CN111825752B - 水稻小穗簇生突变体及其分子鉴定方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物分子生物学技术领域，具体涉及水稻小穗簇生突变体及其分子鉴定方法和应用。本发明提供一种水稻SPED1蛋白突变体，以野生型水稻SPED1蛋白的氨基酸序列为参考序列，该突变体的第519位天冬酰胺突变为丝氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该突变体是一个部分显性突变体，其纯合基因型和杂合基因型均可导致水稻植株枝梗顶端小穗的簇生，杂合基因型还可提高水稻的结实率。该突变体可用于提高杂交水稻结实率和观赏水稻的培育。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子生物学技术领域，具体涉及水稻小穗簇生突变体及其分子鉴定方法和应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一，也是禾本科和单子叶植物的模式植物。小穗是禾本科植物花序独有的一种结构单元，具有开花结实的生物学功能。深入研究水稻小穗的发育过程和分子调控机制，不仅有助于理解水稻花序的发育过程和分子基础，而且对提高水稻的产量和品质具有重要意义。
水稻的花序又称为穗，属于复总状花序。穗由主穗轴、一次枝梗、二次枝梗、小穗梗和小穗组成。从穗颈节到穗顶端退化的生长点是穗轴，穗轴上一般有8～15个穗节。穗颈节是最下端的一个穗节，退化的穗顶生长点处是最上端的一个穗节，每个穗节上着生一个一次枝梗。一次枝梗上再分出的枝梗称为二次枝梗。每个一次枝梗上除了二次枝梗，在接近顶端的部分还可分散着生4～7个小穗梗。每个二次枝梗上可以分散着生2～4个小穗梗。在小穗梗的末端着生一个小穗。每个小穗会分化出3朵颖花，但有2朵会在发育过程中退化，形成护颖，称为不完全花；剩下一朵花为完全花，可以开花结实。因此每个小穗只有1朵正常的颖花。
目前，很多控制水稻小穗发育的基因已经被克隆了，例如SUPERNUMERARY BRACT(SNB)、MULTI-FLORET SPIKELET1(MFS1)、TONGARI-BOUSHI 1(TOB1)和FON4等。这些基因突变后，会导致小穗内小花数目的增加，为以增加穗粒数为目标的水稻育种提供了新的潜在途径。然而，snb、mfs1、tob1和fon4突变体的小穗除了多花性状外，还同时表现出许多其它花器官缺陷，不能直接进行生产应用。
小穗簇生是一种突变性状，指一次枝梗或二次枝梗上靠近顶端、原本散生的数粒小穗，由于枝梗和/或小穗轴的缩短而紧密地聚集在一起生长发育的现象。SPED1是一个调控小穗簇生的基因(Jiang G,Xiang Y,Zhao J,Yin D,Zhao X,Zhu L,Zhai W(2014)Regulation of inflorescence branch development in rice through a novelpathway involving the pentatricopeptide repeat protein sped1-D.Genetics 197:1395-1407)。小穗簇生稻与一花多子房簇生稻不同：一花多子房簇生稻是在一朵颖花内有多个子房，产生多粒米，碾米后易产生碎米，故没有实用价值；而小穗簇生稻每个小穗内的完全花都具有健全的颖壳及雌雄花器官，都能正常开花结实，且谷粒大小饱满均匀，结实率高。小穗簇生突变不仅可直接应用于生产，还可作为一种新的种质资源在水稻育种中加以利用。
发明内容
本发明的目的是提供一种导致小穗簇生性状的水稻SPED1蛋白突变体、其编码基因、分子标记及其应用。
本发明发现了一个水稻SPED1蛋白的突变体，该突变体相对于野生型SPED1蛋白在第519位天冬酰胺突变为丝氨酸，该突变体是一个部分显性突变，可影响水稻小穗轴和枝梗的发育以及小穗在穗上的空间分布，导致小穗簇生、小穗多花以及小穗轴、枝梗和穗长缩短，提高水稻穗粒数和结实率。
本发明提供如下技术方案：
本发明的第一方面是提供水稻SPED1蛋白突变体，以野生型水稻SPED1蛋白的氨基酸序列为参考序列，所述突变体包含第519位天冬酰胺突变为丝氨酸的突变位点。
以上所述的野生型水稻SPED1蛋白的Genbank登录号为LOC_Os06g39650。
具体地，所述突变体具有如下(1)～(3)任一氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入得到的、对应蛋白具有使水稻产生小穗簇生性状功能且来源于水稻的氨基酸序列；
(3)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％同源性、对应蛋白具有使水稻产生小穗簇生性状功能且来源于水稻的氨基酸序列。
本发明的第二方面是提供编码所述水稻SPED1蛋白突变体的核酸。
在已知所述水稻SPED1蛋白突变体的氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可根据密码子规则获得编码水稻SPED1蛋白突变体的核酸的核苷酸序列。
可选地，所述核酸具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为SPED1蛋白突变体的基因组核苷酸序列。
本发明还提供一种水稻SPED1基因等位突变体sped1-1(序列如SEQ ID NO.2所示)，其为水稻SPED1基因在编码区第1556个碱基发生了一个A到G的SNP突变，导致其编码蛋白的第519位氨基酸残基从天冬酰胺突变为丝氨酸。
本发明的第三方面是提供包含所述核酸的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
上述表达盒可为将编码水稻SPED1蛋白突变体的核酸与调控其转录或表达的元件连接的DNA片段。
上述载体可为克隆载体或表达载体。
上述宿主细胞可为微生物细胞或非繁殖性植物细胞。
本发明的第四方面是提供包含所述核酸的水稻、水稻组织或水稻细胞。
本发明的第五方面是提供水稻SPED1蛋白突变体或编码该突变体的核酸或含有该核酸的生物材料在调控水稻的如下任一性状中的应用：
(1)小穗簇生；
(2)小穗梗长、枝梗长或穗长；
(3)穗粒数；
(4)结实率；
(5)粒重。
上述(1)～(2)具体为：通过使水稻具有所述水稻SPED1蛋白突变体的杂合或纯合基因型，使水稻具有小穗簇生性状，使水稻的小穗梗长和/或枝梗长缩短，使水稻的穗长缩短。
上述(3)具体为：通过使水稻具有所述水稻SPED1蛋白突变体的杂合基因型，使水稻的穗粒数降低；或者，通过使水稻具有所述水稻SPED1蛋白突变体的纯合基因型使水稻的穗粒数增加。
上述(4)具体为：通过使水稻具有所述水稻SPED1蛋白突变体的杂合基因型，使水稻的结实率提高；或者，通过使水稻具有所述水稻SPED1蛋白突变体的纯合基因型，使水稻的结实率降低。
上述(5)具体为：通过使水稻具有所述水稻SPED1蛋白突变体的纯合基因型，使水稻的单粒重降低。
本发明的第六方面是提供水稻SPED1蛋白突变体或编码该突变体的核酸或含有该核酸的生物材料在具有如下任一性状的水稻的选育或种质资源改良中的应用：
(1)小穗簇生；
(2)小穗梗长、枝梗长或穗长缩短；
(3)穗粒数改变；
(4)结实率改变；
(5)粒重降低。
上述(1)～(2)具体为：通过使水稻具有所述水稻SPED1蛋白突变体的杂合或纯合基因型，使水稻具有小穗簇生性状，使水稻的小穗梗长和/或枝梗长缩短，使水稻的穗长缩短。
上述(3)具体为：通过使水稻具有所述水稻SPED1蛋白突变体的杂合基因型，使水稻的穗粒数降低；或者，通过使水稻具有所述水稻SPED1蛋白突变体的纯合基因型，使水稻的穗粒数增加。
上述(4)具体为：通过使水稻具有所述水稻SPED1蛋白突变体的杂合基因型，使水稻的结实率提高；或者，通过使水稻具有所述水稻SPED1蛋白突变体的纯合基因型，使水稻的结实率降低。
上述(5)具体为：通过使水稻具有所述水稻SPED1蛋白突变体的纯合基因型，使水稻的单粒重降低。
本发明提供的第七方面是提供一种制备改良水稻的方法，该方法包括：使水稻表达所述水稻SPED1蛋白突变体。
所述改良水稻具有如下任一性状：
(1)小穗簇生；
(2)小穗梗长、枝梗长或穗长缩短；
(3)穗粒数改变；
(4)结实率改变；
(5)粒重降低。
上述(1)～(2)具体为：通过使水稻具有所述水稻SPED1蛋白突变体的杂合或纯合基因型，使水稻具有小穗簇生性状，使水稻的小穗梗长和/或枝梗长缩短，使水稻的穗长缩短。
上述(3)具体为：通过使水稻具有所述水稻SPED1蛋白突变体的杂合基因型，使水稻的穗粒数降低；或者，通过使水稻具有所述水稻SPED1蛋白突变体的纯合基因型，使水稻的穗粒数增加。
上述(4)具体为：通过使水稻具有所述水稻SPED1蛋白突变体的杂合基因型，使水稻的结实率提高；或者，通过使水稻具有所述水稻SPED1蛋白突变体的纯合基因型，使水稻的结实率降低。
上述(5)具体为：通过使水稻具有所述水稻SPED1蛋白突变体的纯合基因型，使水稻的单粒重降低。
优选地，通过基因编辑、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法使水稻表达所述水稻SPED1蛋白突变体。
本发明所述的小穗簇生具体为植株枝梗顶端小穗的簇生。
本发明的第八方面是提供用于检测所述水稻SPED1蛋白突变体或其核酸的分子标记，所述分子标记为含有SEQ ID NO.6所示序列第96位的多态性为A/G的位点的DNA片段。
具体地，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的第九方面是提供用于扩增所述分子标记的引物，其包含SEQ ID NO.3-4所示的上游引物和SEQID NO.5所示的下游引物。
上游引物sped1-1_F1：AAAAAAAACTCAATCAAGCTACACCCT GAAC(SEQ ID NO.3)；
上游引物sped1-1_F2：CTCAATCAAGCTACACCCTGCAG(SEQ ID NO.4)；
下游引物sped1-1_R：GAATTTGCTCATGTCTAATGTA(SEQ ID NO.5)。
本发明的第十方面是提供所述分子标记或所述引物的如下任一应用：
(1)检测水稻是否含有所述水稻SPED1蛋白突变体或其核酸；
(2)制备具有小穗簇生性状的水稻。
上述应用中，利用SEQ ID NO.3-4所示的上游引物和SEQ ID NO.5所示的下游引物进行PCR扩增，若只能扩增出126bp的产物，则待检水稻为所述水稻SPED1蛋白突变体对应基因的纯合基因型，表型为枝梗末端有2个或2个以上小穗簇生；若只能够扩增出118bp的产物，则待检水稻不携带所述水稻SPED1蛋白突变体对应基因，表型为枝梗末端小穗不发生簇生；若能够同时扩增出126bp和118bp的产物，则待检水稻为所述水稻SPED1蛋白突变体对应基因的杂合基因型，表型为枝梗末端有不超过2个小穗簇生。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明提供了一个新的水稻小穗簇生蛋白突变体sped1-1及其分子标记和检测方法，为具有簇生小穗性状的水稻的选育提供了新方法。
(2)sped1-1杂合基因型可在不显著影响粒重的情况下提高杂交水稻的结实率，为提高杂交水稻的产量提供了新方法。
附图说明
图1为本发明实施例2中野生型水稻和sped1-1突变体黄熟期小穗的表型；其中A为野生型小穗的表型；B为sped1-1突变体杂合基因型时枝梗末端簇生2个小穗的表型；C为sped1-1突变体纯合基因型时枝梗末端簇生3个小穗的表型。
图2为本发明实施例5中sped1-1基因的图位克隆图谱。
图3为本发明实施例7中sped1-1基因测序结果峰图；其中A为枝梗末端簇生2个小穗杂合型基因型，B为枝梗末端簇生3个小穗纯合突变基因型。
图4为实施例7中sped1-1突变体基因的突变位点及氨基酸残基改变示意图。
图5为本发明实施例8中突变位点分子标记及其扩增引物设计构思示意图。
图6为本发明实施例8中sped1-1基因共分离验证电泳图，其中，2花和3花分别代表簇生2穗突变体和簇生3穗突变体，MH63表示明恢63，ZH11表示中花11号。
图7为本发明实施例9中sped1-1基因杂交转育的技术路线图，其中RP代表受体水稻材料。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1水稻小穗簇生突变体sped1-1的获得
2016年6月筛选获得一份自然变异的水稻小穗簇生突变体，命名为小穗簇生稻。经过2017年早造和晚造的种植及表型观察，发现该变异为可遗传的变异。2017年晚造，用小穗簇生稻同明恢63、日本晴、93-11进行正反交收获F1代杂交种，2018年早造播种F1杂交种，发现所有杂交种均表现为枝梗末端簇生2个小穗，表明该小穗簇生性状为部分显性。2018年晚造播种F2群体，通过调查F2代的表型分离，发现群体能分离出野生型，枝梗末端簇生2个小穗，3个小穗，4个小穗，5个小穗及5个以上小穗等多种表型。按小穗簇生数目的不同，分单株收种，并于2019年早造种植成家系。从所述家系中，发现一个F3群体的遗传分离比符合孟德尔遗传定律，将该F3群体用于后续实施例的分析。
实施例2水稻小穗簇生突变体F3群体的表型分析
在实施例1得到的F3群体中，小穗簇生稻每颗籽粒的颖壳及雌雄花器官均健全，均能正常扬花结实，而且谷粒充实饱满细长，各簇生粒与单粒的外观、大小无异。与野生型水稻(图1的A)相比，sped1-1杂合突变体一般只在一次枝梗末端簇生2个小穗(图1的B)，sped1-1纯合突变体则一般在一次和二次枝梗末端簇生2-3个小穗，以3粒居多(图1的C)。造成小穗簇生的原因主要是突变体中枝梗和小穗梗与野生型相比明显缩短。
实施例3水稻sped1-1基因的遗传分析
在实施例1得到的F3群体中，共获得枝梗末端簇生2个小穗的植株73株，枝梗末端簇生3个小穗的植株41株，野生型42株，野生型：簇生2穗：簇生3穗分离比符合1:2:1(χ2＝0.15，P>0.05)。上述结果表明在该F3群体中，小穗簇生性状是一种部分显性性状，由sped1-1单基因控制，枝梗末端簇生2个小穗的植株为sped1-1杂合基因型。
实施例4水稻小穗簇生突变体sped1-1的考种分析
为具体分析小穗簇生在种植资源利用上的价值，从实施例1获得的F3群体分离出来的野生型、簇生2小穗、簇生3小穗植株中，每种表型各随机选取5个单株对分蘖、穗长、穗粒数、实粒数、单粒重等农艺性状进行考种分析(表1)。从表1可以看出，在有效穗数方面，突变体比野生型略有增加。而穗长方面簇生2小穗植株的穗长比野生型短，而簇生3小穗植株的穗长比簇生2小穗植株的穗更短，这主要是因为突变体的小穗着生更紧密，枝梗和小穗梗更短。穗粒数方面，簇生2小穗的单株间穗粒数差异较大，因而平均穗粒数较野生型降低，而簇生3小穗植株的平均穗粒数比野生型略有增加，表明簇生性状在一定程度上有增加穗粒数的作用。实粒数方面，实粒/穗粒数可以看出，野生型植株有效结实率为64.8％，簇生2小穗植株有效结实率为68.8％，簇生3小穗植株有效结实率为59.0％，表明簇生2小穗植株具有最高的结实率，提示sped1-1杂合基因型具有在杂交水稻组合选育中对结实率改良的潜力。单粒重方面，簇生3小穗植株较野生型显著降低，但簇生2小穗植株与野生型没有显著差异。
表1农艺性状考种分析
实施例5水稻小穗簇生突变体sped1-1基因的定位
以实施例1获得的F3群体为作图群体，使用图位克隆的方法对sped1-1基因进行定位(图2)。利用该群体将sped1-1初定位于6号染色体SSR标记6.215和6.263之间约4Mb的距离，随后在2个标记之间开发紧密连锁标记RM20270、RM20300、RM20316、RM20343、RM20356、RM20361、6.246、RM20424，sped1-1与SSR标记RM20316和RM20343共分离。sped1-1基因与上述8个标记之间的交换单株分别为3个，2个，0个，0个，2个，2个，1个，5个。根据文献报道，一个控制小穗簇生性状的基因SPED1就位于sped1-1所在的区段内。用于定位的标记引物对序列见表2。
表2用于定位sped1-1的引物对序列
实施例6候选基因测序
采用CTAB法提取水稻叶片DNA，用Nanodrop2000检测DNA浓度，稀释至10ng/L用作PCR模板。用候选基因SPED1的引物扩增野生型和簇生3小穗植株的DNA。
用于扩增SPED1的引物对序列见表3：
表3用于扩增sped1-1的引物对序列
PCR反应体系为：1μL 10×反应缓冲液，0.25μL dNTP，0.25μL正向引物和0.25μL反向引物，0.5UTaq酶，1μL 10ng/μL模板DNA，加超纯水将总体积补至10μL。
PCR反应程序为：94-98℃变性1-3min，然后执行以下循环：95℃变性20s，53-58℃复性20s，72℃延伸30s，30-40个循环。循环结束后72℃补充延伸3-10min，结束反应。
配置1.5％琼脂糖凝胶，在5V/cm电场下电泳30min；采用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物。
实施例7 sped1-1基因DNA序列分析
将实施例6回收所得野生型与突变体的PCR产物DNA采用ABI3730测序仪进行测序，测序引物分别使用正向引物与反向引物。使用常见DNA序列分析软件DNAman6.0对双向测序结果进行拼接。测序峰图如图3所示，图3的A为簇生2穗突变体测序峰，图3的B为簇生3穗突变体测序峰图，对野生型和突变体序列进行比对发现，簇生3穗突变体测序纯合并在sped1-1基因的基因组序列第1556个碱基之后的A碱基替换为1个G碱基(sped1-1基因的基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)；该突变位点位于外显子上，蛋白序列分析比对显示，该突变引起了氨基酸的改变，导致野生型中第519位天冬酰胺在簇生3穗突变体中替换为丝氨酸(sped1-1基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)。而簇生2穗突变体则在该位点杂合，与遗传分析结果一致。sped1-1突变体SPED1基因的突变位点及氨基酸残基改变如图4所示。
实施例8突变位点分子标记设计与共分离鉴定
根据实施例7中得到的突变位点两侧的序列设计基因特异引物(图5)：正向引物sped1-1_F1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；正向引物sped1-1_F2，其核苷酸序列如SEQID NO.4所示；反向引物sped1-1_R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在实施例6中所述PCR反应条件下，用上述引物对对MH63，ZH11，93-11，簇生2穗突变体和簇生3穗突变体进行扩增。
扩增产物在12％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳方法如下：
(1)聚丙烯酰胺胶的配制：12％PA胶80mL，10％过硫酸胺250μL(冬天)/125μL(夏天)，四甲基乙二胺(TEMED)80μL。摇匀后灌胶。用洗涤剂把玻璃板反复擦洗干净，用酒精擦净、晾干。在通风橱中将凹板涂上2％的Repel Silane后，再用酒精擦净、干燥，将另一块平板涂上0.5％的Binding Silane 1.5mL(在1.5ml离心管中加入7.5μL Binding Silane和7.5μL冰醋酸，补足95％乙醇至1.5mL)。操作过程中，防止两块玻璃板相互污染，彻底干燥后再进行玻璃板组装、灌胶。
(2)预电泳：待胶凝固后，取出梳子，洗掉上边凝胶尤其注意接缝处定要洗净。先在电泳槽下槽(阴极)装入1×TBE的电极缓冲液，将聚合的凝胶板装在电泳槽内，在上槽中注入0.5×TBE的电极缓冲液。恒定功率40W-65W，预电泳约30min。用吸管清除胶面上沉淀的尿素和气泡，插入梳子。
(3)电泳：扩增产物中加入5μl 5×Loading Buffer混合后95℃变性5分钟，立刻转移到冰上冷却，吸取1.5-3μl加入上样孔；恒定功率40W-65W进行电泳，至溴酚蓝到达电泳槽底部结束。视SSR扩增产物分子量大小及差异带型的可辨程度调整电泳时间。
(4)银染显色，将带胶的一块玻璃板放入10％的冰乙酸固定液中，65r/min振荡约30min，直至二甲苯腈全部脱色；蒸馏水冲洗2次，每次5min；将冲洗后的胶板放入新配制的染色液(2L水中加入2g硝酸银、3mL 37％甲醛)中65r/min摇动30min；将染色后的胶板放入蒸馏水冲洗5s，立即拿出进行显影；将胶板快速转移到4℃预冷的显影液(2L水中加入30g氢氧化钠，10ml 37％甲醛)轻轻摇动至带纹出现；将胶板置于10％的冰乙酸固定液中至无气泡产生为止；用蒸馏水冲洗2次，每次2min；室温下自然干燥后，拍照保存图像。
结果见图6，野生型MH63、9311的扩增产物为118bp，比簇生3穗突变体的扩增产物126bp短8bp；而簇生2穗的扩增产物则具有突变126bp与野生型118bp两条带型，与测序结果一致。结果表明，实施例7中所述突变位点与簇生3穗突变体是共分离的。这一结果结合该突变体的突变表型、突变位点，以及已发表文献中的表型描述(Jiang G,Xiang Y,Zhao J,YinD,Zhao X,Zhu L,Zhai W(2014)Regulation of inflorescence branch development inrice through a novel pathway involving the pentatricopeptide repeat proteinsped1-D.Genetics 197:1395-1407)，可推断复粒丛生稻簇生3穗突变体的表型是由实施例7中所述的突变造成的。
实施例9 sped1-1突变基因的杂交转育
可按图7所示的步骤将sped1-1基因通过杂交转育到其它水稻遗传背景中：
(1)杂交：
以sped1-1纯合植株为父本，与轮回亲本，如明恢63，杂交获得F1种子；
(2)第一轮回交：
F1播种后获得F1植株，将F1植株与轮回亲本进行回交，获得BC1F1种子；
(3)BC1F1前景选择：
播种BC1F1种子，获得不少于100株幼苗，在幼苗期采集各单株叶片，以实施例6中所述方法提取DNA，以实施例8中所列的引物对(sped1-1_F1、sped1-1_F2和sped1-1_R)进行扩增和电泳，选取sped1-1基因型纯合的单株继续种植；
(4)BC1F1背景选择：
采用一组(例如100个，或200个等)在sped1-1和轮回亲本之间存在多态的，且在基因组上均匀分布的分子标记(可以是但不限于SSR、SNP、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR等类型标记)，对步骤(3)中选出的单株进行鉴定，选取与轮回亲本相似度高(例如大于88％相似度，或2％中选率等)的材料；
(5)第二轮回交：用步骤(4)中选出的单株为父本，为轮回亲本授粉，获得BC2F1种子；
(6)BC2F1的前景与背景选择：对选出的材料重复步骤(3)至步骤(4)的操作，选出与轮回亲本相似度高于选择标准(如相似度大于98％，或2％中选率等)的BC2F1代植株；
(7)自交获得BC2F2种子：对步骤(6)中选出的BC2F2植株进行自交，获得BC2F2种子。
(8)BC2F2群体表型鉴定：种植BC2F2群体，选出性状整齐，与轮回亲本表型最相似但带有簇生小穗性状的群体作为中选的回交转育株系。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司
<120> 水稻小穗簇生突变体及其分子鉴定方法和应用
<130> KHP201112961.3
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Met Ala Ala Ala Arg Arg Gly His Gly Met Pro Leu Trp Glu
1 5 10 15
Cys Asn Val Leu Ile Arg Thr Leu Ala Arg Arg Gly Ser Phe Ala Arg
20 25 30
Val Met Ala Val Tyr Tyr Asp Leu Arg Ala Arg Gly Leu Val Ala Asp
35 40 45
Ser Phe Thr Tyr Pro Phe Val Leu Arg Ala Val Gly Val Leu Lys Leu
50 55 60
Ser Val Glu Gly Arg Lys Ala His Ala Ala Ala Val Lys Thr Gly Phe
65 70 75 80
Arg Trp Asp Ala Tyr Thr Gly Ser Ser Leu Met Glu Met Tyr Thr Met
85 90 95
Leu Gly Arg Val Asp Ile Ala Arg Lys Val Phe Asp Glu Met Pro Ser
100 105 110
Arg Ala Leu Val Leu Trp Asn Met Met Val Arg Cys Tyr Ile Arg Cys
115 120 125
Gly Trp Tyr Ser Ala Ala Val Ala Leu Ser Glu Gln Met Glu Arg Ser
130 135 140
Gly Val Thr Pro Asp Arg Val Thr Leu Val Thr Ala Val Thr Ala Cys
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Ser Arg Ala Arg Asp Leu Ser Leu Gly Arg Arg Ile His Val Tyr Met
165 170 175
Asp Asn Val Phe Gly Phe Asn Leu Pro Val Ala Asn Ala Leu Leu Asp
180 185 190
Met Tyr Thr Lys Asn Asp Cys Leu Glu Glu Ala Val Lys Leu Phe Glu
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Gln Met Pro Ala Arg Asn Ile Ile Ser Trp Thr Ile Leu Val Ser Gly
210 215 220
Tyr Gly Leu Ala Gly Gln Leu Asp Lys Ala Arg Val Leu Phe Asn Gln
225 230 235 240
Cys Lys Glu Lys Asp Leu Ile Leu Trp Thr Ala Met Ile Asn Ala Cys
245 250 255
Val Gln His Gly Cys Phe Glu Glu Ala Leu Thr Leu Phe Arg Asp Met
260 265 270
Gln Met Gln Arg Val Glu Pro Asp Arg Phe Thr Val Val Thr Leu Leu
275 280 285
Thr Cys Cys Ala Asn Leu Gly Ala Leu Asp Gln Gly Glu Trp Ile His
290 295 300
Gln Tyr Ala Glu Gln Arg Lys Met Lys Ile Asp Ala Val Leu Gly Thr
305 310 315 320
Ala Leu Ile Asp Met Tyr Ser Lys Cys Gly His Ile Glu Lys Ser Leu
325 330 335
Glu Val Phe Trp Arg Met Gln Gly Arg Asp Ala Thr Ala Trp Thr Ala
340 345 350
Ile Ile Cys Gly Leu Ala Thr Asn Gly Gln Ala Gly Arg Ala Leu Glu
355 360 365
Leu Phe Gln Asp Met Gln Arg Ser Lys Val Lys Pro Asp Gly Val Thr
370 375 380
Phe Ile Gly Val Leu Ser Ala Cys Cys His Gly Gly Leu Val Asp Glu
385 390 395 400
Gly Arg Lys Gln Phe His Ala Met Arg Glu Val Tyr Gln Ile Glu Pro
405 410 415
Arg Val Glu His Tyr Ser Cys Leu Val Asn Leu Leu Gly Arg Ala Gly
420 425 430
Leu Leu Asp Glu Ala Glu Arg Leu Ile Gly Asp Val Pro Ile Asn Lys
435 440 445
Asp Ala Met Pro Leu Phe Gly Ala Leu Leu Thr Ala Cys Lys Ala His
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Gly Asn Val Glu Met Ser Glu Arg Leu Thr Lys Arg Ile Cys Glu Gln
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Asp Ser Gln Ile Thr Asp Val Asn Leu Leu Met Ser Asn Val Tyr Ala
485 490 495
Thr Ala Ser Arg Trp Glu Asp Val Ile Arg Val Arg Gly Lys Met Ala
500 505 510
His Pro Thr Val Lys Lys Ser Ala Gly Cys Ser Leu Ile Glu Val Lys
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Gly Tyr
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atcaggacgc tggcgaggcg ggggagcttc gcgcgcgtca tggcggtgta ctacgacctc 120
cgcgcgcggg gactcgtggc ggacagcttc acctacccgt tcgtgctcag ggccgtcggg 180
gtcctcaagc tgtcggtcga ggggcgcaag gcgcacgcgg ccgctgtcaa gaccgggttc 240
cggtgggacg cctacaccgg gagctcgctg atggagatgt acacgatgct ggggcgcgtg 300
gacatcgcgc ggaaggtgtt cgacgaaatg ccgagtaggg cgctggtgct gtggaacatg 360
atggtcaggt gctacatcag gtgcgggtgg tactcggcgg cagttgcttt gtctgaacag 420
atggagagaa gcggtgtcac acctgacagg gtgacgttgg tgacggcggt gacggcgtgc 480
tctagagcaa gggacctgag cttgggaagg aggattcatg tgtacatgga taacgtcttc 540
ggtttcaatc tgccagttgc aaatgctctg ctggacatgt acacgaagaa tgattgcttg 600
gaagaggcgg tgaaattgtt cgagcaaatg cctgcgagga acataatttc ttggaccata 660
cttgtgtcgg gatatggcct tgctgggcag ctggacaagg ccagagtgct cttcaaccag 720
tgcaaagaga aggatctaat tctgtggact gcaatgatca atgcgtgtgt gcaacacgga 780
tgcttcgagg aggcgctgac attgttccga gatatgcaga tgcaacgggt tgagccagac 840
aggttcactg ttgtcactct cctgacatgc tgtgccaatc ttggcgctct tgatcaaggt 900
gaatggattc accagtatgc tgaacaaagg aaaatgaaga tcgatgcagt cctaggcacc 960
gcattgattg acatgtattc taaatgtggg cacattgaga agtctctaga ggtcttctgg 1020
cgaatgcaag gcagagatgc cacagcttgg actgccatca tctgtgggct ggccacaaat 1080
ggtcaggctg gtagagctct tgaactgttt caagatatgc agagaagtaa agttaagccc 1140
gacggtgtta cgtttattgg ggtgctaagt gcatgctgcc atggtggctt ggttgatgaa 1200
ggccggaagc agttccatgc aatgagggag gtttatcaga tagaaccaag agttgaacac 1260
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atcggtgacg ttccaattaa caaggatgct atgccactgt ttggtgcact cctcactgct 1380
tgcaaggctc atgggaatgt tgagatgagt gaacggttaa ccaaacgaat ctgtgagcaa 1440
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ctggaagccg tttcattagc aattttgaag aaccttgtct gaacagacat tcgagtgatc 1740
aggcttgtac agttagttaa tttgaggact actgaacttc agctagcttg tttcaggctt 1800
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aaaacaaggt tagacaccaa tgccagtagt attttttttt ctgttgttgc ctatgcctat 1920
cagtgcagat gattatatct aatgtgcaac cataacttct taacaatgga tggacgaaca 1980
ttatcatcgc agcatgattc tgtcatttgt cagcttgtta aaaatgctat acttggattt 2040
tcagtttgct cttgttgatg tattcagcat atccactcaa aactcactaa cacataaaac 2100
atcactttga agtgaatgca atatttattt atggaagaag gttcatctgc aagtcacagt 2160
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gaatttgctc atgtctaatg tatatgcaac agcaagtaga tgggaggatg tgataagggt 60
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ataatactac acattaaacg gaggg 25
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Claims (10)
1.水稻SPED1蛋白突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述突变体的核酸。
3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
4.包含权利要求2或3所述核酸的生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体或微生物细胞。
5.权利要求1所述的突变体或权利要求2或3所述的核酸或权利要求4所述的生物材料在调控水稻的如下任一性状中的应用：
(1)小穗簇生；
(2)小穗梗长、枝梗长或穗长；
(3)穗粒数；
(4)结实率；
(5)粒重。
6.一种制备改良水稻的方法，其特征在于，使水稻表达权利要求1所述的突变体；
所述改良水稻具有如下任一性状：
(1)小穗簇生；
(2)小穗梗长、枝梗长或穗长缩短
(3)穗粒数改变；
(4)结实率改变；
(5)粒重降低。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过基因编辑、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法使水稻表达权利要求1所述的突变体。
8.用于检测权利要求2或3所述核酸的引物，其特征在于，包含SEQ ID NO.3-4所示的上游引物和SEQ ID NO.5所示的下游引物。
9.权利要求8所述引物的如下任一应用：
(1)检测水稻是否含有权利要求2或3所述核酸；
(2)制备具有小穗簇生性状的水稻。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，利用SEQ ID NO.3-4所示的上游引物和SEQ ID NO.5所示的下游引物进行PCR扩增；若只能扩增出126bp的产物，则待检水稻为权利要求1所述突变体对应基因的纯合基因型，表型为枝梗末端有2个或2个以上小穗簇生；若只能够扩增出118bp的产物，则待检水稻不携带权利要求1所述突变体对应基因，表型为枝梗末端小穗不发生簇生；若能够同时扩增出126bp和118bp的产物，则待检水稻为权利要求1所述突变体对应基因的杂合基因型，表型为枝梗末端有不超过2个小穗簇生。
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