CN111842088B

CN111842088B - 一种低电位疏水性多肽单层膜及其制备方法与应用

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Publication number: CN111842088B
Application number: CN202010753400.5A
Authority: CN
Inventors: 李天铎; 许静; 班青; 马慧君; 张震
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Qilu University of Technology
Priority date: 2020-07-30
Filing date: 2020-07-30
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2040-07-30
Also published as: US20230142745A1; CN111842088A; WO2022021708A1

Abstract

本发明提供一种具有表面低电位且疏水性的多肽单层膜，所述多肽是由分子量为(1.48±0.2)×10⁵g/mol的多肽分子构成的，单层膜的厚度为6.2～9.0nm，膜表面的伯氨基暴露量为9.5～15％，多肽单层膜的Zeta电位为‑3～‑9mV；所述膜的接触角为61±1°～84±1°。该膜厚度超薄，最低仅6.6nm左右，其较低的表面电位及一定的疏水性能使其可应用于皮革制备领域。本发明的多肽单层膜还可应用于生物传感器的制备中，有助于提高检测限；由于本发明涉及的多肽单层膜表面的伯氨基量可控，有利于进一步化学改性可控性，为下一步实现聚硅氧烷及生物制剂的可控接枝提供基础。

Description

一种低电位疏水性多肽单层膜及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于天然高分子领域，涉及多肽单层膜及其制备方法与应用，具体涉及一种具有表面低电位及疏水性的多肽单层膜及其制备方法与应用。

背景技术

胶原多肽是通过胶原蛋白的化学热降解而获得的一种水溶性蛋白。由于其优良的生物相容性，可塑性，粘性，丰富度和低成本而成为最常用的生物聚合物之一。胶原多肽作为一种可生物降解和可再生资源，被广泛应用于制备医用材料、仿生材料、包装及涂饰材料。生物固定化涂层常被应用于生物仿生支架领域，解决酶、乳糖等生物分子、药物分子、合成高分子或有机小分子的搭载问题，若将胶原多肽制备成多肽单层膜具有搭载量易精确控制等优势。

但是，现有技术中生物固定化涂层的厚度交厚且不易控制，生物固定化涂层的层厚普遍大于100nm。且胶原多肽分子上含有氨基、羧基、羟基等很多极性基团，使其产生较强的分子间氢键，形成网状结构，再脱水后形成脆性薄膜；此外，这些基团与水分子形成氢键，从而使多肽薄膜易吸水。这些特性导致胶原多肽材料变脆并且容易溶于水，限制了它在一些领域的应用。

天然生物大分子的二级结构能够影响多肽分子上官能团的暴露量，从而影响膜表面的化学性质、润湿性、电性质等物理化学性质，通过改变生物固定化涂层分子层膜表面的化学性质、润湿性、电性质，使其能够应用于仿生材料制备等领域。

尽管使用表面活性剂对界面上多肽分子构象进行调控的相关研究比较普遍，但限于天然生物大分子结构的复杂性，对多肽分子单层膜表面的化学性质的研究鲜有报道，因此限制了多肽分子的应用。另外，加强对多肽分子单层膜表面的化学性质的研究有利于多肽分子的下一步改性，能够进一步弥补其自身的缺点。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种表面低电位且具有疏水性的多肽单层膜及其制备方法与应用。本发明通改变多肽单层膜表面的伯氨基暴露量来改善膜表面电荷及润湿性质，所得多肽单层膜通过搭载其他目标分子，则能够应用于皮革制造领域。

本发明中，所述伯氨基的暴露量指的是：伯氨基摩尔量/胶原多肽(g)。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种具有表面低电位且疏水性的多肽单层膜，其特征在于，所述多肽是由分子量为(1.48±0.2)×10⁵g/mol的多肽分子构成的，单层膜的厚度为6.2～9.0nm，膜表面的伯氨基暴露量为9.5～15％，多肽单层膜的Zeta电位为-3～-9mV；所述膜的接触角为61±1°～84±1°。

优选的，所述多肽为胶原多肽。

优选的，所述单层膜的厚度为6.6±0.1～8.5±0.1mm。进一步优选的，所述单层膜的厚度为6.6±0.1mm、7.3±0.1mm、8.5±0.1mm。更进一步优选为6.6±0.1mm。

优选的，所述多肽的氨基酸的组成为甘氨酸(Gly)：7.30±0.5％；缬氨酸(Vla)：17.48±0.5％；异亮氨酸(Ile)：36.97±0.5％；亮氨酸(Leu)：13.85±0.5％；酪氨酸(Tyr)：2.68±0.5％；苯丙氨酸(Phe)：1.5±0.5％；赖氨酸(Lys)：4.41±0.5％；组氨酸(His)：0.45±0.5％；精氨酸(Arg)：3.45±0.5％；脯氨酸(Pro)：5.96±0.5％；半胱氨酸(Cys)：5.95±0.5％。

优选的，所述单层膜胶原多肽的二级结构含量为：α-helix为24～30％；β-sheet为18～24％；β-turn为4～8％；random coil为43～48％。

优选的，多肽单层膜是由密堆积的纳米颗粒组成的，球形纳米颗粒的平均粒径为30±2nm。

优选的，所述膜表面的伯氨基暴露量为9.92±0.3％～14.51±0.3％，进一步优选的，所述伯氨基暴露量为9.92±0.3％、11.6±0.3％或者14.51±0.3％。进一步优选为14.51±0.3％。

优选的，所述多肽单层膜的Zeta电位为-(3.33±0.2)mV、-(8.75±0.2)mV或-(8.99±0.2)mV。

优选的，所述膜的二级结构含量为：α-helix为29.66±0.1％；β-sheet为18.98±0.15；β-turn为7.93±0.05％；random coil为43.44±0.26％；

或者α-helix为24.77±0.1％；β-sheet为20.50±0.11％；β-turn为7.26±0.08％；random coil为47.47±0.19％；

或者α-helix为24.28±0.1％；β-sheet为23.21±0.12％；β-turn为4.70±0.03％；random coil为47.80±0.20％。

本发明还提供一种含有多肽单层膜的复合膜：包括聚乙烯亚胺薄膜和多肽单层膜，聚乙烯亚胺薄膜和多肽单层膜之间通过离子键结合，其中，聚乙烯亚胺薄膜的厚度为0.25～0.38nmnm，多肽单层的厚度为6.2～9.0nm。

本发明还提供了上述多肽单层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在一定温度下，配制多肽溶液，然后加入表面活性剂十四烷基磺酸钠(STSo)，得到多肽-STSo混合溶液，保温备用；

(2)将钛片表面打磨抛光，浸入混酸溶液中处理，冲洗至中性，用氮气吹干后再烘干；

(3)将烘干后的钛片浸入聚乙烯亚胺(PEI)水溶液中处理后，用水冲洗，用氮气吹干后再烘干，得到沉积有PEI的正离子化的钛片；

(4)将正离子化的钛片浸入步骤(1)所得多肽-STSoS混合溶液中，沉积8～12min，然后将其在去离子水中提拉20～25次，用高纯氮气吹干后，即得多肽单层膜。

优选的，步骤(1)中所述温度与步骤(4)中沉积过程温度均为50℃。

优选的，步骤(1)中，多肽溶液的浓度为4％wt；混合溶液中十四烷基磺酸钠的浓度为：2.50mmol/L～7.96mmol/L。进一步优选的，混合溶液中十四烷基磺酸钠的浓度为2.5mmol/L、7.00mmol/L、7.96mmol/L。

优选的，步骤(1)中，胶原多肽溶液的配置方法为：将多肽和去离子水混合，于室温溶胀0.5小时后，加热至50℃，搅拌2小时，使多肽完全溶解，然后调节pH至10.00±0.02。

优选的，步骤(2)中，钛片使用金相砂纸打磨抛光后，依次用去离子水，无水乙醇，丙酮超声清洗钛片各15min，然后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱干燥12h。进一步优选的，打磨抛光的方法为：使用金相砂纸按照800，1500，3000，5000，7000目的顺序依次打磨抛光。

优选的，步骤(2)中，混酸溶液为体积比为1:1的质量分数为30％H₂O₂和98％H₂SO₄的混合液，处理时间为1小时。

优选的，步骤(2)中，钛片在PEI水溶液中的处理时间为20～40分钟。

优选的，本发明中所述多肽是将市售多肽产品经过透析方法得到的结构规整的胶原多肽。

本发明还提供上述胶原多肽单层膜在皮革制造领域中的应用。

本发明的有益效果：

本发明的多肽单层膜由于具有较高的伯氨基暴露量、且暴露量可控，易搭载其他目标分子，从而应用于皮革制造领域。且该膜厚度超薄，最低仅6.6nm左右，其较低的表面电位及一定的疏水性能也使其利于应用于皮革制备领域。本发明的多肽单层膜还可应用于生物传感器的制备中，有助于提高检测限；由于本发明涉及的多肽单层膜表面的伯氨基量可控，有利于进一步化学改性可控性，为下一步实现聚硅氧烷及生物制剂的可控接枝提供基础。

附图说明

图1是多肽浓度对椭圆度的影响；

图2是4％浓度胶原多肽所得胶原多肽分子层膜的AFM图像；

图3是不同提拉次数的荧光强度；

图4是(e)G-STSo厚度-距离曲线，(f)G-STSo的AFM图像；

图5多肽单层膜的高分辨率N1s XPS光谱和对应伯氨基含量(a,G-STSo_6％，b,G-STSo_cmc，c,G-STSo_cac，d,4％多肽膜，e,伯氨基含量)；

图6是胶原多肽单层膜的Zeta电位和水接触角；

图7是多肽单层膜的接触角图(图a是SDScac、图b是SDS_6％、图c是G-STSo_6％、图d是G-STSo_cmc)；

图8是产物四苯乙烯(TPE)-异硫氰酸酯(ITC)的TPE-CH₃(a),TPE-N₃(b),TPE-ITC(c)的¹H NMR谱图；

图9是不同样品的CLSM图像(a,正离子化后的钛片；b,4％多肽-TPE；c,4％多肽；d,G-SDS_cac-TPE；e,G-SDS_cac；f,G-SDS_6％-TPE；g,G-SDS_6％；h,G-STSo_6％-TPE；i,G-STSo_6％)；

图10是不同样品的CCK-8检测结果；

图11是不同样品的MTT检测结果；

图12是不同样品进行细胞克隆实验后，细胞存活情况实物照片(a,对照组，b,G-STSo_6％c，c,G-STSo_6％；d，各处理组细胞存活百分数)；

图13是胶原多肽单层膜在生理盐水中浸泡7天前后的荧光显微镜图像((a,b)4％多肽膜，(c，d)G-STSo_cac，(e，f)G-STSo_cmc，(g，h)G-STSo_6％)，样品放置在恒温箱里15天后的荧光显微镜图像((i)G-STSo_6％)。

具体实施方式：

本申请实施例中所使用的胶原多肽为市售多肽产品(A.R.)，其分子量约为5.00×10⁴～1.80×10⁵g/mol，经透析方法到的分子量为的多肽(1.48±0.2)×10⁵g/mol。其他试剂没有特别说明的均为普通市售产品。

胶原多肽是两性聚电解质，在等电点下可团聚为球形粒子。利用胶原多肽的聚集行为，通过调节温度、浓度、pH、离子强度等因素，使分子量小的胶原多肽通过半透膜，从而达到与分子量较大的胶原多肽分开的目的。凝胶电泳、激光粒度仪的研究结果表明，规格为5万的透析袋，胶原多肽的透析浓度为2％，透析温度为45℃，NaCl的浓度为0.9mol·L^-1的条件下可制备出窄分子量分布的胶原多肽。

透析前后胶原多肽CP、CA、M_W和等电点(IP)的对比如表1所示，透析前后氨基酸种类对比如表2所示。GPC测试结果表明透析胶原多肽的重均分子量M_w＝1.48×10⁵g·mol^-1，M_w/M_n＝1.43。凯氏定氮法测出胶原多肽中蛋白质含量(CP)为83.38％，氨基酸含量(CA)为4.95×10^-4mol·g^-1，伯氨基定量仪于50℃测定结果表明透析胶原多肽分子中包含4.95×10^-4g·mol^-1的伯氨基，透析前后胶原多肽的分子结构没有明显改变。将胶原多肽配制为5％的水溶液，其电导率为5.98μS cm^-1，去离子水自身电导率为2.06μS cm^-1，上述结果表明分子量较小的胶原多肽以及胶原多肽中混杂的无机盐都被透析出去了。

表1.

表2.

实施例1

一种多肽单层的制备方法，包括以下步骤：

(1)配制浓度为4％wt的胶原多肽溶液50mL：精确称取胶原多肽于100mL于三口烧瓶中，准确量取去离子水，把去离子水倒入三口烧瓶中，室温溶胀0.5h后，将三口烧瓶放入50±1℃的水浴中，加热搅拌2h，使其完全溶解，然后用2mol/L的氢氧化钠把溶液的pH调节至10.00±0.02，在水浴中稳定0.5h后。

(2)向上述胶原多肽溶液中加入表面活性剂STSo，得到胶原多肽-STSo混合溶液，混合溶液中STSo的浓度为2.50(CAC，50℃时，STSo的临界聚集浓度)mmol/L；在水浴中稳定6h备用。

(3)切割大小为1cm×1cm×1mm的长方形钛片，使用金相砂纸按照，800，1500，3000，5000，7000目的顺序依次打磨抛光，依次用去离子水，无水乙醇，丙酮超声清洗钛片各15min，然后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱干燥12h备用。配制30％H₂O₂和98％H₂SO₄体积比为1:1的混酸溶液，冷却至室温后，将上述处理好的钛片用混酸处理1h，然后用自来水冲洗至中性，再用去离子水清洗5次，最后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱干燥12h备用。

(4)配制1mg/mL的PEI聚乙烯亚胺水溶液，将上述酸蚀的钛片用PEI溶液室温处理0.5h，后用去离子水清洗5次，去除掉结合不牢的电荷，最后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱干燥12h备用。将正离子化的钛片放入沉积盒中，分别向沉积盒中倒入上述配制好的不同体系的多肽溶液，50℃下沉积10min，然后将其在去离子水中提拉20次，用高纯氮气吹干后置于氮气中保存。

所得多肽单层标记为G-STSocac。

实施例2

一种多肽单层的制备方法，包括以下步骤：

(2)向上述胶原多肽溶液中加入表面活性剂STSo，得到胶原多肽-STSo混合溶液，混合溶液中STSo的浓度为7.00mmol/L(CMC，50℃时，STSo的临界胶束浓度)；在水浴中稳定6h备用。

所得多肽单层标记为G-STSocmc。

实施例3

一种多肽单层的制备方法，包括以下步骤：

(2)向上述胶原多肽溶液中加入表面活性剂STSo，得到胶原多肽-STSo混合溶液，混合溶液中STSo的浓度为7.96(6％wt)mmol/L；在水浴中稳定6h备用。

所得多肽单层标记为G-STSo_6％。

对比例1

配制浓度为1～5％wt的胶原多肽溶液，计算好所需的胶原多肽的质量和去离子水的体积，精确称取胶原多肽于50mL三口烧瓶中，准确量取去离子水，把去离子水倒入三口烧瓶中，室温溶胀0.5h后，将三口烧瓶在50℃的水浴中加热搅拌2h，使其完全溶解，然后用1mol/L的氢氧化钠把溶液的pH调节至10.00±0.02备用。

将上述不同浓度的胶原多肽溶液进行圆二色谱仪(CD)表征，通常用摩尔消光系数差Δε(M^-1·cm^-1)和摩尔椭圆度θ来度量圆二色性的大小。CD测试是在Chirascan系统(英国应用光物理有限公司)上进行的，使用氮气吹扫时流速为35mL/min。将所有溶液中蛋白质的浓度稀释至0.16mg/mL，混合样品在50℃下平衡1h，同时在50℃下，取200μL溶液于1mm样品池中进行测量，测量温度保持在50℃。在190～260nm范围内记录光谱，分辨率为0.2nm，共扫描6次。数据处理：减去缓冲溶液的光谱以校正基线，CD光谱以摩尔椭圆度为单位进行了归一化，采用峰回归计算方法和CONTIN拟合程序对二级结构含量进行了计算。多肽浓度对其二级结构的影响结果见图1和表3所示。

表3

表3和图1所示，随着多肽质量浓度的从1％增加到5％，α-helix、Antiparallelβ-sheet、parallelβ-sheet结构呈现出先增加后减少的趋势，在浓度为4％时达到最大；β-turn、random coil结构呈现出先减少后增加的趋势，在浓度为4％时达到最小。该结果表明在4％时，多肽分子二级结构发生较大变化。此浓度正好处于多肽分子接触浓度和缠结浓度交界区域。因此，本发明在制备胶原多肽单层膜时，将多肽的质量浓度优选为4％。

对比例2

一种多肽单层膜的制备方法，与实施例1相比，不同之处在于，在单层膜在制备过程中没有加表面活性剂，仅将胶原多肽沉积到正离子化的钛片上，其他条件与实施例1相同。

将浓度为4％的胶原多肽溶液沉积到用PEI处理的钛金属片上，沉积温度50℃，沉积时间10min、提拉次数20次，胶原多肽分子排列松散，详见图2。所得胶原多肽单层膜标记为G。

对比例3

一种多肽单层的制备方法，包括以下步骤：

(2)向上述胶原多肽溶液中加入表面活性剂SDS，得到胶原多肽-SDS混合溶液，混合溶液中SDS的浓度为3.50(CAC，50℃时，SDS的临界聚集浓度)mmol/L；在水浴中稳定6h备用。

所得多肽单层标记为G-SDScac。

对比例4

一种多肽单层的制备方法，包括以下步骤：

(2)向上述胶原多肽溶液中加入表面活性剂SDS，得到胶原多肽-SDS混合溶液，混合溶液中SDS的浓度为8.32(6％wt)mmol/L；在水浴中稳定6h备用。

所得多肽单层标记为G-SDS_6％。

1.多肽单分层膜厚度测定

用PEI处理的钛金属片沉积胶原多肽后，多肽分子中的-COO^-与PEI中的-NH₃ ⁺可以形成强的离子键。为了验证胶原多肽分子是通过离子键而不是物理吸附与基底结合的，测量了多肽单层膜在沉积过程中不同提拉次数的荧光强度。随着提拉次数的增加(5～20次)，通过物理吸附到基底的多肽会被洗掉而由离子键结合的则会牢固地固定在基底上。由图3可以看出，提拉15次后，荧光强度不再降低，表明通过物理吸附到基底上的胶原多肽已被去除。

本发明使用Multimode8型AFM(Bruker，德国)对膜表面形貌进行研究。将多肽单层膜样品置于工作台上，以Peak Force模式对样品形貌进行测试。膜厚的测量：使用沉积法制备多肽单层膜时，用锡纸包裹钛片的一半，使其不被溶液沾染。测试时，先用原子力显微镜自带的光学辅助系统找到钛片的边界，然后把测试范围设置为20μm以横跨基底和样品区域，沿边界用AFM针尖进行扫描，从对应于膜基质的高度一直到边界底部，扫描3个不同区域以获得平均膜厚。扫描速度0.977Hz，扫描范围20μm、10μm、5μm、1μm，数据处理软件为AFM自带的NanoScope Analysis。

从图4的AFM图像中可以发现，实施例3所得多肽单层膜(G-STSo_6％)的平均厚度为6.6nm。而STSocac多肽单层膜的厚度约为8.5nm、STSocmc多肽单层膜的厚度为7.3nm。

另外，实施例1～3所得胶原多肽单层膜是由密堆积的纳米颗粒组成的，球形纳米颗粒的平均粒径约为30nm。而G-SDS_6％单层膜是由平均粒径约为60nm的球形纳米颗粒堆积而成，其平均厚度为14.2nm。可见，本发明的多肽单层膜厚度非常薄。

2.多肽单分层膜表面伯氨基暴露量的测定

对实施例1～3及对比例2所得样品进行了XPS表征，并对其N元素进行了分峰处理。伯胺的结合能为400.05eV，酰胺键为398.89eV，仲胺为398.26eV。XPS数据还可以通过检测结合能和局部化学状态的变化，对官能团进行半定量分析。N 1s核心区域(从396至402eV)的高分辨率光谱和伯氨基暴露量如图5所示，G-STSo6％的伯氨基暴露量为14.51％，G-STSocac为11.60％，G-STSocmc为9.92％。而对比例2多肽单层膜的伯氨基暴露量为2.89％；对比例3所得多肽单层膜G-SDS_cac的伯氨基暴露量为12.47％，对比例4所得多肽单层膜G-SDS_6％的伯氨基暴露量为13.13％。使用CasaXPS对N1s高分辨率图谱进行分峰并计算伯氨基含量XPS和Raman的结果表明，胶原多肽单层膜中氨基暴露量不仅与增加的β-sheet和randomcoil结构有关，而且与在不同表面活性剂浓度下，胶原多肽和表面活性剂的非共价相互作用有关。多肽单层膜G-STSo_6％具有最多的伯氨基暴露量，高的伯氨基暴露量将有效提高酶、乳糖等生物分子或药物分子的搭载量。

3.膜表面润湿性、荷电性质测定

对膜样品采用DSA-100型光学接触角测量仪(Kruss公司，德国)在室温下测量了样品的水接触角(CA)。使用自动分配控制器将2mL去离子水滴到样品上，并使用Laplace-Young拟合算法自动确定CA。通过在五个不同位置测量样本获得平均CA值，并用数码相机(日本索尼有限公司)拍摄图像。使用以SurPASS电动固体表面分析仪测定膜表面Zeta电位。

使用1mM Na₂SO₄溶液作为电解质测定了膜表面Zeta电位。图6显示了含SDS的胶原多肽单层膜表面的Zeta电位。表面Zeta电位的数值大小排序为：4wt.％多肽单层膜<G-STSo_cmc<G-STSo_cac<G-STSo_6％<G-SDS_cac<G-SDS_6％。结果表明，电位情况为：4wt.％多肽单层膜：-15.6mV；G-SDS_cmc：-2.29mV；G-SDS_cac：-0.85mV；G-SDS_6％：4.907mV；G-STSo_cac：-8.75mV；G-STSo_cmc：-8.99mV；G-STSo_6％：-3.33mV。Zeta电位的变化不仅与伯氨基暴露有关，而且与单层膜结构有关。

表面的润湿性可以直接通过水的接触角值反映出来，如图6所示。纯Ti片表现出疏水性，接触角为101.4±0.2°，4wt.％胶原多肽单层膜表面显示的接触角为56.1±1.2°。G-STSo_cmc的表面接触角～84°，G-STSo_cac和G-STSo_6％的表面接触角为～61°。而G-SDS_cac和G-SDS_6％表面上发现了接触角约为10°，如图7所示。结果表明，润湿性与伯氨基暴露和单层膜结构有关。

4.多肽单层中二级结构含量计算

在酰胺基团的振动中，酰胺I和酰胺Ⅲ带的拉曼峰对蛋白质主链的构象变化非常敏感。对于酰胺Ⅲ带来说，α-helix，β-sheet，β-turn，random coil这四种二级结构分别位于：1265-1300cm^-1，1230-1240cm^-1，1305cm^-1，1240-1260cm^-1。通过拉曼光谱对在Ti表面上组装的G-SDS的SAMs进行表征，酰胺III带的拉曼光谱揭示了有关胶原多肽单层膜二级结构的表面敏感信息。采用显微共焦拉曼光谱仪表征多肽单层膜表面二级结构含量，测试方法为：用配备有He-Ne激光器(632.8nm)和600凹槽mm^-1光栅的LabRAM HR800(Horiba JY，法国)光谱仪记录样品的振动拉曼光谱图。拉曼强度的测量精度约为1.2cm^-1。在激光功率为1.1mw，辐照1s，30次积累的条件下，获得了样品的拉曼参考光谱。用～0.06mW的激光功率，1s的照射时间和10次扫描获得PEI修饰的样品和胶原多肽覆盖样品的拉曼光谱。在所有拉曼实验中，都仔细控制了平台的方向，以使输入激光的偏振器平行于领结轴。光谱处理在Systat软件的PeakFit上进行。确定基线，以去卷积谱和三阶导数谱为参考确定各子峰位置。这有助于分辨重叠的子峰，并将干扰与噪声峰值区分开。曲线拟合法用于获得二级结构的百分比。然后，改变每个子峰的峰高，半峰宽和高斯含量，以使曲线拟合的均方根误差最小，并用次峰面积表征。采用曲线拟合的方法对原始光谱的酰胺Ⅲ谱带进行了分析。在酰胺III带区域，α-helix，β-sheet，β-turn和random coil结构的典型吸收峰分别为1265-1300cm^-1，1230-1240cm^-1，1305cm^-1和1240-1260cm^-1。

多肽单层膜表面二级结构含量见表4所示，通过添加不同浓度STSo，单层膜中α-helix，β-sheet，β-turn和random coil含量发生了变化。随着STSo的浓度从CAC增加到6wt.％，β-sheet和random coil的总含量从62％增加到71％。另外，α-helix的含量在含STSo的胶原多肽单层膜中变化很小，表明胶原多肽的二级结构被STSo稳定了。

表4

5.膜表面伯氨基分布点表征

探针合成：合成对伯氨基响应荧光探针分子四苯乙烯(TPE)-异硫氰酸酯(ITC)，对多肽单层膜表面的伯氨基分布进行直观表征。具体为1-[4-(异硫氰酸甲酯)苯基]-1,2,2-三苯基乙烯(TPE-ITC)，四苯基乙烯(TPE)和异硫氰酸酯(ITC)的加合物。

合成步骤如上式(1)，具体分5步：①在250mL双颈圆底烧瓶中，在N₂下将5.05g(30mmol)二苯基甲烷溶于100mL蒸馏四氢呋喃中。混合物冷却至0℃后，通过注射器缓慢加入15mL(2.5M己烷溶液，37.5mmol)正丁基锂。将混合物在0℃搅拌1小时。然后将4.91g(25mmol)4-甲基二苯甲酮加入到反应混合物中。将混合物加热至室温并搅拌6小时。合成化合物3。

②将反应混合物用饱和氯化铵溶液猝灭，然后用二氯化碳萃取。收集有机层并浓缩。将粗产物和0.20g对甲苯磺酸溶于100mL甲苯中。将该混合物加热回流4小时。冷却至室温后，反应混合物用二氯化碳萃取。收集有机层并浓缩。通过使用己烷作为洗脱剂的硅胶色谱法纯化粗产物，得到白色固体4。

③在250mL圆底烧瓶中，将5.20g(15.0mmol)4，2.94g(16.0mmol)N-溴代琥珀酰亚胺，0.036g过氧化苯甲酰在80mL四氯化碳中的溶液回流12小时。反应完成后，混合物用二氯甲烷和水萃取。将有机层合并，用无水硫酸镁干燥。通过使用己烷作为洗脱剂的硅胶色谱法纯化粗产物，得到5，为白色固体。

④在250mL双颈圆底烧瓶中，在N₂下将1.70g(4mmol)5和0.39g(6mmol)叠氮化钠溶于二甲基亚砜中。将混合物在室温下搅拌过夜(25℃，48h)。然后加入大量(100mL)水，溶液用乙醚萃取三次。将有机层合并，用无水硫酸镁干燥。通过使用己烷/氯仿(v/v＝3:1)作为洗脱剂的硅胶色谱法纯化粗产物，得到6，为白色固体。

⑤将叠氮基官能化的四苯乙烯(6；0.330g，0.852mmol)和三苯基膦(0.112g，0.426mmol)加入到双颈烧瓶中，其在真空下抽空并用干燥氮气冲洗三次。将二硫化碳(0.55g，7.242mmol)和蒸馏过的二氯甲烷(50mL)加入烧瓶中搅拌。将所得反应混合物回流过夜，然后减压除去溶剂。粗产物用冷乙醚(250mL)沉淀，过滤沉淀并洗涤三次。最后将产物真空干燥得到TPE-ITC，为白色固体。

首先对合成产物(四苯乙烯(TPE)-异硫氰酸酯(ITC))进行核磁氢谱表征。产物的¹HNMR由AVANCE II 400核磁共振波谱仪(Bruker，德国)获得，将～0.5cm的待测样品放入核磁管中，加入0.6mL氘代氯仿使其全部溶解，以四甲基硅烷(TMS)作为内标，在室温下手动匀场进行测定，扫描次数为64次，获得的¹H NMR谱图使用MestReNova软件进行处理，结果如图8所示。(图8a)¹H NMR(CDCl₃，400MHz)，δ(TMS，ppm)：7.15-6.98(m，15H)，6.89(s，4H)，2.24(s，3H)；(图8b)¹H NMR(CDCl₃，400MHz)，δ(TMS，ppm)：7.12-6.90(m，19H)，4.24(s，2H)；(图8c)¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)：6.90-7.15(m，19H)，4.61(s，2H)。例如，由于TPE和ITC单元之间亚甲基单元的共振，产物在¹HNMR(图9c)光谱中的δ4.16处显示出峰。

上述结果说明合成了用于伯氨基成像和功能化的TPE-ITC分子探针，其中反应性ITC基团对伯氨基有灵敏的响应性。因此，TPE-ITC是一种典型的具有聚集诱导发射(AIE)特性的荧光分子。TPE-ITC的AIE属性通过将大量AIE标签附着到胶原多肽链上，使得TPE-多肽生物共轭物能够产生强烈的荧光。通过简单地增加其标记度(DL)，可以大大提高生物结合物的荧光输出(高达2个数量级)。AIE探针策略是对伯氨基进行实时观察的有效方法。其优点是操作简单，低成本和高效率。此外，进一步调整AIE荧光基团的结构仍将有助于开发用于表面官能团检测的特定探针。

用合成的TPE-ITC标记胶原多肽膜表面的伯氨基，标记过程如式(2)所示。

具体步骤为：配制浓度为0.8mg/mL的TPE-ITC/DMSO溶液，用1mL注射器吸取上述溶液0.5mL，滴加9滴至5mL的Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲溶液中，将混合溶液超声10min，分散均匀。将多肽单层膜放入沉积盒中，然后把超声过的混合溶液缓缓倒入沉积盒中，50℃反应2h，反应完成后，在DMSO中提拉10次以去除未标记的TPE-ITC，最后用高纯氮气吹干后置于氮气中保存。

样品的激光扫描共焦显微镜(CLSM)图像是由TCS SP8 STED 3X共焦激光扫描显微镜(徕卡公司，德国)获得的，该显微镜配备有氩离子激光和两个光电倍增管。共振扫描器与超灵敏HyDTM探测器一起使用。用405nm激光激发样品，在430493nm处检测到荧光。CLSM图像如图9所示，在G-STSo_6％单层膜(图9h)中观察到了最大数量的荧光点分布信号，表明胶原多肽单层膜表面上伯胺的暴露数量最多。G-SDS_6％单层膜(图9f)中的伯胺含量大于其他浓度的伯胺。CLSM结果与XPS分析的结果一致。胶原多肽分子上含有苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，可自发荧光，实验中对没有TPE-ITC标记的样品进行了CLSM表征，作为对照，以说明标记后荧光的增强是伯氨基暴露引起的(图9c，e，g和i)。

6.膜生物相容性研究

对膜样品采用八肽胆囊收缩素(CCK-8)和四甲基偶氮唑蓝(MTT)测定细胞相容性。待测材料的制备尺寸与12孔细胞培养板中的孔相同。将纯Ti和G-STSo_6％单层膜样品放置在孔内，每个样品使用三个平行孔。人脐静脉内皮细胞(HUVECs，5×10⁵细胞/mL)接种于各孔中，在37℃、5％CO₂和10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基中培养24小时。随后，用无血清必需培养基伊格尔(MEM)清洗细胞两次，并在每个含有100μL无血清MEM的孔中加入15μLCCK-8溶液。在37℃、5％CO₂下孵育1h后，将100μL混合物转移到另一个12孔板上，因为残留的G-STSo₆％单层膜会影响450nm处的吸光度值。以655nm为参比，用iMark微孔板读取器在450nm处测量混合溶液的吸光度，仅含细胞和培养基的孔作为对照。细胞活力计算公式如下：

Viability_CCK-8＝(Sample abs_430-d33um/Positive control abs_430-d33um)×100

除CCK-8测定外，用MTT法测定HUVECs细胞活力。用下列公式计算细胞活力。以无单层膜细胞为对照。

Viability_MTT＝(Sample abs_370-d33um/control abs_370-d33um)×100

CCK-8分析的结果表明，与对照组相比，G-STSo₆％作为修饰表面的存在对细胞活力和生长没有影响(图10)。MTT检测结果还显示，G-STSo₆％单层膜对HUVEC几乎无毒性(图11)。

细胞克隆实验：将MCF-7细胞培养于60mm培养皿中，在37℃、5％CO₂和DMEM中孵育24小时，然后对细胞进行3步不同的处理：空白对照组和G-STSo₆％单层膜。8h后，用PBS缓冲液(10mM，pH＝7.4)洗涤细胞3次；随后，将这些细胞在37℃的新鲜细胞培养基中，在5％CO₂的DMEM中再培养10天，然后用4％多聚甲醛固定，并用0.2％结晶紫染色；计数每个细胞超过50个的菌落。从三个平行实验中获得平均存活分数。

存活分数＝(细胞克隆形成菌落数)/(细胞接种数×接种效率)

在对细胞进行不同的处理后(对照组，G-STSo₆％重复两次)，在8小时后对细胞集落进行计数(图12)。对照组，G-STSo₆％组中的菌落数量仅略有不同，这表明胶原多肽单层膜中的痕量表面活性剂对细胞活力没有影响。因此，本发明所得多肽单层膜表面具有优异的细胞相容性。

7.膜稳定性研究

胶原多肽单层膜的稳定性由DMI3000B倒置荧光显微镜(徕卡，德国)上进行，该显微镜配备Lecia DFC 450C型CCD。将不同样品于室温下放置在生理盐水中浸泡7天后，样品使用高纯氮气吹干备用。将G-STSo₆％继续放置于40℃生化培养箱中浸泡15天后，使用高纯氮气吹干备用。观察前，需先把荧光模块打开，将机器预热15min后使用。将载玻片清洗干净，取待测样品于清洗干净的载玻片上，放在载物台上固定，先粗略调节载物台高度，随后微调聚焦，用明场找到最清晰的样品细节，然后用荧光模块观察，先用50X观察荧光点分布情况，然后依次把倍数放大，观察荧光点分布，对比胶原多肽单层膜浸泡前后荧光点分布情况，可以直观地分析其稳定性。结果如图13所示。浸泡一周后绿色荧光点的分布没有减少，表明胶原多肽单层膜固定的表面很稳定。另外，样品在40℃的恒温箱中放置15天，荧光点分布也没有明显变化。综合以上结果，可以得出在Ti表面上形成了相对稳定的G-STSo_6％单层膜，这种稳定性归因于PEI和胶原多肽之间的静电相互作用和其他非共价相互作用。

Claims

1.一种具有表面低电位且疏水性的多肽单层膜，其特征在于，所述多肽是由分子量为（1.48±0.2）×10⁵g/mol的多肽分子构成的，单层膜的厚度为6.2~9.0nm，膜表面的伯氨基暴露量为9.5~15%，多肽单层膜的Zeta电位为-3~-9mV；所述膜的接触角为61±1°~84±1°。

2.根据权利要求1所述的多肽单层膜，其特征在于，所述多肽为胶原多肽；所述多肽的氨基酸的组成为甘氨酸（Gly）：7.30±0.5%；缬氨酸（Vla）：17.48±0.5%；异亮氨酸（Ile）：36.97±0.5%；亮氨酸（Leu）：13.85±0.5%；酪氨酸（Tyr）：2.68±0.5%；苯丙氨酸（Phe）：1.5±0.5%；赖氨酸（Lys）：4.41±0.5%；组氨酸（His）：0.45±0.5%；精氨酸（Arg）：3.45±0.5%；脯氨酸（Pro）：5.96±0.5%；半胱氨酸（Cys）：5.95±0.5%。

3.根据权利要求1所述的多肽单层膜，其特征在于，所述单层膜的厚度为6.6±0.1~8.5±0.1mm。

4.根据权利要求1所述的多肽单层膜，其特征在于，所述单层膜的厚度为6.6±0.1mm、7.3±0.1mm、8.5±0.1mm。

5.根据权利要求1所述的多肽单层膜，其特征在于，所述单层膜的厚度为6.6±0.1mm。

6.根据权利要求1所述的多肽单层膜，其特征在于，所述单层膜中多肽的二级结构含量为：α-helix为24~30%；β-sheet为18~24%；β-turn为4~8%；random coil为43~48%。

7.根据权利要求1所述的多肽单层膜，其特征在于，所述膜的二级结构含量为：α-helix为29.66±0.1%；β-sheet为18.98±0.15；β-turn为7.93±0.05%；random coil为43.44±0.26%；

或者α-helix为24.77±0.1%；β-sheet为20.50±0.11%；β-turn为7.26±0.08%；randomcoil为47.47±0.19%；

或者α-helix为24.28±0.1%；β-sheet为23.21±0.12%；β-turn为4.70±0.03%；randomcoil为47.80±0.20%。

8.根据权利要求1所述的多肽单层膜，其特征在于，多肽单层膜是由密堆积的纳米颗粒组成的，球形纳米颗粒的平均粒径为30±2 nm；所述多肽单层膜的Zeta电位为-（3.33±0.2）mV、-（8.75±0.2）mV或-8.99mV。

9.根据权利要求1所述的多肽单层膜，其特征在于，所述膜表面的伯氨基暴露量为9.92±0.3%~14.51±0.3%。

10.根据权利要求9所述的多肽单层膜，其特征在于，所述伯氨基暴露量为9.92±0.3%、11.6±0.3%或者14.51±0.3%。

11.根据权利要求10所述的多肽单层膜，其特征在于，所述伯氨基暴露量为14.51±0.3%。

12.一种含有多肽单层膜的复合膜，其特征在于，包括聚乙烯亚胺薄膜和权利要求1~11任一项所述多肽单层膜，聚乙烯亚胺和多肽单层膜之间通过离子键结合，其中，聚乙烯亚胺薄膜的厚度为0.25~0.38nm，多肽单层的厚度为6.2~9.0nm。

13.权利要求1~11任一项所述多肽单层膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在一定温度下，配制多肽溶液，然后加入表面活性剂十四烷基磺酸钠（STSo），得到多肽-STSo混合溶液，保温备用；

（2）将钛片表面打磨抛光，浸入混酸溶液中处理，冲洗至中性，用氮气吹干后再烘干；

（3）将烘干后的钛片浸入聚乙烯亚胺（PEI）水溶液中处理后，用水冲洗，用氮气吹干后再烘干，得到沉积有PEI的正离子化的钛片；

（4）将正离子化的钛片浸入步骤（1）所得多肽-STSoS混合溶液中，沉积8~12 min，然后将其在去离子水中提拉20~25次，用高纯氮气吹干后，即得多肽单层膜。

14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述温度与步骤（4）中沉积过程温度均为50℃。

15.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，多肽溶液的浓度为4%wt；混合溶液中十四烷基磺酸钠的浓度为：2.50mmol/L~7.96mmol/L。

16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，混合溶液中十四烷基磺酸钠的浓度为2.5mmol/L、7.00mmol/L或7.96mmol/L。

17.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，多肽溶液的配置方法为：将多肽和去离子水混合，于室温溶胀0.5小时后，加热至50℃，搅拌2小时，使多肽完全溶解，然后调节pH至10.00 ± 0.02。

18.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，钛片使用金相砂纸打磨抛光后，依次用去离子水，无水乙醇，丙酮超声清洗钛片各15 min，然后用高纯氮气吹干后在60℃烘箱干燥12 h。

19.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，打磨抛光的方法为：使用金相砂纸按照800，1500，3000，5000，7000目的顺序依次打磨抛光。

20.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，混酸溶液为体积比为1:1的质量分数为30%H₂O₂和98%H₂SO₄的混合液，处理时间为1小时。

21.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，钛片在PEI水溶液中的处理时间为20~40分钟。

22.权利要求1~11任一项所述多肽单层膜或权利要求12所述复合膜在皮革制造领域中的应用。