CN111801428B - 一种获得单细胞mRNA序列的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种获得单细胞mRNA序列的方法。本发明的方法：(1)利用细胞标签载体捕获细胞的mRNA，反转录得到具有细胞标签的cDNA；来自于同一个细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签；(2)利用转座酶复合体和分子标签载体，得到具有分子标签的多个cDNA片段；来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签；(3)高通量测序；(4)根据分子标签进行序列拼接，得到每个mRNA的序列；根据细胞标签，得到每个单细胞的所有mRNA的序列。本发明提供的方法可用于高通量获得大量单细胞中每个单细胞的所有mRNA的序列。

Description

一种获得单细胞mRNA序列的方法

技术领域

本发明涉及一种获得单细胞mRNA序列的方法。

背景技术

多细胞生物，顾名思义由多种细胞组成。在多细胞生物中，每种细胞类型均有自己独特的功能，这些具有不同功能的细胞聚合起来，共同构成了组织与器官，并最终作为一个整体定义了多细胞生命。每种细胞的谱系及其发育状态决定了它们与其他细胞，及其周边微环境的相互作用。不仅如此，即使分类在同一亚细胞类型中的不同细胞间也有极大可能存在遗传异质性。

大部分单细胞测序的原初动力来自于癌症研究，因为癌症发生发展过程中不同细胞之间体现了高度遗传特异性，加之肿瘤样品取样存在一定困难，难免会有正常细胞混入其中，因此对单个细胞进行分别研究具有重要意义。但随着技术的发展，如今单细胞测序技术已经被广泛用于解析复杂生物学系统和过程，例如中央神经系统，免疫系统和哺乳动物发育过程。尽管目前在单细胞层面对组织和器官的生物学功能的了解仍然不甚清晰，但单细胞测序和相关分析技术仍提供了一窥未来的可能。

除此以外，单细胞测序还为鉴定那些难于进行体外分离培养的细胞或生物提供了可靠手段。单细胞测序技术的发展改善了传染性疾病、食物传播以及具有抗药性的微生物病原体的检测准确性和灵敏度，同时为环境或肠道微生物多样性分析提供了解决方案。

近年来高通量测序技术发展迅速，该技术以其高准确性和特异性成为了单细胞DNA/RNA测序的最佳选择。早年的单细胞技术依赖于显微操作或流式细胞仪，因此通量较低。近期出现的结合微流控平台和油包水技术方法将单细胞mRNA测序的检测细胞通量提升到了一个非常客观的数量级，但均无法对mRNA的全长进行测序，因此无法检测mRNA的可变剪切或基因融合，微流控芯片对于控制设备有一定要求，因此限制了该技术应用的进一步拓展。

单细胞转录本测序最早起源于单细胞mRNA实时定量PCR(qPCR)检测技术，后者确定了转录本扩增的技术基础。之后随着高通量测序平台的不断发展，单细胞转录本测序技术也随之兴起。最早的单细胞分离方案依赖口吸管将单细胞从细胞群体中分离出来，对实验人员要求高，处理细胞通量低，但能够进行全长转录本的检测。后续又有研究人员开发出了基于激光显微切割的单细胞分离方法，需要昂贵设备支持，同时切割的细胞活性会受到一定程度损伤，影响下游实验结果。随后利用流式细胞术进行单细胞分选的方法也被开发出来，与激光显微切割方法类似，同样需要昂贵设备支持同时分选会对细胞活性有一定影响。之后Fluidigm公司推出了C1单细胞测序系统，该方法利用Fluidigm的微流控芯片将细胞捕获至特殊的小室中，从而实现单细胞分离的效果，Fluidigm C1系统价格较高(800美金/每次运行)，同时单细胞处理通量为96个细胞/每次运行，因此不具成本优势，Fluidigm计划升级该系统至384个细胞/每次运行、但相应成本也在增加。2015年出现了基于微流控/油包水液滴和带有细胞标签的载体的单细胞分离方法，极大提升了一次可以处理的单细胞数量，但由于载体上携带的细胞标签与进行逆转录oligo dT是绑定在一起的，因此在二代测序的短读长限制下，使用微流控/油包水液滴的方案进行单细胞mRNA测序只能检测mRNA的3‘端尾巴，无法对全长mRNA进行测序。

发明公开

本发明提供了一种获得单细胞mRNA序列的方法。

本发明提供了一种获得单细胞mRNA序列的方法，包括如下步骤：

(1)利用细胞标签载体捕获细胞的mRNA，然后进行反转录，得到具有细胞标签的cDNA；所述细胞标签载体为携带细胞标签的固相载体；来自于同一个细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签；

(2)利用转座酶复合体和分子标签载体，得到具有分子标签的多个cDNA片段；来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签；分子标签载体为携带分子标签的固相载体；

(3)高通量测序；

(4)测序结果根据分子标签进行序列拼接，得到每个mRNA的序列；进一步根据细胞标签，得到每个单细胞的所有mRNA的序列。

本发明还提供了一种获得单细胞mRNA序列并定量的方法，包括如下步骤：

(1)利用细胞标签载体捕获细胞的mRNA，然后进行反转录，得到具有细胞标签和转录本标签的cDNA；所述细胞标签载体为携带细胞标签和转录本标签的固相载体；来自于同一细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签；来自于同一细胞的各个cDNA具有不同的转录本标签；

(2)利用转座酶复合体和分子标签载体，得到具有分子标签的多个cDNA片段；来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签；分子标签载体为携带分子标签的固相载体；

(3)高通量测序；

(4)测序结果根据分子标签进行序列拼接，得到每个mRNA序列；进一步根据细胞标签，得到每个单细胞的所有mRNA的序列；最后根据mRNA序列相同但转录本标签不同的序列数量，对每个单细胞的mRNA进行定量。

本发明还提供了一种制备单细胞cDNA测序文库的方法，包括如下步骤：

(1)获得具有细胞标签的cDNA；来自于同一个细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签；

(2)获得具有分子标签的多个cDNA片段；来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签。

获得具有细胞标签的cDNA的实现方法如下：利用细胞标签载体捕获细胞的mRNA，然后进行反转录，得到具有细胞标签的cDNA；所述细胞标签载体为携带细胞标签的固相载体。

获得具有分子标签的多个cDNA片段的实现方法如下：利用转座酶复合体和分子标签载体，得到具有分子标签的多个cDNA片段；分子标签载体为携带分子标签的固相载体。

本发明还提供了一种制备单细胞定量cDNA测序文库的方法，包括如下步骤：

(1)获得具有细胞标签和转录本标签的cDNA；来自于同一细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签；来自于同一细胞的各个cDNA具有不同的转录本标签；

(2)获得具有分子标签的多个cDNA片段；来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签。

具体的，获得具有细胞标签和转录本标签的cDNA的实现方法如下：利用细胞标签载体捕获细胞的mRNA，然后进行反转录，得到具有细胞标签和转录本标签的cDNA；所述细胞标签载体为携带细胞标签和转录本标签的固相载体。

具体的，获得具有分子标签的多个cDNA片段的实现方法如下：利用转座酶复合体和分子标签载体，得到具有分子标签的多个cDNA片段；分子标签载体为携带分子标签的固相载体。

具体的，在步骤(1)和步骤(2)之间可包括富集目标物的步骤。步骤(1)和步骤(2)之间的富集目标物的步骤，一种具体形式为PCR扩增，另一种具体形式为滚环扩增，也可为本领域技术人员所了解的其它方式。

具体的，在步骤(2)和步骤(3)之间可包括富集目标物的步骤。

具体的，步骤(2)包括如下步骤：将具有细胞标签的cDNA分子与转座酶复合体孵育，得到转座酶复合体和cDNA片段的复合物。

具体的，步骤(2)包括如下步骤：用分子标签载体捕获转座酶复合体和cDNA片段复合物，使各个cDNA片段带有分子标签，释放带有分子标签的cDNA片段。

本发明还提供了一种用于制备单细胞cDNA测序文库的试剂盒，包括细胞标签载体和分子标签载体；所述细胞标签载体为携带细胞标签的固相载体，用于获得具有细胞标签的cDNA，来自于同一个细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签；分子标签载体为携带分子标签的固相载体，用于获得具有分子标签的多个cDNA片段，来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签。

本发明还提供了一种用于制备单细胞定量cDNA测序文库的试剂盒，包括细胞标签载体和分子标签载体；所述细胞标签载体为携带细胞标签和转录本标签的固相载体，用于获得具有细胞标签和转录本标签的cDNA，来自于同一个细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签，来自于同一细胞的各个cDNA具有不同的转录本标签；分子标签载体为携带分子标签的固相载体，用于获得具有分子标签的多个cDNA片段，来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签。

具体的，试剂盒还包括转座酶复合体。转座酶复合体由转座子和转座酶组成。

具体的，试剂盒还包括用于反转录的引物。

具体的，试剂盒还包括用于“利用转座酶复合体和分子标签载体，得到具有分子标签的各个cDNA片段”的封闭序列和引物。

具体的，试剂盒还包括用于PCR扩增获得测序文库的引物对。

具体的，试剂盒还包括用于环化和滚环扩增的单链寡核酸。

具体的，试剂盒还包括用于环化和滚环扩增的引物。

具体的，试剂盒还包括用于滚环扩增产物二链合成的引物。

具体的，试剂盒还包括微孔芯片或者微流控液滴体系。

所述细胞标签载体的一种具体形式为，将多条DNA分子乙连接至固相载体表面得到的；DNA分子乙为部分双链结构，由两条部分互补的单链DNA分子组成；所述DNA分子乙中具有细胞标签和mRNA捕获区。

所述细胞标签载体的另一种具体形式为，将多条DNA分子乙连接至固相载体表面得到的；DNA分子乙为部分双链结构，由两条部分互补的单链DNA分子组成；所述DNA分子乙中具有细胞标签、转录本标签和mRNA捕获区。

所述细胞标签载体也可为本领域技术人员所了解的其他形式。

不同的细胞标签载体上连接的DNA分子乙中的转录本标签可以相同，也可以不同。

所述分子标签载体是将多条DNA分子甲连接至固相载体表面得到的；DNA分子甲为部分双链结构，由两条部分互补的单链DNA分子组成；所述DNA分子甲中具有分子标签和转座酶复合体捕获区。

所述分子标签载体也可为本领域技术人员所了解的其他形式。

本发明还要求保护以上方法在高通量获得大量单细胞中每个单细胞的所有mRNA的序列中的应用。

本发明还要求保护以上方法在高通量获得大量单细胞中每个单细胞的所有mRNA的序列并对其进行定量中的应用。

本发明还要求保护以上试剂盒在高通量获得大量单细胞中每个单细胞的所有mRNA的序列中的应用。

本发明还要求保护以上试剂盒在高通量获得大量单细胞中每个单细胞的所有mRNA的序列并对其进行定量中的应用。

针对目前市面上单细胞mRNA测序产品所存在的种种限制和不足，本发明提出了一种基于短读序列共标签(co-barcoding)的方法，预期解决当前高通量技术无法检测全长mRNA转录本，能够检测全长转录本的技术通量过低的矛盾。

本发明中，利用单细胞分离技术分离单细胞并给单细胞的cDNA增加细胞标签，利用虚拟分隔和分子标签共标记技术将全长逆转录后的cDNA分子标记上相同的分子标签，之后利用cDNA末端同时携带细胞标签和分子标签这一特征，将携带相同分子标签的短读序列信息还原回原始cDNA上，再利用细胞标签追溯该cDNA的来源细胞，即利用一个双重标记系统，分别记录分子来源和细胞来源，从而实现克服常规高通量单细胞RNA测序过程中，由于丢失了细胞标签而无法进行全长cDNA测序的问题。

本发明的原理流程：使用微孔芯片(或者微流控液滴体系)进行细胞分离，同时将带有细胞标签的载体置于有细胞的微孔(或液滴)内，裂解细胞释放mRNA后，使用载体表面携带的带有细胞标签(cell tag)的逆转录引物捕获mRNA，之后进行mRNA逆转录，得到全长cDNA(3’末端包含细胞标签)；利用虚拟分隔(vitrual compartments)和快速的酶反应，将同一虚拟分隔中的cDNA使用相同的分子标签(molecule barcode)进行标记；然后进行常规建库和测序。当虚拟分隔内的cDNA数量很少时，可以认为一个分子标签下的测序序列均来自以同一cDNA分子，因此在测序完成后，根据分子标签信息，可以将测序仪产生的短读序列重新组装(还原)为原始cDNA序列。随后利用cDNA上的3’末端的细胞标签，即可将追溯该cDNA全长分子的细胞来源。从而实现对单细胞全长cDNA的检测。

本发明的关键发明点：

(1)微控芯片单细胞分离技术；该技术是建立在大量样品无规则取样最终服从泊松分布的理论基础上，将有限量的细胞稀释后加入到孔数量足够多的微控芯片上(大部分孔内不包含细胞，少部分孔内包含一个细胞，极少部分孔内包含两个或以上细胞)，之后加入与微孔直径相当的微球载体，该载体上携带有特定的核酸序列用于标记单个细胞内的信使RNA(即mRNA)，即对mRNA的细胞来源进行标记；由于微孔直径的限制，每个孔内有且仅能有一个微球载体，从而实现单个细胞有且只有一个细胞标签的特征；

(2)虚拟分隔标记技术；分子热运动的速率是相对稳定的，因此在一定时间内，分子热运动的范围有限，所以可以将某一半径范围内的液体空间视为一个“虚拟”分隔。当液体体积足够大，分子数量足够稀时，分子之间的距离较大，两个独立分子可以被视为完全隔离，不会产生相互作用；将所有细胞内的mRNA分别标记好细胞标签后，进行逆转录形成标记好的cDNA，之后在单一反应体系中加入带有分子标签的载体从而将cDNA进行虚拟分隔，再之后通过片段化和标签化的过程，将来自于同一cDNA的短读序列全部标记上相同的分子标签，从而最终实现双重标记系统。

附图说明

图1为本发明提供的方法的技术流程示意图。

图2为分子标签载体的结构示意图。

图3为细胞标签载体的结构示意图。

图4为转座产物的示意图。

图5为制备转座酶复合体并获得测序文库的原理和流程示意图。

图6为测序文库溶液的1.5％琼脂糖凝胶电泳图。

图7为对测序结果进行分析拼接的流程示意图。

图8为转录本的Reads覆盖度分析；X轴表示reads对转录本的覆盖度，左边的Y轴表示转录本的比例，右边的Y轴表示转录本的密度。

图9为Reads在转录本上的分布；X轴表示转录本的位置，Y轴表示reads的数目。

图10为每个Barcode下的reads分布。

图11为双链环化滚环扩增获得具有细胞标签的cDNA的流程示意图。

图12为单链环化滚环扩增获得具有细胞标签的cDNA的流程示意图。

实施发明的最佳方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明的一种具体实施方式，制备具有大量微孔的芯片；之后，将有限数量的细胞加入到微孔芯片表面，待细胞充分沉降后洗掉芯片表面没有沉降到孔内的多余细胞；之后，加入经过特殊设计的携带有细胞标签的mRNA捕获载体，将细胞在孔内原位裂解后，标签mRNA捕获载体即可捕获该单细胞所释放出来的mRNA，反转录或者将所有捕获载体收集到一个反应容器中进行mRNA逆转录反应，生成对应的一端带有细胞标签的全长cDNA；之后，将一定分子数量的全长cDNA分子与转座酶复合体混合，在一定温度下转座酶复合体会随机插入并结合到DNA长分子上；之后，将带有转座酶复合体的cDNA分子和携带有大量特定分子标签(barcode)的载体共同孵育，随后控制反应体积，cDNA分子浓度，载体浓度以及反应时间，使每一个带有大量特定分子标签(barcode)的载体形成一个虚拟分割，该载体能捕获结合在长片段cDNA分子上的转座酶复合体，当cDNA长片段分子浓度足够低，而带有分子标签的载体数量足够多时，会使得落在一个载体形成的虚拟分隔内的cDNA分子，那么一个载体就只会捕获一条cDNA分子，载体捕获cDNA分子后，将载体上的Barcode与转座复合体的接头序列连起来，这样Barcode就连接到DNA片段上去了，然后释放转座酶，从而最终使一条长片段cDNA断裂成许多适合测序的短片段，并且这些来自同一个长片段cDNA分子的短片段上所带有的标签是相同的；之后，通过标签信息，将测序生成的短读长序列重新还原成原始长片段cDNA，再通过cDNA上同时携带的细胞标签和分子标签，确定每个cDNA的细胞来源，从而实现高通量单细胞全长转录本测序。

上述实施方式的实施路线分为四个部分：第一个部分为制备大量带有多拷贝特定标签序列(细胞标签和分子标签)的载体；第二个部分为将单细胞分离至微孔内，并使用一个带有细胞标签的载体捕获该单细胞内的信使RNA；第三部分为将逆转录后形成的cDNA与转座酶复合体进行结合；第四部分为分子标签载体杂交捕获带有转座复合体的全长cDNA，并将分子标签转移至cDNA上。

对于一种具体形式，细胞标签载体是将多条DNA分子乙连接至固相载体表面得到的；DNA分子乙由单链DNA分子C和单链DNA分子D组成，为部分双链结构；单链DNA分子C从5’→3’方向，依次由如下三个区段组成：5’端区段、中部区段和3’端区段；整个单链DNA分子D与单链DNA分子C的中部区段反向互补形成双链结构；单链DNA分子C的5’末端与固相表面连接；单链DNA分子C的3’端区段具有mRNA捕获区；单链DNA分子C的中部区段具有细胞标签。事实上，单链DNA分子C也可通过3’末端与固相表面连接。

对于一种具体形式，细胞标签载体是将特异DNA分子乙连接至固相表面得到的；特异DNA分子乙由单链DNA分子C和单链DNA分子D组成，为部分双链结构；单链DNA分子C从5’→3’方向，依次由如下三个区段组成：5’端区段、中部区段和3’端区段；整个单链DNA分子D与单链DNA分子C的中部区段反向互补形成双链结构；单链DNA分子C的5’末端与固相表面连接；单链DNA分子C的3’端区段自上游至下游依次具有独特转录本标签和mRNA捕获区；单链DNA分子C的中部区段具有细胞标签。事实上，单链DNA分子C也可通过3’末端与固相表面连接。

对于一种具体形式，分子标签载体是将多条DNA分子甲连接至固相载体表面得到的；DNA分子甲由单链DNA分子A和单链DNA分子B组成，为部分双链结构；单链DNA分子A从5’→3’方向，依次由如下三个区段组成：5’端区段、中部区段和3’端区段；整个单链DNA分子B与单链DNA分子A的中部区段反向互补形成双链结构；单链DNA分子A的5’端区段具有转座子捕获区；单链DNA分子A的3’末端与固相表面连接；单链DNA分子A的中部区段具有分子标签。事实上，单链DNA分子A也可通过5’末端与固相表面连接。

对于一种具体形式，固相为颗粒状固相。颗粒状固相具体可为磁珠或胶珠或二氧化硅珠等。

对于一种具体形式，细胞标签载体中，每个颗粒状固相的表面连接一种DNA分子乙；每个颗粒状固相的表面连接多条DNA分子乙；一种DNA分子乙，即序列相同的DNA分子乙。每个颗粒状固相表面具体可连接10000000条以上的DNA分子乙，优选连接100000000条以上的DNA分子乙，进一步优选连接500000000条以上的DNA分子乙。

对于一种具体形式，分子标签载体中，每个颗粒状固相的表面连接一种DNA分子甲；每个颗粒状固相的表面连接多条DNA分子甲；一种DNA分子甲，即序列相同的DNA分子甲。每个颗粒状固相表面具体可连接10000条以上的DNA分子甲，优选连接50000条以上的DNA分子甲，进一步优选连接80000条以上的DNA分子甲。

具体可采用500000种以上的细胞标签，优选1000000以上的细胞标签，进一步优选2000000以上的细胞标签。细胞标签中可以具有一组细胞标签或多组细胞标签(例如两组、三组等，以增加标签所代表的细胞数量)。对于一种具体形式，细胞标签由细胞标签1、间隔序列和细胞标签2组成。细胞标签1可以由4-50个核苷酸组成，优选由8-20个核苷酸组成。细胞标签1的设计原则为：由A、T、C、G四种核苷酸组成，每种核苷酸不能连续出现3次以上。细胞标签2可以由4-50个核苷酸组成，优选由8-20个核苷酸组成。细胞标签2的设计原则为：由A、T、C、G四种核苷酸组成，每种核苷酸不能连续出现3次以上。细胞标签1具体可由10个核苷酸组成。细胞标签2具体可由10个核苷酸组成。具体可采用1536种细胞标签1和1536种细胞标签2，从而得到2359296种细胞标签。具体可采用768种细胞标签1和384种细胞标签2，从而得到294912种细胞标签。

具体可采用500000种以上的分子标签，优选1000000以上的分子标签，进一步优选2000000以上的分子标签。分子标签中可以具有一组分子标签或多组分子标签(例如两组、三组等，以增加标签所代表的分子数量)。对于一种具体形式，分子标签由分子标签1、间隔序列和分子标签2组成。分子标签1可以由4-50个核苷酸组成，优选由8-20个核苷酸组成。分子标签1的设计原则为：由A、T、C、G四种核苷酸组成，每种核苷酸不能连续出现3次以上。分子标签2可以由4-50个核苷酸组成，优选由8-20个核苷酸组成。分子标签2的设计原则为：由A、T、C、G四种核苷酸组成，每种核苷酸不能连续出现3次以上。分子标签1具体可由10个核苷酸组成。分子标签2具体可由10个核苷酸组成。具体可采用1536种分子标签1和1536种分子标签2，从而得到2359296种分子标签。具体可采用768种分子标签1和384种分子标签2，从而得到294912种细胞标签。

独特转录本标签可由8-50个核苷酸组成，例如由8-20个核苷酸组成，每个核苷酸均为随机的A或者T或者C或者G。作为一种具体示例，独特转录本标签由10个核苷酸组成。

作为一种具体示例，反转录中，采用的TSO引物如序列表的序列13所示，采用的ISO引物如序列表的序列14所示。

作为一种具体示例，“利用转座酶复合体和分子标签载体，得到具有分子标签的各个cDNA片段”中，采用的封闭序列如序列表的序列19所示，采用的引物如序列表的序列20所示。

作为一种具体示例，“PCR扩增”，采用序列表的序列21所示引物和序列表的序列22所示引物组成的引物对。

作为一种具体示例，“利用细胞标签载体捕获单细胞的mRNA”是在微孔芯片或者微流控液滴体系中进行的。微孔芯片的微孔尺寸具体可为“直径25μm，高30μm”。每个微孔芯片上微孔的个数可为1万个以上，数量级可为10万。

作为一种具体示例，细胞标签载体中：每个颗粒状固相表面具体可连接10000000条以上的DNA分子乙，优选连接100000000条以上的DNA分子乙，进一步优选连接500000000条以上的DNA分子乙。

作为一种具体示例，用于反转录的引物包括TSO引物和ISO引物。TSO引物如序列表的序列13所示。ISO引物如序列表的序列14所示。

作为一种具体示例，封闭序列如序列表的序列19所示。引物如序列表的序列20所示。

作为一种具体示例，用于PCR扩增获得测序文库的引物对为采用序列表的序列21所示引物和序列表的序列22所示引物组成的引物对。

作为一种具体示例，用于反转录的引物为TSO引物。实施例中具体采用的TSO引物可以如序列表的序列13所示。作为一种具体示例，用于PCR扩增获得全长转录本扩增产物的引物为ISO引物。实施例中具体采用的ISO引物可以如序列表的序列23所示。作为一种具体示例，用于滚环扩增的单链寡核酸为Oligo。实施例中具体采用的Oligo可以如序列表的序列24所示。实施例中用于双链合成的引物具体可以如序列表的序列21所示。

作为一种具体示例，用于反转录的引物为TSO引物。实施例中具体采用的TSO引物可以如序列表的序列25所示。作为一种具体示例，用于PCR扩增获得全长转录本扩增产物的引物为ISO引物和PCR引物。实施例中具体采用的ISO引物可以如序列表的序列26所示。实施例中具体采用的PCR引物可以如序列表的序列27所示。作为一种具体示例，用于单链环化反应的单链寡核酸为Oligo。实施例中具体采用的Oligo可以如序列表的序列28所示。作为一种具体示例，用于滚环扩增的单链寡核酸为Oligo。实施例中具体采用的Oligo可以如序列表的序列27所示。实施例中用于双链合成的引物具体可以如序列表的序列21所示。

作为一种具体示例，微孔芯片的微孔尺寸具体可为“直径25μm，高30μm”。

作为一种具体示例，每个微孔芯片上微孔的个数为1万个以上，数量级可为10万。

mRNA捕获区可由连续17-25个T以及位于3’末端的V组成。

转座酶复合体具体由转座子1、转座子2和转座酶组成。转座子1可以被转座子捕获区捕获，转座子2不能被转座子捕获区捕获。转座酶具体可为Tn5转座酶。

作为更具体的一种形式，特异DNA乙具体可由片段L2、片段3和片段4依次连接得到。片段L2是将序列表的序列7所示单链DNA分子与序列表的序列8所示单链DNA分子退火得到的；片段3是将序列表的序列9所示单链DNA分子与序列表的序列10所示单链DNA分子退火得到的；片段4是将序列表的序列11所示单链DNA分子和序列表的序列12所示单链DNA分子退火得到的。对于本具体形式来说，细胞标签载体通过将特异DNA乙的5’粘末端连接于固相表面得到。

作为更具体的一种形式，特异DNA甲具体可由片段2、片段1和片段L1依次连接得到。片段2是将序列表的序列5所示单链DNA分子与序列表的序列6所示单链DNA分子退火得到的；片段1是将序列表的序列3所示单链DNA分子和序列表的序列4所示单链DNA分子退火得到的。片段L1是将序列表的序列1所示单链DNA分子与序列表的序列2所示单链DNA分子退火得到的。对于本具体形式来说，分子标签载体通过将特异DNA甲的3’粘末端连接于固相表面得到。

作为更具体的一种形式，转座子1是将序列表的序列15所示单链DNA分子和序列表的序列16所示单链DNA分子退火得到的。作为更具体的一种形式，转座子2是将序列表的序列17所示单链DNA分子和序列表的序列18所示单链DNA分子退火得到的。

连接缓冲液工作液：含10g/100mL PEG₈₀₀₀、50mM Tris-HCl、0.33mM ATP、0.05mg/mL BSA、10mM MgCl₂、0.5mM DTT，余量为水。

低盐磁珠洗涤缓冲液：含50mM Tirs-HCl、150mM NaCl、0.02％(体积比)Tween-20，余量为水。

高盐磁珠洗涤缓冲液：含50mM Tirs-HCl、500mM NaCl、0.02％(体积比)Tween-20，余量为水。

载体加载缓冲液：含0.1％(体积比)Tween-20，余量为pH8.0、1M的PBS缓冲液。

细胞裂解液：含14mM NaCl、3mM KCl、1mM EDTA、12g/100mL蔗糖、1％(体积比)Triton X-100，余量为pH7.5、13mM的Tris-HCl缓冲液。

洗涤缓冲液：含150mM NaCl、0.02％(体积比)Tween-20，余量为pH7.5、50mM的Tirs-HCl缓冲液。

逆转录反应缓冲液：含75mM KCl、3mM MgCl₂，余量为pH8.3、50mM的Tris-HCl缓冲液。

Tn5转座酶：购自南京诺唯赞公司，产品名TruePrep Advanced DNA Sample PrepKit，目录号S301-01。

实施例1、方法的建立

技术流程示意图见图1。

一、制备分子标签载体

具有多拷贝分子标签序列的载体(简称分子标签载体)，是指在一个载体上，带有序列相同的多个拷贝的作为分子标签的寡聚核苷酸序列。本步骤采用“分散-合并-分散”的技术手段实现多种类多拷贝特定分子标签序列载体的制备。分子标签载体的结构示意图见图2。

1、通过生物素-链霉亲和素的相互作用将特定接头序列与载体连接。

(1)制备特定接头序列

特定接头序列又称linker。Linker为两端具有粘末端双链DNA分子。在制备该Linker时将浓度为100μM的Linker-F溶液和浓度为100μM的Linker-R溶液等体积混合后进行退火，得到Linker。

Linker-F为单链DNA分子，3’末端具有双生物素基团修饰。Linker-F核苷酸序列如下：

Linker-F(序列表的序列1)：

5’-CTTCCGGCAGAACGACATGGCTACGAAAAAAAAAA-3’。

Linker-R为单链DNA分子，核苷酸序列如下：

Linker-R(序列表的序列2)：5’-CGTAGCCATGTCGTTCTGCC-3’。

(2)获得载体

载体为偶联有链霉亲和素的磁珠，产品全称为Dynabeads M-280 streptation，Invitrogen公司，货号11206D。后续简称M280磁珠。

(3)通过生物素-链霉亲和素的相互作用将步骤(1)制备的linker与M280磁珠连接，得到具有linker的磁珠。

步骤(3)得到产物具体为磁珠悬液形式，因此命名为linker磁珠悬液。linker磁珠悬液中，linker均已连接到磁珠上。linker磁珠悬液中，Linker的浓度为1.6μM。linker磁珠悬液中，平均每个磁珠连接86000个Linker。

2、取4个384孔板(共具有1536个孔)，每孔加入2μl 100μM的1-F溶液和2μl 100μM的1-R溶液，然后进行退火，形成标签片段1。

1-F和1-R均为单链DNA分子，核苷酸序列如下：

1-F(序列表的序列3)：5’-分子标签1-ACCCTGACTAGGTCGC-3’；

1-R(序列表的序列4)：

5’-GGAAGGCGACCTAGTCAGGGT-分子标签1’-CGCAGA-3’。

本实施例中的分子标签1由10个核苷酸组成。

分子标签1’与分子标签1反向互补。

不同孔中，分子标签1各不相同，1536个孔具有1536种分子标签1。

3、取完成步骤2的4个384孔板，每孔加入2.5μl步骤1制备的linker磁珠悬液，然后加入T4 DNA ligase及其配套缓冲液，25℃反应1小时。

4、完成步骤3后，将4个384孔板中的磁珠全部收集到一个离心管中。

5、用低盐磁珠洗涤缓冲液充分洗涤步骤4得到的磁珠，然后用连接缓冲液工作液重悬磁珠，得到Linker浓度为1.6μM的磁珠悬液。

6、取4个新的384孔板(共具有1536个孔)，每孔加入2μl 100μM的2-F溶液和2μl100μM的2-R溶液，然后进行退火，形成标签片段2。

2-F和2-R均为单链DNA分子，核苷酸序列如下：

2-F(序列表的序列5)：

5’-GCACTGACGACATGATCACCAAGGATCGATAGTCCATGCTAGGCGTCGTTTTA-分子标签2-TCTGCG-3’；

2-R(序列表的序列6)：5’-分子标签2’-TAAAACGACG-3’。

2-F中，下划直线标注的是转座子捕获区。

本实施例中的分子标签2由10个核苷酸组成。

分子标签2’与分子标签2反向互补。

不同孔中，分子标签2各不相同，1536个孔具有1536种分子标签2。

7、取完成步骤6的4个384孔板，每孔加入2.5μl步骤5得到的磁珠悬液，然后加入T4DNA ligase及其配套缓冲液，25℃反应1小时。

8、完成步骤7后，将4个384孔板中的磁珠全部收集到1个离心管中。

9、用低盐磁珠洗涤缓冲液充分洗涤步骤8得到的磁珠，然后用低盐磁珠洗涤缓冲液重悬磁珠，得到Linker浓度为1.6μM的磁珠悬液。

将步骤9得到的磁珠悬液命名为分子标签载体悬液。

分子标签载体悬液中的磁珠，均已连接特异DNA分子。特异DNA分子由单链DNA分子A和单链DNA分子B组成，为部分双链结构。单链DNA分子A从5’→3’方向，依次由如下三个区段组成：5’端区段、中部区段和3’端区段。整个单链DNA分子B与单链DNA分子A的中部区段反向互补形成双链结构。单链DNA分子A的5’端区段中具有转座子捕获区。单链DNA分子A的3’末端通过生物素-链霉亲和素的相互作用与磁珠连接。单链DNA分子A的中部区段具有分子标签1和分子标签2。

在上述制备过程中，引入了1536种分子标签1和1536种分子标签2，将每种具体分子标签1和具体分子标签2的组合作为一种具体的分子标签，分子标签载体悬液中存在2359296种具有不同分子标签的磁珠，每个磁珠均连接一种(多条)具有具体的分子标签的特异DNA分子。

二、制备细胞标签载体

本步骤采用“分散-合并-分散”的技术手段实现多种类多拷贝细胞标签序列载体(简称细胞标签载体)的构建。细胞标签载体的结构示意图见图3。

1、制备特定接头序列

特定接头序列又称linker。Linker为两端具有粘末端双链DNA分子。在制备该Linker时将浓度为100μM的Linker-F溶液和浓度为100μM的Linker-R溶液等体积混合后进行退火，然后用TE buffer稀释，得到Linker溶液。Linker溶液中，Linker的浓度为33μM。

Linker-F为单链DNA分子，5’末端具有双生物素基团修饰。Linker-F核苷酸序列如下：

Linker-F(序列表的序列7)：

5'-iSp18-TTTTTCCCGTAGCCATGTCGTTCTGCG-3’。

Linker-R为单链DNA分子，核苷酸序列如下：

Linker-R(序列表的序列8)：5'-ACGACATGGCTACGGG-3’。

Linker-F中，iSp18代表18个碳原子形成的骨架。

2、取4个384孔板(共具有1536个孔)，每孔加入2μl 100μM的3-F溶液和2μl 100μM的3-R溶液,然后进行退火，形成标签片段3。

3-F和3-R均为单链DNA分子，核苷酸序列如下：

3-F(序列表的序列9)：5'-细胞标签1-ACCTGAGATCGC-3’；

3-R(序列表的序列10)：

5'-GGAAGGGCGATCTCAGGT-细胞标签1’-CGCAGA-3’。

本实施例中的细胞标签1由10个核苷酸组成。

细胞标签1’与细胞标签1反向互补。

不同孔中，细胞标签1各不相同，1536个孔具有1536种细胞标签1。

3、取完成步骤2的4个384孔板，每孔加入0.781μl步骤1制备的Linker溶液，然后加入T4 DNA ligase及其配套缓冲液，25℃反应1小时。

4、获得载体

载体为偶联有链霉亲和素的磁珠，产品全称为Streptavidin CoatedPolystyrene Particles(SVP-200-4，Spherotech)。后续简称SVP-200-4磁珠。

5、在完成步骤3的4个384孔板中，通过生物素-链霉亲和素的相互作用使各孔中的DNA分子与SVP-200-4磁珠连接。

6、完成步骤5后，将4个384孔板中的磁珠全部收集到到1个离心管中。

7、用低盐磁珠洗涤缓冲液充分洗涤步骤6得到的磁珠，然后用连接缓冲液工作液重悬磁珠，得到Linker浓度为10μM的磁珠悬液。磁珠悬液中，平均每个磁珠连524025069个Linker。

8、取4个新的384孔板(共具有1536个孔)，每孔中加入0.5μl 100μM的4-F溶液和0.5μl 100μM的4-R溶液,然后进行退火，形成标签片段4。

4-F和4-R均为单链DNA分子，核苷酸序列如下：

4-F(序列表的序列11)：

5'-CCTTCC-细胞标签2-CGATG

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3’；

4-R(序列表的序列12)：5'-CATCG-细胞标签2’-3’。

4-F中，V代表A或者C或者G。4-F中，方框标注的是独特转录本标签(UMI)。4-F中，下划波浪线标注的是mRNA捕获区。

本实施例中的细胞标签2由10个核苷酸组成。

细胞标签2’与细胞标签2反向互补。

不同孔中，细胞标签2各不相同，1536个孔具有1536种细胞标签2。

本实施例中的独特转录本标签由10个N组成，每条4-F中均具有唯一的独特转录本标签。

9、取完成步骤8的4个384孔板，每孔加入5μl步骤7得到的磁珠悬液，然后加入T4DNA ligase及其配套缓冲液，25℃反应1小时。

10、完成步骤9后，将4个384孔板中的磁珠全部收集到到1个离心管中。

11、用低盐磁珠洗涤缓冲液充分洗涤步骤10得到的磁珠，然后用低盐磁珠洗涤缓冲液重悬磁珠，得到磁珠悬液。

将步骤11得到的磁珠悬液命名为细胞标签载体悬液。

细胞标签载体悬液中，磁珠浓度为4000个/μl。细胞标签载体悬液中的磁珠，均已连接特异DNA分子。特异DNA分子由单链DNA分子C和单链DNA分子D组成，为部分双链结构。单链DNA分子C从5’→3’方向，依次由如下三个区段组成：5’端区段、中部区段和3’端区段。整个单链DNA分子D与单链DNA分子C的中部区段反向互补形成双链结构。单链DNA分子C的5’末端通过生物素-链霉亲和素的相互作用与磁珠连接。单链DNA分子C的3’端区段自上游至下游依次具有独特转录本标签和mRNA捕获区。单链DNA分子C的中部区段具有细胞标签1和细胞标签2。

在上述制备过程中，引入了1536种细胞标签1和1536种细胞标签2，将每种具体细胞标签1和具体细胞标签2的组合作为一种具体的细胞标签，细胞标签载体悬液中存在2359296种具有不同细胞标签的磁珠，每个磁珠均连接具有一种(多条)具有具体的细胞标签的特异DNA分子(但与该磁珠连接的每条特异DNA分子均具有唯一的独特转录本标签，即与该磁珠连接的每条特异DNA分子中的独特转录本标签各不相同)。

三、制备微孔芯片并获得全长转录本扩增产物

1、制备芯片

(1)以SU-8光刻胶在硅片表面制成的具有微米结构的阵列为模具，制备聚二甲基硅氧烷(PDMS)材质的微孔芯片。每个微孔芯片约具有10万个微孔，每个微孔的尺寸均为“直径25μm，高30μm”。

(2)取步骤(1)得到的微孔芯片，表面进行等离子体处理，使其暴露出羟基从而获得一定亲水性。

(3)取步骤(2)得到的微孔芯片，放入6孔板中(每个微孔芯片放入1个孔)。

(4)取完成步骤(3)的6孔板，每孔中加入3ml DEPC水，静置30分钟，然后弃除孔中的液体。

(5)取完成步骤(4)的6孔板，每孔加入3mL PBS缓冲液，然后弃除孔中的液体。

(6)取完成步骤(5)的6孔板，每孔加入3mL PBS缓冲液，然后弃除孔中的液体。

(7)取完成步骤(6)的6孔板，每孔加入2.5mL PBS缓冲液。

后续步骤2、步骤3和步骤4的操作均是以一个微孔芯片为例进行描述的。

2、加入细胞标签载体至微孔芯片

(1)取步骤二制备的细胞标签载体悬液，收集磁珠，将约40万个磁珠重悬于200μl载体加载缓冲液中，然后均匀加载至完成步骤1的微孔芯片的表面，室温静置10分钟，然后从微孔芯片侧边轻轻的吸出液体，回收其中的磁珠，将回收的磁珠再次重悬于200μl载体加载缓冲液，再次均匀加载至所述微孔芯片的表面，室温静置5分钟。

(2)完成上一步后，从微孔芯片侧边轻轻地吸出液体，用PBS缓冲液清洗微孔芯片两次，每次步骤均为：从侧边轻柔地加入3ml PBS缓冲液，再从侧边吸出液体。

3、加入细胞至微孔芯片

(1)将10万个细胞充分悬浮于3ml PBS缓冲液中，从微孔芯片侧边加入完成步骤2的微孔芯片中，静置30分钟。

(2)完成上一步骤后，从微孔芯片侧边轻轻地吸出液体，用PBS缓冲液清洗微孔芯片两次，每次步骤均为：从侧边轻柔地加入3ml PBS缓冲液，再从侧边吸出液体。

4、裂解细胞并捕获mRNA

(1)在完成步骤3的微孔芯片表面贴上一层孔径为0.01μm的聚碳酸酯滤膜，然后加入3ml细胞裂解液，室温静置30分钟。

(2)完成上一步后，从微孔芯片侧边轻轻地吸出液体，用洗涤缓冲液清洗微孔芯片两次，每次步骤均为：从侧边轻柔地加入3ml洗涤缓冲液，再从侧边吸出液体。

(3)完成上一步后，将微孔芯片转移到新的6孔板中(新6孔板中每孔已预先加入1ml洗涤缓冲液)，然后使其表面朝下并收集全部磁珠。

理论上，每个磁珠捕获单个细胞的所有mRNA，每个mRNA连接于该磁珠的一条特异DNA分子上。

5、PCR扩增获得具有细胞标签的cDNA

(1)取步骤4获得的全部磁珠，制备逆转录反应体系，进行逆转录反应。

逆转录反应体系(20μl)：全部磁珠、2μl dNTP(10mM)、1μl逆转录酶(200U/μl)、0.5μl RNaseOUT^TM(40U/μL)、4μl 5×Superscript II first-strand buffer、1μl DTT溶液(100mM)、4μl Betaine溶液(5M)、6μl MgCl₂溶液(25mM)、0.2μl TSO引物溶液(100μM)，余量为水。

Superscript II first-strand buffer：含375mM KCl、15mM MgCl₂，溶剂为pH8.3、250mM的Tris-HCl缓冲液。

TSO引物(序列表的序列13)：5’-CGTAGCCATGTCGTTCTGrGrG+G-3’；

r代表r后面的一个核苷酸为核糖核苷酸，+代表+后面的一个核苷酸为锁核苷酸(LNA)。

逆转录反应条件：42℃、90分钟。

(2)完成上一步后，收集磁珠，用低盐磁珠洗涤缓冲液洗涤两次，制备外切酶反应体系，进行反应。

外切酶反应体系(50μl)：全部磁珠、1μl外切酶(Exonuclease I，20U/μl)、5μl 10×Exonuclease I Reaction Buffer，余量为水。

反应条件：37℃、10分钟。

(3)完成上一步后，收集磁珠，用低盐磁珠洗涤缓冲液洗涤两次，制备PCR反应体系，进行PCR扩增反应。

PCR反应体系(100μl)：全部磁珠、50μl 2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix、5μlISO引物溶液(10μM)，余量为水。

ISO引物(序列表的序列14)：5’-CGTAGCCATGTCGTTCTG-3’。

PCR扩增程序：98℃3分钟；98℃20秒、67℃15秒、72℃6分钟、14个循环；72℃5分钟。

(4)完成步骤(3)后，用磁力架吸附磁珠，收集上清液，然后用XP磁珠纯化并收集纯化产物，即为全长转录本扩增产物。

全长转录本扩增产物中，具有数目庞大的具有细胞标签的cDNA，同一单细胞得到的各个cDNA均具有相同的细胞标签，不同单细胞得到的cDNA具有不同的细胞标签，同一单细胞得到的各个cDNA均具有不同的转录本标签。

四、制备转座酶复合体并获得测序文库

原理和流程示意图见图5。

1、将转座子1F和转座子1R等摩尔混合后进行退火，得到转座子1。退火产物以溶液形式存在，又称转座子1溶液，其中转座子1的浓度为50μM。

转座子1F和转座子1R均为单链DNA分子，核苷酸序列如下：

转座子1F(序列表的序列15)：

5’-CCTAGCATGGACTATCGATCCTTGGTGATCATGTCGTCAGTGCTTGTCTTCCTAAGATGTGTATAAGAGACAG-3’；

转座子1R(序列表的序列16)：5’-CTGTCTCTTATACACATCT-3’。

2、将转座子2F和转座子2R等摩尔混合后进行退火，得到转座子2。退火产物以溶液形式存在，又称转座子2溶液，其中转座子2的浓度为50μM。

转座子2F和转座子2R均为单链DNA分子，核苷酸序列如下：

转座子2F(序列表的序列17)：

5’-GAGACGTTCTCGACTCAGCAGAAGATGTGTATAAGAGACAG-3’；

转座子2R(序列表的序列18)：5’-CTGTCTCTTATACACATCT-3’。

3、取11.8μl Tn5转座酶溶液、1.6μl转座子1溶液、1.6μl转座子2溶液和25μl甘油溶液，冰上混合后置于30℃反应1个小时，得到转座酶复合体溶液，然后用甘油溶液稀释，得到转座子1和转座子2的总浓度为0.5pmol/μl的转座酶复合体稀释液。

Tn5转座酶溶液中，Tn5转座酶的浓度为1U/μl。

甘油溶液是用TE缓冲液稀释甘油得到的，甘油浓度为50g/100ml。

4、在冰上配制反应体系并进行转座反应，得到转座产物。

反应体系(10μl)：2μl 5×转座酶打断缓冲液、步骤三制备的全长转录本扩增产物(DNA含量为2ng)、1.5μl步骤3得到的转座酶复合体稀释液，余量为水。

5×转座酶打断缓冲液：含50％(体积比)DMF、25mM MgCl₂，溶剂为pH8.5、50mM的HEPES-KOH缓冲液。

反应条件：55℃、10分钟，然后马上放到冰上。

转座产物的示意图见图4。

5、向完成步骤4的体系中加入15μl水和25μl 2×杂交缓冲液，即为转座产物稀释液。

2×杂交缓冲液：含2000mM NaCl、0.1％(体积比)Tween-20，溶剂为pH7.5、100mM的Tris-HCl缓冲液。

6、取步骤一制备的分子标签载体悬液，收集约1千万个磁珠，用50μl低盐磁珠洗涤缓冲液洗涤，然后用50μl强碱变性缓冲液重悬并常温孵育5分钟，然后收集磁珠，依次用50μl强碱变性缓冲液、50μl低盐磁珠洗涤缓冲液、50μl杂交缓冲液洗涤磁珠，最后用50μl杂交缓冲液重悬磁珠，得到磁珠悬液。

强碱变性缓冲液：含1.6M KOH、1mM EDTA，余量为水。

杂交缓冲液：含1000mM NaCl、0.05％(体积比)Tween-20，溶剂为pH7.5、50mM的Tris-HCl缓冲液。

7、取50μl步骤5制备的转座产物稀释液，与50μl步骤6制备的磁珠悬液混合，60℃反应1分钟，然后自然降至室温，然后25℃杂交1个小时。

8、完成步骤7后，在体系中加入2μl 100μM封闭序列1溶液(Blocker 1)和1μl100μM引物3溶液，置于垂直混匀仪上25℃反应0.5个小时，然后收集磁珠，用低盐磁珠洗涤缓冲液洗涤，然后配制反应体系并进行反应。

反应体系(50μl)：全部磁珠、6μl DNA聚合酶溶液(T4 DNA Polymerase，3U/μl)、1μl连接酶溶液(T7 DNA ligase，3000U/μl)、25μl 2×T7 DNA ligase buffer、0.5μl 25mMdNTP溶液，5μl 10mM ATP溶液，余量为水。

封闭序列1(序列表的序列19)：

5’-CCTAGCATGGACTATCGATCCTTGGTGATCATGTCGTCAGTGC-3’。

引物3(序列表的序列20)：

5’-CGTAGCCATGTCGTTCTGCCGGAAGGGCGACCTAGTCAGGGT-3’。

封闭序列1的3’末端具有生物基团修饰。

反应条件：20℃、0.5小时。

9、完成步骤8后，在体系中加入5μl 0.44g/100ml SDS水溶液，室温孵育10分钟(使转座酶变性从DNA上释放下来)，然后收集磁珠，依次用高盐磁珠洗涤缓冲液和低盐磁珠洗涤缓冲液洗涤，然后收集磁珠，配制反应体系并进行反应。

反应体系(50μl)：全部磁珠、1μl聚合酶溶液(Standard Taq polymerase，5U/ul)、5μl 10×thermopol buffer、0.8μl dNTP溶液(25mM),余量为水。

反应条件：72℃、10分钟。

10、完成步骤9后，用磁力架吸附磁珠，收集上清液。

11、将步骤10得到的上清液作为模板溶液，采用引物1和引物2，采用诺唯赞TD601PCR试剂盒并按说明书操作，进行聚合酶链式扩增(12-14个循环)，然后采用XP磁珠纯化并收集纯化产物，即为测序文库溶液。测序文库溶液中，具有数目庞大的具有分子标签的cDNA片段。同一cDNA得到的各个cDNA片段均具有相同的分子标签，不同cDNA得到的cDNA片段具有不同的分子标签。

引物1(序列表的序列21)：5’-CGTAGCCATGTCGTTCTG-3’；

引物2(序列表的序列22)：5’-GAGACGTTCTCGACTCAGCAGA-3’。

五、获得单细胞mRNA序列并定量

1、取步骤四得到的测序文库溶液，进行成环反应(按照BGIseq-500标准DNA小片段建库流程进行)，然后使用BGIseq-500进行高通量测序。

2、获取步骤1的原始测序结果。根据分子标签进行序列拼接，得到每个mRNA序列。进一步根据细胞标签，得到每个单细胞的所有mRNA的序列。最后根据mRNA序列相同但转录本标签不同的序列数量，对每个单细胞的每个mRNA进行定量。

实施例2、采用实施例1建立的方法进行具体试验

细胞为永生化的B淋巴细胞。

按照实施例1建立的方法进行操作，得到的测序文库溶液。

测序文库溶液的1.5％琼脂糖凝胶电泳图见图6。图6中，左侧的DNA Marker为NEB100bp ladder,右侧的DNAmarker为Thermofisher 1kb plus DNA ladder。测序文库溶液中，条带大小为300-1000bp之间，主带约450bp。

测序文库溶液的DNA含量为222ng，根据DNA质量与摩尔直接之间的换算关系，222ng DNA为747.5fmol(222/660/450*1000*1000),满足标准成环反应要求。

成环反应后，获得单链环13ng(87fmol),满足测序要求。

使用BGISEQ-500测序平台进行双端100bp加单端54bp加单端53bp的测序。其中双端100bp是指针对构建的文库中所包含的cDNA序列，从5’末和3’末端分别进行100bp的测序，单端54bp序列是针对分子标签进行测序，随后的单端53bp序列是针对细胞标签和独特转录本标签(UMI)进行测序。

获取原始测序结果，根据分子标签进行序列拼接，得到每个mRNA序列；进一步根据细胞标签，得到每个单细胞的所有mRNA的序列；最后根据mRNA序列相同但转录本标签不同的序列数量，对每个单细胞的每个mRNA进行定量。对测序结果进行分析拼接的流程示意图见图7。

将reads通过bowtie2软件比对到refMrna.fa参考转录本序列上，统计转录本覆盖情况。约有60％的参考转录本可以被完整覆盖(如图8所示)，且reads在转录本上均匀分布(如图9所示)。

将未比对到基因组上的reads，用于单细胞barcode信息分析，约有1.96％的reads能够拆分得到single cell barcode。每个Barcode下的reads分布见图10，每个Barcode下的平均Reads数为64-128。

实施例3、

与实施例1的差异仅在于步骤一中的部分，步骤二中的部分以及步骤三中的步骤5。

因此，仅描述差异步骤。

步骤一的2，用2个384孔板代替“4个384孔板”。步骤一的6，用1个384孔板代替4个384孔板。即制备过程中，引入了768种分子标签1和384种分子标签2，将每种具体分子标签1和具体分子标签2的组合作为一种具体的分子标签，分子标签载体悬液中存在294912种具有不同分子标签的磁珠，每个磁珠均连接一种(多条)具有具体的分子标签的特异DNA分子。

步骤二的2，用2个384孔板代替4个384孔板。步骤二的8，用1个384孔板代替4个384孔板。即在上述制备过程中，引入了768种细胞标签1和384种细胞标签2，将每种具体细胞标签1和具体细胞标签2的组合作为一种具体的细胞标签，细胞标签载体悬液中存在294912种具有不同细胞标签的磁珠，每个磁珠均连接具有一种(多条)具有具体的细胞标签的特异DNA分子(但与该磁珠连接的每条特异DNA分子均具有唯一的独特转录本标签，即与该磁珠连接的每条特异DNA分子中的独特转录本标签各不相同)。

步骤三的5(滚环扩增获得具有细胞标签的cDNA)具体为步骤5.1或者步骤5.2。

5.1双链环化滚环扩增获得具有细胞标签的cDNA

(1)取步骤4获得的全部磁珠，制备逆转录反应体系，进行逆转录反应。

同实施例1的步骤三的5的(1)。

(2)完成上一步后，收集磁珠，用低盐磁珠洗涤缓冲液洗涤两次，然后制备外切酶反应体系，进行反应。

外切酶反应体系(50μl)：全部磁珠、1μl外切酶(Exonuclease I，20U/μl)、5μl 10×Exonuclease I Reaction Buffer，余量为水。

反应条件：37℃、10分钟。

(3)完成上一步后，收集磁珠，用低盐磁珠洗涤缓冲液洗涤两次，然后进行PCR扩增(全长转录本扩增反应)。

PCR反应体系(100μl)：全部磁珠、50μl 2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix、5μlISO引物溶液(10μM)，余量为水。

ISO引物(序列表的序列23)：5’-AAGCdUdUCGTAGCCATGTCGTTCTG-3’。

PCR扩增程序：98℃3分钟；98℃20秒、67℃15秒、72℃6分钟、14个循环(扩增循环数与细胞投入量相关)；72℃5分钟。

(4)完成步骤(3)后，用磁力架吸附磁珠，收集上清液，然后用100μL XP磁珠(Agencourt AMPure XP-Medium，A63882，AGENCOURT公司)纯化，纯化方法见官方提供的标准操作规程。即为全长转录本扩增产物。

(5)取步骤(4)得到的上清液，加入1μL USER酶(1U/μL NEB)和3μL 10X stTaqBuffer(10倍浓度的标准Taq缓冲液，100mM Tris-HCl，500mM KCl，15mM MgCl₂)，用水补充体积到30μL，37℃反应1小时。

(6)完成步骤(5)后，立刻取出，加入5μL 10×TA Buffer，补水至50μL，70℃反应30分钟，然后室温水浴20分钟。

(7)完成步骤(6)后，加入2.75μL 20×Circ Mix(10×TA Buffer，0.1M ATP)和0.1μL T4 DNA连接酶(Enzymatics公司，600U/μL)，用水补充体积到55μL，室温反应2小时。

(8)完成步骤(7)后，体系中加入55μL XP磁珠(Agencourt AMPure XP-Medium，A63882，AGENCOURT公司)进行纯化，纯化方法见官方提供的标准操作规程。

(9)取步骤(8)的产物，加入3μL 10×Plasmid-safe Buffer、3.38μL Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase(10U/μL，Epicentre公司)和1.2μL 25mM ATP，补水至30μL，37℃反应1.5小时。10×Plasmid-safe Buffer(10倍浓度的线性DNA消化缓冲液)：330mMTris-acetate(Tris-醋酸，pH 7.5)，660mM potassium acetate(乙酸钾)，100mMmagnesium acetate(醋酸镁)，5.0mM DTT。

(10)完成步骤(9)后，体系中加入30μL XP磁珠(Agencourt AMPure XP-Medium，A63882，AGENCOURT公司)进行纯化，纯化方法见官方提供的标准操作规程。至此完成了全长转录本的双链环化。

(11)向步骤(10)的产物中加入20μL滚环扩增反应液，用水补足体积至40μL。运行如下程序：95℃1分钟，65℃1分钟，40℃1分钟。程序结束后，马上取出产物放置冰上。

滚环扩增反应液配置方法：4μL用于滚环扩增的oligo(50μM)，加入40μL 10×phi29 buffer(10倍浓度的phi29缓冲液)，补水至200μL。

用于滚环扩增的Oligo(序列表的序列24)：5’-TTTTTTTTTTTTTTTT-3’。

(12)向步骤(11)的产物中加入44μL phi29DNA聚合酶反应混合液，30℃10分钟，然后65℃10分钟。

(13)完成步骤(12)后取液相(含100ngDNA)，加入5μL 10×NEB buffer 2(10倍浓度的NEB缓冲液2)、0.4μL dNTP Mix(每种25mM)、0.5μL ATP(0.1M)、0.5μL用于双链合成的引物(10μM)，置于PCR仪中(运行如下程序：95℃3分钟，58℃30秒)，反应结束后立刻取出，加入2μL DNA聚合酶1(NEB，5U/μL)和1μL T4 DNA连接酶(Enzymatics公司，600U/μL)，置于PCR仪(运行如下程序：37℃30分钟，75℃20分钟)。

用于双链合成的引物(序列表的序列21)：5‘-CGTAGCCATGTCGTTCTG-3’。

(14)完成步骤(13)后，体系中加入50μL XP磁珠(Agencourt AMPure XP-Medium，A63882，AGENCOURT公司)进行纯化，纯化方法见官方提供的标准操作规程。至此完成了mRNA全长转录本(cDNA)的制备与富集。

流程示意图见图11。

5.2单链环化滚环扩增获得具有细胞标签的cDNA

(1)取步骤4获得的全部磁珠，制备逆转录反应体系，进行逆转录反应。

逆转录反应体系(20μl)：全部磁珠、2μl dNTP(10mM)、1μl逆转录酶(200U/μl)、0.5μl RNaseOUT^TM(40U/μL)、4μl 5×Superscript II first-strand buffer、1μl DTT溶液(100mM)、4μl Betaine溶液(5M)、6μl MgCl₂溶液(25mM)、0.2μl TSO引物溶液(100μM)，余量为水。

Superscript II first-strand buffer：含375mM KCl、15mM MgCl₂，溶剂为pH8.3、250mM的Tris-HCl缓冲液。

TSO引物(序列表的序列25)：

5’-GGAAACAGCTATGACCATGCGTAGCCATGTCGTTCTGrGrG+G-3’。

r代表r后面的一个核苷酸为核糖核苷酸，+代表+后面的一个核苷酸为锁核苷酸(LNA)。

逆转录反应条件：42℃、90分钟。

(2)完成上一步后，收集磁珠，用低盐磁珠洗涤缓冲液洗涤两次，然后制备外切酶反应体系，进行反应。

外切酶反应体系(50μl)：全部磁珠、1μl外切酶(Exonuclease I，20U/μl)、5μl 10×Exonuclease I Reaction Buffer，余量为水。

反应条件：37℃、10分钟。

(3)完成上一步后，收集磁珠，用低盐磁珠洗涤缓冲液洗涤两次，然后进行PCR扩增(全长转录本扩增反应)。

PCR反应体系(100μl)：全部磁珠、50μl 2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix、5μlISO引物溶液(10μM)，余量为水。

ISO引物(序列表的序列26)：5’phos-CGTAGCCATGTCGTTCTG-3’。

5’phos代表5’端进行磷酸化修饰。

PCR扩增程序：98℃3分钟；98℃20秒、67℃15秒、72℃6分钟，5个循环后加入5μl另一PCR引物(10μM),再继续进行10个循环。

得到带有两端接头序列的cDNA扩增产物。

另一PCR引物(序列表的序列27)：5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’。

(4)完成步骤(3)后，用磁力架吸附磁珠，收集上清液，然后用100μL XP磁珠(Agencourt AMPure XP-Medium，A63882，AGENCOURT公司)纯化，纯化方法见官方提供的标准操作规程。

(5)取步骤(4)得到的上清液，进行单链环化反应。

单链DNA环化反应采用华大建库试剂盒并按操作说明进行。

用于单链环化的oligo(序列表的序列28)：

5’-GACATGGCTACGGGAAACAGCTAT-3’。

(6)向步骤(5)的产物中加入20μL滚环扩增反应液，用水补足体积至40μL。运行如下程序：95℃1分钟，65℃1分钟，40℃1分钟。程序结束后，马上取出产物放置冰上。

滚环扩增反应液配置方法：4μL用于滚环扩增的oligo(50μM)，加入40μL 10×phi29 buffer(10倍浓度的phi29缓冲液)，补水至200μL。

用于滚环扩增的引物Oligo(序列表的序列27)：5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’。

(7)向步骤(6)的产物中加入44μL phi29DNA聚合酶反应混合液，30℃10分钟，然后65℃10分钟。

(8)完成步骤(7)后取液相(含100ngDNA)，加入5μL 10×NEB buffer 2(10倍浓度的NEB缓冲液2)、0.4μL dNTP Mix(每种25mM)、0.5μL ATP(0.1M)和0.5μL用于双链合成的引物(10μM)，置于PCR仪中(运行如下程序：95℃3分钟，58℃30秒)，反应结束后立刻取出，加入2μL DNA聚合酶1(NEB，5U/μL)和1μL T4 DNA连接酶(Enzymatics公司，600U/μL)，置于PCR仪(运行如下程序：37℃30分钟，75℃20分钟)。

用于双链合成的引物(序列表的序列21)：5’-CGTAGCCATGTCGTTCTG-3’。

(9)完成步骤(8)后，体系中加入50μL XP磁珠(Agencourt AMPure XP-Medium，A63882，AGENCOURT公司)纯化，纯化方法见官方提供的标准操作规程。至此完成了mRNA全长转录本(cDNA)的制备与富集。

流程示意图见图12。

实施例4、采用实施例3建立的方法进行具体试验

细胞为永生化的B淋巴细胞。

按照实施例3建立的方法进行操作，得到的测序文库溶液。

将reads通过bowtie2软件比对到refMrna.fa参考转录本序列上，统计转录本覆盖情况。约有60％的参考转录本可以被完整覆盖，且reads在转录本上均匀分布。

将未比对到基因组上的reads，用于单细胞barcode信息分析，约有1.96％的reads能够拆分得到single cell barcode。每个Barcode下的平均Reads数为64-128。

工业应用

本发明相比现有技术，其优点为：

(1)本发明提供了一种高通量mRNA全场转录本测序的解决方案，成功的解决了现有技术要么通量很低，要么高通量但无法检测mRNA全长的问题。

(2)本发明使用微孔芯片而非微流控芯片进行单细胞分离，因此无需蠕动泵或注射器泵等复杂控制设备。

(3)本发明构建得到的文库所产生的测序数据，可用于单细胞转录本的从头组装。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大智造科技有限公司

<120> 一种获得单细胞mRNA序列的方法

<130> PIDC3203714PCN

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cttccggcag aacgacatgg ctacgaaaaa aaaaa 35

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgtagccatg tcgttctgcc 20

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(10)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

nnnnnnnnnn accctgacta ggtcgc 26

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(31)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

ggaaggcgac ctagtcaggg tnnnnnnnnn ncgcaga 37

<210> 5

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (54)..(63)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

gcactgacga catgatcacc aaggatcgat agtccatgct aggcgtcgtt ttannnnnnn 60

nnntctgcg 69

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(10)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

nnnnnnnnnn taaaacgacg 20

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tttttcccgt agccatgtcg ttctgcg 27

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acgacatggc tacggg 16

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(10)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 9

nnnnnnnnnn acctgagatc gc 22

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(28)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 10

ggaagggcga tctcaggtnn nnnnnnnncg caga 34

<210> 11

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(16)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(31)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 11

ccttccnnnn nnnnnncgat gnnnnnnnnn nttttttttt tttttttttt ttv 53

<210> 12

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 12

catcgnnnnn nnnnn 15

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgtagccatg tcgttctgrg rgg 23

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgtagccatg tcgttctg 18

<210> 15

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cctagcatgg actatcgatc cttggtgatc atgtcgtcag tgcttgtctt cctaagatgt 60

gtataagaga cag 73

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctgtctctta tacacatct 19

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gagacgttct cgactcagca gaagatgtgt ataagagaca g 41

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctgtctctta tacacatct 19

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cctagcatgg actatcgatc cttggtgatc atgtcgtcag tgc 43

<210> 20

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cgtagccatg tcgttctgcc ggaagggcga cctagtcagg gt 42

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cgtagccatg tcgttctg 18

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gagacgttct cgactcagca ga 22

<210> 23

<211> 26

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列

<400> 23

aagcduducg tagccatgtc gttctg 26

<210> 24

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tttttttttt tttttt 16

<210> 25

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ggaaacagct atgaccatgc gtagccatgt cgttctgrgr gg 42

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cgtagccatg tcgttctg 18

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ggaaacagct atgaccatg 19

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gacatggcta cgggaaacag ctat 24

Claims (22)

1.一种获得单细胞mRNA序列的方法，包括如下步骤：

（1）利用细胞标签载体捕获细胞的mRNA，然后进行反转录，得到具有细胞标签的cDNA；所述细胞标签载体为携带细胞标签的固相载体；来自于同一个细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签；

（2）利用转座酶复合体和分子标签载体，得到具有分子标签的多个cDNA片段；来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签；分子标签载体为携带分子标签的固相载体；

（3）高通量测序；

（4）测序结果根据分子标签进行序列拼接，得到每个mRNA的序列；进一步根据细胞标签，得到每个单细胞的所有mRNA的序列；

其中，所述细胞标签载体是将多条DNA分子乙连接至固相载体表面得到的；DNA 分子乙为部分双链结构，由两条部分互补的单链 DNA 分子组成，所述DNA 分子乙中具有细胞标签和mRNA捕获区；

所述分子标签载体是将多条DNA分子甲连接至固相载体表面得到的；DNA 分子甲为部分双链结构，由两条部分互补的单链DNA分子组成，所述DNA分子甲中具有分子标签和转酶复合体捕获区。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

在步骤（1）和步骤（2）之间包括富集目标物的步骤；

和/或

在步骤（2）和步骤（3）之间包括富集目标物的步骤。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤（1）和步骤（2）之间的富集目标物的步骤，为PCR扩增或滚环扩增。

4.一种获得单细胞mRNA序列并定量的方法，包括如下步骤：

（1）利用细胞标签载体捕获细胞的mRNA，然后进行反转录，得到具有细胞标签和转录本标签的cDNA；所述细胞标签载体为携带细胞标签和转录本标签的固相载体；来自于同一细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签；来自于同一细胞的各个cDNA具有不同的转录本标签；

（2）利用转座酶复合体和分子标签载体，得到具有分子标签的多个cDNA片段；来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签；分子标签载体为携带分子标签的固相载体；

（3）高通量测序；

（4）测序结果根据分子标签进行序列拼接，得到每个mRNA序列；进一步根据细胞标签，得到每个单细胞的所有mRNA的序列；最后根据mRNA序列相同但转录本标签不同的序列数量，对每个单细胞的mRNA进行定量；

其中，所述细胞标签载体是将多条DNA分子乙连接至固相载体表面得到的；DNA分子乙为部分双链结构，由两条部分互补的单链DNA分子组成；所述DNA分子乙中具有细胞标签、转录本标签和mRNA捕获区；

所述分子标签载体是将多条DNA分子甲连接至固相载体表面得到的；DNA分子甲为部分双链结构，由两条部分互补的单链DNA分子组成；所述DNA分子甲中具有分子标签和转座酶复合体捕获区。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：

在步骤（1）和步骤（2）之间包括富集目标物的步骤；

和/或

在步骤（2）和步骤（3）之间包括富集目标物的步骤。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：

步骤（1）和步骤（2）之间的富集目标物的步骤，为PCR扩增或滚环扩增。

7.一种制备单细胞cDNA测序文库的方法，包括如下步骤：

（1）获得具有细胞标签的cDNA；来自于同一个细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签；

（2）获得具有分子标签的多个cDNA片段；来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签；

其中，获得具有细胞标签的cDNA的实现方法如下：利用细胞标签载体捕获细胞的mRNA，然后进行反转录，得到具有细胞标签的cDNA；所述细胞标签载体为携带细胞标签的固相载体；

所述细胞标签载体是将多条DNA分子乙连接至固相载体表面得到的；DNA分子乙为部分双链结构，由两条部分互补的单链DNA分子组成；所述DNA分子乙中具有细胞标签和mRNA捕获区；

获得具有分子标签的多个cDNA片段的实现方法如下：利用转座酶复合体和分子标签载体，得到具有分子标签的多个cDNA片段；分子标签载体为携带分子标签的固相载体；

所述分子标签载体是将多条DNA分子甲连接至固相载体表面得到的；DNA分子甲为部分双链结构，由两条部分互补的单链DNA分子组成；所述DNA分子甲中具有分子标签和转座酶复合体捕获区。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：

在步骤（1）和步骤（2）之间包括富集目标物的步骤。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述富集目标物的步骤，为PCR扩增或滚环扩增。

10.一种制备单细胞定量cDNA测序文库的方法，包括如下步骤：

（1）获得具有细胞标签和转录本标签的cDNA；来自于同一细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签；来自于同一细胞的各个cDNA具有不同的转录本标签；

（2）获得具有分子标签的多个cDNA片段；来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签；

获得具有细胞标签和转录本标签的cDNA的实现方法如下：利用细胞标签载体捕获细胞的mRNA，然后进行反转录，得到具有细胞标签和转录本标签的cDNA；所述细胞标签载体为携带细胞标签和转录本标签的固相载体；

获得具有分子标签的多个cDNA片段的实现方法如下：利用转座酶复合体和分子标签载体，得到具有分子标签的多个cDNA片段；分子标签载体为携带分子标签的固相载体；

所述细胞标签载体是将多条DNA分子乙连接至固相载体表面得到的；DNA分子乙为部分双链结构，由两条部分互补的单链DNA分子组成；所述DNA分子乙中具有细胞标签、转录本标签和mRNA捕获区；

所述分子标签载体是将多条DNA分子甲连接至固相载体表面得到的；DNA分子甲为部分双链结构，由两条部分互补的单链DNA分子组成；所述DNA分子甲中具有分子标签和转座酶复合体捕获区。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：

在步骤（1）和步骤（2）之间包括富集目标物的步骤。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：

所述富集目标物的步骤，为PCR扩增或滚环扩增。

13.一种用于制备单细胞cDNA测序文库的试剂盒，包括细胞标签载体和分子标签载体；所述细胞标签载体为携带细胞标签的固相载体，用于获得具有细胞标签的cDNA，来自于同一个细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签；分子标签载体为携带分子标签的固相载体，用于获得具有分子标签的多个cDNA片段，来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签；

所述细胞标签载体是将多条DNA分子乙连接至固相载体表面得到的；DNA分子乙为部分双链结构，由两条部分互补的单链DNA分子组成；所述DNA分子乙中具有细胞标签和mRNA捕获区；

所述分子标签载体是将多条DNA分子甲连接至固相载体表面得到的；DNA分子甲为部分双链结构，由两条部分互补的单链DNA分子组成；所述DNA分子甲中具有分子标签和转座酶复合体捕获区。

14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括转座酶复合体。

15.如权利要求14所述的试剂盒，其特征在于：所述转座酶复合体由转座子和转座酶组成。

16.一种用于制备单细胞定量cDNA测序文库的试剂盒，包括细胞标签载体和分子标签载体；所述细胞标签载体为携带细胞标签和转录本标签的固相载体，用于获得具有细胞标签和转录本标签的cDNA，来自于同一个细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签，来自于同一细胞的各个cDNA具有不同的转录本标签；分子标签载体为携带分子标签的固相载体，用于获得具有分子标签的多个cDNA片段，来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签；

所述细胞标签载体是将多条DNA分子乙连接至固相载体表面得到的；DNA分子乙为部分双链结构，由两条部分互补的单链DNA分子组成；所述DNA分子乙中具有细胞标签、转录本标签和mRNA捕获区；

所述分子标签载体是将多条DNA分子甲连接至固相载体表面得到的；DNA分子甲为部分双链结构，由两条部分互补的单链DNA分子组成；所述DNA分子甲中具有分子标签和转座酶复合体捕获区。

17.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括转座酶复合体。

18.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于：所述转座酶复合体由转座子和转座酶组成。

19.权利要求1或2或3或7或8或9所述方法在高通量获得大量单细胞中每个单细胞的所有mRNA的序列中的应用。

20.权利要求4或5或6或10或11或12所述方法在高通量获得大量单细胞中每个单细胞的所有mRNA的序列并对其进行定量中的应用。

21.权利要求13或14或15所述试剂盒在高通量获得大量单细胞中每个单细胞的所有mRNA的序列中的应用。

22.权利要求16或17或18所述试剂盒在高通量获得大量单细胞中每个单细胞的所有mRNA的序列并对其进行定量中的应用。

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