CN111855624B - 一种用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
一种用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111855624B CN111855624B CN201910361498.7A CN201910361498A CN111855624B CN 111855624 B CN111855624 B CN 111855624B CN 201910361498 A CN201910361498 A CN 201910361498A CN 111855624 B CN111855624 B CN 111855624B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- electrode
- electrochemical
- antibody
- cad
- emt
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000007705 epithelial mesenchymal transition Effects 0.000 title claims abstract description 85
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 claims abstract description 40
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 25
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 25
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 23
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000001903 differential pulse voltammetry Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 28
- 239000002041 carbon nanotube Substances 0.000 claims description 22
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 claims description 19
- 229910021393 carbon nanotube Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 239000003607 modifier Substances 0.000 claims description 14
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 claims description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 10
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 8
- 229910021397 glassy carbon Inorganic materials 0.000 claims description 8
- PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(=O)NC(CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 7
- 238000000970 chrono-amperometry Methods 0.000 claims description 7
- 229920000371 poly(diallyldimethylammonium chloride) polymer Polymers 0.000 claims description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 6
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 claims description 5
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims description 5
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 claims description 2
- 239000003115 supporting electrolyte Substances 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 2
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims 1
- 238000005498 polishing Methods 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 abstract description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000004791 biological behavior Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 64
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 17
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 12
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 12
- -1 AgCl (saturated KCl Chemical class 0.000 description 10
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 9
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 9
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 108050000637 N-cadherin Proteins 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 4
- 102100035071 Vimentin Human genes 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 3
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000002484 cyclic voltammetry Methods 0.000 description 3
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- UHYPYGJEEGLRJD-UHFFFAOYSA-N cadmium(2+);selenium(2-) Chemical class [Se-2].[Cd+2] UHYPYGJEEGLRJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000006557 surface reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010877 transwell invasion assay Methods 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- BUOYTFVLNZIELF-UHFFFAOYSA-N 2-phenyl-1h-indole-4,6-dicarboximidamide Chemical compound N1C2=CC(C(=N)N)=CC(C(N)=N)=C2C=C1C1=CC=CC=C1 BUOYTFVLNZIELF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000009650 gentamicin protection assay Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000002048 multi walled nanotube Substances 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000004094 preconcentration Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
- G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供一种用于细胞上皮‑间质转化检测的电化学生物传感器及其制备方法和应用，属于分子生物学和生物传感器制备技术领域。本发明制备得到的电化学生物传感器能够专门检测EMT的标志蛋白(E‑钙粘蛋白)的变化，并能够有效地分析EMT的不同阶段。由于分子信息传输到电子设备，EMT的信号被大大放大。同时由于QD和碳纳米管‑金纳米颗粒的协同作用，使用差分脉冲伏安法检测时，电化学信号的响应快速且灵敏，能够有效推动电化学生物传感技术应用于复杂生物学行为的研究，因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和生物传感器制备技术领域，具体涉及一种用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
上皮-间充质转化(EMT)在多种生物过程中发挥重要作用，如胚胎发育，组织生长和伤口愈合等等。越来越多的证据表明EMT在肿瘤进展中起关键作用，EMT会促进良性肿瘤细胞向周围组织的浸润并转移到远处的部位。在EMT发生期间，上皮细胞失去极性和细胞间连接，呈现细长的形态，并获得细胞运动能力。许多分子，如作为转化生长因子(TGF)和表皮生长因子(EGF)，已被确定能够诱发EMT的发生。此外，EMT过程中涉及几个分子事件，包括：转录因子的激活、表达特定的蛋白质以及细胞骨架的重排。
目前EMT主要通过传统方法进行检测，如Western blotting和免疫荧光显微镜。但是，发明人发现，上述方法存在包括检测时间长，步骤繁琐，成本高等缺陷。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供一种用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器及其制备方法和应用，所述电化学生物传感器能够专门检测EMT的标志蛋白(E-钙粘蛋白)的变化，从而能够有效地分析EMT的不同阶段。本发明中，由于分子信息传输到电子设备，EMT的信号被大大放大，同时由于CdSe/ZnS量子点(QD)和碳纳米管-金纳米颗粒的协同作用，使用差分脉冲伏安法检测时，电化学信号的响应快速且灵敏，且基于QD的独特性能，可以在检测电化学信号的同时实现荧光检测。因此本发明技术方案具有良好的实际应用之价值。
本发明基于以下技术方案实现上述技术目的：
本发明的第一个方面，提供一种用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器，所述电化学生物传感器至少包括羧基化碳纳米管-金纳米颗粒(CNT-AuNP)改性电极；以及E-cad-抗体-QD探针。
本发明的第二个方面，提供上述用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器的制备方法，所述制备方法包括：
羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极的制备；和，
E-cad-抗体-QD探针的制备。
其中，所述羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极的制备方法包括：
将羧基化碳纳米管悬浮液与含有HAuCl4的溶液混合得改性剂，将电极置于改性剂中，采用计时电流法即得羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极。
所述E-cad-抗体-QD探针的制备方法包括：
向羧基量子点溶液中加入E-cad-抗体和偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)在室温下搅拌处理1～2小时进行缀合反应，经纯化后即得。
本发明的第三个方面，提供上述电化学生物传感器在细胞上皮-间质转化检测中的应用。
本发明的第四个方面，提供一种用于细胞上皮-间质转化检测的方法，所述方法包括使用所述电化学生物传感器基于电化学和荧光信号检测E-钙粘蛋白的变化进而分析细胞上皮-间质转化；
具体的，羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极为工作电极，以Ag/AgCl(饱和KCl)作为参比电极，铂丝作为对电极，连接至电化学工作站，Hg2+-乙酸缓冲液溶液作为支持电解液，将待测样品与E-cad-抗体-QD探针进行孵育后，采用差分脉冲伏安法(DPV)进行电化学检测；同时基于免疫荧光技术进行荧光检测。
本发明的优点和积极效果：
本发明设计一种新型电化学生物传感器，能够使用E-钙粘蛋白作为生物标志物检测EMT。QD和CNT-AuNP纳米复合材料用于增强EMT生物传感器的灵敏度。本发明制备的EMT电化学生物传感器具有优于常规方法的若干优点。首先，EMT生物传感器中含有的E-cad-抗体探针可以特异性识别活细胞中的E-钙粘蛋白。因此，EMT生物传感器可以在不同时间点区分TGFβ处理后的EMT阶段。
此外，由于QD的独特性能，可以在检测电化学信号的同时实现荧光检测。最后，电化学EMT生物传感器是检测原位细胞中EMT的理想选择，检测时间短，灵敏度高。电化学检测不需要细胞裂解、固定和二抗孵育，从而节省时间和成本。
与传统标准方法相比，本发明制备的电化学生物传感器可以在更短的时间内检测EMT，并且在活细胞中具有更高的灵敏度。同时，本发明电化学生物传感器可以扩展到各种细胞过程，如细胞迁移、细胞凋亡、坏死、多药耐药性和其他相关领域，能够有效推动电化学生物传感技术应用于复杂生物学行为的研究，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1使用A549细胞建立EMT模型，基于EMT生物传感器的电化学检测流程图；其中图1(a)为用E-钙粘蛋白，N-钙粘蛋白，ZO-1，波形蛋白和α-微管蛋白抗体通过蛋白质印迹分析TGFβ处理前后的A549细胞图；图1(b)为EMT前后A549细胞的明视野图像；图1(c)为在TGFβ诱导之前和之后的A549细胞中的Transwell侵袭测定图(比例尺，200μm)；图1(d)为TGFβ处理前后视野中细胞数的统计分析图；图1(e)为通过免疫荧光显微术(比例尺，10μm)检测E-钙粘蛋白，N-钙粘蛋白，ZO-1，波形蛋白和α-微管蛋白水平图。
图2为本发明实施例1中的纳米复合材料的形态，结构和电化学性能的表征图；其中，图2(a-c)AuNP(a)，CNT(b)和CNT-AuNP(比例尺，50nm)的透射电子显微镜图像；图2(d)为CNT-AuNP的X射线衍射图谱；图2(e)是以50mV/s的扫描速率记录在10mM K3[Fe(CN)6]中的裸GCE，CNT/GCE和CNT-AuNPs/GCE的循环伏安曲线图；图2(f)为CNT-AuNPs/GCE的动力学分析图，扫描速率范围为10-100mV/s，表明修饰电极的反应是扩散控制的表面反应；图2(g)为氧化峰值电流(Ipa)和降低的峰值电流(Ipc)与扫描速率的平方根(v1/2)的线性拟合图。
图3为本发明实施例1中的制备的探针的特异性和灵敏度分析图；其中，图3(a)用标准抗体和E-cad-抗体-QD探针孵育不同浓度细胞的E-钙粘蛋白的Western印迹图；图3(b)为来自不同浓度细胞的荧光强度曲线图；图3(c)为通过E-cad-抗体-QD探针，具有HNO3溶液的E-cad-抗体-QD探针和纯QD(比例尺，25μm)染色的细胞的免疫荧光显微镜检查图；图3(d)使用差分脉冲伏安法测量制备的电化学生物传感器的响应电流图，使用和不使用细胞传感器测量；图3(e)为优化E-cad-QD探针从0分钟到180分钟的孵育时间图。
图4为本发明实施例1中使用EMT生物传感器对蛋白质水平和不同细胞浓度进行电化学检测图；其中，图4(a)为差异脉冲伏安法检测不同浓度的E-钙粘蛋白图，范围为1-900ng/mL；图4(b)为校准曲线图，显示生物传感器在检测E-钙粘蛋白中的线性关系，误差棒代表平均值±标准偏差(n＝5)；图4(c)为差异脉冲伏安法检测不同浓度的细胞图，范围为7.0×102-4.1×105个细胞/mL。
图5为本发明实施例1中的使用EMT生物传感器检测EMT的阶段图；其中图5(a)为通过TGF诱导的细胞中E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白的蛋白质印迹0至72小时图；图5(b)为通过免疫荧光显微术(比例尺，50μm)评估在不同时间点的TGFβ处理后的E-钙粘蛋白表达图；图5(c)为通过差分脉冲伏安法使用生物传感器对不同程度的EMT进行电化学检测图；图5(d)为校准曲线显示电流和诱导时间之间的关系图。误差棒代表平均值±标准偏差(n＝3)。
图6为本发明实施例1中的EMT生物传感器适用于多种细胞系演示图；其中，图6(a)为在TGFβ处理之前和之后RBE，MCF7，SKOV3和PANC1的免疫荧光照片；图6(b-d)为Western印迹显示在TGFβ处理之前和之后RBE，MCF7，SKOV3和PANC1细胞中的E-钙粘蛋白；使用制备的生物传感器对图6(b)RBE，图6(c)MCF7，图6(d)SKOV3和图6(e)PANC1进行EMT电化学检测。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，EMT主要通过传统方法进行检测，如Western blotting和免疫荧光显微镜。但是，上述方法存在包括检测时间长，步骤繁琐，成本高等缺陷。
而已知钙粘蛋白家族成员E-cadherin(E-cad)的下调是EMT起始的关键事件之一。E-cadherin的表达与肺、肝、卵巢和胃相关癌症的病理分类和分期呈负相关。同时，CdSe/ZnS量子点(QD)是制备EMT电化学生物传感器的良好工具，因为它具有高电子密度和尺寸可调节的独特特性以及窄的荧光发射光谱，所以能够实现细胞中荧光和电化学信号的同步检测。
有鉴于此，本发明的一个典型实施方式中，提供一种用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器，所述电化学生物传感器至少包括羧基化碳纳米管-金纳米颗粒(CNT-AuNP)改性电极；以及E-cad-抗体-QD探针。
本发明的又一具体实施方式中，所述羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极，其制备方法为：
将羧基化碳纳米管悬浮液与含有HAuCl4的溶液混合得改性剂，将电极置于改性剂中，采用计时电流法即得羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极。
本发明的又一具体实施方式中，所述改性剂中羧基化碳纳米管与HAuCl4的质量摩尔比为2～4mg:8～12mmol(优选为3mg:10mmol)。
本发明的又一具体实施方式中，所述羧基化碳纳米管悬浮液制备方法为：将CNT超声分散在0.4％聚二烯丙基二甲基氯化铵中0.5～2小时(优选为1小时)，离心并用双蒸水洗涤至少3次即得。
本发明的又一具体实施方式中，所述含有HAuCl4的溶液由L-半胱氨酸、H2SO4和HAuCl4组成。
本发明的又一具体实施方式中，所述含有HAuCl4的溶液组成为：0.1mM L-半胱氨酸，0.1M H2SO4,5mM HAuCl4。
本发明的又一具体实施方式中，所述E-cad-抗体-QD探针，其制备方法包括：向羧基量子点溶液中加入E-cad-抗体和偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐进行缀合反应，经纯化后即得。
本发明的又一具体实施方式中，所述纯化具体方法为将缀合物过0.2μm滤膜除去大聚集体，并使用硼酸盐缓冲液洗涤至少5次。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器的制备方法，所述制备方法包括：
羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极的制备；和，E-cad-抗体-QD探针的制备。
本发明的又一具体实施方式中，所述羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极的制备方法包括：
将羧基化碳纳米管悬浮液与含有HAuCl4的溶液混合得改性剂，将电极置于改性剂中，采用计时电流法即得羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极。
本发明的又一具体实施方式中，所述计时电流法处理条件为：固定沉积电压为300～500mv(优选为400mv)；处理时间为100～130s(优选为120s)；通过优化处理条件，有利于吸附有纳米金颗粒的碳纳米管沉积附着于电极上。
本发明的又一具体实施方式中，所述电极为预处理后的玻碳电极。
本发明的又一具体实施方式中，所述预处理方法为：依次使用直径为0.3μm和0.05μm的氧化铝粉末抛光玻碳电极GCE的表面以除去氧化物层；同时为了除去其他物理吸附的物质，使用双蒸水和乙醇超声清洗电极表面；然后立即在氮气下干燥玻碳电极GCE。
本发明的又一具体实施方式中，所述改性剂中羧基化碳纳米管与HAuCl4的质量摩尔比为2～4mg:8～12mmol(优选为3mg:10mmol)。
本发明的又一具体实施方式中，所述羧基化碳纳米管悬浮液制备方法为：将CNT超声分散在0.4％聚二烯丙基二甲基氯化铵中0.5～2小时(优选为1小时)，离心并用双蒸水洗涤至少3次即得。
本发明的又一具体实施方式中，所述含有HAuCl4的溶液由L-半胱氨酸、H2SO4和HAuCl4组成。
本发明的又一具体实施方式中，所述含有HAuCl4的溶液组成为：0.1mM L-半胱氨酸，0.1M H2SO4,5mM HAuCl4。
本发明的又一具体实施方式中，所述E-cad-抗体-QD探针的制备方法包括：
向羧基量子点溶液中加入E-cad-抗体和偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)在室温下搅拌处理1～2小时进行缀合反应，经纯化后即得。
本发明的又一具体实施方式中，所述纯化具体方法为将缀合物过0.2μm滤膜除去大聚集体，并使用硼酸盐缓冲液洗涤至少5次。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述电化学生物传感器在细胞上皮-间质转化检测中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于细胞上皮-间质转化检测的方法，所述方法包括使用所述电化学生物传感器基于电化学和荧光信号检测E-钙粘蛋白的变化进而分析细胞上皮-间质转化；
羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极为工作电极，以Ag/AgCl(饱和KCl)作为参比电极，铂丝作为对电极，连接至电化学工作站，Hg2+-乙酸缓冲液溶液作为支持电解液，将待测样品与E-cad-抗体-QD探针进行孵育(优选为2小时)后，采用差分脉冲伏安法(DPV)进行电化学检测；同时基于免疫荧光技术进行荧光检测。
本发明的又一具体实施方式中，所述Hg2+-乙酸缓冲液溶液pH为5.2。
下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。
实施例1
1、化学品和试剂
羧基化碳纳米管(CNT，直径30-50nm，平均长度10-20μm)购自Xfnano MaterialsTech(南京，中国)。Qdot TM 655ITK TM羧基量子点(Q21321MP)获自Thermo FisherScientific(Waltham，MA，USA)。硼酸，氯化钾(KCl)和磷酸盐均购自Sinopharm GroupChemical Reagent Co.LTD(中国)。抗-E-cad抗体，抗-N-cad抗体，抗ZO-1抗体，抗波形蛋白抗体由抗体cam提供。E-钙粘蛋白蛋白和氯金酸(HAuCl4)购自Sigma-Aldrich。使用双蒸水制备所有检测系统。
2、细胞培养和EMT模型的构建
将A549，PANC1和MCF7细胞培养在补充有10％FBS的DMEM培养基中。RBE和SKOV3细胞在补充有10％FBS的RPMI1640培养基中培养。所有细胞均购自中国科学院细胞库。细胞在5％CO2和37℃的潮湿气氛中生长。将细胞接种在6孔板中用于Western印迹分析，并将24孔板接种用于免疫荧光染色和电化学检测。通过将TGF加入培养基中以15ng/mL的终浓度诱导EMT并孵育48小时。
3、免疫荧光显微镜
在用或不用TGF(15ng/ml)孵育的载玻片上生长的细胞用PBS洗涤两次，然后用4％多聚甲醛(PFA)固定20分钟。用0.2％Triton X-100/PBS透化并在室温下用4％BSA封闭1小时后，孵育细胞并用抗体染色过夜。用PBS洗涤后，将载玻片与二抗在室温下孵育2小时。用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)显现细胞核。在没有第二抗体的情况下进行活细胞染色，并且在固定步骤之前与E-cad-抗体-QD一起孵育2小时。
4、蛋白质印迹分析
在SDS-PAGE凝胶上分别拆分全细胞提取物并转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5％脱脂奶粉将膜封闭2小时，然后与5％脱脂奶粉中的一抗在4℃温育过夜。通过在含有0.1％Tween-100的TBST(每次3×5分钟)中洗涤膜除去过量的一抗后，将二抗偶联的辣根过氧化物酶与膜在室温下温育1小时。然后将膜在TBST中洗涤(每次3×5分钟)并用增强的化学发光检测试剂(Pierce Biotechnology)显色。使用E-cad-抗体-QD的Western印迹分析在没有二抗的情况下进行并且被蓝光激发。
5、Transwell迁移和侵袭测定
将饥饿24小时的细胞(5×104～1×105个细胞/孔)置于具有500μL含有10％FBS的培养基的transwell中，所述培养基在24孔板的下层中。在37℃温育24小时后，用甲醇固定迁移细胞，并用0.1％结晶紫染色。在显微镜下拍摄侵入的细胞，并从五个随机视野中计数。
6、制备E-cad-抗体-QD探针
根据QD产品规格，制备E-cad-抗体-QD纳米复合材料，并进行修改。简而言之，使用10mM硼酸盐缓冲液(pH7.4)将10μL羧基量子点的储备溶液稀释至2mL。向上述溶液中加入总共30μL E-cad-抗体，然后立即加入1.2μL5mg/mL EDC储备溶液。将溶液在室温下温和搅拌1-2小时以进行缀合。将缀合物溶液通过0.2μmPES注射器过滤器过滤以除去大聚集体，并使用50mM硼酸盐缓冲液(pH8.3)洗涤至少5次。将溶液浓缩至20μL并在4℃下储存。
7、电极修饰
用直径为0.3μm和0.05μm的氧化铝粉末抛光玻碳电极GCE的表面以除去氧化物层。为了除去其他物理吸附的物质，使用双蒸水和乙醇超声清洗电极表面。立即在氮气下干燥GCE。将CNT超声分散在0.4％聚二烯丙基二甲基氯化铵中1小时，然后离心并用双蒸水洗涤至少3次。通过将10μL CNT悬浮液(3mg/mL)置于20mL溶液(0.1mM L-半胱氨酸，0.1MH2SO4,5mMHAuCl4)中，将GCE置于混合溶液中然后在400mV下计时电流法测量120秒制备CNT-金纳米复合材料修饰的GCE。
8、电化学测量
用CHI400C恒电位仪电化学工作站(CH Instruments，Chenhua，China)进行电化学测量。CNT-AuNP改性的玻碳电极(GCE)用作工作电极，Ag/AgCl(饱和KCl)作为参比电极，铂丝(1mm直径)作为对电极。在铁氰化钾溶液(10mM)中以50mV/s在-0.1V和0.6V之间进行循环伏安法检测。
将细胞与E-cad-抗体-QD探针一起孵育2小时，然后用PBS洗涤三次。用0.1MHNO3溶解QD。在-1.1V的预浓缩步骤300秒后，在频率为15Hz的Hg2+-乙酸缓冲液(pH 5.2)溶液中，从-1.0V～0V进行QD的差分脉冲伏安法(DPV)检测，振幅为25mV，电位阶跃为4mV。所有电化学实验均在室温下进行。
结果分析：
1、EMT模型构建的表征
鉴于EMT在肺癌中进行了充分的研究，在本实施例中使用了公认的A549人肺癌细胞。分析了TGF处理前后EMT的各种标志物，以表征用于电化学检测的细胞EMT模型系统的成功构建。免疫印迹分析显示TGFβ处理48小时后E-cadherin水平下调，而N-cadherin表达上调，证明了EMT发生期间经典的钙粘蛋白转换。另外，ZO-1表达的下调和波形蛋白水平的上调也符合经典EMT标记物的变化(图1a)。还在明场中比较了TGF处理前后的细胞形态图像(图1b)。在TGFβ处理后，A549的形态从立方形的上皮状变为长的纺锤体的间充质状，这种形态可以促进细胞迁移，并且是经历EMT的细胞的定行为特性。在transwell侵袭测定中，用TGFβ+处理并用结晶紫染色的细胞数显着高于TGFβ-组(图1c)。还通过倒置显微镜计数入侵的TGFβ+细胞的数量来分析两组之间的侵袭率，与TGFβ-细胞相比，其从63.7％增加至76.7％(图1d)。免疫荧光染色结果也与免疫印迹分析一致，其显示EMT标志物的表达符合预期变化，包括E-钙粘蛋白，N-钙粘蛋白，ZO-1和波形蛋白(图1e)。这些结果表明EMT模型系统的成功建立。
2、纳米复合材料的表征和修饰电极的电催化活性
为了提高电极性能，使用羧基化多壁碳纳米管-金纳米颗粒(MWCNT-AuNP)纳米复合材料来修饰电极的表面。首先使用透射电子显微镜来表征MWCNT-AuNP的形态和结构，纯AuNPs被证明是均匀的球形结构，平均直径约为5nm(图2a)。如图2b所示，在聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDDA)(一种强阳离子聚电解质)的帮助下，清楚地显示了没有聚集的MWCNT的典型核-壳结构。由于静电吸附作用，具有负电荷的AuNP可以附着在CNT的表面上(图2c)。另外，进行EDX实验，来分析纳米材料的元素组成，结果分别显示出与AuNPs和CNT相对应的Au和C的峰明显，其中Cu和O相关的峰来自基片(图2d)。
裸GCE，CNT/GCE和CNT-AuNPs/GCE的电化学性能使用循环伏安法进行了研究，结果表明每个修饰电极都具有明显的氧化还原峰，这是由铁氰化物离子形成的(图2e)。根据Randles-Sevcik方程计算了CNT-AuNPs/GCE的微观电活性区域，其分别比裸GCE和CNT/GCE高2.6和1.7倍。这些结果说明改性纳米材料可以增强电极的导电性和敏感性。
通过分析扫描速率对氧化还原电流的影响研究修饰电极的动力学。当在10mM铁氰化钾溶液中、扫描速率为10-100mV/s时检测CNT-AuNPs/GCE的电化学性能，发现氧化还原反应的最大电流值随着扫描速率的增加而线性增加。此外，氧化还原峰之间的距离变得越来越远(图2f)。基于这些结果，对与扫描速率的平方根(v1/2)相关的氧化峰(Ipa)和还原(Ipc)峰值电流进行了线性拟合(图2g)。确定最终线性方程为Ipa＝13.79v1/2(mV/s)-4.19(R2＝0.99675)、Ipc＝-18.09v1/2(mV/s)-11.08(R2＝0.99991)。这些计算的结果表明，电化学信号是扩散控制表面反应的结果。
3、E-cad-抗体-QD探针的表征和实验条件的优化
为了探索这种探针的有效性，首先考虑了E-cad-抗体-QD是否能够特异性识别E-钙粘蛋白，这是EMT检测的先决条件。使用E-cad-抗体-QD和标准E-cad抗体比较了从不同浓度的细胞裂解的E-钙粘蛋白(图3a)。由E-cad-抗体-QD染色的膜比用标准抗体染色的膜更亮，并且荧光强度随着细胞浓度的增加而增加(图3b)。免疫荧光还证明制备的探针可以特异性结合E-钙粘蛋白，并且在QD被HNO3溶解后荧光信号消失。此外，用纯QD孵育的细胞缺乏荧光信号(图3c)。在有和没有A549细胞的情况下也进行了电化学检测，表明在-0.65V下针对探针的特异性电化学信号与细胞表面上的E-钙粘蛋白有关(图3d)。研究了孵育时间对E-cad-抗体-QD探针的影响，这可直接影响电化学生物传感器的性能。图3e显示了使用在不同孵育时间下制备的电化学EMT系统的DPV实验的结果。结果显示氧化电流从0增加到120分钟然后随时间降低，所以120分钟是探针孵育的最佳时间。
4、使用EMT传感系统在蛋白质水平和不同浓度的活细胞中进行电化学检测
首先在蛋白质水平上评估所提出的EMT传感系统的分析性能。差分脉冲伏安法测量显示，随着E-钙粘蛋白浓度的增加，QD的峰值电流信号被强化(图4a)。电流的增加归因于E-钙粘蛋白抗原在CNT-AuNP修饰的电极上更多地吸附E-cad-抗体-QD探针。所提出的生物传感器表现出明显的线性，E-cadherin浓度从1ng/mL到900ng/mL，线性回归方程计算为Y＝0.01X+1.83，Pearson系数为0.99(RSD从2.3％变为3.9％，n＝5)(图4b)。为了证明氧化峰的检测是评估细胞中E-钙粘蛋白表达的有效手段，使用生物传感器检测了不同浓度的A549细胞。当A549细胞的数量从7.0×102逐渐增加至4.1×105后，当前的DPV峰显著增加(图4c)，该结果与对Western印迹结果相对应(图3a)。这些结果表明，所提出的传感系统可用于检测E-钙粘蛋白并分析EMT过程。
5、在EMT过程中通过EMT电化学生物传感器检测电流的改变
为了研究EMT生物传感器的电化学性能，通过TGF-β处理得到不同阶段的EMT模型，并使用蛋白质印迹，免疫荧光显微镜和电化学方法对其进行检测。蛋白质印迹显示E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白水平如预期的那样改变，这证明了EMT过程(图5a)。α-微管蛋白水平没有明显变化。图5b显示了E-钙粘蛋白荧光强度随着诱导时间的增加而逐渐消失。差分脉冲伏安法测量显示，在EMT的后期阶段，峰值电流信号变小(图5c)。在五次独立的重复实验后拟合了电流和诱导时间的校准曲线，在EMT后期给出了线性电流响应，相关系数为0.98(RSD<3.0％，n＝5)(图5d)。当前信号显示早期EMT从0小时到24小时急剧下降，这与Western印迹结果相对应(图5a)。这些数据证明EMT电化学传感器可以区分EMT的不同阶段。
6、不同细胞系中的EMT检测
为了验证所制备的EMT电化学传感器应用的普遍性，使用蛋白质印迹、免疫荧光显微镜和本研究中制备的EMT传感器对TGF处理前后的RBE胆管癌、MCF7乳腺癌、SKOV3卵巢癌以及PANC1胰腺癌细胞系中的E-钙粘蛋白表达水平进行检测。免疫荧光显微镜(图6a)证明四种细胞系均被诱导入EMT。RBE(图6b)，MCF7(图6c)，SKOV3(图6d)和PANC1(图6e)细胞中的电化学信号在TGF处理后明显减弱，这与western印迹的结果一致。该现象证明EMT电化学传感器可用于多个细胞系中以进行EMT检测。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (19)
1.一种用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器，其特征在于，所述电化学生物传感器至少包括羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极；以及E-cad-抗体-QD探针；其中，QD为羧基量子点。
2.如权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极，其制备方法为：
将羧基化碳纳米管悬浮液与含有HAuCl4的溶液混合得改性剂，将电极置于改性剂中，采用计时电流法即得羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极。
3.如权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述E-cad-抗体-QD探针，其制备方法包括：向羧基量子点溶液中加入E-cad-抗体和偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐进行缀合反应，经纯化后即得。
4.权利要求1-3任一项所述用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极的制备；和，
E-cad-抗体-QD探针的制备。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极的制备方法包括：
将羧基化碳纳米管悬浮液与含有HAuCl4的溶液混合得改性剂，将电极置于改性剂中，采用计时电流法即得羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极；
所述电极为预处理后的玻碳电极；
所述预处理方法为：使用氧化铝粉末抛光玻碳电极GCE的表面以除去氧化物层；同时为了除去其他物理吸附的物质，使用双蒸水和乙醇超声清洗电极表面；然后立即在氮气下干燥玻碳电极GCE。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述改性剂中羧基化碳纳米管与HAuCl4的质量摩尔比为2~4mg:8~12mmol。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述改性剂中羧基化碳纳米管与HAuCl4的质量摩尔比为3mg:10mmol。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述羧基化碳纳米管悬浮液制备方法为：将CNT超声分散在0.4%聚二烯丙基二甲基氯化铵中0.5~2小时，离心并用双蒸水洗涤至少3次即得。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述羧基化碳纳米管悬浮液制备方法中，将CNT超声分散在0.4%聚二烯丙基二甲基氯化铵中1小时。
10.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述含有HAuCl4的溶液由L-半胱氨酸、H2SO4和HAuCl4组成。
11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述含有HAuCl4的溶液组成为：0.1 mML-半胱氨酸，0.1M H2SO4，5 mM HAuCl4。
12.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述计时电流法处理条件为：固定沉积电压为300~500mv；处理时间为100~130s。
13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述计时电流法处理条件为：固定沉积电压为400mv；处理时间为120s。
14.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述E-cad-抗体-QD探针的制备方法包括：
向羧基量子点溶液中加入E-cad-抗体和偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在室温下搅拌处理1~2小时进行缀合反应，经纯化后即得。
15.如权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述纯化具体方法为将缀合物过0.2μm滤膜除去大聚集体，并使用硼酸盐缓冲液洗涤至少5次。
16.权利要求1-3任一项所述电化学生物传感器或权利要求4-15任一项所述制备方法制备得到的电化学生物传感器在细胞上皮-间质转化检测中的应用。
17.一种用于细胞上皮-间质转化检测的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1-3任一项所述电化学生物传感器或权利要求4-15任一项所述制备方法制备得到的电化学生物传感器基于电化学和荧光信号检测E-钙粘蛋白的变化进而分析细胞上皮-间质转化。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，羧基化碳纳米管-金纳米颗粒改性电极为工作电极，以Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极，连接至电化学工作站，Hg2+-乙酸缓冲液溶液作为支持电解液，将待测样品与E-cad-抗体-QD探针进行孵育后，采用差分脉冲伏安法进行电化学检测；同时基于免疫荧光技术进行荧光检测。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述参比电极为含有饱和KCl的Ag/AgCl电极；所述Hg2+-乙酸缓冲液溶液的pH为5.2；所述待测样品与E-cad-抗体-QD探针进行孵育的时间为2小时。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910361498.7A CN111855624B (zh) | 2019-04-30 | 2019-04-30 | 一种用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910361498.7A CN111855624B (zh) | 2019-04-30 | 2019-04-30 | 一种用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111855624A CN111855624A (zh) | 2020-10-30 |
| CN111855624B true CN111855624B (zh) | 2022-11-29 |
Family
ID=72965603
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910361498.7A Active CN111855624B (zh) | 2019-04-30 | 2019-04-30 | 一种用于细胞上皮-间质转化检测的电化学生物传感器及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111855624B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108196060A (zh) * | 2017-12-07 | 2018-06-22 | 山东大学齐鲁医院(青岛) | 可溶性E-cadherin作为癌症上皮间质转化标志物的应用 |
| CN108449998A (zh) * | 2015-09-09 | 2018-08-24 | 费森尤斯医疗护理德国有限责任公司 | 用于诊断腹膜的上皮向间充质转化(emt)的方法和试剂盒 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012519170A (ja) * | 2009-02-26 | 2012-08-23 | オーエスアイ・ファーマシューティカルズ，エルエルシー | 生体内の腫瘍細胞のｅｍｔステータスをモニターするためのｉｎｓｉｔｕ法 |
-
2019
- 2019-04-30 CN CN201910361498.7A patent/CN111855624B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108449998A (zh) * | 2015-09-09 | 2018-08-24 | 费森尤斯医疗护理德国有限责任公司 | 用于诊断腹膜的上皮向间充质转化(emt)的方法和试剂盒 |
| CN108196060A (zh) * | 2017-12-07 | 2018-06-22 | 山东大学齐鲁医院(青岛) | 可溶性E-cadherin作为癌症上皮间质转化标志物的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| "In Situ Synthesis of Fluorescent Carbon Dots/Polyelectrolyte Nanocomposite Microcapsules with Reduced Permeability and Ultrasound Sensitivity";Hui Gao等;《ACS Nano》;20160929;第1-24页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111855624A (zh) | 2020-10-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wei et al. | Graphene nanocomposites modified electrochemical aptamer sensor for rapid and highly sensitive detection of prostate specific antigen | |
| Tian et al. | An ultrasensitive electrochemical cytosensor based on the magnetic field assisted binanozymes synergistic catalysis of Fe3O4 nanozyme and reduced graphene oxide/molybdenum disulfide nanozyme | |
| Jie et al. | Enhanced electrochemiluminescence of CdSe quantum dots composited with CNTs and PDDA for sensitive immunoassay | |
| Qiao et al. | Novel electrochemical sensing platform for ultrasensitive detection of cardiac troponin I based on aptamer-MoS2 nanoconjugates | |
| Liu et al. | Three-dimensional electrochemical immunosensor for sensitive detection of carcinoembryonic antigen based on monolithic and macroporous graphene foam | |
| Zheng et al. | Aptamer-DNA concatamer-quantum dots based electrochemical biosensing strategy for green and ultrasensitive detection of tumor cells via mercury-free anodic stripping voltammetry | |
| Hui et al. | Gold nanoparticles and polyethylene glycols functionalized conducting polyaniline nanowires for ultrasensitive and low fouling immunosensing of alpha-fetoprotein | |
| Ilyas et al. | Electrical detection of cancer biomarker using aptamers with nanogap break-junctions | |
| CN111413385B (zh) | 一种基于RGO-CS-Fc/Pt-Pd NPs纳米复合材料检测GPC3的方法 | |
| Zhu et al. | Amperometric immunosensor for simultaneous detection of three analytes in one interface using dual functionalized graphene sheets integrated with redox-probes as tracer matrixes | |
| CN107677719B (zh) | 一种基于石墨烯、硫堇和核酸适配体检测甲胎蛋白的方法 | |
| CN104020204B (zh) | 一种用于检测铅的电化学传感器及其制备方法和应用 | |
| Yang et al. | Hollow platinum decorated Fe3O4 nanoparticles as peroxidase mimetic couple with glucose oxidase for pseudobienzyme electrochemical immunosensor | |
| Zhang et al. | Signal-on electrochemiluminescent immunosensor based on poly (amidoamine) dendrimer functionalized carbon nanodots amplification for ultrasensitive detection of α-fetoprotein | |
| Tzouvadaki et al. | Memristive biosensors based on full-size antibodies and antibody fragments | |
| Jing et al. | A ‘signal on-off’electrochemical peptide biosensor for matrix metalloproteinase 2 based on target induced cleavage of a peptide | |
| Meng et al. | An electrochemical immunosensor for prostate specific antigen using nitrogen-doped graphene as a sensing platform | |
| Yue et al. | Label-free electrochemical biosensor with magnetically induced self-assembly for the detection of cancer antigen 125 | |
| Wang et al. | An electrochemiluminescence biosensor for detection of CdkN2A/p16 anti-oncogene based on functional electrospun nanofibers and core-shell luminescent composite nanoparticles | |
| Dong et al. | Novel sandwich-structured electrochemiluminescence immunosensing platform via CdTe quantum dots-embedded mesoporous silica nanospheres as enhanced signal labels and Fe3O4@ SiO2@ PS nanocomposites as magnetic separable carriers | |
| Deng et al. | Electrochemiluminescence-based detection method of lead (II) ion via dual enhancement of intermolecular and intramolecular co-reaction | |
| Zheng et al. | Boronic acid functionalized magnetic composites with sandwich-like nanostructures as a novel matrix for PDGF detection | |
| CN108445031A (zh) | 一种同时检测卡那霉素和链霉素残留的适配体传感器的制备方法 | |
| Li et al. | Ultrasensitive multiplexed protein biomarker detection based on electrochemical tag incorporated polystyrene spheres as label | |
| CN111413384A (zh) | 一种基于RGO-CS-Hemin/Au NPs纳米复合材料检测GPC3的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |