CN111849880A - 一种人脂肪间充质干细胞超低温冻存后的复苏方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及干细胞领域的技术领域，尤其是涉及一种人脂肪间充质干细胞超低温冻存后的复苏方法，本发明采用含有芍药苷的条件培养基，以及使用血清替代物替代了胎牛血清，且在溶液A中添加了一定含量的地黄低聚糖，整个培养体系没有引入动物源成分，同时在人脂肪间充质干细胞的复苏、传代培养以及分泌因子的获取过程中，提高了复苏后人脂肪间充质干细胞的数量和活率，加快了细胞的快速扩增，且传代培养时各代次的人脂肪间充质干细胞活率都较高且十分稳定，便于进行传代培养后续的相关实验，同时增大了分泌因子的获取量，具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞领域的技术领域，尤其是涉及一种人脂肪间充质干细胞超低温冻存后的复苏方法。
背景技术
目前研究发现，间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建，具有很高的医学价值，普通的间充质干细胞有多种来源(包括骨髓)，但产量原没有脂肪组织中得到的多，因此脂肪间充质干细胞具有产量大、获取便捷的优点，同时间充质干细胞具有能够分泌多种分泌因子的能力,这些具有生物活性的物质可以促进损伤组织的增殖与修复，分泌因子在临床和医学研究中正显现出重要的作用。
现有技术中使用基础培养基加一定含量的胎牛血清对冻存的间充质干细胞进行复苏，虽然能够达到复苏间充质干细胞的目的，但对于人脂肪间充质干细胞来说，使用胎牛血清会导致培养体系中引入了动物源成分，增大了细胞被污染的几率，增加了后续临床使用中的危险性。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的之一是提供一种人脂肪间充质干细胞超低温冻存后的复苏方法。
本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种人脂肪间充质干细胞超低温冻存后的复苏方法，其包含如下步骤：
S1：将从液氮罐中放有种子干细胞的冻存管快速放入37℃水浴锅中，迅速摇动冻存管使其中冻存液快速融化，得到解冻冻存液；
S2：将解冻冻存液移到装有培养基的离心管中，离心后弃去离心管中的上清液，并震散细胞沉淀，得到离心细胞沉淀；
S3：向盛有离心细胞沉淀的离心管加入溶液A混匀，得到细胞悬液，所述溶液A用量为5～6mL/ 支离心管，所述溶液A包括以下重量份数的原料：基础培养基95-97份、血清替代物3-5份；
S4：将溶液A按照25～30mL/瓶量加入细胞培养瓶中，吸取步骤S4中的细胞悬液3～5mL，接种至细胞培养瓶中,细胞接种量为8×105～4×106/T-175；
S5：将S4的细胞培养瓶进行继续培养。
通过采用上述方案，使用血清替代物代替胎牛血清，使细胞被污染的几率减小，提高后续临床使用中的安全性。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：S2中在解冻冻存液移到装有培养基的离心管后，向冻存管中加入1～2mL培养基，清洗冻存管管壁并将冲洗液倒入S2同一离心管中。
通过采用上述方案，加入清洗冻存管的步骤，减少冻存后的人脂肪间充质干细胞的损失。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：S2中离心步骤包括：
T1：将离心管放入离心机，300g离心5min；
T2：吸弃上清液，轻轻震散细胞沉淀；
T3：再向离心管中加入培养基，定容至10mL，颠倒混匀；
T4：再次放入离心机，300g离心5min。
通过采用上述方案，再次进行离心操作，进一步去除杂质，提高人脂肪间充质干细胞的纯度。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：S5中细胞培养瓶培养瓶放入CO2培养箱中培养72小时。
通过采用上述方案，使用适合人脂肪间充质干细胞的生长环境，保证人脂肪间充质干细胞的正常生长和快速增长。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述溶液A中血清替代物的含量为4wt％。
通过采用上述方案，血清替代物的含量选用4wt％时对人脂肪间充质干细胞的复苏效果更好，提高了复苏后人脂肪间充质干细胞的数量和活率。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述溶液A中还包括地黄低聚糖0.2-0.32 份。
通过采用上述方案，通过添加地黄低聚糖加速人脂肪间充质干细胞的增殖，使人脂肪间充质干细胞复苏后的数量和活率得以增加。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述S2中培养基包括以下质量份的原料：基础培养基100份、芍药苷0.24-0.3份。
通过采用上述方案，通过添加芍药苷减缓人脂肪间充质干细胞聚合形成细胞团的过程，减缓细胞扩增速度，将芍药苷与地黄低聚糖共同使用提高了人脂肪间充质干细胞复苏后的数量和活率，增加了人脂肪间充质干细胞的分泌因子的分泌量。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：S5使用的细胞培养瓶为T-175培养瓶，细胞接种量为1.0×106/T-175。
通过采用上述方案，在保证人脂肪间充质干细胞的正常生活环境的条件下，使人脂肪间充质干细胞有足够的生长条件能够快速增殖。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1.由于本发明采用含有芍药苷的条件培养基，以及使用血清替代物替代了胎牛血清，且在溶液A中添加了一定含量的地黄低聚糖，整个培养体系没有引入动物源成分，防止了细胞被污染，保证了使用的安全性；
2.在人脂肪间充质干细胞的复苏、传代培养以及分泌因子的获取过程中，提高了复苏后人脂肪间充质干细胞的数量和活率；
3.传代培养时各代次的人脂肪间充质干细胞活率都较高且十分稳定，便于进行传代培养后续的相关实验；
4.增大了分泌因子的获取量，具有良好的临床应用前景。
具体实施方式
制备例1～4，
一种细胞培养溶液A，其成分为基础培养基95-97份、血清替代物3-5份。
制备例1～4的具体参数如下表一所示。
表一.制备例1～4细胞培养溶液A中基础培养基与血清替代物的配比
| 制备例1 | 制备例2 | 制备例3 | 制备例4 | |
| 基础培养基/份 | 95 | 95 | 97 | 96 |
| 血清替代物/份 | 3 | 5 | 3 | 4 |
制备例1、2中血清替代物为Helios公司GMP级的血清替代物，
制备例3、4中血清替代物为PALL公司GMP级的血清替代物。
制备例5～8，
一种细胞培养溶液A，其成分为基础培养基95-97份、血清替代物3-5份、地黄低聚糖0.2-0.32 份。
制备例5～8的具体参数如下表二所示。
表二.制备例5～8细胞培养溶液A中基础培养基、血清替代物与地黄低聚糖的配比
| 制备例5 | 制备例6 | 制备例7 | 制备例8 | |
| 基础培养基/份 | 95 | 95 | 97 | 96 |
| 血清替代物/份 | 3 | 5 | 3 | 4 |
| 地黄低聚糖/份 | 0.2 | 0.26 | 0.3 | 0.32 |
制备例1、2中血清替代物为Helios公司GMP级的血清替代物，
制备例3、4中血清替代物为PALL公司GMP级的血清替代物。
制备例9～12，
一种培养基，其成分为基础培养基100份、芍药苷0.24-0.3份。
制备例9～12的具体参数如下表三所示。
表三.制备例9～12培养基中基础培养基和芍药苷的配比
| 制备例9 | 制备例10 | 制备例11 | 制备例12 | |
| 基础培养基/份 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 芍药苷/份 | 0.24 | 0.26 | 0.28 | 0.3 |
实施例1,
一种人脂肪间充质干细胞超低温冻存后的复苏方法，
其包含如下步骤：
S1：将从液氮罐中放有种子干细胞的冻存管快速放入37℃水浴锅中，迅速摇动冻存管使其中冻存液快速融化，得到解冻冻存液；
S2：将解冻冻存液移到装有培养基的离心管中，在解冻冻存液移到装有基础培养基的离心管后，向冻存管中加入1mL培养基，清洗冻存管管壁并将冲洗液倒入同一离心管中,
将离心管放入离心机，300g离心5min,吸弃上清液，轻轻震散细胞沉淀,再向离心管中加入培养基，定容至10mL，颠倒混匀,再次放入离心机，300g离心5min；
离心后弃去离心管中的上清液，并震散细胞沉淀，得到离心细胞沉淀；
其中培养基为制备例9的培养基；
S3：向盛有离心细胞沉淀的离心管加入溶液A混匀，得到细胞悬液，所述溶液A用量为5mL/ 支离心管，所述溶液A为制备例5；
S4：将溶液A按照25mL/瓶量加入细胞培养瓶中，吸取步骤S3中的细胞悬液5mL，接种至细胞培养瓶中,细胞接种量为1.0×106/T-175；
S5：将S4的细胞培养瓶放入CO2培养箱中培养72小时培养。
实施例2～4
一种人脂肪间充质干细胞超低温冻存后的复苏方法，基于实施例1的基础上，更改S2中的培养基以及S3中的溶液A，实施例1～4的具体参数如下表四所示。
表四.实施例1～4中使用的培养基和溶液A对应关系
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | |
| S2中的培养基 | 制备例9 | 制备例10 | 制备例11 | 制备例12 |
| S3中的溶液A | 制备例5 | 制备例6 | 制备例7 | 制备例8 |
对比例1,实施例5～12
一种人脂肪间充质干细胞超低温冻存后的复苏方法，基于实施例3的基础上，更改S2中的培养基以及S3中的溶液A，对比例1和实施例5～12的具体参数如下表五所示。
表五.对比例1和实施例5～12中使用的培养基和溶液A对应关系
对比制备例1：一种细胞培养溶液A，其成分为基础培养基97份、血清替代物3份、地黄低聚糖0.1份。
对比制备例2：一种细胞培养溶液A，其成分为基础培养基97份、血清替代物3份、地黄低聚糖0.4份。
对比制备例3：一种培养基，其成分为基础培养基100份、芍药苷0.15份。
对比制备例4：一种培养基，其成分为基础培养基100份、芍药苷0.4份。
对实施例3和对比例1以及实施例5～12中培育得到细胞悬液进行细胞复苏率检测、分泌因子获取实验。
[细胞复苏率检测]
在S4步骤完成后，用5mL移液管从待测的T-175培养瓶中分别吸取2.0mL细胞悬液，分别加入5mL离心管并贴上标签做好标记，制成2.0mL检样，参照公开号为CN109699634A中公开的方法测定细胞的复苏率。
表六：实施例3和对比例1和实施例5～12中细胞的复苏率
| 复苏率(％) | |
| 实施例3 | 96.26 |
| 对比例1 | 85.34 |
| 实施例5 | 90.56 |
| 实施例6 | 93.95 |
| 实施例7 | 80.85％ |
| 实施例8 | 80.52％ |
| 实施例9 | 80.35％ |
| 实施例10 | 92.09％ |
| 实施例11 | 91.16％ |
| 实施例12 | 86.73％ |
从表六中可以看出，对比实施例5和对比例1，实施例5细胞复苏率大于对比例1中的细胞复苏率，本申请中使用血清替代物替代胎牛血清可以提高人脂肪间充质干细胞的复苏率。
对比实施例6和实施例5可知，实施例6中的细胞复苏率大于实施例5中的细胞复苏率，本申请中使用在溶液A中加入适量的地黄低聚糖，可以提高人脂肪间充质干细胞的复苏率。
对比实施例3与实施例5可知，实施例3细胞复苏率大于实施例5中的细胞复苏率，同时对比实施例3和实施例7、5可知，在没有地黄低聚糖加入的前提下，本申请中加入适量含量的芍药苷，无法起到提高人脂肪间充质干细胞的复苏率的作用，还会降低人脂肪间充质干细胞的复苏率；故而本申请中同时加入适量的地黄低聚糖和芍药苷，两者协同作用下可显著提高人脂肪间充质干细胞的复苏率。
对比实施例3和实施例9、10可知，本申请中地黄低聚糖的用量在0.2-0.32份范围内可起到提高人脂肪间充质干细胞的复苏率的效果，当地黄低聚糖的用量大于0.32份时，效果反而降低。
对比实施例3和实施例11、12可知，本申请中芍药苷的用量在0.24-0.3份可起到提高人脂肪间充质干细胞的复苏率的效果，当芍药苷的用量大于0.3份时，效果反而降低。
因此可得出以下结论：使用血清替代物替代胎牛血清可以提高人脂肪间充质干细胞的复苏率，复苏过程中在基础培养基中添加芍药苷且在溶液A使用基础培养基和血清替代物的基础上添加地黄低聚糖时，对人脂肪间充质干细胞的复苏率有很大的提高，极大地促进了人脂肪间充质干细胞在冻存之后的复苏效果。
[细胞传代培养并获取分泌因子]
参照公开号为CN109929800A中公开的方法对实施例3以及对比例1和实施例5～8中所复苏的人脂肪间充质干细胞进行传代培养并获得分泌因子。
[细胞数量和活率检测]
表七：实施例3和对比例1和实施例5～8中依次扩增的P1-P8各代次间充质干细胞的数量和活率(下表中，例如在P1栏中的P1是指终末细胞的代次，即起始接种细胞是P0代，终末细胞是扩增后的P1代)，活率的计算方法为活细胞数÷(活细胞数+死细胞数)×100％。
从表七中可知，在P1-P8代传代培养期间对比实施例5和对比例1的终末细胞数量可得出，使用血清替代物替代胎牛血清时各代次的终末细胞数量均发生了提高。
对比实施例6和实施例5可知，实施例6中的各代次的终末细胞数量大于实施例5中的各代次的终末细胞数量，本申请中使用在溶液A中加入适量的地黄低聚糖，可以提高人脂肪间充质干细胞各代次的终末细胞数量。
对比实施例3与实施例5可知，实施例3各代次的终末细胞数量大于实施例5中的各代次的终末细胞数量，同时对比实施例3和实施例7、5可知，在没有地黄低聚糖加入的前提下，本申请中加入适量含量的芍药苷，无法起到提高人脂肪间充质干细胞各代次的终末细胞数量的作用，还会降低人脂肪间充质干细胞各代次的终末细胞数量；故而本申请中同时加入适量的地黄低聚糖和芍药苷，两者协同作用下可显著提高人脂肪间充质干细胞各代次的终末细胞数量。
同时通过对比实施例3和实施例5可知，实施例3中人脂肪间充质干细胞各代次的细胞活率都较高且十分稳定，便于进行传代培养后续的相关实验。
[细胞分泌因子中蛋白质浓度的检测]
测定实施例3以及对比例1和实施例5～8中所得到的干细胞分泌因子中蛋白质的浓度。
利用BCA法对所得到的P8代人脂肪间充质干细胞分泌因子中的蛋白质浓度进行测定，将其稀释5倍后，取25μL测定其吸光度，根据测得的标准曲线得出公式算出相应的蛋白量，经计算得出干细胞分泌因子中的蛋白浓度。
表八：实施例3以及对比例1和实施例5～8中得到的分泌因子中蛋白质的浓度
| 蛋白质浓度mg/mL | |
| 实施例3 | 0.167 |
| 对比例1 | 0.142 |
| 实施例5 | 0.147 |
| 实施例6 | 0.162 |
| 实施例7 | 0.145 |
| 实施例8 | 0.148 |
从表八中可以看出，对比实施例5和对比例1可知，使用血清替代物替代胎牛血清时分泌因子中蛋白质浓度提高。
对比实施例3与实施例5可知，实施例3分泌因子中蛋白质浓度提高大于实施例5分泌因子中蛋白质浓度提高，同时对比实施例3和实施例7、5可知，在没有地黄低聚糖加入的前提下，本申请中加入适量含量的芍药苷，无法起到提高分泌因子中蛋白质浓度的作用，还会降低分泌因子中的蛋白质浓度；故而本申请中同时加入适量的地黄低聚糖和芍药苷，两者协同作用下可显著提高分泌因子中的蛋白质浓度。
[细胞接种量的确定]
基于实施例3的基础上，更改S4中的接种量使其如下表所示，测定细胞的复苏率如表八所示。
表八：更改细胞接种量测定人脂肪间充质干细胞复苏率
| 9.0×10<sup>5</sup>/T-175 | 9.5×10<sup>5</sup>/T-175 | 1.0×10<sup>6</sup>/T-175 | 1.5×10<sup>6</sup>/T-175 | |
| 复苏率(％) | 94.85 | 95.47 | 96.26 | 96.04 |
基于实施例3的基础上，更改S4中的接种量使其如下表所示，测定细胞的人脂肪间充质干细胞依次扩增的P1-P8各代次间充质干细胞的数量和活率。
表九：更改细胞接种量测定人脂肪间充质干细胞依次扩增的P1-P8各代次间充质
干细胞的数量和活率(下表中，例如在P1栏中的P1是指终末细胞的代次，即起始接种细胞是
P0 代，终末细胞是扩增后的P1代)
| P1代次 | 起始接种细胞数量/T-175 | 活率/％ | 终末细胞数量/T-175 | 活率/％ |
| 9.0×10<sup>5</sup> | 97.11 | 8.1×10<sup>5</sup> | 96.91 | |
| 9.5×10<sup>5</sup> | 96.25 | 8.5×10<sup>5</sup> | 96.75 | |
| 1.0×10<sup>6</sup> | 97.33 | 9.1×10<sup>6</sup> | 97.57 | |
| 1.5×10<sup>6</sup> | 95.55 | 8.4×10<sup>6</sup> | 95.98 | |
| P2代次 | 起始接种细胞数量/T-175 | 活率/％ | 终末细胞数量/T-175 | 活率/％ |
| 9.0×10<sup>5</sup> | 96.94 | 8.4×10<sup>5</sup> | 96.87 | |
| 9.5×10<sup>5</sup> | 96.04 | 8.9×10<sup>5</sup> | 96.75 | |
| 1.0×10<sup>6</sup> | 97.54 | 9.3×10<sup>6</sup> | 97.03 | |
| 1.5×10<sup>6</sup> | 94.92 | 8.5×10<sup>6</sup> | 95.41 | |
| P3代次 | 起始接种细胞数量/T-175 | 活率/％ | 终末细胞数量/T-175 | 活率/％ |
| 9.0×10<sup>5</sup> | 96.02 | 9.1×10<sup>5</sup> | 95.44 | |
| 9.5×10<sup>5</sup> | 95.84 | 9.4×10<sup>5</sup> | 95.53 | |
| 1.0×10<sup>6</sup> | 96.68 | 10.7×10<sup>6</sup> | 97.31 | |
| 1.5×10<sup>6</sup> | 94.33 | 9.7×10<sup>6</sup> | 95.81 | |
| P4代次 | 起始接种细胞数量/T-175 | 活率/％ | 终末细胞数量/T-175 | 活率/％ |
| 9.0×10<sup>5</sup> | 95.47 | 8.9×10<sup>5</sup> | 96.31 | |
| 9.5×10<sup>5</sup> | 94.84 | 9.1×10<sup>5</sup> | 95.58 | |
| 1.0×10<sup>6</sup> | 96.68 | 9.5×10<sup>6</sup> | 96.53 | |
| 1.5×10<sup>6</sup> | 94.53 | 8.6×10<sup>6</sup> | 94.79 | |
| P5代次 | 起始接种细胞数量/T-175 | 活率/％ | 终末细胞数量/T-175 | 活率/％ |
| 9.0×10<sup>5</sup> | 96.25 | 8.2×10<sup>5</sup> | 95.24 | |
| 9.5×10<sup>5</sup> | 94.21 | 8.4×10<sup>5</sup> | 94.28 | |
| 1.0×10<sup>6</sup> | 97.68 | 9.7×10<sup>6</sup> | 96.70 | |
| 1.5×10<sup>6</sup> | 93.87 | 8.8×10<sup>6</sup> | 94.01 | |
| P6代次 | 起始接种细胞数量/T-175 | 活率/％ | 终末细胞数量/T-175 | 活率/％ |
| 9.0×10<sup>5</sup> | 96.88 | 8.1×10<sup>5</sup> | 96.84 | |
| 9.5×10<sup>5</sup> | 95.68 | 8.2×10<sup>5</sup> | 95.24 | |
| 1.0×10<sup>6</sup> | 98.22 | 8.6×10<sup>6</sup> | 96.12 | |
| 1.5×10<sup>6</sup> | 94.58 | 8.0×10<sup>6</sup> | 93.27 | |
| P7代次 | 起始接种细胞数量/T-175 | 活率/％ | 终末细胞数量/T-175 | 活率/％ |
| 9.0×10<sup>5</sup> | 94.85 | 7.2×10<sup>5</sup> | 94.18 | |
| 9.5×10<sup>5</sup> | 94.21 | 7.6×10<sup>5</sup> | 93.87 | |
| 1.0×10<sup>6</sup> | 95.31 | 7.9×10<sup>6</sup> | 96.53 | |
| 1.5×10<sup>6</sup> | 93.98 | 7.7×10<sup>6</sup> | 93.25 | |
| P8代次 | 起始接种细胞数量/T-175 | 活率/％ | 终末细胞数量/T-175 | 活率/％ |
| 9.0×10<sup>5</sup> | 94.42 | 6.1×10<sup>5</sup> | 94.08 | |
| 9.5×10<sup>5</sup> | 93.54 | 6.5×10<sup>5</sup> | 93.07 | |
| 1.0×10<sup>6</sup> | 95.21 | 7.3×10<sup>6</sup> | 96.65 | |
| 1.5×10<sup>6</sup> | 93.77 | 6.2×10<sup>6</sup> | 93.51 |
通过对比9.0×105/T-175、9.5×105/T-175、1.0×106/T-175和1.5×106/T-175四种接种量时人脂肪间充质干细胞的复苏率和依次扩增的P1-P8各代次间充质干细胞的数量和活率，可知当接种量为1.0×106/T-175时，人脂肪间充质干细胞的复苏率和依次扩增的P1-P8各代次间充质干细胞的数量和活率均高于接种量为9.0×105/T-175、9.5×105/T-175和1.5×106/T-175时，由此本申请中将细胞接种量范围设置为1.0×106/T-175此时对人脂肪间充质干细胞的复苏率和依次扩增的P1-P8各代次间充质干细胞的数量和活率均有显著效果。
由于本发明采用含有芍药苷的条件培养基，以及使用血清替代物替代了胎牛血清，且在溶液A中添加了一定含量的地黄低聚糖，整个培养体系没有引入动物源成分，同时在人脂肪间充质干细胞的复苏、传代培养以及分泌因子的获取过程中，提高了复苏后人脂肪间充质干细胞的数量和活率，加快了细胞的快速扩增，且传代培养时各代次的人脂肪间充质干细胞活率都较高且十分稳定，便于进行传代培养后续的相关实验，同时增大了分泌因子的获取量，具有良好的临床应用前景。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种人脂肪间充质干细胞超低温冻存后的复苏方法，其特征在于：
其包含如下步骤：
S1：将从液氮罐中放有种子干细胞的冻存管快速放入37℃水浴锅中，迅速摇动冻存管使其中冻存液快速融化，得到解冻冻存液；
S2：将解冻冻存液移到装有培养基的离心管中，离心后弃去离心管中的上清液，并震散细胞沉淀，得到离心细胞沉淀；
S3：向盛有离心细胞沉淀的离心管加入溶液A混匀，得到细胞悬液，所述溶液A用量为5~6mL/支离心管，所述溶液A包括以下重量份数的原料：基础培养基95-97份、血清替代物3-5份；
S4：将溶液A按照25mL/瓶量加入细胞培养瓶中，吸取步骤S4中的细胞悬液3~5mL，接种至细胞培养瓶中,细胞接种量为8×105~2×106 /T-175；
S5：将S4的细胞培养瓶进行继续培养。
2.根据权利要求1所述的一种人脂肪间充质干细胞超低温冻存后的复苏方法，其特征在于：S2中在解冻冻存液移到装有培养基的离心管后，向冻存管中加入1~2mL培养基，清洗冻存管管壁并将冲洗液倒入S2同一离心管中。
3.根据权利要求2所述的一种人脂肪间充质干细胞超低温冻存后的复苏方法，其特征在于：S2中离心步骤包括：
T1：将离心管放入离心机，300g离心5min；
T2：吸弃上清液，轻轻震散细胞沉淀；
T3：再向离心管中加入培养基，定容至10mL，颠倒混匀；
T4：再次放入离心机，300g离心5min。
4.根据权利要求3所述的一种人脂肪间充质干细胞超低温冻存后的复苏方法，其特征在于：S5中细胞培养瓶培养瓶放入CO2培养箱中培养72小时。
5.根据权利要求4所述的一种人脂肪间充质干细胞超低温冻存后的复苏方法，其特征在于：所述溶液中血清替代物的含量为4wt%。
6.根据权利要求5所述的一种人脂肪间充质干细胞超低温冻存后的复苏方法，其特征在于：所述溶液A中还包括地黄低聚糖0.2-0.32份。
7.根据权利要求6所述的一种人脂肪间充质干细胞超低温冻存后的复苏方法，其特征在于：所述S2中培养基包括以下质量份的原料：基础培养基100份、芍药苷0.24-0.3份。
8.根据权利要求7所述的一种人脂肪间充质干细胞超低温冻存后的复苏方法，其特征在于：S5使用的细胞培养瓶为T-175培养瓶，细胞接种量为1.0×106／T-175。
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