CN111838198B

CN111838198B - 鹰嘴豆提取物在防治农作物病原细菌中的应用

Info

Publication number: CN111838198B
Application number: CN202010824753.XA
Authority: CN
Inventors: 拉博德·佩德罗; 王苏妍; 徐东; 胡凯旋; 施欣驰
Original assignee: Nantong University
Current assignee: Nantong University
Priority date: 2020-08-17
Filing date: 2020-08-17
Publication date: 2021-07-02
Anticipated expiration: 2040-08-17
Also published as: CN111838198A

Abstract

本发明公开了鹰嘴豆提取物在防治农作物病原细菌中的应用，属于农业技术领域。具体地，所述鹰嘴豆提取物为鹰嘴豆芽素A或/和染料木素，该提取物对于大豆斑疹病菌（Xanthomonas axonopodis pv.glycines,Xag）、梨火疫病菌（Erwinia amylovora,Ea）、番茄细菌性溃疡病菌（Clavibacter michiganensis,Cm）、西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli,Ac）均有抑制作用，可用于制备防治农作物病原细菌的农药。

Description

鹰嘴豆提取物在防治农作物病原细菌中的应用

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体涉及鹰嘴豆提取物在防治农作物病原细菌中的应用。

背景技术

农业的发展离不开农药，但农药在给农业发展做出重大贡献的同时，也给自然环境带来了危害。近年来，由于化学农药的滥用，增加了害虫的抗药性，导致农药用量和次数不断增加，进一步加剧了环境污染和生态破坏，造成了恶性循环，严重危害了人类的生活与健康。据相关报道，在农药的施用过程中，仅约5％发挥其应有的作用，而绝大部分农药流失到水土等周围环境中，造成环境危害。如何提高农药有效利用率，降低农药在非靶标环境中的投放量，已成为我国农药学科亟待解决的问题，农药合理使用技术的研究是目前农药学研究的热点之一。

当前，国家提出了必须立足国内实现粮食基本自给的方针，制定粮食生产持续稳定发展的长效机制，保护和调动农民的种粮积极性。而发展粮食生产，提高单位面积产量，使用农药防治农作物病害是必要条件之一。然而农药的使用对人畜和生态环境造成了不良影响，食品及环境中农药残留超标，严重威胁人类健康。

为推动生态农业建设，实现减少化肥、农药使用的目标，生物农药的开发显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供鹰嘴豆提取物在防治农作物病原细菌中的应用，该提取物对4种农作物病原细菌均具有拮抗活性，可用于制备防治农作物病原细菌的农药。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

鹰嘴豆提取物在防治农作物病原细菌中的应用，所述鹰嘴豆提取物为鹰嘴豆芽素A或/ 和染料木素。

进一步地，所述防治农作物病原细菌包括但不限于大豆斑疹病菌(Xanthomonasaxonopodis pv.glycines,Xag)、梨火疫病菌(Erwinia amylovora,Ea)、番茄细菌性溃疡病菌 (Clavibacter michiganensis,Cm)、西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)。

一种用于防治农作物病原细菌的农药，包括鹰嘴豆芽素A或/和染料木素。

一种用于防治大豆斑疹病的农药，包括鹰嘴豆芽素A或/和染料木素。

本发明研究了鹰嘴豆芽素A及染料木素对4种农作物病原细菌的拮抗活性，并深入探究了鹰嘴豆芽素A对大豆斑疹病菌Xag鞭毛游动性、蛋白酶活性及生物膜形成情况的影响，以及鹰嘴豆芽素A对大豆叶片上大豆斑疹病菌(Xanthomonas axonopodispv.glycines,Xag)的预防及治疗作用的影响，结果证明鹰嘴豆芽素A能有效防治大豆斑疹病。

鹰嘴豆芽素A及染料木素是从植物中提取的天然产物，用于制备防治农作物病原细菌的农药，不对农作物产生药害作用，且环境友好。

附图说明

图1为本发明实施例1中鹰嘴豆植物内活性物质鹰嘴豆芽素A及染料木素的高效液相色谱图以及MS分析图。其中图1A中a为鹰嘴豆植株组织提取物的高效液相色谱图；b为鹰嘴豆芽素A(Biochanin A)标准品的高效液相色谱图；c为染料木素(Genistein)标准品的高效液相色谱图；图1B为鹰嘴豆芽素A的质谱图；图1C为染料木素的质谱图。

图2为本发明实施例3中不同浓度的鹰嘴豆芽素A对Xag细菌鞭毛游动性的影响。ns表示没有显著差异，**表示p<0.01，具有极显著差异。

图3为本发明实施例4中不同浓度的鹰嘴豆芽素A对Xag蛋白酶活性的影响。ns表示没有显著差异，*表示p<0.05，具有显著差异。

图4为本发明实施例5中不同浓度的鹰嘴豆芽素A对Xag生物膜形成的影响。**表示p< 0.01和***表示p<0.001，具有极显著差异。

图5为本发明实施例6和7中鹰嘴豆芽素A对大豆叶片上Xag的预防及治疗作用的影响。其中，图5A为鹰嘴豆芽素A对大豆叶片上Xag的预防及治疗作用的统计数据分析图；图5B 为鹰嘴豆芽素A对大豆叶片上Xag的预防及治疗作用的叶片直观图。

具体实施方式

本发明公开了鹰嘴豆芽素A和染料木素在防治作物细菌性病害方面的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明中。本发明的微生物菌株和相关应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。

实施例1

鹰嘴豆植株中抗Xag活性物质提取物的分离及鉴定

称取1g鹰嘴豆植株，用小刀将其切成长度约为1mm的小段后转移至研钵中研碎，将组织碎片转移至离心管中，向其中加入200μL乙醇，于12000rpm摇床中震荡10min，将离心管转移至4℃离心机内8000rpm，离心10min，上清液经0.22μm滤膜过滤后用高效液相色谱检测。采用C18色谱柱(250mm×4.6mm,Phenomenex)，紫外检测波长为254nm，以乙腈和水为流动相，前30min乙腈的含量由10％梯度递增至100％，维持5min后立即降至10％并维持5min，流速为1mL/min，柱温箱温度为25℃。高效液相色谱图如图1A所示，收集波峰15.8min和20.3min处的洗脱液，在冻干机中干燥后将其重溶于30μL ddH₂O中备用。

MS分析结果如图1B和1C所示，在15.8min处的活性物质有一个主质谱峰，m/z为271.0，与染料木素(C₁₅H₁₁O₅[M+H]⁺＝271.0606)一致，在20.3min处的活性物质有一个主质谱峰， m/z为285.0，与鹰嘴豆芽素A(C₁₆H₁₃O₅[M+H]⁺＝285.0763)一致。此外，商品化的染料木素和鹰嘴豆芽素A在液相上的出峰时间和在质谱上的碎片峰与所收集样品一致，由此确认提取得到的活性物质为染料木素和鹰嘴豆芽素A。

Xag菌液准备：从-80℃冰箱中取出甘油保存的Xag接种于10mL LB液体培养基中(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH调至7.0)，于28℃，200rpm摇床中避光培养至OD₆₀₀＝1.2。

将100μL Xag菌液加入到10mL LB固体培养基中，混匀后倒入培养皿并冷却至室温，备用。用打孔器在固体培养基中央打一个直径约3mm的孔，向其中加入收集的单波峰样品溶液，将培养皿置于28℃培养箱培养48h后，测量抑菌圈大小。结果表明，在色谱图上15.8 min和20.3min处有2个活性物质对Xag有拮抗活性，进一步确认鹰嘴豆植株内具有拮抗Xag 的活性物质为鹰嘴豆芽素A和染料木素。

实施例2

鹰嘴豆芽素A及染料木素对农作物病原细菌拮抗活性的检测

本实施例所用农作物病原细菌包括Xag、Ea、Cm、Ac。病原菌菌液准备方法同实施例1。向200μL含有0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL 鹰嘴豆芽素A或染料木素的LB液体培养基中加入4μL菌液，于28℃摇床中200rpm震荡培养6h后监测菌液浊度。结果如表1所示。

表1鹰嘴豆芽素A和染料木素对农作物病原细菌的最小抑菌浓度

由上表可知，鹰嘴豆芽素A对Xag的最小抑菌浓度(MIC)为100μg/mL，对Ea、Cm、 Ac的MIC值为200μg/mL。染料木素对Xag、Ea、Cm、Ac的MIC大于500μg/mL。由此可见，鹰嘴豆芽素A及染料木素对农作物病原细菌均有抑菌效果，且鹰嘴豆芽素A对这些农作物病原细菌的抑菌效果优于染料木素。

实施例3

鹰嘴豆芽素A对Xag鞭毛游动性的影响

Xag菌液准备方法同实施例1。制备含有0μg/mL、5μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50 μg/mL鹰嘴豆芽素A的LB固体培养基，向培养基上点入3μL菌液，将培养皿置于28℃恒温箱培养72h后，测量菌落直径。

结果如图2所示，50μg/mL鹰嘴豆芽素A能显著抑制Xag的鞭毛移动性(Swimmingmotility)。

实施例4

鹰嘴豆芽素A对Xag蛋白酶活性的影响

Xag菌液准备方法同实施例1。向含有1％奶粉的LB固体培养基中加入含有0μg/mL、5 μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL的鹰嘴豆芽素A，向培养基上点入3μL菌液，将培养皿置于28℃恒温箱培养48h后，测量水解圈直径。

结果如图3所示，50μg/mL鹰嘴豆芽素A能显著抑制Xag的蛋白酶活性(Proteaseactivity)。

实施例5

鹰嘴豆芽素A对Xag生物膜形成的影响

Xag菌液准备方法同实施例1。于4℃，5000rpm离心机中离心8min收集菌体，并将其重悬于等体积的去离子水中。向含有0μg/mL、5μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL 鹰嘴豆芽素A的3mL LB液体培养基中加入30μL菌液，将玻璃试管置于28℃摇床中培养5 d。去除菌液，用去离子水轻轻冲洗2遍后，向玻璃试管中加入6mL结晶紫溶液，室温静置1h后弃去溶液，用去离子水洗3遍，并于空气中干燥1h。向玻璃试管中加入3mL 40％的甲醇和10％的冰醋酸混合液，充分溶解后，在575nm波长下测定鹰嘴豆芽素A对生物膜形成的影响。

结果如图4所示，5μg/mL鹰嘴豆芽素A即对Xag生物膜形成(Biofilm formation)存在显著抑制作用，且鹰嘴豆芽素A浓度越高，抑制能力越强。

实施例6

鹰嘴豆芽素A对大豆叶片上Xag的预防作用

Xag菌液准备方法同实施例1。于4℃，5000rpm离心机中离心6min收集菌体后，用适量的无菌去离子水清洗菌体2次，并将其重悬于特定体积的去离子水中，使OD₆₀₀＝1。在灭菌土壤中种植大豆，3周后备用。

随机选取40片大豆叶片，向叶片左半边喷洒100μg/mL的鹰嘴豆芽素A溶液(pH5.0)，右半边喷洒等体积、pH＝5.0的水溶液。自然风干后，喷洒等体积的Xag菌液。7d后对叶片上的黄色病斑进行计数，评估鹰嘴豆芽素A对大豆上Xag的预防作用。

结果如图5所示，与对照组(Control)相比，鹰嘴豆芽素A(Biochanin A)能使Xag造成的病斑数减少50％，说明鹰嘴豆芽素A对大豆斑疹病具有较好的预防作用(Preventive)。

实施例7

鹰嘴豆芽素A对大豆叶片上Xag的治疗作用

Xag菌液准备方法同实施例1。大豆准备同实施例6。

随机选取40片大豆叶片，向叶片上喷洒Xag菌液。48h后，向叶片左半边喷洒100μg/mL 的鹰嘴豆芽素A溶液(pH 5.0)，右半边喷洒等体积、pH＝5.0的水溶液。5d后对叶片上的黄色病斑进行计数，评估鹰嘴豆芽素A对大豆上Xag的治疗作用。

结果如图5所示，与对照组(Control)相比，鹰嘴豆芽素A(Biochanin A)能使Xag造成的病斑数减少45％，说明鹰嘴豆芽素A对大豆斑疹病具有较好的治疗作用(Curative)。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.鹰嘴豆提取物在防治农作物病原细菌中的应用，所述鹰嘴豆提取物为鹰嘴豆芽素A，或鹰嘴豆芽素A和染料木素的混合物；

所述农作物病原细菌为大豆斑疹病菌（Xanthomonas axonopodis pv. glycines）、梨火疫病菌（Erwinia amylovora）、番茄细菌性溃疡病菌（Clavibacter michiganensis）或西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli）。