略不计。

本实施例中，为了进一步控制样品在微通道中的流动，可以在微通道的出入口处设置驱动电极对。例如，在微通道的进口处设置驱动负电极，在微通道的出口处设置驱动正电极，这样，样品在样品通道1中受到流场和电场的双重作用，流场和电场共同对病原微生物颗粒提供向前流动的动力；又如，在微通道的进口处设置驱动正电极，在微通道的出口处设置驱动负电极，这样，可以通过减小样品在微通道中流动的速度，延长浓缩过程的时间。

本实施例中，所述半透膜优选为混合纤维素酯材料的带有纳米空隙的薄膜，其材质优选为聚四氟乙烯PTFE、ePTFE、氧化铝薄膜或聚丙烯滤膜；所述微通道的材质优选为聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚乙烯Tygon、聚全氟乙丙烯共聚物FEP或聚四氟乙烯PTFE、COC/COP环烯烃类共聚物、聚碳酸酯PC。

本实施例中，浓缩通道2的宽度优选为小于样品通道1的宽度，当浓缩样品的浓度为浓缩前样品的浓度的X倍以上时(以下以100倍为例进行说明)，假设样品通道1的宽度L₁，浓缩通道2的宽度L₂，两个流道高度一致为H，样品通道1的流速V₁，浓缩通道2的流速V₂，样品通道1现有M个样本需要在T时间内浓缩至浓缩通道2，则：

流量：Q＝LHVT；

含量：W＝M/Q；

为使浓缩后的浓度至少是浓缩以前的100倍，则W₂≥100W₁；

则有：M/L₂H₂V₂T≥100M/L₁H₁V₁T；

则有：L₁ V₁/L₂ V₂≥100。

本实施例还提供一种利用上述病原微生物快速浓缩装置进行病原微生物快速浓缩的方法。该方法包括：

样品进入样品通道1，病原微生物颗粒在正电极和负电极的作用下，病原微生物颗粒受到垂直于流道方向上的电场力，其在流动的过程中通过过滤元件6到达浓缩通道2，其余杂质和不能通过的颗粒等物质保留在样品通道1，即病原微生物逐渐向正电极一侧偏移，病原微生物3经过滤元件6进入浓缩通道2，废液进入样品通道1。带有病原微生物颗粒的样本在装置中受到流场和电场的双重作用，流场或电场对病原微生物颗粒提供向前的动力，电场能够以很小的电压使带负电荷的病原微生物颗粒发生偏转。病原微生物粒子进入待浓缩通道的轨迹如图3所示，在电场作用下，病原微生物粒子在运动的过程中向下偏离，4S时病原微生物粒子的偏移轨迹如图4所示，此时，病原微生物粒子在电场的作用下已经通过过滤元件6到达浓缩通道2。图6显示随着电压的增强，病原微生物粒子回收至浓缩通道2的回收效率也随之增高；图7显示在20v电压条件下，5秒时随着病原微生物粒子直径的增加，回收效率无明显变化，回收效率均很高。因此，本发明的装置能够以很小的电压使带负电荷的病原微生物颗粒偏转，即实际消耗少，成本低，根据COMSOL仿真结果，偏转率可达100％，病原微生物的理论回收率极高。

如图8所示，在单个子正电极上施加有大于零的波动电压，与之邻近的子正电极的电压与所述波动电压交替变化，在邻近的子正电极之间形成变化的电势差。需要说明的是，子正电极可以设置多个，当子正电极设置有多个时，正电极包含有多组邻近的子正电极，而图8中仅以其中一组(即邻近的子正电极A和B)进行示例说明。其中，t1时刻的电场分布如图9所示，t2时刻的电场分布图如图10所示。当A、B电极上的电压在t₁时刻时，A电压为1.2V、B电压为0.4V，此时病原微生物粒子偏转进入流道后，病原微生物粒子会往电场箭头强的方向运动，如t₁时刻电场分布图所示(箭头长度越大，代表电场越强)，电场方向为由A指向B，所以病原微生物粒子会向A电极运动。而当A、B电极上的电压在t₂时刻时，A电压为0.4V、B电压为1.2V，此时纯化流道的电场方向与t₁时刻相比，发生方向变化，电场方向为由B指向A，病原微生物粒子会往电极B运动。当在电极A、B施加交变的方波电压后，病原微生物粒子将在A、B两个电极之间做往复运动，并逐渐在交替变化的两个子正电极的中间区域富集，多个子正电极控制下所形成的区域富集状态如图11所示；通过该步骤形成的聚集有病原体颗粒的富集区域可以有多个，也可以通过调整电极的工作与否形成少数几个甚至一个富集区域，这样就使得呼气中的病原体得到可控地有效浓缩，不仅大大减少了气体收集冷凝单元所需收集的呼气量，而且提高了浓缩样品中病原体可被检测的几率，从而可以极大地提高检测的便捷性和准确性；仅微量的浓缩样品即可被送入样品检测单元检测，从而有利于实现系统的小型化和检测的连续性；

本实施例中，该步骤的优选控制方法为：设置若干个单个子正电极，其中在部分或全部子正电极上施加波动电压，在其中的几个子正电极之间形成波动变化的电场，形成一个或多个富集区域；并可在富集过程中逐步减少提供电压的电极数量，形成更少的富集区，以进一步富集。

以下以一种优选的方案进行示例说明(假设单个子正电极设置有N个，依序编号为1、2、3、4……N)：

首先，在第1、3、5……个子正电极上施加大于零的波动电压，在第2、4、6……个子正电极上施加与所述波动电压呈交替变化趋势的交变电压，直至病原体粒子在第1和2个子正电极之间、第2和3个子正电极之间、第3和4个子正电极之间……富集，形成A个富集区域；

然后，控制使第2、4、6……个子正电极接地，在第1、5、9……个子正电极上施加大于零的波动电压，在第3、7、11……个子正电极上施加与所述波动电压呈交替变化趋势的交变电压，直至病原体粒子在第1和3个子正电极之间、第3和5个子正电极之间、第5和7个子正电极之间……富集，形成数量小于A的B个富集区域；

然后，进一步控制使第3、7、11……个子正电极接地，在第1、9、17……个子正电极上施加大于零的波动电压，在第5、13、21……个子正电极上施加与所述波动电压呈交替变化趋势的交变电压，直至病原体粒子在第1和5个子正电极之间、第5和9个子正电极之间、第9和13个子正电极之间……富集，形成数量小于B的C个富集区域；

依此类推，使病原体颗粒富集区域逐渐减少，同时每个富集区域浓缩的病原体颗粒量逐渐增多。当达到所需浓度后，再控制使全部子正电极接地，此时病原微生物样本将不再受到电场力控制，浓缩样本将在流场和/或电场的作用下继续流动，可在浓缩通道2的出口获得浓缩样品。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种病原微生物快速浓缩装置，其特征在于，包括电极和用于使样品通过的微通道，所述微通道包括浓缩通道和样品通道，所述浓缩通道和样品通道之间设置有过滤元件，所述电极包括正电极和负电极，所述正电极包括若干个子正电极，若干个子正电极间隔阵列布置于靠近浓缩通道的一侧，所述负电极设置于靠近样品通道的一侧，浓缩过程中，单个子正电极上施加有大于零的波动电压，与之邻近的子正电极的电压与所述波动电压交替变化，在邻近的子正电极之间形成变化的电势差，所述样品流入微通道后，在所述电极的作用下，样品中的病原微生物在浓缩通道的正电极一侧区域化富集形成浓缩样品；所述样品通道的宽度L₁和浓缩通道的宽度L₂满足：

L₁ V₁/L₂ V₂≥X

其中，V₁为样品通道的流速，V₂为浓缩通道的流速，X为浓缩样品的浓度与浓缩前样品的浓度的比值。

2.根据权利要求1所述的一种病原微生物快速浓缩装置，其特征在于，所述微通道的出入口处设置有驱动电极对。

3.根据权利要求1所述的一种病原微生物快速浓缩装置，其特征在于，所述大于零的波动电压的波动形式包括矩形波、和/或三角波、和/或正弦波。

4.根据权利要求1所述的一种病原微生物快速浓缩装置，其特征在于，所述过滤元件为半透膜、和/或微柱阵列、和/或凝胶聚合物，为带有空隙的过滤结构。

5.根据权利要求1所述的一种病原微生物快速浓缩装置，其特征在于，所述浓缩通道的宽度小于样品通道的宽度。

6.根据权利要求1所述的一种病原微生物快速浓缩装置，其特征在于，所述微通道的材质为聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚乙烯Tygon、聚全氟乙丙烯共聚物FEP、聚四氟乙烯PTFE、COC/COP环烯烃类共聚物或聚碳酸酯PC。

7.一种基于权利要求1-6中任意一项所述的病原微生物快速浓缩装置的病原微生物快速浓缩方法，其特征在于，包括：

样品进入微通道，在正电极和负电极的作用下，病原微生物逐渐向正电极一侧偏移，病原微生物经过滤元件进入浓缩通道；

在单个子正电极上施加大于零的波动电压，与之邻近的子正电极的电压与所述波动电压交替变化，在邻近的子正电极之间形成变化的电势差，病原微生物在邻近的两个子正电极之间往复运动，并逐渐在邻近的两个子正电极的中间区域富集；

在浓缩通道的出口获得浓缩样品。

8.根据权利要求7所述的病原微生物快速浓缩方法，其特征在于，所述单个子正电极设置有若干个，其中部分或全部单个子正电极上施加有波动电压，在其中的几个子正电极之间形成波动变化的电场，形成一个或多个富集区域；并在富集过程中逐步减少提供电压的电极数量，形成更少的富集区，以进一步富集。

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