CN111896727A

CN111896727A - 一种稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法、水体监测预警方法

Info

Publication number: CN111896727A
Application number: CN202010637316.7A
Authority: CN
Inventors: 王彦华; 李薪芳; 吕露; 王豆; 王强
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-07-03
Filing date: 2020-07-03
Publication date: 2020-11-06

Abstract

本发明属于毒性测定技术领域，公开了一种稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法、水体监测预警方法，取农药储备液用标准稀释水按等比级差逐级稀释所需浓度；采用细胞培养板为暴露容器，每孔加入受精卵；采用DPS统计分析软件，利用机率值分析法将稀有鮈鲫胚胎死亡率数据进行统计分析，求出LC₅₀及其95％置信限；分别以两种农药单一暴露对稀有鮈鲫胚胎96h‑LC₅₀值为一个毒性单位，染毒96h后，采用DPS软件分别求出两种农药在混合体系中的LC₅₀值及其95％置信限；根据Marking相加指数法，评价三唑磷和氰戊菊酯复合暴露对稀有鮈鲫胚胎毒性的影响。本发明为水体中农药复合暴露的监测预警及修复治理提供重要科学依据。

Description

一种稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法、水体监测预警方法

技术领域

本发明属于毒性测定技术领域，尤其涉及一种稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法、水体监测预警方法。

背景技术

三唑磷(Triazophos)是一种中毒、广谱的有机磷类杀虫杀螨剂，具有强烈的触杀和胃毒作用，主要用于果树、棉花、禾谷类作物的虫害防治。自20世纪80年代后期，我国浙江和福建等沿海地区在海水贝类养殖业中开始大量使用三唑磷作为清涂、清塘药剂。由于三唑磷在农、林、渔业生产上的大量使用，导致其通过地表径流进入水体进而危害水生生物，造成了较大的渔业经济损失。三唑磷农药对河口、海湾以及水产养殖品种的污染问题日益引起关注。氰戊菊酯(Fenvalerate)是中等毒性的拟除虫类菊酯杀虫剂，有很强的触杀和驱避作用，具有高效、广谱的特点，在全球多种农作物上广泛使用防治有害生物。氰戊菊酯具有对水生生物高毒的氰基，因此，鱼类、蟹类和龙虾等养殖生物均易受到其残留的危害。由于氰戊菊酯的大量广泛使用，其在水体环境中被频繁检出。此外，低浓度的氰戊菊酯会被用于养殖鱼类的杀虫，所以水体环境中氰戊菊酯的残留毒害日益受到关注。由于三唑磷和氰戊菊酯混合使用对农业害虫具有增效作用，二者的混剂在农业生产中被广泛使用。因此，包括三唑磷与氰戊菊酯在内自然界中不同的污染源绝非是单独存在的，而是存在着紧密的相互作用关系，他们往往同时或先后进入环境中。

稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)作为我国本土的一种小型鱼类，是我国化学品环境管理中推荐的试验鱼种之一；该鱼种具有性成熟快、在人工控制条件下可终年产卵、属连续产类型等三大特点；由于其胚胎具有光学透明性，可透过卵膜清晰观察胚胎发育，发育过程也与多数淡水硬骨鱼类似，具有成为中国特有模式鱼种的潜能。此外，鱼类胚胎毒性符合3Rs原则[replacement(替代)、reduction(减少)、refinement(优化)]。因此，开展农药对稀有鮈鲫胚胎毒性评价，对于保护我国的生态环境具有重要指导作用。

尽管农药对稀有鮈鲫的毒性已有报道，但大都局限于单一农药评价。在实际环境中，农药均以混合污染的形式存在，单一污染是不存在的，而且农药之间相互作用的环境效应无法用单一化合物的作用机理来解释，以往依赖单一效应制定的有关评价标准难以真实地反应现实环境质量的客观要求。因此，对复合污染的研究已经成为生态毒理学领域关注的热点。随着三唑磷和氰戊菊酯在环境中的排放量日益增多，它们潜在共存性增加，且在水体样本中经常同时检出这两种化合物。因此，农田生态系统中存在着三唑磷和氰戊菊酯复合污染的威胁。尽管国内外学者对三唑磷和氰戊菊酯单一的生态毒理学进行了大量研究，实际环境中这两类污染物共存时的毒害作用却日渐突出，但有关它们复合污染的研究仍然不够深入。三唑磷和氰戊菊酯在水环境中的吸附、累积、化学性质的差异以及复杂的交互作用，使之成为水体污染治理的难点，探究其对稀有鮈鲫胚胎的复合暴露毒性效应评价技术显得非常必要。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前农药对稀有鮈鲫的毒性局限于单一农药评价，农药之间相互作用的环境效应无法用单一化合物的作用机理来解释，难以真实地反应现实环境质量。

解决以上问题及缺陷的难度为：由于不同农药在水体中的吸附、累积、化学性质的差异以及复杂的交互作用，采用以往的理化分析方法，可检测水体中农药的浓度，但不能确定农药复合污染效应。

解决以上问题及缺陷的意义为：可为农药混合使用提供科学依据，避免开发的农药混剂对有害靶标生物具有良好防效的同时，却对水生生态环境产生严重不利影响，同时也为农药复合污染风险评估及监测提供技术支撑。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法、水体监测预警方法。

本发明是这样实现的，一种稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法，所述稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法包括：

第一步，取农药储备液用标准稀释水按等比级差逐级稀释所需浓度；采用细胞培养板为暴露容器，每孔加入受精卵；采用DPS统计分析软件，利用机率值分析法将稀有鮈鲫胚胎死亡率数据进行统计分析，求出LC₅₀及其95％置信限；

第二步，分别以两种农药单一暴露对稀有鮈鲫胚胎96h-LC₅₀值为一个毒性单位，染毒96h后，采用DPS软件分别求出两种农药在混合体系中的LC₅₀值及其95％置信限；

第三步，根据改进后的Marking相加指数法，即相加作用为一个区间范围而不是具体的数值，利用三唑磷和氰戊菊酯对稀有鮈鲫胚胎单一和复合毒性的LC₅₀值，评价三唑磷和氰戊菊酯复合暴露对稀有鮈鲫胚胎毒性的影响。

进一步，所述第一步试验时加入取农药储备液用标准稀释水按等比级差逐级稀释所需浓度5～7个，采用24孔细胞培养板为暴露容器，每孔加入1枚受精卵，每浓度设3个重复，每个重复为1块24孔板，其中20个孔注入试验药液，另外4孔作为助溶剂对照；空白对照组24个孔均注入标准稀释水，空白对照组也设置3个重复。每24h更换1次药液，染毒96h后记录胚胎死亡率和中毒症状。

进一步，所述第二步混合体系中两种农药的毒性单位比为4:1、3:2、1:1、2:3和1:4。

进一步，在不同毒性比的混合农药体系中，每个毒性比均以等对数间距设置5～7个不同的浓度。

进一步，染毒96h后，采用DPS软件(V2.0版)对测定的每个浓度对应的死亡率进行综合统计分析，分别求出两种农药在混合体系中的LC₅₀值及其95％置信限。

进一步，所述第三步采用公式求出生物毒性作用之和S：S＝Am/Ai+Bm/Bi，式中Am和Bm分别是混合体系中各农药的毒性LC₅₀，Ai和Bi分别是A和B农药单独作用时的毒性LC₅₀；将S转换成相加指数AI；

当S≤1时，AI＝(1/S)-1.0；当S>1时，AI＝1.0–S；最后用AI值评价农药的复合效应。由于Marking相加指数法中AI＝0为相加作用，在实际研究中，很少发生AI＝0的情况，本发明采用-0.2<AI<0.25时为相加作用，将AI值设定一个区间为相加作用，更加符合实际情况。毒性增加倍数＝AI+1。

进一步，采用-0.2<AI<0.25时为相加作用，将AI值设定一个区间为相加作用。

进一步，所述稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法三唑磷和氰戊菊酯配比时，对稀有鮈鲫胚胎毒性的AI值的范围为4.14～6.09，毒性增加倍数为5.14～7.09。因此，在进行水体污染监测预警及修复治理时，必须考虑农药在混合体系中的毒性，且与单独存在时的毒性进行比较，计算出复合污染效应，才能准确评估农药复合污染的毒性风险。

本发明的另一目的在于提供一种水体农药复合暴露的监测预警方法，所述水体监测预警方法使用所述的稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法。

本发明的另一目的在于提供一种水体农药复合暴露的修复治理方法，所述水体农药复合暴露的修复治理方法使用所述的稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：水体中不断积累的农药对生态系统造成了严重威胁，且经常构成复合暴露，开展它们共存时的毒性效应评价技术，对于准确评价复合暴露对水生生物毒副作用和有效保护生物多样性非常重要。本发明以我国本土鱼类稀有鮈鲫为受试生物，选用水体中广泛存在的三唑磷和氰戊菊酯为研究对象，进行它们单一与复合暴露时对稀有鮈鲫胚胎毒性影响评价，明确复合暴露效应。本发明的结果旨在阐明实际环境中农药复合暴露对水生态系统的潜在毒性影响，为我国水体中农药复合暴露早期诊断及其修复治理提供可靠的理论依据。

三唑磷和氰戊菊酯在不同毒性比复合暴露下对稀有鮈鲫胚胎毒性均产生了显著的协同效应，暗示出它们共存时可对水体生态环境产生严重不利影响。尽管三唑磷和氰戊菊酯混剂在农业生产中广泛使用，以提高对农业害虫的控制效果和扩大防治对象，但它们复合暴露时对生态环境也会产生毒副作用。因此，三唑磷和氰戊菊酯混剂在农业生产中应谨慎使用，以减少对生态环境的潜在不利影响。

本发明对三唑磷和氰戊菊酯复合暴露对稀有鮈鲫胚胎毒性评价，为其它不同种类的污染物复合暴露对稀有鮈鲫胚胎毒性测试提供了借鉴，这将为水体中农药复合暴露的监测预警及修复治理提供重要科学依据。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法流程图。

图2是本发明实施例提供的稀有鮈鲫胚胎中毒症状示意图；

图中：(a)卵凝结；(b)尾部弯曲；(c)心包水肿；(d)脊柱弯曲；(e)卵黄囊水肿；(f)对照组。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法、水体监测预警方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明提供的稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法包括以下步骤：

S101：取一定量的农药储备液用标准稀释水按等比级差逐级稀释所需浓度5～7个；采用24孔细胞培养板为暴露容器，每孔加入1枚受精卵，每浓度设3个重复；采用DPS统计分析软件，利用机率值分析法将稀有鮈鲫胚胎死亡率数据进行统计分析，求出LC₅₀及其95％置信限；

S102：分别以两种农药单一暴露对稀有鮈鲫胚胎96h-LC₅₀值为一个毒性单位，混合体系中两种农药的毒性单位比设计为4:1、3:2、1:1、2:3和1:4；染毒96h后，采用DPS软件分别求出两种农药在混合体系中的LC₅₀值及其95％置信限；

S103：根据Marking相加指数法并加以改进，评价三唑磷和氰戊菊酯复合暴露对稀有鮈鲫胚胎毒性的影响。

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述。

1材料与方法

1.1供试农药及试剂

供试农药为三唑磷和氰戊菊酯原药，纯度均>90％。吐温-80、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)均为分析纯。供试原药用吐温-80和N，N-二甲基甲酰胺配制成高浓度储备液。

整个试验过程中的试验用水，为统一配制、充氧饱和，温度保持26±1℃的标准稀释水，用分析纯试剂和双蒸水配制而成。具体配制标准稀释水的方法如下：①氯化钙溶液，称取11.76gCaCl₂·2H₂O溶于蒸馏水中，稀释至1L；②硫酸镁溶液，称取4.93gMgSO₄·7H₂O溶于蒸馏水中，稀释至1L；③碳酸氢钠溶液，称取2.59gNaHCO₃溶于蒸馏水中，稀释至1L；④氯化钾溶液，称取0.23gKCl溶于蒸馏水中，稀释至1L。取上述4种溶液各25mL，混合，并用双蒸水稀释至1L。标准稀释水在试验前应曝气1d以上。

1.2供试生物

稀有鮈鲫成年亲鱼购自江苏无锡中科水质环境技术有限公司，饲养于室内循环养殖系统中，溶解氧≥7mgL^-1。每日定时投喂人工配合饲料2次，外加丰年虫1次。投喂15min后及时吸去残饵，水温保持在26±1℃，pH控制在7.0±0.5，光/暗比为14h/10h。试验所用胚胎由稀有鮈鲫成年亲鱼其繁殖所得。试验所用稀有鮈鲫胚胎为同一批收集的健康胚胎，卵径1.35～1.70mm，且透明无白色杂质。

1.3单一农药暴露毒性测试

通过立体显微镜观察，挑选发育正常的健康受精卵孵化后3h进行测试。试验时加入取一定量的农药储备液用标准稀释水按等比级差逐级稀释所需浓度5～7个。采用24孔细胞培养板为暴露容器，每孔加入1枚受精卵，每浓度设3个重复，每个重复为1块24孔板，其中20个孔注入试验药液，另外4孔作为助溶剂对照。空白对照组24个孔均注入标准稀释水，空白对照组也设置3个重复。每24h更换1次药液。染毒96h后记录胚胎死亡率和中毒症状。胚胎死亡特征为卵凝结、体节缺失、尾部未分离或无心跳。常见的胚胎中毒症状包括以下几种：卵凝结、心包水肿、卵黄囊水肿、脊柱弯曲和尾部弯曲等(图2)。采用DPS统计分析软件(版本号：V15.10)，利用机率值分析法将稀有鮈鲫胚胎死亡率数据进行统计分析，求出LC₅₀及其95％置信限。

1.4农药复合暴露毒性测试

农药联合毒性以往通常采用等毒性方法进行，但在实际环境中，很少发生混合农药以等毒性配比的情况。本发明考虑到混合农药在水体环境中的毒性比在不同时间和不同地域变化，分别以两种农药单一暴露对稀有鮈鲫胚胎96h-LC₅₀值为一个毒性单位，混合体系中两种农药的毒性单位比(毒性比)设计为4:1、3:2、1:1、2:3和1:4，可代表混合农药的随时空变化的浓度比例，更符合实际环境。在上述不同毒性比的混合农药体系中，每个毒性比均以等对数间距设置5～7个不同的浓度，染毒试验方法同1.3。染毒96h后，采用DPS软件分别求出两种农药在混合体系中的LC₅₀值及其95％置信限。

1.5试验有效性

试验使用的胚胎总受精率≥70％；试验期间，试验容器中温度维持在26±1℃；试验结束时，空白对照组胚胎存活率≥90％，胚胎孵化率≥80％，空白对照组和最高浓度处理组溶液的溶解氧含量≥80％空气饱和值。

1.6农药复合暴露效应评价方法

根据Marking相加指数法并加以改进，评价三唑磷和氰戊菊酯复合暴露对稀有鮈鲫胚胎毒性的影响。采用下面的公式求出生物毒性作用之和S：S＝Am/Ai+Bm/Bi，式中Am和Bm分别是混合体系中各农药的毒性(LC₅₀)，Ai和Bi分别是A和B农药单独作用时的毒性(LC₅₀)；将S转换成相加指数AI(Additive Index)。当S≤1时，AI＝(1/S)-1.0；当S>1时，AI＝1.0-S。最后用AI值评价农药的复合效应，当-0.2<AI<0.25时为相加作用(Addition)；当AI≥0.25时为协同作用(Synergism)；当AI≤-0.2时为拮抗作用(Antagonism)。毒性增加倍数＝AI+1。

由于Marking相加指数法中AI＝0为相加作用，在实际研究中，很少发生AI＝0的情况，本发明采用-0.2<AI<0.25时为相加作用，将AI值设定一个区间为相加作用，更加符合实际情况。

二、结果与分析

本试验使用的胚胎总受精率≥85％；试验期间，试验容器中温度维持在25.41～26.69℃；试验结束时，空白对照组胚胎存活率为92.34±3.18％，胚胎孵化率为85.27±4.61％，空白对照组和最高浓度处理组溶液的溶解氧含量≥81.9％空气饱和值。说明本试验有效，符合质量控制要求。

农药单一对稀有鮈鲫胚胎毒性影响结果表明：在测定的农药浓度范围内，随着染毒浓度的增大，胚胎死亡率也增加，且都观察到了胚胎中毒症状如心包水肿、卵黄囊水肿、脊柱弯曲和尾部弯曲等。暴露96h后，三唑磷和氰戊菊酯单独作用时对稀有鮈鲫胚胎的LC₅₀及其95％置信限分别为6.74(5.29～8.46)mg a.i.L^-1和0.98(0.65～1.34)mga.i.L^-1，暗示氰戊菊酯单一暴露时对稀有鮈鲫胚胎毒性明显大于三唑磷单一暴露的毒性(表1)。

混合农药对稀有鮈鲫胚胎毒性影响的结果表明：三唑磷和氰戊菊酯以多种不同毒性配比时，对稀有鮈鲫胚胎毒性的AI值的范围为4.14～6.09，即毒性增加倍数为5.14～7.09，暗示这两种农药对稀有鮈鲫胚胎毒性产生了显著的协同效应，即二者混合时均增加对稀有鮈鲫胚胎毒性(表1)。三唑磷和氰戊菊酯也对稀有鮈鲫胚胎产生了如心包水肿、卵黄囊水肿、脊柱弯曲和尾部弯曲等中毒症状。

表1三唑磷和氰戊菊酯联合作用对稀有鮈鲫胚胎毒性效应

^a三唑磷和氰戊菊酯单独作用时对稀有鮈鲫胚胎毒性的LC₅₀(95％置信限)。

^b三唑磷和氰戊菊酯联合作用时对稀有鮈鲫胚胎毒性的LC₅₀(95％置信限)。

^c相加指数值。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法，其特征在于，所述稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法包括：

2.如权利要求1所述的稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法，其特征在于，所述第一步试验时加入取农药储备液用标准稀释水按等比级差逐级稀释所需浓度5～7个，采用24孔细胞培养板为暴露容器，每孔加入1枚受精卵，每浓度设3个重复，每个重复为1块24孔板，其中20个孔注入试验药液，另外4孔作为助溶剂对照；空白对照组24个孔均注入标准稀释水，空白对照组也设置3个重复，每24h更换1次药液，染毒96h后记录胚胎死亡率和中毒症状。

3.如权利要求1所述的稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法，其特征在于，所述第二步混合体系中两种农药的毒性单位比为4:1、3:2、1:1、2:3和1:4。

4.如权利要求3所述的稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法，其特征在于，在不同毒性比的混合农药体系中，每个毒性比均以等对数间距设置5～7个不同的浓度。

5.如权利要求3所述的稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法，其特征在于，染毒96h后，采用DPS软件分别求出两种农药在混合体系中的LC₅₀值及其95％置信限。

6.如权利要求1所述的稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法，其特征在于，所述第三步采用公式求出生物毒性作用之和S：S＝Am/Ai+Bm/Bi，式中Am和Bm分别是混合体系中各农药的毒性LC₅₀，Ai和Bi分别是A和B农药单独作用时的毒性LC₅₀；将S转换成相加指数AI；

当S≤1时，AI＝(1/S)-1.0；当S>1时，AI＝1.0–S；最后用AI值评价农药的复合效应，采用-0.2<AI<0.25时为相加作用，将AI值设定一个区间为相加作用，毒性增加倍数＝AI+1。

7.如权利要求6所述的稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法，其特征在于，采用-0.2<AI<0.25时为相加作用，将AI值设定一个区间为相加作用。

8.如权利要求1所述的稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法，其特征在于，所述稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法三唑磷和氰戊菊酯配比时，对稀有鮈鲫胚胎毒性的AI值的范围为4.14～6.09，毒性增加倍数为5.14～7.09。

9.一种水体农药复合暴露的监测预警方法，其特征在于，所述水体农药复合暴露的监测预警方法使用如权利要求1～8任意一项所述的稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法。

10.一种水体农药复合暴露的修复治理方法，其特征在于，所述水体农药复合暴露的修复治理方法使用如权利要求1～8任意一项所述的稀有鮈鲫胚胎毒性测定方法。