[go: up one dir, main page]

CN111876402A - 一种固定化头孢菌素c酰化酶的制备方法 - Google Patents

一种固定化头孢菌素c酰化酶的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111876402A
CN111876402A CN202010615993.9A CN202010615993A CN111876402A CN 111876402 A CN111876402 A CN 111876402A CN 202010615993 A CN202010615993 A CN 202010615993A CN 111876402 A CN111876402 A CN 111876402A
Authority
CN
China
Prior art keywords
phosphate buffer
enzyme
solution
acylase
stirring
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010615993.9A
Other languages
English (en)
Inventor
何锡林
张云辉
李琨
韩原亮
赵洋
秦卫宁
马利萍
杨胜强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ili Chuanning Biological Technology Co ltd
Original Assignee
Ili Chuanning Biological Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ili Chuanning Biological Technology Co ltd filed Critical Ili Chuanning Biological Technology Co ltd
Priority to CN202010615993.9A priority Critical patent/CN111876402A/zh
Publication of CN111876402A publication Critical patent/CN111876402A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01093—Glutaryl-7-aminocephalosporanic-acid acylase (3.5.1.93)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种固定化头孢菌素C酰化酶的制备方法，它包括如下步骤：(1)破碎菌体；(2)澄清浓缩；(3)盐析；(4)脱盐；(5)吸附解析；(6)加载固化；(7)贮存。本发明的固定化头孢菌素C酰化酶的制备方法，降低了提取所需设备成本及生产成本。降低了杂质酯酶含量，缩短了反应时间，提高了反应批次。

Description

一种固定化头孢菌素C酰化酶的制备方法
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，涉及一种固定化头孢菌素C酰化酶的方法。
背景技术
头孢菌素C酰化酶(CCA)是一步酶法生产7-氨基头孢氨酸(7-ACA) 的关键酶，能够将原料头孢菌素C(CPC)直接催化，脱去7-位的D-α氨基己二酰侧链，生成7-ACA。
头孢菌素C酰化酶(CCA)作用分子式如下所示：
Figure BDA0002563748420000011
头孢菌素C酰化酶(CCA)生产过程中，用大孔树脂吸附与离子交换时两者对滤液的要求较高，滤液中含有大量的无机离子影响树脂吸附与交换；滤液中还大量存在可溶性蛋白，使树脂污染，吸附效果变差，树脂使用寿命变短；现有提取CPC酰化酶方法生产的固定化CPC酰化酶D值较高，酶活衰减快，反应批次少；已有文献报道的提取CPC酰化酶的方法满足CPC残留≤200时反应时间较长，D值平均残留≥0.4，难以满足7-ACA生产的需求。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种固定化头孢菌素C酰化酶的制备方法，它包括如下步骤：
(1)破碎菌体：取头孢菌素C酰化酶发酵液离心，收集发酵菌体，加磷酸盐缓冲液，混匀，均质，均质液加入絮凝剂，搅拌，离心，收集轻相得粗液酶；
(2)澄清浓缩：向步骤(1)粗液酶加入氯化钙溶液，离心，收集上清液浓缩，得浓缩液；
(3)盐析：向步骤(2)浓缩液加入硫酸铵，溶解，混匀，降温至15-20℃，搅拌，离心收集重相蛋白，加入磷酸盐缓冲液溶解，离心，收集轻相得液酶；
(4)脱盐：将步骤(3)液酶降温至8-15℃，脱盐，得脱盐液；
(5)吸附解析：将步骤(4)脱盐液上样于树脂柱，用含0.03-0.05mol/l Nacl的磷酸盐缓冲液解析，收集解析液；
(6)加载固定：向步骤(5)解析液加入大孔吸附树脂，搅拌固化，得固定化头孢菌素C酰化酶；
(7)贮存：漂洗步骤(6)固定化酶，干燥，加入生物酶杀菌剂，搅拌，即得。
进一步的，步骤(1)所述加磷酸盐缓冲液至原体积的2.5倍；所述均质压强为80-120Mpa；所述均质液用12％氢氧化钾调pH值至6.8-7.2；所述均质液与絮凝剂的体积比1000：23；所述搅拌时间为1h。
进一步的，所述絮凝剂为聚季铵盐-37。
进一步的，步骤(2)所述粗液酶与氯化钙溶液的体积比为1000:18；所述氯化钙溶液浓度为25％；所述浓缩是用能截留分子量10000的超滤膜浓缩。
进一步的，步骤(3)所述加硫酸铵至其浓度为1.5-2.2mol/L；所述搅拌速度为20-30rpm，时间2h；所述重相蛋白与磷酸缓冲盐的质量体积比为1： 7.5。
进一步的，步骤(4)所述脱盐是用能去小分子阴离子的脱盐膜组脱盐。
进一步的，步骤(5)所述磷酸盐缓冲液的用量为1.5BV。
进一步的，步骤(6)所述大孔吸附树脂的加入量为每1g大孔吸附树脂加载1500u酶活；所述固化温度为25-28℃，时间24h。
进一步的，步骤(7)所述漂洗是用10倍体积纯化水漂洗；所述干燥是离心甩干；所述生物酶杀菌剂与干燥后固定化酶的体积质量比为5：1；所述生物酶杀菌剂是将生物酶杀菌剂以12g:1000ml比例溶解在磷酸盐缓冲液中制备而成的
进一步的，所述磷酸盐缓冲液是0.1M pH7.50磷酸钾缓冲液。
本发明固定化头孢菌素C酰化酶的制备方法，生产的固化酶酶活平均值为153u/ml，裂解验证CPC残留效价≤200时平均反应时间为40min，D平均值为0.36，降低了杂质酯酶含量，缩短了反应时间，提高了固定化头孢菌素C酰化酶的裂解反应批次，降低了提取所需设备成本及生产成本，具有推广应用价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1工艺流程图
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1本发明固定化头孢菌素C酰化酶制备
(1)取头孢菌素C酰化酶发酵液离心，收集发酵菌体，在收集的发酵菌体中加入0.1M pH7.50磷酸钾缓冲液稀释至原体积的2.5倍，混合均匀得到细胞液，将混合均匀的细胞液打入高压均质机中，以80-120Mpa均质，得均质液，均质液用12％氢氧化钾调pH值至6.8-7.2，按23L/m3的比例加入聚季铵盐-37絮凝，搅拌1h后，离心，收集上清液，得粗液酶。
(2)取步骤(1)粗液酶加入25％氯化钙溶液18L/m3，离心收集上清液。
(3)将步骤(2)上清液于截留分子量10000的超滤膜中浓缩，收集得到浓缩液。
(4)取步骤(3)浓缩液，加入硫酸铵至浓缩液中硫酸铵浓度1.5-2.2mol/L，溶解混匀，降温至15-20℃，搅拌转速20-30rpm盐析2h，离心收集重相蛋白，加入7.5倍量(v/w，ml/g)0.1M pH7.50磷酸钾缓冲液，溶解蛋白，进行离心，收集轻相得到纯化后液酶；
(5)将步骤(4)液酶降温至8-15℃，再用能脱去小分子阴离子脱盐膜组脱盐，得到脱盐液；
(6)将步骤(5)脱盐液缓慢加入树脂柱吸附，待脱盐液吸附完毕，再用1.5BV含0.03-0.05mol/L Nacl的磷酸钾缓冲液(磷酸钾缓冲液是0.1M pH7.50磷酸钾缓冲液)，进行解析，收集解析液；
(7)将步骤(6)解析液，按1500U/g投入大孔吸附树脂载体，缓慢搅拌，控制温度25-28℃，固定化24h，得固定化头孢菌素C酰化酶；
(8)贮存：将步骤(7)固定化头孢菌素C酰化酶用10倍体积(v/w) 纯化水漂洗，再上料于离心机离心40min，得到固定化头孢菌素C成品，成品加入5倍量(v/w)的12‰生物酶杀菌剂(生物酶杀菌剂按12g:1000ml比例溶解在磷酸盐缓冲液中)搅拌30min，即得。
按照上述方法(工艺流程图见图1)，共生产15批固定化头孢菌素C 酰化酶，生产检测记录见表1。
表1固定化头孢菌素C酰化酶生产检测记录
Figure BDA0002563748420000041
从上表可见：用本发明固定化头孢菌素C酰化酶的制备方法，生产的固化酶酶活平均值为153u/ml，裂解验证CPC残留效价≤200时平均反应时间为40min，D平均值为0.36。
综合考虑固定化CPC酰化酶反应时间、反应批次及成品D值，本发明可以显著提高CPC酰化酶的质量，降低杂质D含量。
综上，本发明固定化头孢菌素C酰化酶的制备方法，生产的固化酶酶活平均值为153u/ml，裂解验证CPC残留效价≤200时平均反应时间为40min， D平均值为0.36，降低了杂质酯酶含量，缩短了反应时间，提高了固定化头孢菌素C酰化酶的裂解反应批次，降低了提取所需设备成本及生产成本，具有推广应用价值。

Claims (10)

1.一种固定化头孢菌素C酰化酶的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)破碎菌体：取头孢菌素C酰化酶发酵液离心，收集发酵菌体，加磷酸盐缓冲液，混匀，均质，均质液加入絮凝剂，搅拌，离心，收集轻相得粗液酶；
(2)澄清浓缩：向步骤(1)粗液酶加入氯化钙溶液，离心，收集上清液浓缩，得浓缩液；
(3)盐析：向步骤(2)浓缩液加入硫酸铵，溶解，混匀，降温至15-20℃，搅拌，离心收集重相蛋白，加入磷酸盐缓冲液溶解，离心，收集轻相得液酶；
(4)脱盐：将步骤(3)液酶降温至8-15℃，脱盐，得脱盐液；
(5)吸附解析：将步骤(4)脱盐液上样于树脂柱，用含0.03-0.05mol/l Nacl的磷酸盐缓冲液解析，收集解析液；
(6)加载固定：向步骤(5)解析液加入大孔吸附树脂，搅拌固化，得固定化头孢菌素C酰化酶；
(7)贮存：漂洗步骤(6)固定化酶，干燥，加入生物酶杀菌剂，搅拌，即得。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(1)所述加磷酸盐缓冲液至原体积的2.5倍；所述均质压强为80-120Mpa；所述均质液用12％氢氧化钾调pH值至6.8-7.2；所述均质液与絮凝剂的体积比1000：23；所述搅拌时间为1h。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于：所述絮凝剂为聚季铵盐-37。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(2)所述粗液酶与氯化钙溶液的体积比为1000:18；所述氯化钙溶液浓度为25％；所述浓缩是用能截留分子量10000的超滤膜浓缩。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(3)所述加硫酸铵至其浓度为1.5-2.2mol/L；所述搅拌速度为20-30rpm，时间2h；所述重相蛋白与磷酸缓冲盐的质量体积比为1：7.5。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(4)所述脱盐是用能去小分子阴离子的脱盐膜组脱盐。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(5)所述磷酸盐缓冲液的用量为1.5BV。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(6)所述大孔吸附树脂的加入量为每1g大孔吸附树脂加载1500u酶活；所述固化温度为25-28℃，时间24h。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(7)所述漂洗是用10倍体积纯化水漂洗；所述干燥是离心甩干；所述生物酶杀菌剂与干燥后固定化酶的体积质量比为5：1；所述生物酶杀菌剂是将生物酶杀菌剂以12g:1000ml比例溶解在磷酸盐缓冲液中制备而成。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液是0.1M pH7.50磷酸钾缓冲液。
CN202010615993.9A 2020-06-30 2020-06-30 一种固定化头孢菌素c酰化酶的制备方法 Pending CN111876402A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010615993.9A CN111876402A (zh) 2020-06-30 2020-06-30 一种固定化头孢菌素c酰化酶的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010615993.9A CN111876402A (zh) 2020-06-30 2020-06-30 一种固定化头孢菌素c酰化酶的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111876402A true CN111876402A (zh) 2020-11-03

Family

ID=73157698

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010615993.9A Pending CN111876402A (zh) 2020-06-30 2020-06-30 一种固定化头孢菌素c酰化酶的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111876402A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999001566A1 (en) * 1997-07-03 1999-01-14 Dsm N.V. PREPARATION OF ENZYME WITH REDUCED β-LACTAMASE ACTIVITY
CN1428423A (zh) * 2002-12-30 2003-07-09 湖南福来格生物技术有限公司 一种戊二酰－7－氨基头孢烷酸酰化酶提取纯化方法
CN101173264A (zh) * 2007-10-31 2008-05-07 天津大学 β-甘露聚糖酶复合制剂及其制备方法
CN104593351A (zh) * 2014-12-30 2015-05-06 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 一种制备头孢菌素c酰化酶固定化酶的方法
CN105087537A (zh) * 2015-09-16 2015-11-25 山东鲁抗立科药业有限公司 一种7-aca固定化酶lk118的制备及其使用方法
CN107177583A (zh) * 2017-07-27 2017-09-19 河北华石生物科技有限公司 一种固定化酰化酶稳定剂及提高固定化酰化酶储存稳定性的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999001566A1 (en) * 1997-07-03 1999-01-14 Dsm N.V. PREPARATION OF ENZYME WITH REDUCED β-LACTAMASE ACTIVITY
CN1428423A (zh) * 2002-12-30 2003-07-09 湖南福来格生物技术有限公司 一种戊二酰－7－氨基头孢烷酸酰化酶提取纯化方法
CN101173264A (zh) * 2007-10-31 2008-05-07 天津大学 β-甘露聚糖酶复合制剂及其制备方法
CN104593351A (zh) * 2014-12-30 2015-05-06 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 一种制备头孢菌素c酰化酶固定化酶的方法
CN105087537A (zh) * 2015-09-16 2015-11-25 山东鲁抗立科药业有限公司 一种7-aca固定化酶lk118的制备及其使用方法
CN107177583A (zh) * 2017-07-27 2017-09-19 河北华石生物科技有限公司 一种固定化酰化酶稳定剂及提高固定化酰化酶储存稳定性的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
INMACULADA等: "Characterization of cross-linked immobilized arylesterase from Gluconobacter oxydans 621H with activity toward cephalosporin C and 7-aminocephalosporanic acid", 《BIOCATALYSTS AND BIOREACTOR DESIGN》 *
KLEI等: "Purification and preliminary crystallographic studies of penicillin G acylase from Providencia rettgeri", 《PROTEIN SCIENCE》 *
徐文玲: "头孢菌素C酰化酶提取及固定化工艺研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *
高孔荣等: "《食品分离技术》", 30 November 1998 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107446981B (zh) 一种牛胶原蛋白肽的分级提取工艺
CN102321681A (zh) 一种制备没食子酸的方法及装置
CN103525800A (zh) 一种聚乙烯醇固定化酰化酶的制备方法及其应用
JP4427450B2 (ja) 乳酸含有発酵生成物からバイオマスを凝集で分離
CN111876402A (zh) 一种固定化头孢菌素c酰化酶的制备方法
EP0323790A1 (fr) Procédé continu d'obtention de gélatine à partir de poudre d'os et gélatine obtenue
CN103602649B (zh) 一种木瓜蛋白酶的提纯方法
CN116640742A (zh) 一种酸性磷酸酶突变体、其应用及其制备烟酰胺核糖的方法
CN110128286B (zh) 一种谷氨酸提取结晶工艺
CN117447512A (zh) 一种玉米浸泡水为原料生产植酸钾的方法
CN113005161A (zh) 一种聚唾液酸的制备方法及聚唾液酸制品
JPS5928484A (ja) Ｌ−アミノ酸の単離方法
SU1575946A3 (ru) Способ получени концентрата глюкозоизомеразы
RU2425878C1 (ru) Способ производства сычужного фермента
CN111362982B (zh) 一种磷酸吡哆醛的精制方法
CN105002156A (zh) 一种氢过氧化物裂解酶的固定化方法
CN111166873B (zh) 重组汉逊酵母表达的手足口病疫苗抗原的粗纯工艺、疫苗原液及其制备方法
CN104593351B (zh) 一种制备头孢菌素c酰化酶固定化酶的方法
JP4662846B2 (ja) 酒類のオリ下げ剤
CN104557575A (zh) 氨基酸产品中美拉德产物的去除方法
CN1918289A (zh) 生产乳过氧化物酶的方法
CN106554273A (zh) 一种发酵液中长链二羧酸的提纯方法
RU2467068C1 (ru) Способ производства молокосвертывающего ферментного препарата
JP2717227B2 (ja) 固定化ウレアーゼとそれを用いた酒類の製造方法
CN110407893B (zh) 一种去除d组分提高酒石酸泰乐菌素质量的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20201103