CN111808776B - 一株耐盐碱空气芽孢杆菌及其活菌制剂的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐盐碱空气芽孢杆菌及其活菌制剂的制备方法与应用。本发明自玉米根际土壤分离到一株耐盐碱空气芽孢杆菌(Bacillus aerius)PAPM‑14，该菌株于2020年6月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20118。该菌株的耐盐碱能力较强，具有较强的产IAA、解磷与解钾的能力，对玉米纹枯病等病原菌具有较强的拮抗作用，可用于生产微生物肥料，特别是盐碱地玉米专用微生物肥料，用于玉米纹枯病等作物病害的生物防治，减少病害发生，提高产量和质量。

Description

一株耐盐碱空气芽孢杆菌及其活菌制剂的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一株具有耐盐碱、产IAA、解磷、解钾和拮抗玉米纹枯病病原菌作用的空气芽孢杆菌及其应用，属于农业生物技术领域。

背景技术

玉米是一年生禾本科玉蜀黍属植物，广泛分布于美国、中国、巴西和其他国家，是世界上重要的粮食作物。玉米纹枯病是制约玉米高产优质栽培的重要病害之一，是由立枯丝核菌、玉蜀黍丝核菌和禾谷丝核菌等真菌引起的病害，其中由立枯丝核菌引起的病害较为常见。玉米纹枯病在全国各地普遍发生，且危害期很长，从苗期至生长后期都会发病，但在抽雄期至灌浆期较为明显，主要损害叶鞘，其次是叶片，果穗及苞叶。发病严重时，比较坚实的茎秆也会受到侵害，严重影响玉米的产量与质量。特别是我国西南玉米种植地区，由于气温高、湿度大，再加上主栽的玉米品种不抗病，纹枯病已成为玉米持续减产的第一大病害。

长期以来，玉米纹枯病以化学防治为主，并结合选育抗病品种、优化栽培管理等技术措施。化学防治以大量使用菌核净、井冈霉素、退菌特、噻呋酰胺、丙环唑、已唑醇、戊唑醇、氟环唑、苯醚甲环唑-丙环唑等药物为主。化学防治虽简单高效，但也存在很多弊端。化学农药的大量使用不仅对人体健康造成很大危害，还严重污染环境，长期使用还会导致病原菌产生耐药性。发展生物防治技术，减量使用化学农药，是发展的必然趋势。

生物防治是利用有益生物或其代谢产物来防治病虫害的方法，其特点是不污染环境、对人和其他生物安全、节约能源、保持生态平衡，是发展绿色食品、保护人身健康的重要手段。目前，哈茨木霉、绿色木霉、枯草芽孢杆菌等有益微生物已用于玉米纹枯病的生物防治，但由于防治效果有限，未能在农业生产中大面积推广。

盐碱地是我国重要的土地资源，据农科院南京土壤所报道，我国盐碱地和盐碱障碍耕地总面积超过5亿亩，其中具有农业利用潜力的多达2亿亩，占中国耕地面积的10％左右，主要分布在我国西北、东北及东部沿海地区。玉米具有较强的耐盐碱能力，是盐碱地广为栽培的作物之一。盐碱地玉米纹枯病的生物防治，除要求菌株具有较好的防病促生效果外，还要求其具有较强的耐盐碱能力，能够在盐碱土壤中定植。因此，筛选耐盐碱抗病促生菌株，具有重要意义。

发明内容

针对上述现状，本发明提供了一株空气芽孢杆菌PAPM-14及其活菌制剂的制备方法与应用。该空气芽孢杆菌PAPM-14菌株分离自盐碱地玉米根际土壤，具有耐盐碱、产IAA、解磷、解钾、拮抗作物病原菌(尤其是玉米纹枯病病原菌)等多种优良特性，可用于生产生物肥料。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一株分离自盐碱地玉米根际土壤的耐盐碱空气芽孢杆菌(Bacillus aerius)PAPM-14，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCC No.20118；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年6月22日。该菌株在NA培养基上于37℃培养48h，菌落呈圆形，隆起，湿润、有皱褶、不透明、奶白色；菌体呈短杆状。

本发明还公开了一种以空气芽孢杆菌PAPM-14为主要有效成分的活菌制剂。

所述空气芽孢杆菌PAPM-14活菌制剂的制备方法：其特征是，将空气芽孢杆菌PAPM-14经过扩大培养后，接种于发酵培养基中(接种量2-5％)，35-40℃培养24-48h，得到空气芽孢杆菌PAPM-14发酵液。向空气芽孢杆菌PAPM-14发酵液中加入没食子酸丙酯(PG)0.01-0.02％(w/w)、矿源黄腐酸钾3-5％(w/w)、山梨酸钾0.1-0.3％(w/w)和卡松0.02-0.05％(w/w)，搅拌均匀，获得活菌制剂。

所述发酵培养基的配方：豆粕粉10g、玉米粉15g、酵母浸粉2g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸锌0.2g、硫酸锰0.05g、复合酶制剂0.05g、水1000mL，初始pH7.5。所述复合酶制剂的组成为中性蛋白酶50％、纤维素酶50％。

本发明还公开了上述的空气芽孢杆菌PAPM-14或者上述的活菌制剂在产IAA、解磷、解钾和拮抗玉米纹枯病病菌、玉米小斑病原菌、水稻恶苗病原菌等方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明空气芽孢杆菌PAPM-14分离自盐碱地土壤，耐盐碱能力强，在盐碱土壤中定植率高，具有产IAA、解磷、解钾、拮抗玉米纹枯病病原菌、玉米小斑病原菌、水稻恶苗病原菌的作用，可用于生产盐碱地专用生物肥料，具有提高土壤肥力、促进作物生长、防治玉米纹枯病的作用。

本发明空气芽孢杆菌PAPM-14活菌制剂的生产方法科学，发酵液活菌数高，生产成本低。发酵培养基中添加复合酶制剂，灭菌时在升温过程中对豆粕与玉米粉等原料进行水解，可缩短延迟期，提高原料利用率，提高发酵液活菌浓度。

附图说明

图1为空气芽孢杆菌PAPM-14菌株的菌体形态；

图2空气芽孢杆菌PAPM-14菌株的产IAA能力；注：从左至右依次为：CK(阳性对照，加入50μL 50mg/L IAA)、接种PAPM-14菌株；结果显示接种PAPM-14菌株后颜色变红，说明其具有产IAA的能力；

图3为空气芽孢杆菌PAPM-14菌株在有机磷培养基上的解磷圈，图中内环为菌落，外环为解磷透明圈；

图4为空气芽孢杆菌PAPM-14菌株的解钾能力图，图中为PAPM-14菌株在硅酸盐培养基上生长出的油滴状菌落。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：空气芽孢杆菌菌株PAPM-14的筛选

(1)耐盐碱菌株的筛选

空气芽孢杆菌PAPM-14分离自玉米根际土壤。土壤于2018年9月取样于山东省滨州市滨城区，为盐碱土壤。具体分离方法为：土样混匀，称取5g，放入盛有95mL无菌水和10粒玻璃珠的三角瓶中，于37℃、180rpm振荡30min。取土壤悬液1mL进行10^-1—10^-7系列浓度梯度稀释，然后取10^-5、10^-6、10^-7三个稀释度涂布至含选择培养基的平板上，于37℃倒置培养2d。然后，分别挑取不同的单菌落划线至含选择培养基的平板上，于37℃倒置培养2d。从平板中挑取单菌落转接至保藏培养基试管斜面上，于37℃培养2d，长满菌苔后，置于4℃冰箱中保存备用。共筛选到耐盐碱菌株172株。

所述选择培养基的配方为：蛋白胨10g、酵母膏5g、复合无机盐(NaCl∶KCl∶MgCl₂＝10∶1∶1)25g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH9.0，121℃灭菌20min。

所述保藏培养基的配方为：蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH7.5，121℃灭菌20min后使用。

(2)产IAA(吲哚乙酸)菌株的筛选

向含有L-色氨酸(200mg/L)的LB液体培养基中分别接种上述试验筛选到的耐盐碱菌株，于37℃、180r/min震荡培养4d。取50μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50μLSalkowski比色液。将加入50μL 50mg/L IAA的比色液作为阳性对照。白色陶瓷板于室温避光放置30min，颜色变红者表示能够分泌IAA。共筛选出具有产IAA能力的菌株27株。

所述LB液体培养基配方为：蛋白胨10.0g、酵母膏5.0g、NaCl 10.0g、蒸馏水1000mL、pH＝7.0。

所述的Salkowski比色液配方为：35％HClO₄ 50mL、0.5mol/L FeCl₃ 1mL。

(3)解磷菌株的筛选

将上述具有产IAA能力的菌株分别转接到有机磷细菌培养基，测定其是否具有解磷的能力。共筛选出具有解磷的能力的菌株9株。

所述有机磷细菌培养基配方为：葡萄糖10.0g、(NH₄)₂SO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.3g、MnSO₄·4H₂O 0.03g、KCl 0.3g、FeSO₄·7H₂O 0.03g、NaCl 0.3g、CaCO₃ 5.0g、卵磷脂0.2g、琼脂1.6％，蒸馏水1000mL，pH＝7.0～7.5。配制时，先将卵磷脂溶于无水乙醇中，全部溶解后加水混匀，再加热至乙醇全部蒸发。

(4)解钾菌株的筛选

将上述步骤筛选到的具有解磷能力的菌株采用三区划线的方法接种到硅酸盐细菌培养基平板上，于37℃恒温培养72h，挑取能在平板上生长且菌落较大较厚的菌株。

所述硅酸盐细菌培养基配方为：蔗糖5g、MgSO₄ 0.5g、CaCO₃ 0.1g、Na₂HPO₄ 2g、FeCl₃0.005g、玻璃粉1g、琼脂1.6％，蒸馏水1000mL，121℃灭菌15min，pH＝7.0。

通过上述多重筛选，综合考虑菌株的生长速度、产IAA、解磷和解钾能力，得到一株耐盐碱能力强，具有产IAA、解磷、解钾能力的细菌，编号为PAPM-14。

实施例2：空气芽孢杆菌PAPM-14的鉴定

(1)形态与生理生化特征

所述PAPM-14菌株的形态特征为：在NA培养基上于37℃培养48h，菌落呈圆形，隆起，湿润、有皱褶、不透明、奶白色；菌体呈短杆状，如图1所示。所述NA培养基即营养琼脂培养基，其配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000mL、pH 7.0。

所述PAPM-14菌株的生理生化特征为：革兰氏阳性杆状菌；过氧化氢酶试验阳性，柠檬酸盐利用阳性，丙二酸盐利用阴性，硝酸盐还原阳性，V-P试验阳性；淀粉水解试验阳性，D-葡萄糖发酵试验阳性、D-甘露醇发酵试验阳性、乳糖发酵试验阳性、麦芽糖发酵试验阳性。

(2)16S rDNA序列分析

将PAPM-14菌株接种到NB培养基中，于37℃，180r/min摇床培养24h。所述NB培养基，其配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、水1000ml、pH 7.0。收集菌体，提取总DNA，然后以其为模板，在原核生物16S rRNA基因的通用引物F27:5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTCAG-3′和F27:5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTCAG-3′的引导下进行16S rDNA基因的PCR扩增。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用胶回收试剂盒回收，交由上海生工生物技术有限公司测序。将所测16S rDNA序列(SEQ No.1)与GenBank数据库中的序列比对，并用MEGA7.0软件进行多序列同源性分析。

通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析可知，该菌株为空气芽孢杆菌，命名为空气芽孢杆菌(Bacillus aerius)PAPM-14。该菌株已经于2020年6月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.20118。

实施例3：空气芽孢杆菌PAPM-14菌株的功能验证

(1)空气芽孢杆菌PAPM-14菌株产IAA的能力

向含有L-色氨酸(200mg/L)的LB液体培养基中接入空气芽孢杆菌PAPM-14，37℃，180r/min，摇床培养4d。取50μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50μLSalkowski比色液。将加入50μL 50mg/L IAA的比色液作为阳性对照CK。白色陶瓷板于室温避光放置30min后观察，颜色变红者表示能够分泌IAA。菌株PAPM-14菌悬液在经过试验处理后，颜色呈红色，说明菌株PAPM-14具有较强的分泌IAA的能力(图2)。

所述LB液体培养基的配方为：蛋白胨10.0g、酵母膏5.0g、NaCl 10.0g、蒸馏水1000mL；121℃灭菌20min；pH＝7.0。

所述的Salkowski比色液配方为：35％HClO₄ 50mL、0.5mol/L FeCl₃ 1mL。

(2)空气芽孢杆菌PAPM-14菌株的解磷能力

制备有机磷细菌培养基，其配方为：葡萄糖10.0g、(NH₄)₂SO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O0.3g、MnSO₄·4H₂O 0.03g、KCl 0.3g、FeSO₄·7H₂O 0.03g、NaCl 0.3g、CaCO₃ 5.0g、卵磷脂0.2g、琼脂1.6％，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min，pH＝7.0～7.5。

空气芽孢杆菌PAPM-14的解磷能力：将空气芽孢杆菌PAPM-14菌株用灭菌的牙签接种到有机磷培养基平板上，37℃培养2-5d后，测定透明圈及菌落直径，计算透明圈与菌落直径比(HC)。PAPM-14在有机磷培养基上产生的解磷透明圈直径为11.17mm，菌落直径为7.02mm，HC值为1.59，说明菌株PAPM-14具有较强的解有机磷的能力(图3)。

(3)空气芽孢杆菌PAPM-14菌株的解钾能力

将空气芽孢杆菌PAPM-14用灭菌的牙签接种到硅酸盐细菌培养基平板上，37℃培养72h。培养结果如图4所示，PAPM-14菌株可以在硅酸盐细菌培养基上生长并形成菌落，这说明其具有解钾能力。所述硅酸盐细菌培养基为：蔗糖5g、MgSO₄ 0.5g、CaCO₃ 0.1g、Na₂HPO₄2g、FeCl₃ 0.005g、玻璃粉1g、琼脂1.6％，蒸馏水1000mL，121℃灭菌15min，pH＝7.0。

实施例4：空气芽孢杆菌PAPM-14菌株活菌制剂的制备

所述空气芽孢杆菌PAPM-14活菌制剂的制备方法包括以下步骤：

1)菌种活化：将低温保藏的空气芽孢杆菌PAPM-14菌种转接至LB固体培养基试管斜面，于37℃培养48h进行活化。所述LB固体培养基的配方为：酵母粉5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂粉20g、水1000mL，pH7.5。

2)三角瓶种子制备：用接种环刮取活化后的空气芽孢杆菌PAPM-14菌苔，接种于LB液体培养基中，37℃培养48h。所述LB液体培养基的配方为：酵母粉5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、水1000mL，pH7.5。

3)种子罐菌种制备：将三角瓶种子以体积比2％的接种量转接入装有7L LB液体培养基的10L种子罐中，于37℃培养48h，全程搅拌转速200rpm，0-7h通风量为4L/min，7-24h通风比为8L/min。

4)发酵培养：将种子罐菌种以体积比2％的接种量转接入500L的发酵罐。发酵罐内装发酵培养基350L，37℃培养24-48h，获得空气芽孢杆菌PAPM-14的发酵液。全程搅拌转速为180-200rpm，0-8h通风量为180-200L/min，此后通风量为300-400L/min。发酵结束后，发酵液中空气芽孢杆菌PAPM-14的活菌数为(2～3)×10¹⁰cfu/ml。

步骤4)所述发酵培养基的配方为：豆粕粉10g、玉米粉15g、酵母浸粉2g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸锌0.2g、硫酸锰0.05g、复合酶制剂0.05g、水1000mL，初始pH7.5。所述复合酶制剂的组成为中性蛋白酶50％、纤维素酶50％。中性蛋白酶和纤维素酶均由泰安信得利生物科技有限公司生产，产品规格均为10万U/g。中性蛋白酶的活力单位定义与检测方法执行国家标准GB/T23527-2009《蛋白酶制剂》，纤维素酶的酶活力单位定义与检测方法执行中华人民共和国轻工行业标准QB 2583-2003《纤维素酶制剂》。

步骤4)所述发酵培养基的制备方法为：按照配方称取原料，溶于水中，加热至40-50℃，保温0.5-1h，然后升温至121℃，保温15-30min进行灭菌。

5)活菌制剂的制备：向步骤4)所述空气芽孢杆菌PAPM-14发酵液中加入没食子酸丙酯(PG)0.01％(w/w)、矿源黄腐酸钾3％(w/w)、山梨酸钾0.1％(w/w)和卡松0.02％(w/w)，搅拌均匀，获得活菌制剂，其活菌含量优选为(1.0-2.0)×10¹⁰cfu/g。所述矿源黄腐酸钾由山西广宇通科技股份有限公司生产，其黄腐酸含量为45％。

实施例5：空气芽孢杆菌PAPM-14对病原真菌的拮抗作用

采用对峙培养法。在PDA平板中央接种直径为7mm的病原真菌的菌饼。所述病原真菌分别为：玉米纹枯病的病原菌——立枯丝核菌；玉米小斑病的病原菌——Bipolarismaydis；水稻恶苗病的病原菌——串珠镰刀菌。在以病原真菌菌饼中心为圆心，半径为3cm的圆周上均匀点种PAPM-14菌株3-5个，以不接种PAPM-14菌株的处理为对照，37℃培养7-8d，测定真菌菌落直径或半径。抑菌活性采用抑制率来表示，其计算公式如下：抑菌率＝[(R－r)/R]×100％。式中：R为对照平板上病原菌菌落半径；r为PAPM-14菌株与病原菌对峙处的病原菌菌落半径。结果如表1所示，空气芽孢杆菌PAPM-14菌株对受试的三种病原真菌均有不同程度的拮抗作用，其中对玉米纹枯病致病菌的拮抗效果最好。

表1空气芽孢杆菌PAPM-14对植物病原菌的抑制作用

SEQUENCE LISTING

<110> 德州八虎生物科技有限公司;山东佐田氏生物科技有限公司

<120> 一株耐盐碱空气芽孢杆菌及其活菌制剂的制备方法与应用

<130> 0

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1449

<212> DNA

<213> 空气芽孢杆菌（Bacillus aerius）PAPM-14的16S rDNA 序列

<400> 1

ggggcggggt gctatacatg caagtcgagc ggaccgacgg gagcttgctc ccttaggtca 60

gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120

aaccggggct aataccggat gcttgattga accgcatggt tcaatcataa aaggtggctt 180

ttagctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240

ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgaaacac 300

ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360

ggaacaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aaactctgtt gttagggaag 420

aacaagtacc gttcgaatag ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480

actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540

gtaaagcgcg cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga 600

gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660

ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa 720

ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780

ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg cagcaaacgc 840

attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900

gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960

tcttgacatc ctctgacaac cctagagata gggcttcccc ttcgggggca gagtgacagg 1020

tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1080

caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca 1140

aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca 1200

cgtgctacaa tgggcagaac aaagggcagc gaagccgcga ggctaagcca atcccacaaa 1260

tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta 1320

atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1380

accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc ttttggagcc agccgccgaa 1440

ggggatagt 1449

Claims (6)

1.一株耐盐碱空气芽孢杆菌菌株，其特征为，其为空气芽孢杆菌(Bacillus aerius)菌株PAPM-14，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.20118。

2.权利要求1所述的耐盐碱空气芽孢杆菌菌株在产IAA、解磷、解钾，拮抗玉米纹枯病病原菌、玉米小斑病原菌、水稻恶苗病原菌方面的应用。

3.一种以权利要求1所述的耐盐碱空气芽孢杆菌菌株为主要有效成分的活菌制剂。

4.如权利要求3所述的活菌制剂的制备方法，其特征是，将空气芽孢杆菌菌株PAPM-14经过扩大培养后，接种于发酵培养基中，35-40℃培养24-48h，得到空气芽孢杆菌PAPM-14发酵液；进一步制成活菌制剂。

5.如权利要求4所述的活菌制剂的制备方法，其特征是，所述发酵培养基为：豆粕粉10g、玉米粉15g、酵母浸粉2g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸锌0.2g、硫酸锰0.05g、复合酶制剂0.05g、水1000mL，初始pH7.5；所述复合酶制剂的组成为：按质量比，中性蛋白酶50％、纤维素酶50％。

6.如权利要求4或5所述的活菌制剂的制备方法，其特征是，所述向空气芽孢杆菌PAPM-14发酵液中按质量比加入没食子酸丙酯0.01-0.02％、矿源黄腐酸钾3-5％、山梨酸钾0.1-0.3％和卡松0.02-0.05％，搅拌均匀，获得活菌制剂。

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