CN111801415A - 扩增淋巴细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过在一种或多种包含抗原的肽的存在下和/或在呈递抗原的抗原呈递细胞的存在下培养来自受试者的包含淋巴细胞的样品或衍生自该样品的淋巴细胞来扩增抗原特异性淋巴细胞的方法。还公开了这种方法在改善个性化免疫疗法(例如肿瘤免疫疗法)中的用途。

Description

扩增淋巴细胞的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年11月6日提交的美国临时申请序列号62/582,163的优先权，其全部内容通过引用合并于此。

技术领域

本发明涉及通过在包含抗原的一种或多种肽的存在下和/或在抗原呈递细胞呈递抗原的存在下培养来自受试者的包含淋巴细胞的样品或培养源自该样品的淋巴细胞来扩增抗原特异性淋巴细胞的方法。还公开了这种方法在改善个性化免疫疗法中的用途。

背景

免疫原性肿瘤可以受益于不同的免疫治疗干预。其中，自体肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TILs)的过继细胞转移(adoptive cell transfer，ACT)可有效介导肿瘤消退。

最近的技术进步加速了针对非同义的体细胞肿瘤突变产生的所谓肿瘤新抗原的T细胞特异性的鉴定。新抗原是免疫治疗的理想潜在靶标，不仅因为它们具有高度的肿瘤特异性，而且因为胸腺不会反选择高亲和力和/或亲和力的新抗原特异性T细胞^2-4。不仅新抗原被证明是成功的免疫检查点阻断疗法的关键介体^5-7，而且它们也已成功用于ACT^8,9。最后，几个小组提供了由新抗原特异性T细胞介导的肿瘤消退的直接证据。确实，Tran及其同事通过上皮癌中的新抗原反应性CD4+T细胞的ACT首次证明了后者。最近，Sahin和Ott证实了黑色素瘤患者接受个性化新抗原疫苗接种(分别基于mRNA¹¹和肽¹²)与免疫检查点阻断的完全反应^11,12。

当前用于扩增TIL的方案通常涉及两个主要的扩增过程。最初的TIL培养涉及在富含白介素2(IL-2)的培养基中孵育肿瘤样品，以获得最初的大量TIL。然后，在该初始阶段期间获得的TIL通常经历快速扩增方案(rapid amplification protocol，“REP”)。REP过程将TIL的最终数量增加到10⁹-10¹¹的数量级。

尽管常规的TIL扩增已经为癌症患者提供了良好的服务，但是本领域中需要优化TIL培养过程以使新抗原特异性T细胞克隆的回收最大化或富集新抗原特异性TIL。本文公开的发明满足了该需求，并且还适用于肿瘤特异性新抗原以外的其他抗原。

发明概述

在本领域中非常需要改善个性化免疫疗法。本发明通过提供一种通过在一种或多种包含抗原的肽存在的情况下培养来自受试者的样品来富集抗原特异性淋巴细胞的方法,满足了这一和其他需求，其中所述样品包含淋巴细胞或衍生自淋巴细胞的淋巴细胞。

一方面，本发明提供了一种离体富集和扩增新抗原特异性淋巴细胞的方法，该方法包括在一种或多种肽存在下培养得自受试者的样品或衍生自其的淋巴细胞，其中每种所述肽包含不同的抗原。

在本发明的方法中可以使用任何数量的肽。优选地，不同肽的数目应使得对MHC分子的竞争最小化，以避免对某些T细胞克隆型的次佳刺激。在一些实施方案中，该方法涉及在两种或更多种肽的存在下培养，其中每种所述肽包含不同的肿瘤特异性新抗原。在一些实施方案中，该方法包括在1-300种肽存在下培养，其中每种所述肽包含不同的肿瘤特异性新抗原。在一些实施方案中，该方法包括在1-100种肽存在下培养，其中每种所述肽包含不同的肿瘤特异性新抗原。在一些实施方案中，该方法包括在20-50种肽存在下培养，其中每种所述肽包含不同的肿瘤特异性新抗原。

一方面，本文描述了离体扩增抗原特异性淋巴细胞的方法，该方法包括扩增获自受试者的样品中的淋巴细胞或分离自该样品的淋巴细胞，其中扩增包括在扩增过程中添加一种或多种肽，其中每种所述肽包含不同的抗原，并且其中抗原特异性淋巴细胞被扩增。在某些实施方案中，该方法包括添加两种或更多种肽(即不同肽的集合)。在某些实施例中，进行扩增的一个阶段，并且该扩增阶段是前快速扩增方案(pre-rapid expansion protocol，pre-REP)。在某些实施方案中，第一扩增包括在有利于淋巴细胞比样品中可能存在的其他细胞生长的条件下扩增淋巴细胞。在某些实施方案中，所述抗原特异性淋巴细胞优先于非抗原特异性淋巴细胞扩增。

在另一方面，本文描述了用于离体扩增抗原特异性淋巴细胞的方法，其包括:a)扩增从受试者获得的样品中的淋巴细胞或从该样品中分离的淋巴细胞，其中扩增包括至少两个扩增阶段，和b)在所述至少两个扩增阶段的至少一个阶段中添加一种或多种肽，其中每种所述肽包含不同的抗原，并且其中抗原特异性淋巴细胞被扩增。在某些实施方案中，第一扩增包括在比样品中可能存在的其他细胞更有利于淋巴细胞生长的条件下扩增淋巴细胞。在某些实施方案中，所述抗原特异性淋巴细胞优先于非抗原特异性淋巴细胞被扩增。

在某些实施方案中，所述至少两个扩增阶段包括第一扩增和第二扩增。在某些实施方案中，第一扩增刚好在第二扩增之前发生。在某些实施方案中，在第二次扩增期间不存在所述肽。

在某些实施方案中，在第一扩增和第二扩增之间发生一个或多个另外的扩增。在某些实施方案中，第二扩增在CD3复合物激动剂、促细胞分裂剂或饲养细胞中至少一种存在下进行。在某些实施方案中，所述CD3复合物激动剂是抗CD3复合物激动剂抗体(例如OKT-3)。在某些实施方案中，促细胞分裂剂是植物血凝素(PHA)、伴刀豆球蛋白A(Con A)、商陆促细胞分裂剂(PWM)、美泽林(Mzn)或十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)中的至少一种。在某些实施方案中，所述饲养细胞是自体的、同种异体的和/或辐照的。在某些实施方案中，饲养细胞是外周血单核细胞(PBMC)。在某些实施方案中，所述饲养细胞和淋巴细胞以约1000:1至约1:1的比例存在。在其他实施方案中，所述饲养细胞和淋巴细胞以约100:1的比例存在。

在某些实施方案中，步骤b)包括在所述至少两个扩增阶段的至少一个阶段中添加两种或更多种肽，其中每种所述肽包含不同的抗原。在其他实施方案中，步骤b)包括在所述至少两个扩增阶段中的至少一个阶段起始时添加所述肽。在另外的实施方案中，步骤b)还包括重新添加所述肽至少一次。在另一个实施方案中，步骤b)还包括在第一次添加后每天重新添加所述肽。在又一个实施方案中，步骤b)还包括在第一次添加后每隔一天重新添加所述肽。

在本文公开的方法的某些实施方案中，在第一天后至少两天重新添加所述肽。

在本文公开的方法的某些实施方案中，所述肽为可溶形式。在某些实施方案中，所述肽的浓度为约0.1nM至约100μM。在某些实施方案中，所述肽的长度为约9个氨基酸至约31个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽长9或10个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽长12至15个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽长约25至约31个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽以约2至约300种不同肽的汇集物存在。在一些实施方案中，所述肽以约2至约300种不同肽的汇集物存在。在一些实施方案中，所述肽以约2至约100种不同肽、约10至约100种、约20至约100种、约30至约100种、约40至约100种、约50至约100种、约60至约100种、约70至约100种、约80至约100或约90至约100种不同肽的汇集物存在。在某些实施方案中，所述肽以约20至约50种不同肽的汇集物存在。在某些实施方案中，所述肽以约2至约10种不同肽的汇集物存在。在其他实施方案中，所述肽以约2至约5种不同肽的汇集物存在。在某些实施方案中，所述肽以约1μM的浓度存在。

在本文公开的方法的某些实施方案中，在第一次扩增开始时添加所述肽。在一些实施方案中，在第一次延伸开始时以及每隔一天添加所述肽两天。

在本文公开的方法的某些实施方案中，所述肽存在于抗原呈递细胞(APC)的表面上。在某些实施方案中，样品(例如，组织或体液)中存在的细胞与APC的比例为约1:1至约1:100。在某些实施方案中，样品中存在的细胞与APC的比例为约1:1。在其他实施方案中，淋巴细胞与APC的比率为约0.01:1至约100:1，其中淋巴细胞是从样品中分离的。在某些实施方案中，淋巴细胞与APC的比率为约1:1。在某些实施方案中，呈递肽的APC在第一扩增的开始时添加。

在本文公开的方法的某些实施方案中，所述APC已经与可溶形式的所述肽预孵育。在某些实施方案中，所述肽的长度为约9个氨基酸至约31个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽长9或10个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽长12至15个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽长约25至约31个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽以约2至约300种不同肽的汇集物存在。在一些实施方案中，所述肽以约2至约100种不同肽、约10至约100种、约20至约100种、约30至约100种、约40至约100种、约50至约100种、约60至约100种、约70至约100种、约80至约100种或约90至约100种不同肽的汇集物存在。在某些实施方案中，所述肽以约20至约50种不同肽的汇集物存在。在某些实施方案中，所述肽以约2至约10种不同肽的汇集物存在。在其他实施方案中，所述肽以约2至约5种不同肽的汇集物存在。在某些实施方案中，所述肽以约1μM或2μM的浓度存在。

在本文公开的方法的某些实施方案中，所述APC已经被工程化以在其表面上表达所述肽。在某些实施方案中，所述APC通过转染、转导或临时细胞膜破坏中的至少一种被工程化，以将编码所述肽的至少一种多核苷酸引入该APC。在某些实施方案中，所述至少一种多核苷酸是编码所述肽的DNA质粒和/或mRNA。在某些实施方案中，mRNA包含约50至约5000个核苷酸。在另一个实施方案中，mRNA包含约75至约4000个、约75至约3000个、约75至约2000个、约75至约1000个、约75至约500个核苷酸。在某些实施方案中，所述多核苷酸包含编码所述肽的1至约15个基因。在其他实施方案中，所述多核苷酸基本上由编码单个肽的一个基因组成。在一些实施方案中，mRNA是包含串联编码所述肽的至少两个基因的至少一个多核苷酸。在其他实施方案中，mRNA是包含编码所述肽的至少两个串联基因的单个多核苷酸。在某些实施方案中，总共存在约2至约40，约2至约15或约2至约5个编码肽的基因。在某些实施方案中，每个多核苷酸包含5个编码肽的基因。在某些实施方案中，每个基因编码长约9至约31个氨基酸并且以所述抗原内发现的单个突变氨基酸为中心的多肽，其中所述基因任选地被接头分开。

在本文公开的方法的某些实施方案中，APC被工程化以表达至少一种免疫调节剂，其中所述免疫调节剂是下述中的至少一种：OX40L、4-1BBL、CD80、CD86、CD83、CD70、CD40L、GITR-L、CD127L、CD30L(CD153)、LIGHT、BTLA、ICOS-L(CD275)、SLAM(CD150)、CD662L、白介素12(IL-12)、白介素7(IL-7)、白介素15(IL-15)、白介素17(IL-17)、白介素21(IL-21)、白介素4(IL-4)、Bcl-6、Bcl-XL、BCL-2、MCL1或STAT-5，或者是JAK/STAT途径、PI3K-AKT信号传导途径、BCR信号传导途径或BAFF-BAFFR信号传导途径中的至少一种的激活剂。在某些实施方案中，所述免疫调节剂是OX40L、4-1BBL或IL-12中的至少一种。在某些实施方案中，APC被工程化为瞬时或稳定表达所述免疫调节剂。在某些实施方案中，在第一扩增开始时添加所述工程化的APC，并添加至少另外一天。在某些实施方案中，被工程化的APC在第一扩增开始时添加，并且在第一次添加后10天再次添加。

在本文公开的方法的某些实施方案中，所述APC通过转染、转导或临时细胞膜破坏中的至少一种被工程化，以引入所述至少一种免疫调节剂。在某些实施方案中，转染通过电穿孔发生。

在某些实施方案中，已经通过预测建模、全外显子组测序、全基因组测序、RNA测序或质谱法鉴定了所述肽。在某些实施方案中，已经基于鉴定抗原特异性突变而预先选择了所述抗原。在其他实施方案中，已经基于鉴定抗原特异性突变而预先选择了所述抗原。

在本文公开的方法的某些实施方案中，所述淋巴细胞在至少一种扩增促进剂的存在下扩增。在某些实施方案中，所述扩增促进剂是免疫调节剂。在某些实施方案中，所述免疫调节剂是细胞因子，例如但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素15(IL-15)、白介素17(IL-17)或白介素21(IL-21)。在某些实施方案中，所述扩增促进剂是可溶性分子(例如PD-1、CTLA-4、4-1BB、LAG-3、TIM-3、2B4/CD244/SLAMF4、CD160、TIGIT、TCF1、CD39或BATF中的至少一种的拮抗剂)。在其他实施方案中，所述扩增促进剂是有利于淋巴细胞扩增的抗体(例如针对PD-1、CTLA-4、4-1BB、LAG-3、TIM-3、2B4/CD244/SLAMF4、CD160、TIGIT、TCF1、CD39或BATF的抗体)。在某些实施方案中，所述扩增促进剂是IL-2。在某些实施方案中，IL-2在第一扩增期间以约100IU/ml至约10,000IU/ml的范围存在。在某些实施方案中，IL-2在第一扩增期间以约6,000IU/ml的浓度存在。在某些实施方案中，IL-2在第二扩增期间以约50IU/ml至约10,000IU/ml的范围存在。在某些实施方案中，IL-2在第二扩增期间以约3,000IU/ml的浓度存在。

在本文公开的方法的某些实施方案中，所述淋巴细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)和/或外周血淋巴细胞(PBL)。在某些实施方案中，所述淋巴细胞是T细胞(例如，CD8+或CD4+T细胞)。

在某些实施方案中，所述样品是从引流淋巴结获得的。在其他实施方案中，所述样品是未处理的肿瘤片段、经酶处理的肿瘤片段、解离/悬浮的肿瘤细胞、淋巴结样品或体液(例如血液，腹水或淋巴)样品。在某些实施方案中，已用胶原酶、分散酶、透明质酸酶、游离酶或脱氧核糖核酸酶(DNase)中的至少一种处理所述经酶处理的肿瘤片段。

在本文公开的方法的某些实施方式中，所述APC是激活的。在某些实施方案中，所述APC是自体的、同种异体的或人工的。在某些实施方案中，所述APC是B细胞、树突细胞、巨噬细胞或朗格汉斯细胞。在某些实施方案中，所述APC是B细胞(例如，CD19+)。在某些实施方案中，所述B细胞通过与CD40L、IL-21或IL-4中的至少一种孵育被激活。在某些实施方案中，所述B细胞进一步与Bcl-6，Bcl-XL，BCL-2，MCL1，STAT-5中的至少一种或者JAK/STAT途径、PI3K-AKT信号传导途径，BCR信号传导途径或BAFF-BAFFR信号传导途径中的至少一种的激活物一起培养。

在本文公开的方法的某些实施方案中，所述抗原是肿瘤抗原、翻译后修饰、长的非编码抗原或病毒抗原。在某些实施方案中，肿瘤抗原是共享的肿瘤抗原、过表达的肿瘤抗原、异常表达的肿瘤抗原或肿瘤特异性新抗原。在某些实施方案中，肿瘤特异性新抗原是规范性新抗原或非规范性新抗原。在某些实施方案中，肿瘤抗原来自实体瘤(例如卵巢肿瘤、黑素瘤、肺肿瘤、乳腺肿瘤或胃肠道抗原)或液体肿瘤(例如白血病或淋巴瘤)。

在本文公开的方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括在培养后分离抗原特异性淋巴细胞。在某些实施方案中，所述方法进一步包括在培养之前从受试者获得所述样品。在某些实施方案中，该方法进一步包括在所述培养之前从所述样品中分离淋巴细胞。在某些实施方案中，该方法进一步包括在培养之前从所述样品中分离抗原特异性淋巴细胞。

在本文公开的方法的某些实施方案中，在第一扩增期间暴露于所述肽导致淋巴细胞频率的改善。在某些实施方案中，在第一扩增期间暴露于所述肽导致抗原特异性淋巴细胞的频率改善。在某些实施方案中，淋巴细胞和/或抗原特异性淋巴细胞的频率的改善超过了在第一扩增期间淋巴细胞不暴露于肽的方法。

在本文公开的方法的某些实施方案中，与仅在第二扩增中暴露于所述肽的抗原特异性淋巴细胞相比，在第一扩增过程中暴露于所述肽导致抗原特异性淋巴细胞具有更少的消耗。在其他实施方案中，与在第一和第二扩增中暴露于所述肽的抗原特异性淋巴细胞相比，在第一扩增中暴露于所述肽但在第二扩增中不暴露于所述肽导致抗原特异性淋巴细胞具有更少的消耗。在其他实施方案中，与仅在第二扩增中暴露于所述肽的抗原特异性淋巴细胞相比，在第一扩增期间暴露于所述肽但在第二扩增中不暴露于所述肽导致抗原特异性淋巴细胞具有更少的消耗。

在本文公开的方法的某些实施方案中，该方法进一步包括将所述抗原特异性淋巴细胞重新引入受试者中。

在本文公开的方法的某些实施方案中，所述受试者是人。

在另一方面，本发明涉及通过本文公开的方法产生的抗原特异性淋巴细胞群。

在另一方面，本文描述了在有需要的受试者中治疗肿瘤的方法，其包括向受试者施用有效量的通过本文所公开的方法制备的淋巴细胞。在某些实施方案中，肿瘤是实体瘤(例如卵巢肿瘤、黑素瘤、肺肿瘤、胃肠道肿瘤、乳腺肿瘤)。在某些实施方案中，肿瘤是液体肿瘤(例如白血病或淋巴瘤)。在某些实施方案中，肿瘤表达与包含肿瘤抗原的至少一种肽一致的突变。在某些实施方案中，受试者是人。

在下面的描述，权利要求和附图中，本发明的这些和其他方面对于本领域普通技术人员将是显而易见的。

附图的简要说明

图1A-1B示出了由IFN-γELISpot评估的由卵巢肿瘤单细胞悬液产生的TIL的T细胞反应性的代表性实例。下列条件用于TIL产生:单独使用IL-2(常规)，或与抗CTLA4(4mAB)和抗PD1(10μg/ml)抑制剂(图1A)或与突变的肽(私人预测新抗原汇集物，图1B)组合使用。使用了50-100个私人肽(即专门针对该患者预测的)的汇集物。肽长9至10个氨基酸。

图2A-2B显示了常规的(单独IL-2)和初免的(IL-2+私人的预测新抗原的汇集物)TIL的代表性实例，这些肽通过肽-MHC多聚体染色确定是否存在新抗原特异性TIL。首先用几组预测肽对来自卵巢癌患者CTE-0011(图2A)和CTE-0013(图2B)的TIL培养物进行问询，并通过IFNγELISpot评估T细胞反应，如图1所示。在解析和鉴定单个免疫原性肽后，通过多聚体染色进行验证。对于患者CTE-0011，在常规和初免TIL中以不同的频率检测到SEPT9R289H特异性T细胞；对于患者CTE-0013，HHATL75F特异性T细胞仅在引发的TIL中独特地揭示。这些测定是在抗PD1和抗CTLA4抗体存在的情况下用肿瘤片段进行的。使用了50-100种私人肽(即专门针对该患者预测的)的汇集物。肽长9至10个氨基酸。

图3显示了在来自卵巢肿瘤样品的单细胞悬浮液的常规(IL-2单独，x轴)和初免(IL-2+预测新抗原的汇集物，y轴)TIL培养物中检测到的新抗原特异性CD8+T淋巴细胞的频率的累积分析。

图4显示了来自黑色素瘤患者的常规(单独的IL-2)和初免的(IL-2+预计新抗原的汇集物)的代表性实例，研究是否存在新抗原特异性TIL。使用了50-100种私人肽(即专门针对该患者预测的)的汇集物。肽长9至10个氨基酸。

图5显示了来自引流淋巴结的新抗原特异性TIL的扩增。按照本文所述的方法，从引流淋巴结的单细胞悬液中产生患者CTE-0009的“常规”和“初免”TIL，在第14天通过IFNγ-ELISPOT研究每种培养物是否存在针对4种预测的肽之一和针对相应的野生型(wt)肽的新抗原T细胞反应性。仅在初免培养物中才发现了对#3肽具有特异性(而对wt肽没有特异性)的T细胞。使用PMA(50ng/ml)作为阳性对照，PHA的浓度为1μg/ml。

图6A-6B示出了本文所公开的非限制性实施方式的示意图。图6A显示了串联小基因(tandem minigenes，TMG)的原理，每个小基因编码以单个点突变为中心的31聚体。图6B示出了转染的CD40激活的B细胞的产生的细节。图的左侧描绘了基于鉴定的突变的载体设计，随后转化到细菌中以及随后在细菌内扩增。接下来，将DNA线性化并产生聚腺苷酸化的体外转录(IVT)mRNA，然后将其转染(例如，通过电穿孔)到CD40活化的B细胞中。该图的右侧描绘了通过CD19分离富集的CD40活化B细胞的生成，其中多聚CD40配体的刺激在IL-4存在下发生。这些过程产生呈递新抗原的CD40激活的B细胞。这些活化的B细胞可用于i)筛选新抗原特异性TIL(即新抗原TIL反应物)，或ii)通过用转染的CD40活化的B细胞刺激来富集新抗原特异性TIL。

图7显示用于开发用于转染入CD40活化的B细胞内的IVT mRNA的载体模板的一个非限制性实施方案。T7启动子用于引发IVT反应；信号肽(SP)、MHCI运输信号(MITD)和接头序列用于I类和II类25-31聚体的正确加工和呈递。图的右侧描绘了组成每个所代表元件的氨基酸序列的一个非限制性实施方案。在该实施方案中使用的UTR是串联的β-珠蛋白3′核苷酸UTR序列。

图8A-8C检查了使用分离的APC呈递新抗原的新抗原特异性TIL的产生。具体而言，将B细胞用肽(Peptide)脉冲化(即如方法中所讨论的预加载/温育)或用串联小基因(TMG)转染。所有B细胞均被CD40激活。图8A显示了由具有MelanA CD8+抗原的肽预载B细胞(Peptide)或TMG-B细胞产生的抗原刺激水平(MelanA:来自表2的TMG 103)。在图8B中，将来自卵巢癌患者CTE-009的TIL与预加载的B细胞(肽)或TMG-B细胞(TMG)一起培养，并通过ELISpot和CD137阳性进行测定；使用肽和编码CTE-009特异性新抗原的TMG(表2中肽：IPINPRRCL；COPG2：TMG 105)。图8C显示了ELISpot图，该图显示了TMG-B细胞电穿孔后抗原刺激的半衰期:将几批HLA-A2+CD40激活的B细胞静置指定的时间，并与MelanA CD8+克隆共培养(MelanA：来自表2的TMG 103)。这证明了TMG在APC中的表达持续了多长时间。肽：B细胞预先装有编码新抗原的肽。TMG：B细胞用编码新抗原的mRNA电穿孔。PMA(50ng/ml)用作阳性对照。模拟是空的或非编码的mRNA。

图9A-9B使用病毒和肿瘤相关新抗原检查了HLA II类抗原的加工和呈递。B细胞被脉冲(即，预加载/温育；Peptide)或用串联小基因(TMG)转染。图9A示出了与肽脉冲的APC或TMG-APC(表2的TMG103)共培养的富含Flu MP117-31(MHC-1抗原)和Flu MP131mer(MHC-II抗原)的PBMC的代表性实例。研究PBMC中细胞内细胞因子TNFα和IFNγ的表达。图9B显示了与MageA3_111-126肽(肽；RKVAELVHFLLLKYRA)脉冲的B细胞或被表达TMG的MageA3111-126(表2的TMG 103)转染的B细胞共培养的MageA3111-126特异性CD4+克隆的ELISpot测定。ON:过夜。模拟是空的或非编码的mRNA。

图10A-10B示出了本发明的效果及其在pre-REP阶段对TILs扩增的变化。在图10A中，将卵巢癌患者CTE-006的肿瘤酶促消化物与常规条件(常规；6000IU/ml IL-2)一起孵育，或通过添加三种肽(9-10聚体)的汇集物进行引发(Primed)。通过检测新抗原刺激后IFNγ的分泌(Pool Mut，灰色条)来测试TIL的反应性。在图10B中，测试了不同比例和TMG-B细胞的作用。对CD40激活的B细胞进行电穿孔(在此处标明TMG(TMG 106-CDC2031mer同源新抗原))，B细胞与消化的肿瘤细胞的比例不同(如所示，为1:1或1:2)。在所有测试条件下，均使用CD40激活的B细胞。在产生时使用了抗PD1和抗CTLA4抗体，并用抑制剂更新了培养基。通过与编码CDC20 S231C的肽(Pool Mut，灰色条)孵育来筛选TIL的IFNγ产生。对于图10A-10B，在整个TIL培养期间，向培养基中添加10μg/mL抗PD1 mAb(eBiosciences)和10μg/mL抗CTLA-4 mAb(Ipilimumab，Bristol-Myers)。

图11显示了工程化B细胞的分析以及41BBL、OX40L和IL12的检测。左侧是电穿孔后4-1BBL或OX40L表达的流式细胞术分析。用1μgOX40L或41BBL mRNA电穿孔CD40激活的B细胞。右侧是在用0.25μg或1μgIL-12mRNA电穿孔后通过ELISA分析B细胞的IL-12产生。转染后4-8小时进行测定。

图12示出了在来自卵巢癌患者CTE-007的组织和细胞中刺激一轮(第0天)或两轮(第0天和第10天)之后，使用工程化的B细胞富集TIL。通过FACS分析确定CD137+CD4+新抗原反应性TIL的百分比。TIL不与B细胞共孵育(常规)，或与用肽(APC，肽；肽对患者特异，9-25mers)脉冲(即预加载)的B细胞共孵育，用串联小基因(TMG-APC；TMG 105(SGOL1相关新抗原))转染，或经工程化以表达串联小基因和免疫刺激分子OX40-L、IL12和4-1BBL(工程化TMG-APC)。在指示时(第10天)进行了重新刺激。用新抗原(Pool Mut)进行孵育以筛选TILs活性。在整个TIL培养期间，向培养基中添加10μg/mL抗PD1mAb(eBiosciences)和10μg/mL抗CTLA-4 mAb(Ipilimumab，Bristol-Myers)。

图13显示了在B细胞存在下TIL的倍数扩增。数据显示了采用常规方法和在pre-REP阶段期间存在B细胞的情况下总体TIL总数的增加倍数。从卵巢癌患者CTE-005(正方形)、CTE-006(圆圈)和CTE-010(菱形)中分离肿瘤样品。数据代表pre-REP的不同条件的累积扩增。

图14显示了具有代表性但非限制性的实施方案的本发明结果的概述。图14(第一行)：通过比较常规TIL和引发的TIL(50种肽的汇集物，9聚体和10聚体)，在黑色素瘤患者Mel0011(肿瘤片段)的细胞中观察到TIL富集。图14(第二行)：当将常规方法与表达串联小基因、并且免疫刺激分子在第0天添加一次(工程化的TMG-APC)或添加两次(即第0天和第10天)(工程化的TMG-APC，重新刺激)(TMG 108)。图14(第3和第4行)的B细胞进行比较时，在结肠直肠癌CrCp5(肿瘤片段)中也观察到TIL的富集。类似地，当使用本发明的方法(常规，引发，APC，肽(用肽脉冲的B细胞)，TMG转染的B细胞(TMG-APC)以及用TMG和免疫调节剂(Engineered TMG-APC)转染的B细胞，并在指定处重新刺激)时，来自患者的解离的卵巢肿瘤显示TIL显着富集。对于来自患者CTE-006的TIL(第三行)，使用了三种肽和TMG 106的汇集物；对于来自患者CTE-007的TIL(第四行)，使用了一种31-mer同源肽和TMG 105。常规:仅用IL-2产生的TIL；引发的：IL-2与新抗原肽的；APC，肽：将肿瘤片段或消化物与肽脉冲B细胞共培养；TMG-APC：肿瘤片段或消化物与串联小基因B细胞共培养；工程化的TMG-APC：B细胞被工程化进行免疫刺激表达和串联微基因表达；重新刺激：在第10天再次孵育APC(工程化的TMG-APC和/或TMG-APC)。对于第3行和第4行，在TIL培养的整个过程中在培养基中补充10μg/mL抗PD1 mAb(eBiosciences)和10μg/mL抗CTLA-4mAb(伊匹木单抗，Bristol-Myers)。

图15显示了在常规(x轴)和富集(y轴)TIL(PHLPP2，CDC20，SGOL1(即，使用B细胞的不同实施方案))中检测到的新抗原特异性CD8+T细胞的频率的累积分析。NBEA(正方形)显示了比较常规TIL和引发的TIL的数据。对于CDC20和SGOL1，在整个TIL培养期间向培养基中添加10μg/mL抗PD1 mAb(eBiosciences)和10μg/mL抗CTLA-4 mAb(Ipilimumab，Bristol-Myers)。

图16A-16G示出了本发明的非限制性实施例。图16A(新抗原):将包含新抗原的肽(例如，通过比较肿瘤样品和对照样品进行鉴定)与肿瘤片段、消化物或与得自受试者的肿瘤样品中的多个细胞在IL-2存在下一起孵育获得第一抗原特异性TIL群体。接下来，使所述第一TIL群体(pre-REP)迅速扩增。图16B(用串联小基因(TMG)转染的APC):合成编码新抗原的TMG(通过比较来自肿瘤和对照组织的外显子组和RNA而鉴定)，并转染到APC中，用于由I类和/或II类MHC呈递。然后在IL-2存在下，将这些APC与来自受试者的肿瘤片段、消化物或来自肿瘤的多个细胞共培养以获得第一TIL群体，其将在快速扩增方案中进一步扩增。图16C(预装载了新抗原的APC):用含新抗原的肽(通过比较肿瘤样品和对照样品进行鉴定)脉冲化APC。然后在IL2存在下，将这些APC与来自受试者的肿瘤片段，消化物或来自肿瘤的多个细胞共培养。随后使产生的TIL群体(pre-REP)经历迅速扩增。图16D(工程化的APC也被TMG转染):APC被工程化以诱导免疫刺激蛋白的表达，并通过转染编码新抗原的mRNA而被诱导在I类和/或II类MHC情形下呈递新抗原。将现在呈现新抗原的工程化APC与肿瘤片段、消化物或来自肿瘤样品的多个细胞在IL2存在下一起孵育，以产生pre-REP TIL群体。这些pre-REP TIL通过快速扩增被进一步放大。图16E(预先加载了新抗原的工程化APC):APC被工程化以诱导免疫刺激蛋白的表达，并通过事先暴露于新抗原而被诱导在I类和/或II类MHC情况下呈递新抗原。将现在呈现新抗原的工程化APC与肿瘤片段、消化物或来自肿瘤样品中的多个细胞在IL2存在下一起孵育，以产生pre-REP TIL群体。这些pre-REP TIL通过快速扩增被进一步放大。图16F(APC与新抗原一起):将含新抗原的肽(例如，通过肿瘤和对照组织和/或细胞的外显子组和RNA比较而鉴定)与APC和肿瘤片段、消化物或得自受试者的肿瘤样品的多个细胞在IL-2存在下一起孵育从，以诱导pre-REP TILs的扩增。然后对这些pre-REP TIL进行快速扩增。图16G(工程化的APC与新抗原一起):将APC工程化用于表达免疫调节剂，并在存在IL-2和组成新抗原的肽的情况下与来自受试者的肿瘤的肿瘤片段、消化物或多种细胞共培养以诱导pre-REP TILs的扩增。然后对这些pre-REP TIL进行快速扩增。

图17提供了用于本文所述方法的串联小基因的非限制性实例。具体地，此实例为TMG 103。

图18提供了用于本文所述方法的串联小基因的非限制性实例。具体地，此实例是TMG 106。

图19提供了用于本文所述方法的串联小基因的非限制性实例。具体地，此实例为TMG 105。

图20提供了用于本文所述方法的串联小基因的非限制性实例。具体地，此实例为TMG 108。

图21提供了用于本文公开的方法中的编码hIL-12的载体的非限制性实例。

图22提供了用于本文公开的方法中的编码hOX40L的载体的非限制性实例。

图23提供了用于本文公开的方法中的编码h4-1BBL的载体的非限制性实例。

发明详述

本发明提供了扩增抗原特异性淋巴细胞的方法，其特别地通过在含有一种或多种包含抗原的肽的存在下和/或在呈递所述抗原的抗原呈递细胞的存在下培养来自受试者的包含淋巴细胞的样品或培养从其衍生的淋巴细胞来进行。本文公开的方法产生能够选择性地靶向和攻击表面上具有所述抗原的细胞的淋巴细胞。

一方面，本发明提供了扩增肿瘤抗原特异性淋巴细胞的方法，其特别地通过在包含肿瘤抗原的一种或多种肽存在下和/或在呈递肿瘤抗原的抗原呈递细胞存在下培养肿瘤样品或衍生自其的淋巴细胞来进行。本文公开的方法产生能够选择性地靶向和治疗肿瘤细胞的淋巴细胞。

这些方法具有许多优点。例如，本发明提供了对抗原(例如，肿瘤抗原)、包括对患者独特的那些抗原(例如，新抗原)具有抗原特异性的淋巴细胞。所述淋巴细胞可以根据其抗原特异性进行扩增，以提供淋巴细胞群体用于过继细胞治疗，例如但不限于治疗和/或预防患者的癌症。例如，当使用新抗原时，这些方法是有利的，因为所述方法可以起到扩增靶向肿瘤细胞破坏的淋巴细胞的作用，同时减少或消除正常的非肿瘤细胞的破坏。通过以这种方式改进个性化药物，治疗可以对患者更有效且毒性更低。

这些方法还提供了改善抗原特异性淋巴细胞的频率的令人惊奇的优点。该优点源于在扩增的初始阶段(例如，pre-REP阶段)中添加所述肽抗原(通过可溶性肽和/或APC呈递)。这种抗原特异性淋巴细胞的频率提高是这些方法带来的一个关键特征。与其中肽抗原(通过可溶性肽和/或APC呈递)仅在快速扩增阶段呈递的方法相比，这些方法还为抗原特异性淋巴细胞提供了较少的消耗。

定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

如本文所用，术语“抗原”是可以与抗体特异性结合或产生被T细胞受体识别的肽片段和/或诱导免疫应答的分子和/或物质。抗原可以包含一个或多个“表位”。在某些实施方案中，抗原具有几个表位。在MHC分子的情况下，表位被抗体或淋巴细胞识别。

如本文所用，术语“肿瘤抗原”广义地定义为由肿瘤或癌细胞特异性表达或与肿瘤相关的抗原或新抗原，例如过表达或异常表达的抗原，由致癌病毒产生的抗原，胎粪抗原，改变的细胞表面糖脂和糖蛋白抗原，细胞类型特异性分化抗原。癌细胞表面上存在的肿瘤抗原是个体的正常体细胞表面上不存在的抗原，即该抗原在癌细胞中暴露于免疫系统，但在正常体细胞中不暴露于免疫系统。抗原可以在肿瘤细胞的细胞表面表达，在该表面被体液免疫系统的成分例如B淋巴细胞(B细胞)识别。细胞内肿瘤抗原被加工成较短的肽片段，与主要组织相容性复合物(MHC)分子形成复合物，并呈现在癌细胞的细胞表面上，在那里它们被T淋巴细胞(T细胞)的T细胞受体(TCR)识别或自然杀伤细胞。优选地，肿瘤抗原是一种不由正常细胞表达或至少不以与肿瘤细胞中相同水平表达的抗原。

如本文所用，术语“新抗原”是指新形成的抗原决定簇，其源自体细胞突变并且被识别为“非自身”。新抗原可包括多肽序列或核苷酸序列。突变可包括移码或非移码插入/缺失，错义或无义取代，剪接位点改变(例如，选择性剪接的转录物)，基因组重排或基因融合，或引起neoORF的任何基因组或表达改变。突变也可以包括剪接变体。特异于肿瘤细胞的翻译后修饰可包括异常磷酸化。特异于肿瘤细胞的翻译后修饰还可以包括蛋白酶体产生的剪接抗原(参见例如Liepe等人，HLA I类配体的大部分是蛋白酶体产生的剪接肽；Science.2016 Oct 21；354(6310):354-358，在此全文引入作为参考。新抗原可以包括经典抗原。新抗原也可以包括非经典抗原。新抗原可以是肿瘤特异性的。

如本文所用，术语“编码区”是编码蛋白质的基因的部分。

如本文所用，术语“编码突变”是在编码区域中发生的突变。

如本文所用，术语“ORF”是指开放阅读框。

如本文所用，术语“NEO-ORF”是由突变或其他异常(例如剪接)引起的肿瘤特异性ORF。

如本文所用，术语“错义突变”是引起从一个氨基酸取代为另一氨基酸的突变。

如本文所用，术语“无义突变”是引起从氨基酸到终止密码子的取代的突变。

如本文所用，术语“移码突变”是引起蛋白质的构架改变的突变。

如本文所用，术语“插入/缺失”(indel)是一种或多种核酸的插入或缺失。

如本文所用，“非经典抗原”是缺乏经典特征的新抗原。非经典抗原的非限制性实例是缺乏经典锚定基序的肽，短肽，3-5-聚体，长肽(最多18聚体)，使用新的MHC口袋的肽，替代的锚定氨基酸，GalNAc残基锚点。非经典抗原可以包括非同义的体细胞突变、另外剪接的转录本、转录的5'URT、外显子-内含子连接、内含子区域、非经典阅读框、反义转录本、插入缺失、易位、短和新的开放阅读框(ORF)、逆转录病毒转座因子和lncRNA。关于非经典抗原的其他公开内容可以在下述文章中找到：Ronsin，C.et al.A non-AUG-definedalternative open reading frame of the intestinal carboxyl esterase mRNAgenerates an epitope recognized by renal cell carcinoma-reactive tumor-infiltrating lymphocytes in situ.Journal of immunology 163，483-490(1999)；Mayrand，S.M.，Schwarz，D.A.&Green，W.R.An alternative translational readingframe encodes an immunodominant retroviral CTL determinant expressed by animmunodeficiency-causing retrovirus.Journal of immunology 160，39-50(1998)；VanDen Eynde，B.J.et al.A new antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on ahuman kidney tumor results from reverse strand transcription.The Journal ofexperimental medicine190，1793-1800(1999)；Coulie，P.G.et al.A mutated intronsequence codes for an antigenic peptide recognized by cytolytic T lymphocyteson a human melanoma.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 92，7976-7980(1995)；Laumont，C.M.et al.Globalproteogenomic analysis of human MHC class I-associated peptides derived fromnon-canonical reading frames.Nature communications 7，10238，doi:10.1038/ncomms10238(2016)；Robbins，P.F.et al.The intronic region of an incompletelyspliced gp100 gene transcript encodes an epitope recognized by melanoma-reactive tumor-infiltratinglymphocytes.Journal of immunology 159，303-308(1997)；Lupetti，R.et al.Translation of a retained intron in tyrosinase-relatedprotein(TRP)2mRNA generates a new cytotoxic T lymphocyte(CTL)-defined andshared human melanoma antigen not expressed in normal cells of themelanocytic lineage.The Journal of experimental medicine 188，1005-1016(1998)；Wang，R.F.，Parkhurst，M.R.，Kawakami，Y.，Robbins，P.F.&Rosenberg，S.A.Utilizationof an alternative open reading frame of a normal gene in generating a novelhuman cancer antigen.The Journal of experimental medicine183，1131-1140(1996)；Wang，R.F.et al.A breast and melanoma-shared tumor antigen:T cell responses toantigenic peptides translated from different open reading frames.Journal ofimmunology 161，3598-3606(1998)；Nakayama，M.Antigen presentation by MHC-dressedcells.Frontiers in Immunology 5，672(2015)；and Apostolopoulos，V.Lazoura，E.Noncanonical peptides in complex with MHC class I.Expert Review Vaccines 3(2)，151-162(2004)，出于所有预期目的将它们的全部内容并入本文。

术语“第一扩增”、“前快速扩增方案”或“pre-REP”在本文中可互换使用，并且是指其中淋巴细胞(例如，源自受试者的样品，例如但不限于血液样本、组织、肿瘤碎片或酶消化的组织、解离/悬浮的肿瘤细胞、淋巴结样本或体液样本)首先在初始扩增阶段在补充有确保连续淋巴细胞的分裂和生存的化合物的培养基中扩增一段时间。在某些实施方案中，在pre-REP阶段使用的化合物可以是但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素-7(IL-7)、白介素-15(IL-15)、白介素17(IL-17)、白介素21(IL-21)或其任何组合。在某些实施方案中，在pre-REP阶段使用的化合物可以是IL-2。在某些实施方案中，pre-REP操作在比肿瘤和其他非淋巴细胞更有利于淋巴细胞的生长和/或扩增的条件下进行。在某些实施方案中，pre-REP操作进行约3至约45天，约5至约40天或约11至约35天。

术语“第二扩增”、“快速扩增方案”或“REP”在本文中可互换使用，并且是指在pre-REP操作之后发生的过程，其中淋巴细胞(例如，源自受试者的样品，例如(但不限于)将血液样品，组织，肿瘤片段或酶消化的组织或肿瘤细胞悬液)的数目扩大至少约3倍，至少约5倍，至少约10倍，至少约15倍，至少约20倍，至少约25倍，至少约30倍，至少约35倍，至少约40倍，至少约45倍，至少约50倍，至少约55倍，至少约60倍，至少约65倍，至少约70倍，至少约75倍，至少约80倍，至少约85倍，至少约90倍，至少约95倍或至少约100倍。“REP”可以涉及通过CD3复合物激活pre-REP淋巴细胞(例如，使用抗CD3 mAb)和/或通过从受试者或正常健康供体中获得的饲养细胞(例如，外周血单核细胞(“PBMC”)饲养细胞)进行活化。在某些实施方案中，对饲养细胞进行辐射(例如5,000cGy)。在某些实施方案中，pre-REP淋巴细胞与经照射的饲养细胞(例如，PMBC)以200:1的比例存在。在某些实施方案中，添加IL-2、IL-4、IL-7、IL-15、IL-17、IL-21或其组合，以驱动活化的淋巴细胞中的快速细胞分裂。在某些实施方案中，添加IL-2以驱动活化的淋巴细胞中的快速细胞分裂。在某些实施方案中，然后将淋巴细胞再扩增12天，并根据需要用具有IL-2的1:1培养基稀释。对于快速扩增和其他方法的例子，参见美国专利8,287,857，出于所有目的将其全部内容并入本文。

如本文所用，术语“抗体”是指多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和抗体片段(例如、单链抗体、Fab片段、Fv片段、单链Fv片段(scFv)、二价抗体片段(如(Fab)2'-片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、内抗体(intrabodies)、小抗体、双抗体、三抗体、十抗体(decabodies)和其他结构域抗体(例如Holt，LJ等，TrendsBiotechnol(2003)，21，11，484-490))。术语“抗体”也指例如美国专利申请公开号2007/0004909中公开的共价双抗体，以及例如美国专利申请公开号2009/0060910中公开的Ig-DARTS。可用于本文所述方法的抗体包括任何类型(例如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)、类别(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。

对状态、病症或病状的“治疗”包括:(1)在可能患有或易患状态、病症或病状，但尚未经历或显示该状态、病症或病状的临床或亚临床症状的受试者中预防、延迟或减少该状态、病症或病状的至少一种临床或亚临床症状出现的发生率和/或可能性；(2)抑制所述状态、病症或病状，即阻止、减少或延缓疾病或其复发或其至少一种临床或亚临床症状至少一种的发展；或(3)减轻疾病，即引起所述状态、病症或病状或者其临床或亚临床症状中至少一种的消退。对要治疗的受试者的益处在统计学上是显着的，或者至少对于患者或医师是可察觉的。

应用于剂量或量的术语“有效”是指化合物或药物组合物在施用于有此需要的受试者时足以导致所需活性的量。注意，当施用活性成分的组合时，该组合的有效量可以包括或可以不包括在单独施用时将会有效的每种成分的量。所需的确切量将因受试者而异，这取决于受试者的种类、年龄和一般状况，所治疗疾病的严重程度，所使用的具体药物，给药方式等。

与本文所述的组合物结合使用的短语“药学上可接受的”是指这样的组合物的分子实体和其他成分，其在生理上可耐受并且当施用于哺乳动物(例如人)时通常不产生不良反应。优选地，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他普遍认可的药典中列出的用于哺乳动物、尤其是人的药典。

术语“患者”、“个体”、“受试者”和“动物”在本文中可互换使用，是指哺乳动物，包括但不限于人和兽类动物(例如猫，狗，牛，马，绵羊，猪)等)和实验动物模型。在一个优选的实施方案中，所述受试者是人。

术语“载体”是指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这样的药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。优选将水或水溶液，盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液用作载体，特别是对于可注射溶液。或者，载体可以是固体剂型载体，包括但不限于粘合剂(用于压制药丸)、助流剂、包囊剂、调味剂和着色剂中的一种或多种。合适的药物载体在E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中有所描述。

除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”、“所述”包括复数形式。因此，例如，提及“一种方法”包括一个或多个本文所述类型的方法和/或步骤，和/或对于本领域技术人员而言在阅读本公开后将变得显而易见的一个或多个方法和/或步骤。

术语“约”、“大约”或“近似”包括在数值的有统计意义的范围内。该范围可以在给定值或范围的一个数量级内，优选在50％以内，更优选在20％以内，还更优选在10％以内，甚至更优选在5％以内。术语“大约”或“大致”所涵盖的容许变化取决于所研究的特定系统，并且本领域普通技术人员可以容易地理解。

本文说明性地描述的技术可以在不存在本文未具体公开的任何要素的情况下适当地实施。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包括”、“包含”、“基本上由...组成”和“由...组成”中的任何一个都可以用另外几个术语中的任一个代替。在编码肽的基因的上下文中，“基本上由...组成”是指该基因可以进一步包括另外的核苷酸或区域，例如那些不修饰编码的肽但允许该肽被表达的核苷酸或区域(例如，启动子、增强子、连接子)。

除非另有说明，否则本发明的实施采用统计分析、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术，它们在本领域技术范围内。这样的工具和技术详细描述于例如Sambrook等(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor，New York；Ausubel等编(2005)Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley and Sons，Inc.:Hoboken，NJ；Bonifacino等编(2005)Current Protocols in Cell Biology.John Wileyand Sons，Inc.:Hoboken，NJ；Coligan等编(2005)Current Protocols in Immunology，John Wiley and Sons，Inc.:Hoboken，NJ；Coico等编(2005)Current Protocols inMicrobiology，John Wiley and Sons，Inc.:Hoboken，NJ；Coligan等编(2005)CurrentProtocols in Protein Science，John Wiley and Sons，Inc.:Hoboken，NJ；以及Enna等编(2005)Current Protocols in Pharmacology，John Wiley and Sons，Inc.:Hoboken，NJ。

扩增抗原特异性淋巴细胞的方法

一方面，本文描述了离体扩增抗原特异性淋巴细胞的方法，该方法包括扩增获自受试者的样品中的淋巴细胞或分离自该样品的淋巴细胞，其中扩增包括在扩增过程中添加一种或多种肽，其中每种所述肽包含不同的抗原，并且其中抗原特异性淋巴细胞被扩增。在某些实施方案中，该方法包括添加两种或更多种肽(即不同肽的汇集物)。在某些实施例中，如果仅进行一个阶段的扩增，则扩增的阶段是前快速扩增方案(pre-REP)。在某些实施方案中，所述抗原特异性淋巴细胞优先于扩增过程中存在的其他淋巴细胞而扩增。在某些实施方案中，该优先扩增导致抗原特异性淋巴细胞的富集。

一方面，本文描述了离体扩增抗原特异性淋巴细胞的方法，该方法包括:a)扩增从受试者获得的样品中的淋巴细胞或从该样品中分离的淋巴细胞，其中扩增包括至少两个扩增阶段，和b)在所述至少两个扩增阶段的至少一个阶段中添加一种或多种肽，其中每种所述肽包含不同的抗原，并且其中抗原特异性淋巴细胞被扩增。在某些实施方案中，该方法包括添加两种或更多种肽(即肽的汇集物)。在某些实施方案中，所述抗原特异性淋巴细胞优先于扩增过程中存在的其他淋巴细胞而扩增。在某些实施方案中，该优先扩增导致抗原特异性淋巴细胞的富集。

淋巴细胞的生产通常通过两步过程进行:1)pre-REP阶段，在此阶段中，细胞在标准实验室培养基(如RPMI)中生长，并用试剂处理淋巴细胞，以使其生长并保持淋巴细胞的活力；和2)REP阶段，在此阶段中，淋巴细胞以足够大的培养量扩增以治疗受试者。在某些实施方案中，本文公开的用于不同生产阶段的化合物可以在各个阶段期间包括在培养基中。

在某些实施方案中，本文公开的方法的所述至少两个扩增阶段包括第一扩增(即，pre-REP)和第二扩增(即，REP)。在某些实施方案中，第一和/或第二扩增阶段重复不止一次。在某些实施方案中，添加额外的扩增阶段以允许更多的有效治疗性抗原特异性淋巴细胞(例如更少的消耗)。

在某些实施方案中，第一扩增是指其中淋巴细胞(例如，来自含淋巴细胞的受试者的样品，例如但不限于组织，骨髓，胸腺，肿瘤片段或酶消化的组织、解离/悬浮的细胞，淋巴结样品或体液样品(例如血液，腹水，淋巴液)首先在补充有确保在扩增阶段持续淋巴细胞分裂和存活的化合物的培养基中扩增一段时间。当以这种方式进行时，第一扩增是前快速扩增方案(pre-REP)，可以进行本文所公开的方法的pre-REP阶段的条件对于本领域技术人员而言是众所周知的。

在某些实施方案中，第一扩增(例如pre-REP)阶段包括在至少一种扩增促进剂的存在下扩增淋巴细胞。在某些实施方案中，在第一扩增(例如pre-REP)期间用于促进淋巴细胞生长的细胞因子可以是但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素11(IL-11)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、白介素17(IL-17)、白介素21(IL-21)或其任何组合。在某些实施方案中，在第一扩增(例如pre-REP)期间使用的化合物是细胞因子IL-2。

在某些实施方案中，在第一扩增(例如pre-REP)阶段中使用的化合物可以是以约100IU/ml至约10,000IU/ml的浓度存在的细胞因子。在某些实施方案中，所述细胞因子可以约200IU/ml至约9,500IU/ml、约400IU/ml至约9,000IU/ml、约600IU/ml至约8,500IU/ml、约800IU/ml至约8,000IU/ml、约1,000IU/ml至约7,500IU/ml、约2,000IU/ml至约7,000IU/ml、约3,000IU/ml至约6,750IU/ml、约4,000IU/ml至约6,500IU/ml、约5,000IU/ml至约6,250IU/ml或约5,500IU/ml至约6,000IU/ml存在于细胞培养基中。在某些实施方案中，所述细胞因子可以以约1,000IU/ml至约10,000IU/ml，约2,000IU/ml至约9,000IU/ml，约3,000IU/ml至约8,000IU/ml、约4,000IU/ml至约7,000IU/ml，或约5,000IU/ml至约6,000IU/ml的量存在于细胞培养基中。在某些实施方案中，在第一扩增(例如pre-REP)阶段期间使用的细胞因子以约6,000IU/ml存在于细胞培养基中。在某些实施方案中，细胞因子可以是但不限于IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或其任何组合。在某些实施方案中，细胞因子是IL-2。在某些实施方案中，在第一扩增(例如pre-REP)阶段存在的细胞因子是IL-2，其浓度为约6,000IU/ml。

在第一扩增(例如pre-REP)阶段可能存在的其他化合物包括但不限于小分子(例如有机小分子)、核酸、多肽或片段、同工型、变体、类似物或其抗PD-1、CTLA-4、4-1BB、LAG-3、TIM-3、2B4/CD244/SLAMF4、CD160、TIGIT、TCF1、CD39或BATF的拮抗剂。在某些实施方案中，拮抗剂可以是多肽。在某些实施方案中，拮抗剂可以是抗体或其片段。在某些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中，所述另外的化合物可以是检查点阻断调节剂。

在某些实施方案中，第一扩增(例如pre-REP)过程在比样品和其他非淋巴细胞更有利于淋巴细胞的生长和/或扩增的条件下进行。

在某些实施方案中，第一扩增(例如pre-REP)过程发生在持续约3至约45天、约5至约40天或约11至约35天的时间段内。

在某些实施方案中，第一扩增(例如pre-REP)包括，与不添加所述肽而扩增淋巴细胞相比，在导致抗原特异性淋巴细胞数目增加约1.5倍至约1000倍的条件下(例如在一至两周期间)扩增淋巴细胞。在某些实施方案中，第一扩增(例如pre-REP)包括在与不添加所述肽而扩增淋巴细胞相比，在一周的时间内扩增淋巴细胞的数量增加不少于约1.5倍的条件下扩增淋巴细胞。

在某些实施方案中，第一扩增(例如pre-REP)包括在与不添加所述肽而扩增淋巴细胞相比，在一周的时间内扩增淋巴细胞的数量增加不少于约2倍的条件下扩增淋巴细胞。在某些实施方案中，第一扩增(例如pre-REP)包括在与不添加所述肽而扩增淋巴细胞相比，在一周的时间内扩增淋巴细胞的数量增加约1.5倍到约2倍的条件下扩增淋巴细胞。在某些实施方案中，第一扩增(例如pre-REP)包括在与不添加所述肽而扩增淋巴细胞相比，在一周的时间内扩增淋巴细胞的数量增加大于1.5倍的条件下扩增淋巴细胞。在某些实施方案中，第一扩增(例如pre-REP)包括抗原特异性T细胞的频率富集多达1,000倍(参见例如图15)。在某些实施方案中，在两周内实现了上述的频率富集多达1,000倍。通过比较用常规方法获得的抗原特异性淋巴细胞的频率和在扩增的第一阶段暴露于肽抗原的频率来确定富集倍数。在某些实施方案中，与在pre-REP阶段不存在所述肽的方法相比，第一扩增导致抗原特异性淋巴细胞有约1.5、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900或约1000倍的富集。

可以对本文公开的方法进行第二扩增(例如，REP)阶段的条件是本领域技术人员众所周知的。

在某些实施方案中，第二扩增是指其中在补充有化合物的培养基中在一段时间内首先扩增淋巴细胞(例如，由pre-REP阶段后取自淋巴细胞群的样品衍生的)的过程，所述化合物能够确保在扩增阶段快速进行淋巴细胞分裂。当以这种方式进行时，第二扩增是快速扩增方案(REP)。在某些实施方案中，REP阶段需要cGMP级试剂和30-40L培养基。可以进行本文公开的方法的REP阶段的条件是本领域技术人员众所周知的。

在某些实施方案中，第二扩增(例如，REP)在CD3复合物激动剂，促细胞分裂剂和/或饲养细胞的存在下进行。

在某些实施方案中，CD3复合物激动剂可以是但不限于化合物、小分子(例如、有机小分子)、核酸、多肽或其片段、同工型、变体、类似物或衍生物。在某些实施方案中，CD3复合物激动剂是多肽。在某些实施方案中，CD3复合物激动剂是抗体或其片段。在某些实施方案中，CD3复合物激动剂是单克隆抗体。在某些实施方案中，CD3复合物激动剂OKT-3(例如30ng/ml)。在某些实施方案中，将CD3复合物激动剂与抗CD28抗体组合添加。

在某些实施方案中，促细胞分裂剂包括但不限于植物血凝素(PHA)、伴刀豆球蛋白A(Con A)、商陆有丝分裂原(PWM)、美泽林(Mzn)和十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)。

饲养细胞包括能够支持淋巴细胞或其后代的扩增的细胞。饲养细胞提供的支持物可以表征为接触依赖性的和非接触依赖性的。饲养细胞可在细胞表面上分泌或表达支持祖细胞扩增的因子。饲养细胞的一个例子是外周血单核细胞(PBMC)。其他非限制性实例包括脾细胞，淋巴结细胞和树突细胞。饲养细胞也可以是通常不用作饲养细胞的细胞，例如成纤维细胞，其已被工程化成在其细胞表面上分泌或表达支持T细胞祖细胞扩增所必需的因子。饲养细胞相对于淋巴细胞和/或受试者可以是自体的、同种异体的、同基因的、人工的或异种的。

通过组织培养领域中的标准程序使饲养细胞成为非有丝分裂的。这样的方法的例子是用γ射线源照射饲养细胞或用丝裂霉素C孵育饲养细胞足够的时间以使细胞有丝分裂失活。

在某些实施方案中，在第二扩增(例如，REP)期间用于促进淋巴细胞生长的细胞因子可以是但不限于IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17和IL-21，或其组合。在某些实施方案中，REP期间使用的化合物是IL-2。

快速扩增的一个非限制性实例包括在存在OKT-3抗体以及IL2(3,000IU/ml)和同种异体饲养细胞(例如来自三个不同供体)(比例为100:1)的情况下扩增细胞池(例如1x10⁶个pre-REP淋巴细胞)。

在某些实施方案中，第二扩增(例如，REP)期间使用的细胞因子可以以约50IU/ml至约10,000IU/ml存在于细胞培养基中(至少在最初加入细胞时)。在某些实施方案中，所述化合物可以以约100IU/ml至约9,000IU/ml、约200IU/ml至约8,000IU/ml、约400IU/ml至约7,000IU/ml、约600IU/ml至约6,000IU/ml、约800IU/ml至约5,000IU/ml、约1,000IU/ml至约4,000IU/ml或约2,000IU/ml至约3,000IU/ml的量存在于细胞培养基中。在某些实施方案中，化合物可以以约500IU/ml至约6,000IU/ml、约1,000IU/ml至约5,000IU/ml或约2,000IU/ml至约4,000IU/ml的量存在于细胞培养基中。在某些实施方案中，在第二扩增(例如，REP)期间使用的细胞因子以约3,000IU/ml存在于细胞培养基中。在某些实施方案中，细胞因子可以是但不限于IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或其任何组合。在某些实施方案中，细胞因子是IL-2。在某些实施方案中，在第二扩增(例如，REP)期间存在的细胞因子是浓度约3,000IU/ml的IL-2。

在第二扩增(例如REP)阶段可能存在的其他化合物包括但不限于小分子(例如有机小分子)、核酸、多肽或其片段、同工型、变体、类似物或衍生物或其抗PD-1、CTLA-4、4-1BB、LAG-3、TIM-3、2B4/CD244/SLAMF4、CD160、TIGIT、TCF1、CD39或BATF的拮抗剂。在某些实施方案中，拮抗剂可以是多肽。在某些实施方案中，拮抗剂可以是抗体或其片段。在某些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中，所述其他化合物可以是检查点抑制剂。

在某些实施方案中，第二扩增(例如，REP)过程在比样品和其他非淋巴细胞更有利于淋巴细胞的生长和/或扩增的条件下进行。

在某些实施方案中，第二扩增(例如，REP)过程在持续约5至约42天之间的时间段中发生。在某些实施方案中，第二扩增进行约7至约35天，约10至约28天或约14至约21天之间。在某些实施方案中，第二扩增进行约10天。在某些实施方案中，第二扩增进行约11天。在某些实施方案中，第二扩增进行约14天。

可用于T细胞扩增的试剂可包括白介素，例如IL-2，IL-7，IL-15或IL-21(参见例如Cornish等人2006，Blood.108(2):600-8；Bazdar和Sieg，2007，Journal of Virology，2007，81(22):12670-12674；和Battalia等人，2013，Immunology，139(1):109-120)。可用于T细胞扩增的试剂的其他说明性实例是与CD8、CD45或CD90结合的试剂，例如αCD8、αCD45或αCD90抗体。T细胞群的示例性例子，包括抗原特异性T细胞，T辅助细胞，细胞毒性T细胞，记忆T细胞(记忆T细胞的例子是CD62L|CD8|特异性中央记忆T细胞)或调节性T细胞(Treg的例子是CD4+CD25+CD45RA+Treg细胞。可用于扩增T淋巴细胞的其他试剂包括例如在下述美国专利中描述的方法:6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514和6,867,041，其每一个均通过引用整体并入本文。

可以用于天然杀伤细胞的扩增的试剂可以包括与CD16或CD56结合的试剂，例如αCD16或αCD56抗体。在某些实施方案中，结合剂包括抗体(参见例如Hoshino等人，Blood.1991Dec.15；78(12):3232-40)。可以用于NK细胞扩增的其他试剂可以是IL-15(参见例如Vitale等，2002.The Anatomical Record.266:87-92)。

在某些实施方案中，第二扩增包括在与未添加所述肽而扩增淋巴细胞相比，在一周的时间内导致抗原特异性淋巴细胞数目增加约1.5倍至至少约100倍的条件下扩增淋巴细胞。在某些实施方案中，第二扩增包括在与未添加所述肽而扩增淋巴细胞相比，在一周的时间内导致抗原特异性淋巴细胞数目增加约3倍至至少约100倍的条件下扩增所述淋巴细胞。

本文公开的方法可以包括添加一种或多种肽。在某些实施方案中，所述方法包括添加肽的汇集物(即，两种或更多种不同的肽)。在某些实施方案中，该方法仅添加包含抗原的单种肽。在某些实施方案中，该方法包括添加约2至约300种不同的肽。在某些实施方案中，所述方法包括添加约2至约100，约20至约100，约50至约100，约2至约10或2至约5种不同的肽。在某些实施方案中，该方法包括添加约5种不同的肽。

在某些实施方式中，该方法包括添加至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少11个12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、至少55种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种、至少100种、至少110种、至少120种、至少130种、至少140种、至少150种、至少160种、至少170种、至少180种、至少190种、至少200种、至少210种、至少220种、至少230种、至少240种、至少250种、至少260种、至少270种、至少280种、至少290种或至少300种不同的肽。在某些实施方式中，所述方法添加至少约2种至约100种、约2种至约50种、约2种至约40种、约2种至约30种、约2种至约20种、约2种至约15种、约2种至约10种、约2种至约9种、约2种至约8种、约2种至约7种、约2种至约6种、约2种至约5种、约2种至约4或约2种至约3种不同的肽。在某些实施方案中种、所述方法添加约20种至约300种、约20种至约200种、约20种至约100种、约20种至约90种、约20种至约80种、约20种至约70种、约20种至约60种、约20种至约50种、约20种至约40或约20种至约30种不同的肽。在某些实施方案中种、所述方法添加约10种至约100种、约20种至约100种、约30种至约100种、约40种至约100种、约50种至约100种、约60种至约100种、约70种至约100种、约80种至约100种或约90种至约100种不同的肽。

在某些实施方案中，该方法包括在至少两个扩增阶段的至少一个阶段中添加，其中如果存在一种以上类型的肽，则每种所述肽包含不同的抗原。在某些实施方案中，仅在第一扩增(例如pre-REP)期间添加所述肽。在某些实施方案中，仅在第二扩增(例如REP)期间添加所述肽。在某些实施方案中，在第一扩增(例如pre-REP)和第二扩增(例如REP)两者期间都添加所述肽。

在某些实施方案中，该方法包括在所述至少两个扩增阶段中的至少一个阶段开始时添加所述肽。在某些实施方案中，在第一次扩增(例如pre-REP)开始时添加所述肽。在某些实施方案中，在第二扩增(例如，REP)起始时添加所述肽。在某些实施方案中，仅在第一扩增(例如pre-REP)起始时添加所述肽。在某些实施方案中，在第一扩增(例如pre-REP)和第二扩增(例如REP)起始时都添加所述肽。

在某些实施方案中，该方法包括重新添加所述肽至少一次。在某些实施方案中，仅在第一扩增(例如pre-REP)期间重新添加所述肽。在某些实施方案中，仅在第二扩增(例如，REP)期间重新添加所述肽。在某些实施方案中，仅在第一扩增(例如pre-REP)和第二扩增(例如REP)期间重新添加所述肽。

在某些实施方案中，该方法包括在第一次添加后每天在各自的扩增阶段中重新添加所述肽。在某些实施方案中，可以在第一次添加后每天在各自的扩增阶段中重新添加所述肽至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6个天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天或至少50天。在某些实施方案中，可以在第一次添加后每天在相应的扩增阶段中重新添加所述肽约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8。天、大约9天、大约10天、大约11天、大约12天、大约13天、大约14天、大约15天、大约16天、大约17天、大约18天、大约19天、大约20天、大约21天、大约22天、大约23天、大约24天、大约25天、约26天、约27天、约28天、约29天、约30天、约35天、约40天、约45天或约50天。在某些实施方案中，在第一次添加之后在各自的扩增阶段中重新添加所述肽至少一次。在某些实施方案中，第一次添加后在各自的扩增阶段中重新添加所述肽一次。在某些实施方案中，第一次添加后在各自的扩增阶段中重新添加所述肽至少两天。在某些实施方案中，在第一次添加之后在各自的扩增阶段中重新添加所述肽两天。

在某些实施方案中，该方法包括在第一次添加后每隔一天在各自的扩增阶段中重新添加所述肽。在某些实施方案中，可以在第一次添加后每隔一天在相应的扩增阶段中重新添加所述肽至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次、至少11次、至少12次、至少13次、至少14次、至少15次、至少16次、至少17次、至少18次、至少19次、至少20次、至少21次、至少22次、至少23次、至少24次、至少25次、至少26次、至少27次、至少28次、至少29次、至少30次、至少35次、至少40次、至少45次或至少50次。在某些实施方案中，可以在第一次添加后每隔一天在各自的扩增阶段中重新添加所述肽约1次、约2次、约3次、约4次、约5次、约6次、约7次、约8次、约9次、约10次、约11次、约12次、约13次、约14次、约15次、约16次、约17次、约18次、约19次、约20次、约21次、约22次、约23次、约24次、约25次、约26次、约27次、约28次、约29次、约30次、约35次、约40次、约45或约50次。在某些实施方案中，在各自的扩增阶段中在第一次添加之后重新添加所述肽至少一次。在某些实施方案中，在各自的扩增阶段中在第一次添加之后重新添加所述肽一次。在某些实施方案中，在各自的扩增阶段中在第一次添加后重新添加所述肽至少两次。在某些实施方案中，在各自的扩增阶段中在第一次添加后重新添加所述肽两次。

在某些实施方案中，该方法包括在第一次添加后每第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十天在各自的扩增阶段中重新添加所述肽。在某些实施方案中，可以在第一次添加后每第三、第四、第五、第六或第七天在各自的扩增阶段内添加所述肽至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次、至少11次、至少12次、至少13次、至少14次、至少15次、至少16次、至少17次、至少18次、至少19次、至少20次、至少21次、至少22次、至少23次、至少24次、至少25次、至少26次、至少27次、至少28次、至少29次、至少30次、至少35次、至少40次、至少45次或至少50次。在某些实施方案中，在第一次添加后每第三、第四、第五、第六或第七天添加所述肽约1次、约2次、约3次、约4次、约5次、约6次、约7次、约8。约9次、约10次、约11次、约12次、约13次、约14次、约15次、约16次、约17次、约18次、约19次、约20次、约21次、约22次、约23次、约24次、约25次、约26次、约27次、约28次、约29次、约30次、约35次、约40次、约45次或约50次。在某些实施方案中，在各自的扩增阶段中在第一次添加之后重新添加所述肽至少一次。在某些实施方案中，在各自的扩增阶段中在第一次添加之后重新添加所述肽一次。在某些实施方案中，在各自的扩增阶段中第一次添加后重新添加所述肽至少两次。在某些实施方案中，在各自的扩增阶段中第一次添加后重新添加所述肽两次。

在某些实施方案中，可以仅在扩增阶段的第一天添加所述肽。在某些实施方案中，在扩增阶段的第一天和第三天添加所述肽。在某些实施方案中，在扩增的第一天、第三天和第五天添加所述肽。在某些实施方案中，在扩增的第一天和第十天添加所述肽。

可以以可溶形式添加所述肽或将所述肽呈递在抗原呈递细胞(APC)的表面上，该抗原呈递细胞经工程化以在其表面呈递所述肽。在某些实施方案中，所述肽可以以可溶形式添加并且呈递在APC的表面上。在某些实施方案中，对APC进行处理，使得它们在与淋巴细胞一起添加/共培养之前在其表面上呈递所述肽。在某些实施方案中，在与淋巴细胞一起添加/共培养之前，以可溶形式将肽与未经预处理以将肽呈递在其表面上的APC一起添加。在某些实施方案中，在与淋巴细胞一起添加/共培养之前，以可溶的形式将所述肽与经过预处理以在其表面上呈递所述肽的APC和未经过预处理以呈递所述肽的APC一起添加。

如果以可溶形式添加，则所述肽可以以每种肽约0.1nM至约100μM的浓度添加。在某些实施方案中，可溶性肽可以以每种肽约1nM至约90μM、约10nM至约80μM、约50nM至约70μM、约100nM至约60μM、约150nM至约50μM、约200nM至约40μM、约250nM至约30μM、约300nM至约20μM、约350nM至约10μM、约400nM至约9μM、约450nM至约8μM、约500nM至约7μM、约550nM至约6μM、约600nM至约5μM、约650nM至约4μM、约700nM至约3μM、约750nM至约2.5μM、约800nM至约2μM、约900nM至约1.5μM、或约950nM至约1.25μM的浓度添加。在某些实施方案中，可溶性肽可以以每种肽约100nM至约100μM、约250nM至约75μM、约500nM至约50μM、约750nM至约25μM、约900nM至约10μM或约990nM至约5μM的浓度添加。

在某些实施方案中，可溶性肽可以以每种肽至少约0.1nM、约1nM、约5nM、约10nM、约20nM、约30nM、约40nM、约50nM、约60nM、约70nM、约80nM、约90nM、约100nM、约110nM、约120nM、约130nM、约140nM、约150nM、约160nM、约170nM、约180nM、约190nM、约200nM、约210nM、约220nM、约230nM、约240nM、约250nM、约260nM、约270nM、约280nM、约290nM、约300nM约310nM、约320nM、约330nM、约340nM、约350nM、约360nM、约370nM、约380nM、约390nM、约400nM、约410nM、约420nM、约430nM、约440nM、约450nM、约460nM、约470nM、约480nM、约490nM、约500nM、约510nM、约520nM、约530nM、约540nM、约550nM约560nM、约570nM、约580nM、约590nM、约600nM、约610nM、约620nM、约630nM、约640nM、约650nM、约660nM、约670nM、约680nM、约690nM、约700nM、约710nM、约720nM、约730nM、约740nM、约750nM、约760nM、约770nM、约780nM、约790nM、约800nM、约810nM、约820nM、约830nM、约840nM、约850nM、约860nM、约870nM、约880nM约890nM、约900nM、约910nM、约920nM、约930nM、约940nM、约950nM、约960nM、约970nM、约980nM、约990nM、约1μM、约2μM、约3μM、约4μM、约5μM、约6μM、约7μM、约8μM、约9μM、约10μM、约20μM、约30μM、约40μM、约50μM、约60μM、约70μM、约80μM、约90μM或约100μM的浓度添加。

在某些实施方案中，可溶性肽可以以每种肽约0.1nM、约1nM、约5nM、约10nM、约20nM、约30nM、约40nM、约50nM、约60nM、约70nM、约80nM、约90nM、约100nM、约110nM、约120nM、约130nM、约140nM、约150nM、约160nM、约170nM、约180nM、约190nM、约200nM、约210nM、约220nM、约230nM、约240nM、约250nM、约260nM、约270nM、约280nM、约290nM、约300nM、约310nM、约320nM、约330nM、约340nM、约350nM、约360nM、约370nM、约380nM、约390nM、约400nM、约410nM、约420nM、约430nM、约440nM、约450nM、约460nM、约470nM、约480nM、约490nM、约500nM、约510nM、约520nM、约530nM、约540nM、约550nM、约560nM、约570nM、约580nM、约590nM、约600nM、约610nM、约620nM、约630nM、约640nM、约650nM、约660nM、约670nM、约680nM、约690nM、约700nM、约710nM、约720nM、约730nM、约740nM、约750nM、约760nM、约770nM、约780nM、约790nM、约800nM、约810nM、约820nM、约830nM、约840nM、约850nM、约860nM、约870nM、约880nM、约890nM、约900nM、约910nM、约920nM、约930nM、约940nM、约950nM、约960nM、约970nM、约980nM、约990nM、约1μM、约2μM、约3μM、约4μM、约5μM、约6μM、约7μM、约8μM、约9μM、约10μM、约20μM、约30μM、约40μM、约50μM、约60μM、约70μM、约80μM、约90μM或约100μM的浓度添加。在某些实施方案中，可溶性肽可以以每种肽约1μM的浓度添加。

如果淋巴细胞通过APC呈递而暴露于所述肽，则样品(例如肿瘤样品)中的细胞与呈递肽的APC之比为约1:1至约1:100。在某些实施方案中，样品中的细胞与呈递肽的APC的比例为约1:1至约1:90，约1:1至约1:80，约1:1至约1:70，约1:1至约1:60，约1:1至约1:50，约1:1至约1:40，约1:1至约1:30，约1:1至约1:20，约1:1至约1:10，约1:1至约1:9，约1:1至约1:8，约1:1至约1:7，约1:1至约1:6，约1:1至约1:5，约1:1至约1:4，约1:1至约1:3，或大约1:1到大约1:2。在某些实施方案中，样品中的细胞与呈递肽的APC的比例为约1:2至约1:90，约1:3至约1:80，约1:4至约1:70，约1:5至约1:60，约1:6至约1:50，约1:7至约1:40，约1:8至约1:30，或约1:9至约1:20。

在某些实施方案中，样品中的细胞与呈递肽的APC的比率为至少约1:2，约1:3，约1:4，约1:5，约1:6，约1:7，约1:8，或约1:9，或约1:10，或约1:12，或约1:14，或约1:16，或约1:18，或约1:20，或约1:25，或约1:30，或约1:35，或约1:40，或约1:45，或约1:50，或约1:55，或约1:60，或约1:65，或约1:70，或约1:75，或约1:80，或约1:85，或约1:90，或约1:100。

在某些实施方案中，样品中的细胞与呈递肽的APC的比例为约1:2，约1:3，约1:4，约1:5，约1:6，约1:7，约1:8，或约1:9，或约1:10，或约1:12，或约1:14，或约1:16，或约1:18，或约1:20，或约1:25，或约1:30，或约1:35，或约1:40，或约1:45，或约1:50，或约1:55，或约1:60，或约1:65，或约1:70，或约1:75，或约1:80，或约1:85，或约1:90，或约1:100。

如果淋巴细胞暴露于通过APC呈递的所述肽，则样品中的淋巴细胞与呈递肽的APC之比为约0.01:1至约100:1。在某些实施方案中，样品中的淋巴细胞与呈递肽的APC的比率为约0.025:1至约90:1，约0.05:1至约80:1，约0.075:1至约70:1，约0.1:1至约60:1，约0.125:1至约50:1，约0.15:1至约40:1，约0.175:1至约30:1，约0.2:1至约20:1，约0.3:1至约10:1，约0.4:1至约9:1，约0.5:1至约8:1，约0.6:1，约7:1，约0.7:1，约6:1，约0.7:1至约5:1，约0.8:1至约4:1，约0.9:1至约3:1。在某些实施方案中，所述淋巴细胞是从所述样品中分离的。

在某些实施方案中，样品中的淋巴细胞与呈递肽的APC的比率为至少约0.01:1，约0.02:1，约0.04:1，约0.06:1，约0.08:1，约0.09:1，约0.1:1，约0.2:1，约0.3:1，约0.4:1，约0.5:1，约0.6:1，约0.7:1，约0.8:1，约0.9:1，约1:1，约2:1，约3:1，约4:1，约5:1，约6:1，约7:1，约8:1，约9:1，约10:1，约15:1，约20:1，约25:1，约30:1，约35:1，约40:1，约45:1，约50:1，约55:1，约60:1，约65:1，约70:1，约75:1，约80:1，约90:1，约100:1。在某些实施方案中，所述淋巴细胞是从所述样品中分离的。

在某些实施方案中，样品中的淋巴细胞与呈递肽的APC的比率为约0.01:1，约0.02:1，约0.04:1，约0.06:1，约0.08:1，约0.09:1，约0.1:1，约0.2:1，约0.3:1，约0.4:1，约0.5:1，约0.6:1，约0.7:1，约0.8:1，约0.9:1，约1:1，约2:1，约3:1，约4:1，约5:1，约6:1，约7:1，约8:1，约9:1，约10:1，约15:1，约20:1，约25:1，约30:1，约35:1，约40:1，约45:1，约50:1，约55:1，约60:1，约65:1，约70:1，约75:1，约80:1，约90:1，约100:1。在某些实施方案中，所述淋巴细胞是从所述样品中分离的。

在某些实施方案中，与仅在第二扩增(例如REP)中暴露于所述肽的抗原特异性淋巴细胞相比，在第一扩增(例如pre-REP)中暴露于所述肽导致抗原特异性淋巴细胞更少的消耗。

在某些实施方案中，与在第一(例如pre-REP)和第二扩增(例如REP)中暴露于所述肽的抗原特异性淋巴细胞相比，在第一扩增(例如pre-REP)期间暴露于所述肽而在第二扩增期间不暴露于所述肽导致具有更少消耗的抗原特异性淋巴细胞。

在某些实施方案中，与仅在第二扩增中暴露于所述肽的抗原特异性淋巴细胞相比，在第一扩增(例如pre-REP)期间暴露于所述肽而在第二扩增(例如REP)期间不暴露于所述肽导致具有更少消耗的抗原特异性淋巴细胞。

在本文公开的方法的某些实施方案中，在第一扩增期间暴露于所述肽导致淋巴细胞频率的改善。在某些实施方案中，在第一扩增期间暴露于所述肽导致抗原特异性淋巴细胞频率的改善。在某些实施方案中，淋巴细胞和/或抗原特异性淋巴细胞频率的改善超过了在第一扩增过程中淋巴细胞不暴露于肽的方法。

在某些实施方案中，在与所述肽和/或APC呈递肽共培养之前，不选择和/或分离所述抗原特异性淋巴细胞。在某些实施方案中，在与所述肽和/或APC呈递肽共培养之后，不选择和/或分离所述抗原特异性淋巴细胞。在某些实施方案中，本文公开的方法不用于鉴定培养物中或组织样品内的抗原特异性淋巴细胞。在某些实施方案中，APC的呈递肽不用于鉴定抗原特异性淋巴细胞。在某些实施方案中，本文公开的方法不用于确定淋巴细胞是否识别某种抗原或表位。

肽类

一方面，本文描述了离体扩增抗原特异性淋巴细胞的方法，该方法包括扩增获自受试者的样品中的淋巴细胞或分离自该样品的淋巴细胞，其中扩增包括在扩增过程中添加一种或多种肽，其中每种所述肽包含不同的抗原，并且其中抗原特异性淋巴细胞被扩增。在某些实施方案中，该方法包括添加两种或更多种肽(即，不同肽的汇集物)。在某些实施方案中，所述肽以可溶形式添加。在某些实施方案中，所述肽在抗原呈递细胞(APC)的表面上呈递。在某些实施方案中，将APC与可溶性肽一起温育，这导致APC在其表面上呈现肽(例如，直接结合至其表面上的MHC或通过被APC加工)。在某些实施方案中，将APC工程化成表达所述肽(例如，通过翻译或转导)。在某些实施方案中，所添加的肽与在APC表面上呈递的肽(例如，经工程化以表达所述肽，与该肽预孵育，或两者皆有)均是可溶性肽。在某些实施方案中，将可溶性肽与在与淋巴细胞共培养之前尚未被诱导而在其表面上呈递肽的APC一起添加。

一方面，本文描述了离体扩增抗原特异性淋巴细胞的方法，该方法包括:a)扩增从受试者获得的样品中的淋巴细胞或从该样品中分离的淋巴细胞，其中扩增包括至少两个扩增阶段，和b)在所述至少两个扩增阶段的至少一个阶段中添加一种或多种肽，其中每种所述肽包含不同的抗原，并且其中抗原特异性淋巴细胞被扩增。在某些实施方案中，该方法包括添加两种或更多种肽(即，肽汇集物)。在某些实施方案中，以可溶形式添加所述肽。在某些实施方案中，所述肽被呈递于抗原呈递细胞(APC)的表面上。在某些实施方案中，将APC与一种或多种可溶性肽一起温育，这导致APC在其表面上呈现肽(例如，直接结合至其表面上的MHC或通过被APC加工)。在某些实施方案中，将APC工程化成表达所述肽(例如，通过翻译或转导)。在某些实施方案中，所添加的肽与在APC表面上呈递的肽(例如，经工程化以表达所述肽，与所述肽预孵育，或二者)均是可溶性肽。在某些实施方案中，将可溶性肽与在与淋巴细胞共培养之前尚未被诱导在其表面上呈递肽的APC一起添加。

可用于本文所述方法的肽可包含能够以某种方式与主要组织相容性复合物(MHC)结合的任何肽，使得呈递该肽的MHC可结合至淋巴细胞上的受体，优选以特异性的方式结合。在某些实施方案中，这种结合诱导T细胞应答。在某些实施方案中，这种结合诱导自然杀伤细胞应答。

实例包括通过水解产生的肽，最通常是合成产生的肽，包括专门设计的肽和其中一些肽中至少一些氨基酸位置保守且其余位置是随机的肽。

I类MHC通常呈递由在细胞的细胞质中活跃合成的蛋白质衍生的肽。相比之下，II类MHC通常呈递要么自进入细胞内吞途径的外源蛋白衍生的肽，要么自在ER中合成的蛋白衍生的肽。细胞内运输允许肽与MHC蛋白发生结合。

在某些实施方案中，所述肽是使得多肽以抗原内的单个突变氨基酸为中心的形式。

本发明的肽的长度可以包含少于100个氨基酸，少于50个氨基酸，少于40个氨基酸，少于30个氨基酸，少于20个氨基酸或少于15个氨基酸。在某些实施方案中，肽可以由至少5个氨基酸组成，例如至少10个氨基酸，至少15个氨基酸，至少20个氨基酸，至少25个氨基酸，至少30个氨基酸或至少35个氨基酸。在某些实施方案中，该肽为约5至约60个氨基酸残基，约6至约55个氨基酸残基，约7至约50个氨基酸残基，约8至约45个氨基酸残基，约9至约40个氨基酸残基，约10至约35个，约12至约30个，包括长度在5至40个氨基酸之间的任何大小的肽，以整数递增(即5、6、7、8、9...100)。

在某些实施方案中，本发明的肽可包含约9至约31个氨基酸残基，约9至约30个氨基酸残基，约9至约29个氨基酸残基，约9至约28个氨基酸残基，约9至约27个氨基酸残基，约9至约26个氨基酸残基，约9至约25个氨基酸残基，约9至约24个氨基酸残基，约9至约23个氨基酸残基，约9至约22个氨基酸残基，约9至约21个氨基酸残基，约9至约20个氨基酸残基，约9至约19个氨基酸残基，约9至约18个氨基酸残基，约9至约17个氨基酸残基，约9至约16个氨基酸残基，约9至约15个氨基酸残基，约9至约14个氨基酸残基，约9至约13个氨基酸残基，约9至约12个氨基酸残基，约9至约11个氨基酸残基，或约9至约10个氨基酸残基。

在某些实施方案中，本发明的肽可包含约9至约31个氨基酸残基，约10至约30个氨基酸残基，约10至约29个氨基酸残基，约10至约28个氨基酸残基，约10至约27个氨基酸残基，约10至约26个氨基酸残基，约10至约25个氨基酸残基，约10至约24个氨基酸残基，约10至约23个氨基酸残基，约10至约22个氨基酸残基，约10至约21个氨基酸残基，约10至约20个氨基酸残基，约10至约19个氨基酸残基，约10至约18个氨基酸残基，约10至约17个氨基酸残基，约10至约16个氨基酸残基，约10至约15个氨基酸残基，约10至约14个氨基酸残基，约10至约13个氨基酸残基，约10至约12个氨基酸残基或约10至约11个氨基酸残基。

在某些实施方案中，本发明的肽可包含约9至约31个氨基酸残基，约12至约30个氨基酸残基，约12至约29个氨基酸残基，约12至约28个氨基酸残基，约12至约27个氨基酸残基，约12至约26个氨基酸残基，约12至约25个氨基酸残基，约12至约24个氨基酸残基，约12至约23个氨基酸残基，约12至约22个氨基酸残基，约12至约21个氨基酸残基，约12至约20个氨基酸残基，约12至约19个氨基酸残基，约12至约18个氨基酸残基，约12至约17个氨基酸残基，约12至约16个氨基酸残基，约12至约15个氨基酸残基，约12至约14个氨基酸残基或约12至约13个氨基酸残基。

在某些实施方案中，本发明的肽可包含约9至约31个氨基酸残基，约15至约30个氨基酸残基，约15至约29个氨基酸残基，约15至约28个氨基酸残基，约15至约27个氨基酸残基，约15至约26个氨基酸残基，约15至约25个氨基酸残基，约15至约24个氨基酸残基，约15至约23个氨基酸残基，约15至约22个氨基酸残基，约15至约21个氨基酸残基，约15至约20个氨基酸残基，约15至约19个氨基酸残基，约15至约18个氨基酸残基，约15至约17个氨基酸残基或约15至约16个氨基酸残基。

在某些实施方案中，本发明的肽可包含约9至约31个氨基酸残基，约25至约30个氨基酸残基，约25至约29个氨基酸残基，约25至约28个氨基酸残基，约25至约27个氨基酸残基，或约25至约26个氨基酸残基。

尽管天然结合II类MHC的肽在约9-40个氨基酸之间变化，但是通常该肽可被截短至约9-11个氨基酸的核心而不会丧失MHC结合活性或淋巴细胞识别。在某些实施方案中，所述肽长约9至约10个氨基酸，长约12至约15个氨基酸，或约25至约31个氨基酸长。

在某些实施方案中，将APC工程化以表达所述肽。在某些实施方案中，通过转染、转导或暂时性细胞膜破坏(即细胞挤压)中的至少一种来工程化APC，以将至少一种编码所述肽的多核苷酸引入APC。因此，将表达所述肽的多核苷酸引入APC。在某些实施方案中，所述多核苷酸是DNA质粒。在某些实施方案中，所述多核苷酸是mRNA分子。引入编码肽的基因的方法在下面更详细地讨论。在某些实施方案中，通过病毒转染/转导方法引入所述肽。在某些实施方案中，每个基因编码长约9至约31个氨基酸并且以抗原内发现的单个突变氨基酸为中心的多肽。

在某些实施方案中，所述多核苷酸包含编码分开的肽的约1至约100个基因。在某些实施方案中，所述多核苷酸包含编码分开的肽的约2至约90、约3至约80、约4至约70、约5至约60、约6至约50、约7至约40、约8至约30、约9至约20个或约10至约15个基因。在某些实施方案中，所述多核苷酸包含编码分开的肽的约1至约50、约1至约40、约1至约30、约1至约20、约1至约15、约1至约10、约1至约5、2至约50、约2至约40、约2至约30、约2至约20、约2至约15、约2至约10、约2至约5、5至约50、约5至约40、约5至约30、约5至约20、约5至约15、约5至约10、约5至约5、约10至约50、约10至约40、约10至约30、约10至约20、或约10至约15个基因。在某些实施方案中，所述多核苷酸包含编码单独的肽的约1至约15、约1至约5、约2至约40、约2至约15或约2至约5个基因。

在某些实施方案中，所述多核苷酸包含编码单独的肽的至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约22、约24、约26、约28、约30、约32、约34、约36、约38、约40、约42、约44、约46、约48或约50个基因。

在某些实施方案中，所述多核苷酸包含编码单独的肽的约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约22、约24、约26、约28、约30、约32、约34、约36、约38、约40、约42、约44、约46、约48或约50个基因。在某些实施方案中，所述多核苷酸包含编码分开的肽的1、2、3、4、5、10或15个基因。在某些实施方案中，所述多核苷酸包含编码分开的肽的5个基因。在某些实施方案中，所述多核苷酸基本上由编码分开的肽的1、2、3、4、5、10或15个基因组成。在某些实施方案中，所述多核苷酸基本上由编码分开的肽的5个基因组成。在某些实施方案中，所述多核苷酸基本上由编码本发明的肽的一个基因组成。

在某些实施方案中，该方法可以包括将多核苷酸作为串联小基因(tandemminigene，TMG)构建体引入APC，其中每个小基因包含不同的基因，每个基因包括抗原(例如，编码突变的氨基酸序列的肿瘤特异性突变))。TMG是由可变数量的小基因组成的DNA序列，每个小基因编码一个25-31聚体，以一个突变的氨基酸为中心(图6A)。可以将TMG克隆到合适的表达载体中，将其用作模板以产生体外转录(IVT)mRNA。然后可以将该mRNA引入APC(例如，通过已知的mRNA转染手段，包括电穿孔)。在某些实施方案中，小基因被接头分开。TMG可以通过本领域技术人员众所周知的任何方法制备。表2以及图7和17-20提供了可用于本发明方法的TMG的非限制性实例。

每个小基因可以编码通过本发明的方法鉴定的一个突变，该突变在突变的每一侧侧接来自被鉴定基因编码的内源蛋白质的任何合适数量的连续氨基酸。构建体中小基因的数目不受限制，并且可以包括例如约2个，约3个，约4个，约5个，约10个，约11个，约12个，约13个，约14个，约15个，约20个，约25个，或更多，或上述对多核苷酸中基因数目定义的范围。在某些实施方案中，TMC包含约5个小基因。在某些实施方案中，小基因被接头分开(图7提供了可用于小基因的接头的非限制性实例)。APC表达由TMG构建体编码的突变氨基酸序列，并在细胞膜上展示与MHC分子结合的抗原氨基酸序列。在一个实施方案中，该方法可包括制备一个以上的TMG构建体，每个构建体编码由不同基因编码的一组不同的抗原氨基酸序列，并将每个TMG构建体引入相同或不同的APC群体。在这方面，可以获得多个APC群体，每个群体表达和展示由不同TMG构建体编码的突变的氨基酸序列。

肽包括包含选自下述的蛋白质的至少一部分例如抗原决定簇的肽:与肿瘤相关的蛋白质，自身免疫性疾病，感染因子的蛋白质和毒性蛋白质(例如β-淀粉样蛋白)。

癌症因其具有躲避免疫系统、就好像它是正常组织一样、同时仍然能够对人体造成严重破坏的能力而广为人知。然而，最近，科学家已经确定肿瘤内的体细胞或客体突变会产生新的抗原或新抗原。这些新抗原可以被适应性免疫系统识别为“非自身”，并充当免疫系统如何将癌症与正常细胞区分开。DNA序列的单个碱基对变化，导致编码蛋白的单个氨基酸差异，足以警告免疫系统某些问题，并使它对肿瘤产生反应。由于肿瘤细胞极易发生多种突变，这些突变可能会改变细胞肽的氨基酸序列，从而将其从一种自身蛋白转变为一种携带新抗原的蛋白。这些新抗原是癌细胞所特有的，相比之下，为癌症免疫治疗而探索的其他抗原也可能在正常细胞中表达，从而使患者的健康组织容易受到免疫反应。因此，新抗原可以成为个性化免疫疗法的强大候选者。

在某些情况下，该方法可包括在患者的肿瘤细胞中鉴定一种或多种基因，每个基因包含编码突变氨基酸序列的肿瘤特异性突变(即，包含新抗原)。肿瘤细胞可以得自来自受试者的任何样品，该样品包含或预期包含肿瘤细胞。样品可以是从受试者体内获取的任何样品，例如组织(例如，原发性肿瘤或肿瘤转移瘤)或体液(例如，血液，腹水或淋巴液)。癌细胞的核酸可以是DNA或RNA。

肿瘤特异性新抗原源自编码非沉默突变的任何基因中的突变，该突变存在于受试者的肿瘤细胞中，但不存在于受试者的正常体细胞中。新抗原可以在肿瘤细胞的细胞表面表达，在那里它可以被体液免疫系统的成分例如B淋巴细胞(B细胞)识别。细胞内肿瘤抗原被加工成较短的肽片段，其与主要组织相容性复合物(MHC)分子形成复合物，并呈递在癌细胞的细胞表面上，在那里它们被T淋巴细胞(T细胞)的T细胞受体(TCR)识别。

在某些实施方案中，所使用的肽是私人肽。私人肽是在患者中针对特定肿瘤独特表达的新抗原。因此，私人肽是一种不能用于另一位患者的肽。当两个或两个以上的个体共有新抗原时，它就是一种共享肽。

可以从中鉴定出肿瘤抗原(包括新抗原)的肿瘤相关蛋白的非限制性例子包括例如13HCG、43-9F、5T4、791Tgp72、亲脂素、AIM-2、ALDH1A1、α-辅肌动蛋白-4、甲胎蛋白(“AFP”)、ARTC1、B-RAF、BAGE-1、BCA225、BCLX(L)、BCR-ABL融合蛋白b3a2、β-连环蛋白、BING-4、脑糖原磷酸化酶、BTAA、c-met、CA-125、CA-15-3(CA 27.29\BCAA)、CA-19-9、CA-242、CA-50、CA-72-4、CALCA、CAM 17.1、CAM43、癌胚抗原(“CEA”)、CASP-5、CASP-8、CD274、CD45、CD68\KP1、Cdc27、CDK12、CDK4、CDKN2A、CEA、CLPP、CO-029、COA-1、CPSF、CSNK1A1、CT-7、CT9/BRDT、CTAG1、CTAG2、CTp11、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白-A1、dek-can融合蛋白、DKK1、E2A-PRL、EBNA、EF2、EFTUD2、延伸因子2、ENAH(hMena)、Ep-CAM、EpCAM、EphA3、上皮肿瘤抗原(“ETA”)、EB病毒抗原、ETV6-AML1融合蛋白、EZH2、FGF5、FLT3-ITD、FN1、G250、G250/MN/CAIX、Ga733(EpCAM)、GAGE-1,2,8、GAGE-3,4,5,6,7、GAS7、磷脂酰基醇蛋白聚糖-3(glypican-3)、GnTV、gp100、gp100/Pme117、GPNMB、H-ras、H4-RET、HAUS3、Hepsin、HER-2/neu、HERV-K-MEL、HLA-A11、HLA-A2、HLA-DOB、HOM-MD-21、HOM-MD-397、Hom/Me1-40、Hom/Me1-55、HPV E2、HPV E6、HPV E7、hsp70-2、HTgp-175、IDO1、IGF2B3、IGH-IGK、IL13Rα2、肠羧基酯酶、K-ras、激肽释放酶4、KIAAO205、KIF20A、KK-LC-1、KKLC1、KM-HN-1、KMHN1(也已知为CCDC110)、LAGE-1、LAGE-2、LB33/MUM-1、LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、Lengsin、M-CSF、M344、MA-50、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-A13、MAGE-B(MAGE-B1-MAGE-B24)、MAGE-C(MAGE-C1/CT7、CT10)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-A、MAPE、MART-I、MART-2、MATN、MC1R、MCSP、mdm-2、ME1、Melan-A/MART-1、Meloe、MG7-Ag、中期因子、MMP-2、MMP-7、MOV18、MUC1、MUC5AC、粘蛋白、MUM-1、MUM-2、MUM-3、MYL-RAR、肌球蛋白、I类肌球蛋白、N-ras、N-raw、NA88-A、NAG、NB\170K、neo-PAP、NFYC、nm-23H1、NuMa、NY-BR-1、NY-CO-1、NY-CO-2、NY-ESO1、NY-ESO-1/LAGE-2、OA1、OGT、OS-9、P多肽、p15(58)、p16、p185erbB2、p180erbB-3、p53、PAP、PAX5、PBF、pml-RARα融合蛋白、多型性上皮粘蛋白(polymorphic epithelial mucin、“PEM”)、PPP1R3B、PRAME、PRDX5、PSA、PSCA、PSMA、PTPRK、RAB38/NY-MEL-1、RAGE-1、RBAF600、RCAS1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、SAGE、SART-1、SART-3、SCP-1、SDCCAG16、secernin 1、SIRT2、SNRPD1、SOX10、Sp17、SPA17、SSX-1、SSX-2、SSX-4、SSX-5、STEAP1、生存素、SYT-SSX1或-SSX2融合蛋白、TA-90(Mac-2结合蛋白/亲环蛋白C相关蛋白)、TAAL6、TAG-1、TAG-2、TAG-72-4、TAGE、端粒酶、TERT、TGF-betaRII、TLP、TPBG、TPSTRAG-3、丙糖磷酸异构酶、TRP-1、TRP-2、TRP-1/gp75、TRP-2、TRP2-INT2、TSP-180、TSP50、酪氨酸酶、酪氨酸酶(“TYR”)、VEGF、WT1、XAGE-lb/GAGED2a、Kras、WT-1抗原(在淋巴瘤合其它实体瘤中)、ErbB受体、Melan A[MART1]、gp 100、酪氨酸酶、TRP-1/gp75、和TRP-2(在黑素瘤中)；MAGE-1和MAGE-3(在膀胱癌、头颈癌和非小细胞癌中)；HPV EG和E7蛋白(在宫颈癌中)；粘蛋白[MUC-1](在乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和前列腺癌中)；前列腺特异性抗原[PSA](在前列腺癌中)；癌胚抗原[CEA](在结肠癌、乳腺癌和胃肠道癌中)、和这种共享的肿瘤特异性抗原如MAGE-2、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-10、MAGE-12、BAGE-1、CAGE-1,2,8、CAGE-3至7、LAGE-1、NY-ESO-1/LAGE-2、NA-88、GnTV、TRP2-INT2。例如，肿瘤的特征性抗原肽包括在CancerVaccines and Immunotherapy(2000)Stern，Beverley和Carroll编，CambridgeUniversity Press，Cambridge，Cancer Immunology(2001)Kluwer Academic Publishers，The Netherlands，国际专利申请公开号WO 20000/020581和美国专利申请公开号2010/0284965，以及www.cancerimmunity.org/peptidedatabase/Tcellepitopes列出的那些，这些文献全部出于所有预期目的通过引用整体并入本文。

在肿瘤细胞或来自某些其他身体样品的细胞的核酸中鉴定一种或多种基因可以包括对肿瘤细胞的整个外显子组、整个基因组或整个转录组测序。转录组测序是对来自细胞的信使RNA或转录本进行测序。转录组是转录成RNA的基因组的一小部分(在人类中不到5％)。基因组测序是对生物体基因组的完整DNA序列进行测序。外显子组测序是对基因组中蛋白质编码部分进行测序。

在某些实施方案中，测序深度可以变化。在下一代测序中，产生目标DNA样品的重叠片段并进行测序。然后将重叠序列比对以产生完整的比对序列读数集。测序的深度，也称为测序的覆盖率，是指有助于装配体一部分的核苷酸数量。基于基因组，测序深度是指每个碱基已测序的次数。例如，对基因组测序3OX意味着该序列中的每个碱基均被30个测序读数覆盖。基于核苷酸，测序深度是指添加有关单个核苷酸的信息的序列数。

在某些实施方案中，例如，对受试者基因组的特定部分进行测序(例如，肿瘤)。在大多数情况下，最好对整个基因组/转录组测序。基因组可以被测序到浅深度或深深度，以允许覆盖基因组/转录组的更少或更多部分。

测序可以以本领域已知的任何合适方式进行。测序技术的示例包括但不限于下一代测序(Next Generation Sequencing，NGS)(也称为“大规模并行测序技术”)或第三代测序。NGS是指非基于Sanger的高通量DNA测序技术。NGS技术和平台的非限制性示例包括合成测序(也称为“焦磷酸测序”)(例如，使用GS-FLX 454基因组测序仪，454Life Sciences(Branford，Conn.)，ILLUMINA SOLEXA基因组分析仪(Illumina Inc.，San Diego，Calif.)，或ILLUMINA HISEQ 2000基因组分析仪(Illumina)，或如在Ronaghi等人，Science，281(5375):363-365(1998)中所述，通过连接测序(例如，使用SOLID平台(Life TechnologiesCorporation，Carlsbad，Calif.)或POLONATOR G.007平台(Dover Systems，Salem，N.H.)实施)，单分子测序(例如，使用PACBIO RS系统(Pacific Biosciences(Menlo Park，Calif.))或HELISCOPE平台(Helicos Biosciences(Cambridge，Mass.))，用于单分子测序的纳米技术(例如，使用Oxford Nanopore Technologies(Oxford，UK)的GRIDON平台实施)，由Nabsys(Providence，R.I.)开发的杂交辅助纳米孔测序(HANS)平台，以及具有DNA纳米球(DNB)技术的基于连接酶的DNA测序平台，称为探针锚定连接(cPAL))，基于电子显微镜的单分子测序技术和离子半导体测序，例如在Zhang等人，J.Genet.Genomics，38(3):95-109(2011)和Voelkerding等人，Clinical Chemistry，55:641-658(2009)中描述的那些。

在一些实施方案中，通过预测建模产生所述肽。可以使用任何合适的预测肽序列的方法(例如，NetMHC算法)。例如，分析DNA或RNA标志物集合的差异以产生特异性抗原/表位集合(例如，肿瘤特异性的)包括使用确定表位肽与MHC分子的结合的预测算法。任选地，特异性抗原/表位组被精制以提供MHC限制的特异性抗原/表位组。例如，可以提供K，D或L等位基因的MHC I-限制性表位。可通过确定含有表位的肽与MHC-等位基因特异性肽的结合来产生MHC限制性表位集。这种算法的一个示例是NetMHC-3.2，它使用人工神经网络(ANN)和权重矩阵预测肽与许多不同的HLA等位基因的结合。

作为示例而非限制，可以通过表位预测算法(例如NetMHC)来分析健康组织和癌症组织之间的DNA(或RNA)序列差异以及哺乳动物的MHC组成。该算法可为该个体哺乳动物生成潜在的肿瘤特异性表位列表，并为每个表位提供数值评分。在当前的现有技术中，高评分意味着表位能够被免疫的可能性很高，而低(包括负数)评分意味着表位能够被免疫的可能性很低。该方法进一步包括为肿瘤特异性表位组或MHC限制的肿瘤特异性表位组中的每个表位提供数值，其中该数值是通过从肿瘤特异性表位(突变的)的评分中减去正常表位(未突变)的评分来计算的。从突变癌症表位的数值评分中减去正常表位的数值评分，获得差异的数值-表位的差异性Agretopic指数(Differential Agretopic Index，DAI)。推定的表位可以基于DAI进行排名。

在其他实施方案中，可以通过使用包括串联质谱法(MS/MS)的多维MS技术(MSn)对酶消化物进行测序来鉴定本发明的肽。这样的蛋白质组学方法允许快速、高度自动化的分析(参见例如K.Gevaert和J.Vandekerckhove，Electrophoresis 21:1145-1154(2000)；Bassani-Sternberg M.(2018)Mass Spectrometry Based Immunopeptidomics for theDiscovery of Cancer Neoantigens.在Schrader M.，Fricker L.编，Peptidomics.Methods in Molecular Biology，第1719卷，Humana Press，New York，NY，每篇文献出于所有目的通过引用整体并入本文)。

抗原呈递细胞

一方面，本文描述了离体扩增抗原特异性淋巴细胞的方法，该方法包括扩增获自受试者的样品中的淋巴细胞或分离自该样品的淋巴细胞，其中扩增包括在扩增过程中添加一种或多种肽，其中每种所述肽包含不同的抗原，并且其中形成了抗原特异性淋巴细胞。在某些实施方案中，所述肽被呈递在抗原呈递细胞(APC)的表面上。在某些实施方案中，将APC与可溶性肽一起温育，这导致APC在其表面上呈现肽(例如，直接结合至其表面上的MHC或通过被APC加工)。在某些实施方案中，将APC加工成表达所述肽(例如，通过翻译或转导)。在某些实施方案中，所添加的肽与在APC表面上呈递的肽(例如，经工程化以表达所述肽，与所述肽预孵育，或两者)均是可溶性肽。在某些实施方案中，在与淋巴细胞共培养之前，将可溶性肽与尚未被诱导在其表面上呈递所述肽的APC一起添加。

在某些实施方案中，该方法包括添加两种或更多种肽(即，不同肽的汇集物)。在某些实施例中，如果仅进行一个阶段的扩增，则其使用前快速扩增方案(pre-REP)。在某些实施方案中，抗原特异性淋巴细胞优先于扩增过程中存在的其他淋巴细胞而扩增。在某些实施方案中，该优先扩增导致抗原特异性淋巴细胞的富集。在某些实施方案中，所述肽被呈递在抗原呈递细胞(APC)的表面上。在某些实施方案中，将APC与可溶性肽一起温育，这导致APC在其表面上呈递肽(例如，通过直接结合至其表面上的MHC或通过被APC加工)。在某些实施方案中，将APC工程化成表达所述肽(例如，通过翻译或转导)。在某些实施方案中，所添加的肽与在APC表面上呈递的肽(例如，经工程化以表达所述肽，与该肽预孵育，或两者皆有)均是可溶性肽。在某些实施方案中，在与淋巴细胞共培养之前，将可溶性肽与尚未被诱导在其表面上呈递肽的APC一起添加。

在某些实施方案中，相对于淋巴细胞和/或受试者而言，APC可以是自体的、同种的、同基因的或异种的。在某些实施方案中，使用与受试者自体的APC，以允许在受试者自身的MHC的情况下呈递肽。

在某些实施方案中，APC是人工APC。在某些实施例中，APC不是人造的。

在某些实施方案中，将APC与一种或多种肽一起温育，以便使所述肽呈递在APC的表面上。

在某些实施方案中，将APC与所述肽一起温育，同时将它们引入与淋巴细胞的共培养物中。

在某些实施方案中，在与淋巴细胞共培养之前，将APC与所述肽一起温育。在这样的情况下，可以说APC被所述肽脉冲化或预装载有所述肽。在某些实施方案中，所述肽可以与APC以每种肽约0.1nM至约100μM的浓度孵育。在某些实施方案中，可以将所述肽与APC以每种肽的浓度为约1nM至约90μM，约10nM至约80μM，约50nM至约70μM，约100nM至约60μM，约150nM至约50μM，约200nM至约40μM，约250nM至约30μM，约300nM至约20μM，约350nM至约10μM，约400nM至约9μM，约450nM至约8μM，约500nM至约7μM，约550nM至约6μM，约600nM至约5μM，约650nM至约4μM，约700nM至约3μM，约750nM至约2.5μM，约800nM至约2μM，约900nM至约1.5μM或约950nM至约1.25μM。在某些实施方案中，可以将所述肽与APC以每种肽约100nM至约100μM，约250nM至约75μM，约500nM至约50μM，约750nM至约25μM，约900nM至约10μM或约990nM至约5μM的浓度一起孵育。

在某些实施方案中，可以将所述肽与APC以每种肽至少约0.1nM、约1nM、约5nM、约10nM、约20nM、约30nM、约40nM、约40nM、约50nM、约60nM、约70nM、约80nM、约90nM、约100nM、约110nM、约120nM、约130nM、约140nM、约150nM、约160nM、约170nM、约180nM、约190nM、约200nM、约210nM、约220nM、约230nM、约240nM、约250nM、约260nM、约270nM、约280nM、约290nM、约300nM、约310nM、约320nM、约330nM、约340nM、约350nM、约360nM、约370nM、约380nM、约390nM、约400nM、约410nM、约420nM、约430nM、约440nM、约450nM、约460nM、约470nM、约480nM、约490nM、约500nM、约510nM、约520nM、约530nM、约540nM、约550nM、约560nM、约570nM、约580nM、约590nM、约600nM、约610nM、约620nM、约630nM、约640nM、约650nM、约660nM、约670nM、约680nM、约690nM、约700nM、约710nM、约720nM、约730nM、约740nM、约750nM、约760nM、约770nM、约780nM、约790nM、约800nM、约810nM、约820nM、约830nM、约840nM、约850nM、约860nM、约870nM、约880nM、约890nM、约900nM、约910nM、约920nM、约930nM、约940nM、约950nM、约960nM、约970nM、约980nM、约990nM、约1μM、约2μM、约3μM、约4μM、约5μM、约6μM、约7μM、约8μM、约9μM、约10μM、约20μM、约30μM、约40μM、约50μM、约60μM、约70μM、约80μM、约90μM或约100μM的浓度一起孵育。

在某些实施方案中，可以以每种肽约0.1nM、约1nM、约5nM、约10nM、约20nM、约30nM、约40nM、约50nM、约60nM、约70nM、约80nM、约90nM、约100nM、约110nM、约120nM、约130nM、约140nM、约150nM、约160nM、约170nM、约180nM、约190nM、约200nM、约210nM、约220nM、约230nM、约240nM、约250nM、约260nM、约270nM、约280nM、约290nM、约300nM、约310nM、约320nM、约330nM、约340nM、约350nM、约360nM、约370nM、约380nM、约390nM、约400nM、约410nM、约420nM、约430nM、约440nM、约450nM、约460nM、约470nM、约480nM、约490nM、约500nM、约510nM、约520nM、约530nM、约540nM、约550nM、约560nM、约570nM、约580nM、约590nM、约600nM、约610nM、约620nM、约630nM、约640nM、约650nM、约660nM、约670nM、约680nM、约690nM、约700nM、约710nM、约720nM、约730nM、约740nM、约750nM、约760nM、约770nM、约780nM、约790nM、约800nM、约810nM、约820nM、约830nM、约840nM、约850nM、约860nM、约870nM、约880nM、约890nM、约900nM、约910nM、约920nM、约930nM、约940nM、约950nM、约960nM、约970nM、约980nM、约990nM、约1μM、约2μM、约3μM、约4μM、约5μM、约6μM、约7μM、约8μM、约9μM、约10μM、约20μM、约30μM、约40μM、约50μM、约60μM、约70μM、约80μM、约90μM或约100μM的浓度与APC一起孵育。在某些实施方案中，可以将所述肽以每种肽约1μM的浓度与APC一起温育。在某些实施方案中，可以将所述肽以每种肽约2μM的浓度与APC一起温育。

在一些情况下，与所述肽的孵育可以导致该肽直接结合至APC的表面(例如，通过MHC)，在这种情况下，APC不需要所述肽的内部加工。直接结合可加快表位的呈递速度，从而缩短检测时间。尽管APC可能已经在其表面上与MHC形成复合物而展示了一种或多种肽，但与本发明肽的孵育取代了许多与MHC结合的肽，从而产生了MHC-肽复合物，可用于扩增抗原特异性淋巴细胞。

在某些实施方案中，将APC工程化成表达至少一种免疫调节剂。免疫调节剂可以起到进一步增强淋巴细胞扩增的作用。在某些实施方案中，免疫调节剂可以起到进一步增强抗原特异性淋巴细胞的扩增的作用。在某些实施方案中，免疫调节剂与APC呈递肽协同作用以增强淋巴细胞和/或抗原特异性淋巴细胞的扩增。

在某些实施方案中，通过转染、转导或暂时的细胞膜破坏中的至少一种引入至少一种免疫调节剂来工程化APC以表达免疫调节剂。在某些实施方案中，通过使用基因编辑分子将APC加工成表达免疫调节剂。基因编辑分子的实例包括但不限于核酸内切酶。核酸内切酶是切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶，但是它们仅破坏内部的磷酸二酯键。可用于本发明的组合物和方法中的基因编辑核酸内切酶的实例包括但不限于锌指核酸酶(ZFns)，转录激活子样效应子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)，大范围核酸酶(meganucleases)，限制性核酸内切酶，重组酶和成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats，CRISPR)/CRISPR相关(Cas)蛋白。可用于本发明方法的Cas蛋白的实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9(Csn1或Csx12)、Cas10、Casl0d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE)、Cse4(CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966，其同系物或被修饰形式。

在某些实施方案中，将APC工程化以瞬时表达所述免疫调节剂。在某些实施方案中，将APC工程化以稳定表达所述免疫调节剂。

在某些实施方案中，用于工程化APC的免疫调节剂的非限制性实例包括OX40L、4-1BBL、CD80、CD86、CD83、CD70、CD40L、GITR-L、CD127L、CD30L(CD153)、LIGHT、BTLA、ICOS-L(CD275)、SLAM(CD150)、CD662L、白介素12(IL-12)、白介素7(IL-7)、白介素15(IL-15)、白介素17(IL-17)、白介素21(IL-21)或白介素4(IL-4)。

可以通过本领域已知的任何方法将APC工程化而表达所述肽和/或免疫调节剂，包括但不限于转染、病毒递送(即转导)、脂质体递送、电穿孔、细胞挤压(例如，首先将细胞破坏(例如挤压、变形或压缩)，然后暴露于施加的能量场(例如电场、磁场或声场)、注射、阳离子聚合物、阳离子脂质、磷酸钙和胞吞作用。

例如，可使用电穿孔通过向目标细胞施加静电势来透化APC。随后使以这种方式经受外部电场的APC易于吸收外源核酸。哺乳动物细胞的电穿孔在例如Chu等人，NucleicAcids Research 15:131 1(1987)中有详细描述，其公开内容在此引入作为参考。一种类似的技术，Nucleofection^TM，利用施加的电场来刺激外源多核苷酸摄取到真核细胞的核中。可用于实施该技术的Nucleofection^TM和方案在例如Distler等人，ExperimentalDermatology 14:315(2005)以及US 2010/03171 14中进行了详细描述，其各自的公开内容出于所有预期目的通过引用并入本文。

可用于APC转染的其他技术包括细胞挤压穿孔方法。该技术引起细胞快速机械变形，以刺激外源DNA通过响应所施加的压力形成的膜孔被摄入。该技术的优点在于，不需要利用载体将核酸递送到细胞例如人靶细胞中。例如在Sharei等人，Journal of VisualizedExperiments 81:e50980(2013)中详细描述了细胞挤压-穿孔技术，其公开内容出于所有预期目的通过引用整体并入本文。

脂质转染代表了另一种可用于转染靶细胞的技术。该方法涉及将核酸加载到脂质体中，脂质体通常向脂质体外部呈现阳离子官能团，例如季胺或质子化胺。由于细胞膜的阴离子性质，这促进了脂质体和细胞之间的静电相互作用，最终导致外源核酸的摄取，例如通过脂质体与细胞膜的直接融合或复合物的内吞作用。脂质转染例如在美国专利号7,442,386中有详细描述，其公开内容通过引用并入本文。利用与细胞膜的离子相互作用来激发外来核酸摄取的类似技术包括使细胞与阳离子聚合物-核酸复合物接触。与多核苷酸缔合以赋予有利于与细胞膜相互作用的正电荷的示例性阳离子分子包括活化的树枝状聚合物(例如，在Dennig，Topics in Current Chemistry 228:227(2003)中描述，其公开内容通过引用并入本文)和二乙基氨基乙基(DEAE)-右旋糖酐，其作为转染剂的用途在例如Gulick等人，Current Protocols in Molecular Biology 40:1:9.2:9.2.1(1 997)中有详细描述(其公开内容通过引用并入本文)。磁珠是另一种可用于以温和而有效的方式转染靶细胞的工具，因为该方法利用施加的磁场来指导核酸的摄取。例如在US2010/0227406中详细描述了该技术。上面讨论的每篇参考文献的公开内容出于所有预期目的通过引用整体并入本文。

诱导APC摄入外源核酸的另一种有用工具是激光转染，该技术涉及将细胞暴露于特定波长的电磁辐射中，以使细胞轻柔地透化并允许多核苷酸穿透细胞膜。该技术详细描述于例如Rhodes等，Methods in Cell Biology 82:309(2007)中，出于所有预期目的将其公开内容通过引用整体并入本文。

微泡代表可根据本文所述方法用于修饰APC基因组的另一种潜在载体。例如，由糖蛋白VSV-G与例如基因组修饰蛋白(如核酸酶)共同过表达诱导的微泡可用于有效地将蛋白递送到细胞中，随后催化内源多核苷酸序列的位点特异性切割，以使细胞基因组备用于共价掺入目标多核苷酸，例如基因或调控序列。此类囊泡，也称为Gesicles，用于真核细胞的遗传修饰详细描述于例如Quinn等人，Genetic Modification of Target Cells byDirect Delivery of Active Protein[摘要]，Methylation changes in earlyembryonic genes in cancer[摘要]，Proceedings of the 18th Annual Meeting of theAmerican Society of Gene and Cell Therapy；2015May 13，摘要，第122期。将以上讨论的每篇参考文献的公开内容出于所有预期目的通过引用整体并入本文。

可以使用各种方法来转导细胞。在本发明的一些实施方案中，用载体或质粒，即能够在不同细胞或遗传环境之间转运核酸序列的核酸分子来转导细胞。不同的细胞环境包括同一生物的不同细胞类型，而不同的遗传环境包括不同生物的细胞或具有不同遗传物质和/或基因组的细胞的其他情况。本发明的非限制性载体包括那些能够自主复制和表达其中存在的核酸序列(用于递送到细胞中)的载体。载体也可以以对细胞类型特异的因子有响应的方式诱导表达。非限制性实例包括可通过在体外添加外源调节剂或体内诱导药物的载体的全身递送来诱导。载体还可以任选地包含与所用细胞系统相容的选择标记。用于实施本发明的一种类型的载体被保持为附加体，其是能够进行染色体外复制的核酸。另一种类型是被稳定地整合到将引入其中的细胞的基因组中的载体。

用于转导的载体的类型包括基于任何病毒的那些。衍生自逆转录病毒(包括禽网状内皮组织增殖病病毒(鸭传染性贫血病毒，脾坏死病毒，Twiehaus株网状内皮组织增殖病病毒，C型逆转录病毒，网状内皮组织增殖病病毒匈牙利2(REV-H-2))和猫白血病病毒(FeLV)))是一些特别的非限制性示例。逆转录病毒基因组已被修饰以用作载体(Cone&Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81:6349-6353，(1984))。可用作本发明载体的逆转录病毒的非限制性实例包括慢病毒，例如人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)，猫免疫缺陷病毒(FIV)，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，Maedi/Visna病毒，山羊关节炎/脑炎病毒，马传染性贫血病毒(EIAV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)；禽C型逆转录病毒，例如禽白血病病毒(ALV)；HTLV-BLV逆转录病毒，例如牛白血病病毒(BLV)，人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)和猿猴嗜T淋巴细胞病毒；哺乳动物B型逆转录病毒，例如小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)；哺乳动物C型逆转录病毒，例如鼠白血病病毒(MLV)，猫肉瘤病毒(FeSV)，鼠肉瘤病毒，长臂猿白血病病毒，豚鼠C型病毒，猪C型病毒，羊毛猴肉瘤病毒和毒蛇逆转录病毒；肺炎病毒(泡沫病毒组)，例如人肺炎病毒(HSRV)，猫合胞体形成病毒(FeSFV)，人泡沫状病毒，猿猴泡沫状病毒和牛合胞体病毒；和D型逆转录病毒，例如Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)，松鼠猴逆转录病毒和叶猴猴病毒(langur monkey virus)。

慢病毒和逆转录病毒载体可以使用其天然包膜蛋白进行包装，或可以进行修饰以被异源包膜蛋白封装。包膜蛋白的实例包括但不限于双嗜性包膜(amphotropicenvelope)、亲嗜性包膜或异嗜性包膜，或者可以是包括双嗜性和亲嗜性部分的包膜。该蛋白质也可以是任何上述逆转录病毒和慢病毒的蛋白质。或者，env蛋白可以是修饰的、合成的或嵌合的env构建体，或者可以从非逆转录病毒例如水泡性口炎病毒和HVJ病毒获得。具体的非限制性实例包括莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、劳斯肉瘤病毒、杆状病毒、Jaagsiekte绵羊逆转录病毒(JSRV)包膜蛋白和猫内源性病毒RD114的包膜；长臂猿猿猴白血病病毒(GALV)包膜；狒狒内源性病毒(BaEV)包膜；猿猴肉瘤相关病毒(SSAV)包膜；双嗜性鼠白血病病毒(MLV-A)包膜；人免疫缺陷病毒包膜；禽白血病病毒包膜、内源性异嗜性NZB病毒包膜；和副粘病毒科的包膜，例如但不限于HVJ病毒包膜。

在某些实施方案中，APC可包括例如巨噬细胞、树突细胞、郎格罕氏细胞、B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞)中的任何一种或多种。在某些实施方案中，APC是树突细胞。

在某些实施方案中，APC是B细胞。在某些实施方案中，所述B细胞是通过CD19或CD20选择分离的。

在某些实施方案中，B细胞是激活的。在一些实施方案中，可以通过与化合物温育来活化B细胞，所述化合物例如但不限于CD40L、IL-21和/或IL-4。在某些实施方案中，通过与CD40L孵育来活化B细胞。B细胞刺激细胞，例如CD40阳性L细胞和/或EL4B5细胞也可以用于激活B细胞。另外，也存在于来自获得B细胞的受试者的样品中的其他种类的细胞仍可以存在于B细胞培养物中。当存在于B细胞培养条件下时，与B细胞相比，此类非B细胞通常增殖能力较弱，因此此类污染细胞的数量通常会随时间减少。优选地，B细胞培养物中至少70％的细胞是B细胞。更优选地，所述B细胞培养物中至少75％、80％、85％、90％或95％的细胞是B细胞。在一个实施方案中，B细胞和B细胞刺激细胞，例如CD40阳性L细胞和/或EL4B5细胞，基本上是本发明所用的B细胞培养物中存在的唯一种类的细胞。在一些实施方案中，所述B细胞培养物的基本上所有细胞都是B细胞。

在某些实施方案中，将B细胞进一步用Bcl-6、Bcl-XL、BCL-2、MCL1、STAT-5和/或JAK/STAT途径、PI3K-AKT信号传导途径、BCR信号传导途径或BAFF-BAFFR信号传导途径中的至少一种的激活物进行培养。

在某些实施方案中，可以通过将来自获得的血液的单核细胞增殖和/或分化为树突状细胞来从单核细胞制备树突状细胞。单核细胞可以在含有白介素4(IL-4)的培养基中培养，并可以分化为未成熟的树突状细胞。获得的未成熟树突状细胞可以在含有肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的培养基中培养，并且可以分化为成熟的树突状细胞。树突状细胞也可以使用塑性粘附方法产生。对于塑料粘附方法，可以将整个单核细胞播种并在细胞培养容器中培养1至2个小时，并且可以使用附着在底部的细胞。

树突状细胞可以通过抗原更新而被激活。

呈递肽的MHC分子可以是受试者表达的任何MHC分子。在一些实施方案中，I类MHC多肽是人I类MHC多肽，其选自HLA-A，HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G。在另一个具体的实施方案中，I类MHC多肽是选自H-2K、H-2D、H2L、H-2Q、H-2M和H-2T的鼠I类MHC多肽。在一些实施方案中，II类MHC多肽选自HLADP、HLA-DR和HLA-DQ。在一些实施方案中，II类MHC多肽选自HLA-DMA、HLA-DOA、HLA-DPA、HLA-DQA和HLA-DRA。

淋巴细胞

一方面，本文描述了离体扩增抗原特异性淋巴细胞的方法，该方法包括扩增获自受试者的样品中的淋巴细胞或分离自该样品的淋巴细胞，其中扩增包括在扩增过程中添加一种或多种肽，其中每种所述肽包含不同的抗原，并且其中抗原特异性淋巴细胞被扩增。一方面，本发明提供了扩增抗原特异性淋巴细胞以允许增加的免疫原性活性(例如，更大和/或更长时间的活性)的方法。

一方面，本文描述了离体扩增抗原特异性淋巴细胞的方法，该方法包括:a)扩增从受试者获得的样品中的淋巴细胞或从这样的样品中分离的淋巴细胞，其中扩增包括至少两个扩增阶段，和b)在至少两个扩增阶段的至少一个阶段期间添加一种或多种肽，其中每种所述肽包含不同的抗原，并且其中抗原特异性淋巴细胞被扩增。一方面，本发明提供了扩增抗原特异性淋巴细胞以允许增加的免疫原性活性(例如，更大和/或更长时间的活性)的方法。

包含淋巴细胞的样品可以从受试者的许多来源获得，包括但不限于、例如但不限于组织(包括肿瘤组织、病毒感染组织、炎症部位的组织、淋巴细胞浸润部位和白细胞浸润的部位)、胸腺、肿瘤组织(例如样品、碎片)或酶促消化的组织、离解/悬浮细胞、淋巴结样品或体液样品(例如血液、腹水、淋巴)。示例性的组织包括皮肤、脂肪组织、心血管组织、例如静脉、动脉、毛细血管、瓣膜；神经组织、骨髓、乳腺、胃肠道、肺组织、眼组织(例如角膜和晶状体)、软骨、骨骼和粘膜组织。

所述样品可以未经处理，经酶促处理和/或解离/悬浮以形成细胞悬液。当样品经酶促处理时，可以使用的酶的非限制性实例包括胶原酶，分散酶(dispase)，透明质酸酶，游离酶(liberase)和脱氧核糖核酸酶(DNase)。

一方面，本发明提供了扩增抗原特异性淋巴细胞以允许增加的免疫原性活性(例如更大和/或更长时间的活性)的方法。淋巴细胞是免疫系统中白细胞的一种亚型。

在某些实施方案中，用于本发明的淋巴细胞包括浸润肿瘤的免疫细胞。浸润肿瘤的免疫细胞由可变比例的单核和多形核免疫细胞组成(即T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等)。在某些实施方案中，用于本发明的淋巴细胞包括浸润肿瘤的淋巴细胞(TIL)。TIL是离开血液并向肿瘤迁移的白细胞。TIL通常可以在肿瘤基质和肿瘤本身中发现。在某些实施方案中，TIL是“年轻”的T细胞或最少培养的T细胞。在某些实施方案中，年轻细胞具有缩短的培养时间(例如，总共约22至约32天)。在某些实施方案中，淋巴细胞表达CD27。

在某些实施方案中，用于本发明的淋巴细胞包括外周血淋巴细胞(PBL)。在某些实施方案中，用于本发明的淋巴细胞包括T淋巴细胞(也称为T细胞)和/或自然杀伤细胞(也称为NK细胞)。

在某些实施方案中，淋巴细胞相对于受试者而言可以是自体的、同种异体的、同基因的或异种的。在某些实施方案中，淋巴细胞是自体的，以便当重新引入受试者进行免疫治疗时减少针对淋巴细胞的免疫反应性。

在某些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在某些实施方案中，T细胞是CD4+细胞。在某些实施方案中，在与所述肽和/或APC呈递肽温育之前，分离所述CD8+T细胞。在某些实施方案中，在与肽和/或APC呈递肽温育之前不分离所述CD8+T细胞。在某些实施方案中，在与肽和/或APC呈递肽温育之前，分离所述CD4+T细胞。在某些实施方案中，在与肽和/或APC呈递肽孵育之前不分离所述CD4+T细胞。

在某些实施方案中，NK细胞是CD 16+CD56+和/或CD57+NK细胞。NK的特征在于它们具有通过激活特定的溶细胞酶来结合并杀死不能表达“自身”MHC/HLA抗原的细胞，具有杀死肿瘤细胞或表达NK激活受体的配体的其他患病细胞的能力，以及释放刺激或抑制免疫反应的称为细胞因子的蛋白质分子的能力。

适用于淋巴细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小基本培养基(MEM)，RPMI培养基1640，Lonza RPMI 1640，高级RPMI，Clicks，AIM-V，DMEM，a-MEM，F-12，TexMACS，X-Vivo 15和X-Vivo 20Optimizer，添加了氨基酸、丙酮酸钠和维生素，不含血清或补充了适量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或一定量足以生长和扩增的细胞因子)。

用于淋巴细胞扩增的其他添加剂的实例包括但不限于表面活性剂，piasmanate，pH缓冲液(例如HEPES)和还原剂(例如N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇)，抗生素(例如青霉素和链霉素)，它们仅包括在实验培养物中，而不包括在要注入受试者体内的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和大气(例如空气加5％CO2)。

可以通过本领域已知的任何方法来测试扩增的TIL的特异性肿瘤反应性，例如，通过在与肿瘤细胞共培养之后测量细胞因子的释放(例如，干扰素-γ)。在一个实施方案中，自体ACT方法包括在快速扩增细胞之前，对培养的TIL富集CD8+T细胞。在IL-2中培养TIL后，使用例如CD8微珠分离(例如，使用CliniMACS+CD8微珠系统(MiltenyiBiotec))使T细胞中的CD4+细胞消耗并富集CD8+细胞。在另一个实施方案中，自体ACT方法包括在细胞快速扩增之前，对培养的TIL富集CD4+T细胞。在IL-2中培养TIL之后，使用例如CD4微珠分离(例如，使用CliniMACS+CD4微珠系统(MiltenyiBiotec))使T细胞中的CD8+细胞消耗并富集CD4+细胞。在一些实施方案中，将促进自体T细胞生长和活化的T细胞生长因子与自体T细胞同时或在自体T细胞之后施用给哺乳动物。T细胞生长因子可以是促进自体T细胞生长和活化的任何合适的生长因子。

治疗方法

在一个相关方面，本文公开了一种在需要其的受试者中治疗肿瘤的方法，该方法包括向受试者施用有效量的通过本文所公开的方法产生的抗原特异性淋巴细胞群。在某些实施方案中，肿瘤是实体瘤。在某些实施方案中，肿瘤是液体肿瘤(例如血液癌)。

通过本文描述的方法可治疗的肿瘤的非限制性实例包括例如癌、淋巴瘤、肉瘤、母细胞瘤和白血病。非限制性的具体实例包括例如乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、原发性或转移性黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、所有组织病理学类型的脑癌、血管肉瘤(angiosarcoma)、血管肉瘤(hemangiosarcoma)、骨肉瘤、纤维肉瘤、粘肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、血管内皮肉瘤(endotheliosarcoma)、淋巴管肉瘤(lymphangiosarcoma)、淋巴管内皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤、睾丸癌、子宫癌、子宫颈癌、胃肠道癌、间皮瘤、与病毒感染相关的癌症(例如但不限于人乳头瘤病毒(HPV)相关的肿瘤(例如子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、头颈癌、肛门癌、和阴茎癌))、尤因氏肿瘤、平滑肌肉肉瘤、尤因氏肉瘤、横纹肌肉瘤、原发性未知癌(CUP)、鳞细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、Waldenstroom巨球蛋白血症、乳头状腺癌、囊腺癌、支气管癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆斯氏肿瘤、肺癌、上皮癌、宫颈癌、睾丸肿瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、神经母细胞瘤、小细胞肺癌、膀胱癌、淋巴瘤，多发性骨髓瘤、髓样癌、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、NK细胞淋巴瘤、大颗粒性淋巴细胞淋巴瘤或白血病、γ-δT细胞淋巴瘤或γ-δT细胞白血病、套细胞淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、慢性髓样白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、造血细胞瘤、胸腺瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、EB病毒(EBV)诱发的各种类型的恶性肿瘤、包括但不限于与EBV相关的霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、所有形式的移植后淋巴瘤包括移植后淋巴增生性疾病(PTLD)、子宫癌、肾细胞癌、肝癌、肝母细胞瘤。可以通过本文所述的方法和组合物治疗的癌症包括但不限于来自膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、胃肠道、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌头或子宫的癌细胞。另外,癌症可以具体地是以下组织学类型,尽管不限于这些:肿瘤，恶性的；或癌；癌，未分化的；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌、鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；pilomatrix癌；移行细胞癌、乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性的；胆管癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤息肉中的腺癌；腺癌，家族性息肉病；实体癌；类癌，恶性的；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；发色癌；嗜酸癌；嗜氧腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附件癌；顶泌腺癌；皮脂腺癌；陶瓷腺癌(sebaceous adenocarcinoma)；耵聍腺癌(ceruminous adenocarcinoma)；粘液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma)；膀胱腺癌(cystadenocarcinoma)；乳头状囊腺癌(papillary cystadenocarcinoma)；乳头状浆液性囊腺癌(papillary serouscystadenocarcinoma)；粘液性囊腺癌(mucinous cystadenocarcinoma)；粘液腺癌(mucinous adenocarcinoma)；印戒细胞癌(signet ring cell carcinoma)；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病,乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；有鳞状化生的腺癌(adenocarcinoma w/squamous metaplasia)；胸腺瘤，恶性的；卵巢间质瘤,恶性的；昏迷,恶性的；颗粒细胞瘤,恶性的；母细胞瘤(roblastoma)，恶性的；塞尔托利细胞癌(sertolicell carcinoma)；leydig细胞肿瘤，恶性的；脂质细胞瘤，恶性的；副神经节瘤，恶性的；乳腺旁神经节瘤，恶性的；嗜铬细胞瘤；血管肉瘤；恶性黑色素瘤；釉质黑素瘤(amelanoticmelanoma)；浅表黑色素瘤；色素沉着痣中的恶性黑色素瘤(malig melanoma in giantpigmented nevus)；上皮样细胞黑素瘤；蓝色痣，恶性的；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性的；黏肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；基质肉瘤；混合性肿瘤，恶性的；苗勒氏混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间皮肉瘤，恶性的；布伦纳瘤，恶性的；叶状肿瘤，恶性的；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性的；无性细胞瘤(dysgerminoma)；胚胎癌；畸胎瘤，恶性的；甲状腺肿，恶性的；绒毛膜癌；中肾瘤(mesonephroma)，恶性的；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性的；卡波西氏肉瘤；血管内皮细胞瘤，恶性的；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性的；间质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性的；成釉细胞齿肉瘤(ameloblasticodontosarcoma)；成釉细胞瘤，恶性的；釉质成纤维肉瘤；松果体瘤，恶性的；脊索瘤；胶质瘤，恶性的；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；少突胶质母细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性的；神经纤维肉瘤；神经瘤，恶性的；颗粒细胞瘤，恶性的；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病；霍奇金淋巴瘤；类肉芽肿(paragranuloma)；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性的；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性的；恶性淋巴瘤，滤泡性的；真菌病；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病(erythroleukemia)；淋巴肉瘤细胞白血病(lymphosarcoma cellleukemia)；髓样白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓样肉瘤和毛细胞白血病。

利用通过本文公开的方法扩增的淋巴细胞治疗后的抗肿瘤应答可以在异种移植肿瘤模型中确定。可以使用表达病毒颗粒呈递的肿瘤相关抗原的任何人类癌细胞系来建立肿瘤。为了建立异种移植肿瘤模型，可使用例如Matrigel(Becton Dickinson)将例如约5×10⁶个活细胞例如皮下注射到无胸腺裸鼠中。可以使用本领域技术人员已知的方法，基于肿瘤的大小，动物的体重，存活时间以及癌症的组织化学和组织病理学检查来确定异种移植肿瘤模型的终点。

在一个相关方面，本文公开了一种在需要其的受试者中治疗传染性和/或人畜共患疾病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的通过本文所公开的方法产生的抗原特异性淋巴细胞群。传染病是由病原微生物引起的，例如细菌、病毒、寄生虫或真菌；这些疾病可以直接或间接地从一个人传播到另一个人。人畜共患病是动物的传染性疾病，当传播到人类时会引起疾病。传染病和/或人畜共患疾病的例子包括但不限于急性和慢性传染过程，会导致身体通道阻塞，包括例如男性生殖道阻塞(例如由于尿道炎，附睾炎，前列腺炎引起的狭窄)；女性生殖道阻塞(例如阴道炎，宫颈炎，盆腔炎(例如结核病，淋球菌，衣原体，肠球菌和梅毒))；泌尿道阻塞(例如膀胱炎，尿道炎)；呼吸道阻塞(例如慢性支气管炎，结核病，其他分枝杆菌感染(MAI等)，厌氧菌感染，真菌感染和寄生虫感染)以及心血管阻塞(例如，真菌性动脉瘤和感染性心内膜炎)。

在某些实施方案中，通过本文公开的方法产生的淋巴细胞的施用可以用于治疗病毒感染和/或由病毒感染引起的肿瘤。

示例性的病毒包括但不限于疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒(例如人疱疹病毒1(HHV-1)，人疱疹病毒2(HHV-2))，水痘病毒(例如人疱疹病毒3(HHV-3，也称为水痘带状疱疹病毒))，淋巴滤泡病毒(lymphocryptoviruses)(例如人疱疹病毒4(HHV-4，也称为爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)))，巨细胞病毒(例如人疱疹病毒5(HHV-5)，也称为人巨细胞病毒(HCMV))，玫瑰病毒(roseoloviruses)(例如人疱疹病毒6(HHV-6)，人疱疹病毒7(HHV-7))，狂犬病病毒(例如人疱疹病毒8(HHV-8)，也称为卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV))；痘病毒，例如正痘病毒(例如牛痘病毒，猴痘病毒，痘苗病毒，天花病毒)，副痘病毒(例如牛流行性口腔炎病毒，orf病毒，假牛痘病毒)，软体动物疱疹病毒(例如软体动物传染性病毒)，亚塔痘病毒(yatapoxviruses)(例如塔那痘病毒(tanapox virus)，雅巴猴肿瘤病毒(yaba monkeytumor virus))；腺病毒(例如人腺病毒A(HAdV-A)，人腺病毒B(HAdV-B)，人腺病毒C(HAdV-C)，人腺病毒D(HAdV-D)，人腺病毒E(HAdV-E)，人腺病毒F(HAdV-F)))；乳头瘤病毒(例如人乳头瘤病毒(HPV)；细小病毒(例如B19病毒)；肝炎病毒(例如，乙型肝炎病毒(HBV))；逆转录病毒，例如δ逆转录病毒(deltaretroviruses)(例如嗜灵长类T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)和嗜灵长类T淋巴细胞病毒2(HTLV-2))和慢病毒(例如人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)和人类免疫缺陷病毒2(HIV-2)；呼肠孤病毒，例如正呼肠孤病毒(例如，哺乳动物正呼肠孤病毒(mammalian orthoreovirus，MRV))，球形病毒(例如非洲马病病毒(African horsesickness virus，AHSV)，钱吉诺拉病毒(Changuinola，CORV)，奥轮谷病毒(Orungo virus，ORUV)和轮状病毒(例如轮状病毒A(RV-A)和轮状病毒B(RV-B))；丝状病毒，例如“类马尔堡病毒”(例如MARV)，“埃博拉样病毒”(例如CIEBOV，REBOV，SEBOV，ZEBOV)；副粘病毒(例如呼吸道病毒)(例如人副流感病毒1(HPIV-1)，人副流感病毒3(HPIV-3)，风疹病毒(rubulaviruses)(例如人副流感病毒2(HPIV-2)，人副流感病毒4(HPIV-4)，腮腺炎病毒(MuV))和morbilliviruses(例如麻疹病毒)；肺炎病毒(例如人呼吸道合胞病毒(HSCV)；弹状病毒，例如水泡病毒(例如，水疱性口炎病毒)，狂犬病病毒(lyssaviruses)(例如，狂犬病病毒)；正粘病毒(例如，甲型流感病毒，乙型流感病毒，丙型流感病毒)；布尼亚病毒(例如:加州脑炎病毒(CEV))；汉坦病毒(例如黑溪运河病毒(Black Creek Canal virus，BCCV)，纽约病毒(New York virus，NYV)，辛诺布尔病毒(Sin Nombre virus，SNV))；小核糖核酸病毒，包括肠病毒(例如人肠病毒A(human enterovirus A，HEV-A)，人肠病毒B(humanenterovirus B，HEV-B)，人肠病毒C(HEV-C)，人肠病毒D(HEV-D)，脊髓灰质炎病毒(PV))，鼻病毒(例如人鼻病毒A(human rhinovirus A，HRV-A)，人鼻病毒B(HRV-B))，肝病毒(例如甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus，HAV))；杯状病毒，包括“Norwalk样病毒”(例如Norwalk病毒(Norwalk Virus，NV)和“札幌样病毒”(Sapporo-like viruses)(例如Sapporo病毒(Sapporo virus,SV))；披甲病毒，包括甲型病毒(例如西方马脑炎病毒(Western equineencephalitis virus,WEEV)和东方马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis virus，EEEV))和风疹病毒(rubiviruses)(例如风疹病毒(Rubella virus))；黄病毒(例如登革热病毒(Dengue virus，DENV)，日本脑炎(Japanese encephalitis，JEV)，圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus，SLEV)，西尼罗河病毒(West Nile virus，WNV)，黄热病病毒(Yellow fever virus，YFV)；沙粒病毒(arenaviruses)(例如拉沙病毒(lassa virus))；冠状病毒(例如严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)相关病毒)和肝炎病毒(例如丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV))。

在某些实施方案中，通过本文公开的方法产生的抗原特异性淋巴细胞群与另外的治疗剂一起施用。可将本文所述的抗原特异性淋巴细胞群与在受试者中引起免疫应答(例如，治疗癌症)的另外的治疗剂(包括但不限于小分子、抗体或细胞试剂)同时或之前(例如，之前1-30天)施用于受试者。当共同施用另外的治疗剂时，淋巴细胞和另外的治疗剂可以同时或顺序地(以任何顺序)施用。由于加成作用或协同作用，可以降低每种试剂的合适的治疗有效剂量。

在某些实施方案中，可以将通过本文公开的方法产生的新抗原特异性淋巴细胞群与其他免疫调节治疗组合，例如治疗性疫苗(包括但不限于GVAX，基于DC的疫苗等)，检查点抑制剂(包括但不限于阻断CTLA4、PD1、LAG3、TIM3等的药物)或激活剂(包括但不限于增强41BB、OX40等的药物)。本文所述的抑制性治疗还可与具有调节NKT功能或稳定性的能力的其他治疗联合使用，所述其他治疗包括但不限于CD1d、CD1d融合蛋白、CD1d二聚体或未装载或装载有抗原的CD1d更大的聚合物、CD1d-嵌合抗原受体(CD1d-CAR)或人类中存在的五种已知CD1异构体(CD1a、CD1b、CD1c、CD1e)中的任何一种，为上述任何形式，可以单独使用，或者可以彼此组合或与其他试剂组合。

在过继转移抗原特异性淋巴细胞之前清除淋巴可以通过消除调节性T细胞和免疫系统竞争成分来增强治疗效果。因此，本发明的一些实施方案在引入本发明的抗原特异性淋巴细胞之前在受试者上使用了淋巴清除步骤(有时也称为“免疫抑制调理”)。可以通过给予诸如但不限于氟达拉滨或环磷酰胺(活性形式称为马夫草胺)及其组合的化合物来实现淋巴清除。此类方法描述于例如Gassner等人，Cancer Immunol.Immunother.2011，60，75-85，Muranski等人，Nat.Clin.Pract.Oncol.，2006，3，668-681，Dudley等人，J.Clin.Oncol.2008，26，5233-5239，和Dudley等人，J.Clin.Oncol.2005，23，2346-2357中，出于所有目的将其全部内容通过引用整体并入本文。

在某些实施方案中，在用抗原特异性淋巴细胞治疗之前对受试者进行免疫清除。例如，在输注通过本文所述方法产生的淋巴细胞之前，可以用非清髓性化学疗法对受试者进行预处理。在一个实施方案中，可以通过输注施用抗原特异性淋巴细胞群。在一个实施方案中，非清髓性化疗可以是环磷酰胺60mg/kg/d，持续2天(在抗原特异性淋巴细胞输注之前的第27和26天)和氟达拉滨25mg/m2/d，持续5天(在抗原特异性淋巴细胞输注之前的第27至23天)。在一个实施方案中，在根据本公开内容的非清髓性化疗和抗原特异性淋巴细胞输注(第0天)之后，受试者可以每8小时以720,000IU/kg接受静脉内IL-2的静脉内输注达到生理耐受性。在某些实施方案中，抗原特异性淋巴细胞群可与IL-2组合用于治疗癌症，其中IL-2在抗原特异性淋巴细胞群后施用。

本文所述的治疗方法可以与另外的免疫疗法和疗法组合。例如，当用于治疗癌症时，根据肿瘤的类型、患者状况、其他健康问题以及多种因素，本文所述的淋巴细胞可以与常规的癌症疗法例如手术、放射疗法、化学疗法或其组合结合使用。在某些方面，可用于与本文描述的抑制剂进行组合癌症治疗的其他治疗剂包括抗血管生成剂。已经鉴定了许多抗血管生成剂，并且是本领域已知的，包括例如TNP-470、血小板因子4、血小板反应蛋白-1、金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP1和TIMP2)、催乳素(16-Kd片段)、血管抑制素(纤溶酶原的38Kd片段)、内皮抑素、bFGF可溶性受体、转化生长因子β、干扰素α、可溶性KDR和FLT-1受体、胎盘增殖素相关蛋白、以及Carmeliet和Jain(2000)列出的蛋白。在一些实施方案中，本文描述的抑制剂可以与VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂例如抗VEGF抗体、VEGF变体、可溶性VEGF受体片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适体、中和抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶的抑制剂及其任何组合(例如抗-hVEGF抗体A4.6.1、贝伐单抗或兰尼单抗)组合使用。

可以用于联合治疗的化学治疗化合物的非限制性实例包括例如氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、天冬酰胺酶、bcg、比卡鲁胺、博来霉素、布舍瑞林、白消安、喜树碱、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐(clodronate)、秋水仙碱、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素、柔红霉素、二烯雌酚、己烯雌酚、多西他赛、阿霉素、表柔比星、雌二醇、雌莫司汀、依托泊苷、依西美坦、非格司亭、氟达拉滨、氟氢可的松、氟尿嘧啶、氟甲睪酮、氟他胺、吉西他滨、染料木黄酮(genistein)、戈舍瑞林、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素、伊立替康、ironotecan、来曲唑、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀，氮芥(mechlorethamine)、甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、氨甲蝶呤(methotrexate)、丝裂霉素、米托坦(mitotane)、米托蒽醌、尼鲁米特、诺考达唑、奥曲肽、奥曲肽、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇、帕米多、喷司他丁、普卡霉素(plicamycin)、卟吩姆(porfimer)、丙卡巴肼、雷替曲塞(raltitrexed)、利妥昔单抗、链脲佐菌素、苏拉明(suramin)、他莫西芬、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide)、睾酮、硫鸟嘌呤、塞替派、二氯钛烯(titanocene dichloride)、托泊替康(topotecan)、赫赛汀(trastuzumab)、维甲酸(tretinoin)、长春碱、长春新碱、长春地辛(vindesine)和长春瑞滨。

这些化学治疗化合物可以根据其作用机制分类为以下几组:抗代谢物/抗癌剂例如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨与阿糖胞苷)以及嘌呤类似物、叶酸拮抗剂与相关抑制剂(巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁以及2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖剂/抗有丝分裂剂，包括天然产物如长春花生物碱(长春碱、长春新碱以及长春瑞滨)；微管破坏剂如紫杉醇(紫杉醇，多西他赛)、长春新碱、长春碱、诺考达唑、埃博霉素以及诺维本、表鬼臼毒素(依托泊苷、替尼泊苷)、DNA损伤剂(放线菌素、安吖嗪、蒽环霉素、博莱霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环磷酰胺(cytoxan)、放线菌素、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、hexamethyhnelamine、奥沙利铂(oxaliplatin)、异环磷酰胺(iphosphamide)、美法仑、二氯噻吩、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、光辉霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、泰索帝、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)以及依托泊苷(VP16))；抗生素如放线菌素(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星、蒽环霉素、米托蒽醌、博来霉素、普鲁霉素(光辉霉素)以及丝裂霉素；酶(L-天冬酰胺酶，可以系统地代谢L-天冬酰胺，并去除不具有合成自身天冬酰胺能力的细胞)；抗血小板剂；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂如氮芥(mechlorethamine、环磷酰胺与其类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺与甲基三聚氰胺(methylmelamines)(六甲基三聚氰胺(hexamethylmelamine)与塞替派(thiotepa))、烷基磺酸酯类-白消安、亚硝基脲(卡莫司汀(BCNU)与其类似物、链脲佐菌素)、三氮烯-达卡巴嗪(trazenes-dacarbazinine)(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢物如叶酸类似物(氨甲蝶呤)；铂配合物(platinum coordinationcomplexes)(顺铂、卡铂)、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦、氨鲁米特；激素、激素似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)以及芳香酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝血剂(肝素、合成肝素盐以及其他凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(如组织纤溶酶原活化剂、链激酶与尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫(dipyridamole)、噻氯匹定(ticlopidine)、氯吡格雷(clopidogrel)、阿昔单抗(abciximab)；抗迁移剂；抗分泌剂(breveldin)；免疫抑制剂(环孢菌素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(例如TNP-470、染料木黄酮、贝伐单抗)以及生长因子抑制剂(例如成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻断剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗)；细胞周期抑制剂以及分化诱导剂(维甲酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、放线菌素D(dactinomycin)、eniposide、柔比星、依托泊苷、伊达比星、米托蒽醌、托泊替康，伊立替康)、皮质类固醇(可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松以及泼尼松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导因子以及胱天蛋白酶激活因子；与染色质破坏物。

本文公开的组合物还可包含佐剂，例如铝盐和其他矿物佐剂，张力活性剂，细菌衍生物，媒介物和细胞因子。佐剂也可以具有拮抗的免疫调节特性。例如，佐剂可以刺激Th1或Th2免疫力。本文公开的组合物和方法还可包括辅助疗法。

药物组合物、剂型和给药

本文还公开了药物组合物，其包含通过本文所述的方法产生的新抗原特异性淋巴细胞群以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。另外，本文公开了包含本文所述病毒颗粒的药物剂型。

如本文所讨论的，本文所述的假型病毒颗粒可用于各种治疗应用(体内和离体)和用作研究工具。

可以使用一种或多种生理上可接受的载体和/或赋形剂以任何常规方式配制基于通过本文公开的方法产生的新抗原特异性淋巴细胞群的药物组合物。可将淋巴细胞配制成用于通过例如注射，肠胃外，阴道，直肠施用或通过直接施用于肿瘤的施用。

可以将药物组合物配制成通过注射例如通过推注或连续输注进行肠胃外给药的形式。注射用制剂可以单位剂型提供，例如在安瓿瓶或多剂量容器中，并可选地具有添加的防腐剂。药物组合物可以进一步配制成在油性或水性运载体中的悬浮液、溶液或乳剂，并且可以包含其他试剂，包括悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

适用于注射用途的药物形式可以包括无菌水溶液或分散液；包括芝麻油，花生油或丙二醇水溶液的配方；以及用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉剂。在所有情况下，该形式必须是无菌的并且必须是流体。它必须在制造条件和某些存储参数(例如冷藏和冷冻)下保持稳定，并且必须进行防腐以防微生物(例如细菌和真菌)的污染。

如果本文公开的制剂用作在受试者中增强免疫应答的治疗剂，则可以将治疗剂配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，与无机酸例如盐酸或磷酸形成，或与有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，以及有机碱例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。

载体也可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。可以通过本领域已知的各种抗菌剂和抗真菌剂来预防微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。

在配制时，可以以与剂量制剂相容的方式和以治疗有效的量来施用溶液。给药的剂量范围和频率可以根据通过本文所述的方法产生的新抗原特异性淋巴细胞群的性质和医学状况以及具体患者的参数和所使用的给药途径而变化。

在一些实施方案中，可以将本文所述方法产生的新抗原特异性淋巴细胞群以约10⁷至约10¹²的剂量施用于受试者。更准确的剂量还可以取决于被施用的受试者。例如，如果受试者是青少年，则可能需要较低的剂量，而如果受试者是成人，则可能需要较高的剂量。在某些实施方案中，更准确的剂量可以取决于受试者的体重。

实施例部分

还通过以下实施例描述和证明本发明。然而，在说明书中任何地方使用这些和其他实施例仅是说明性的，绝不限制本发明或任何示例性术语的范围和含义。同样，本发明不限于这里描述的任何特定的优选实施方案。实际上，在阅读本说明书后，本发明的许多修改和变化对本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下进行这种变化。因此，本发明仅由所附权利要求的条款以及那些权利要求的等同物的全部范围来限制。

实施例1

材料和方法

非同义肿瘤突变的鉴定

使用DNeasy试剂盒(Qiagen)从冷冻保存的肿瘤组织和匹配的外周血单核细胞(PBMC)中分离基因组DNA，并使用HiSeq2500 Illumina平台进行全外显子组捕获和配对末端测序。通过使用由基因组作图工具fetchGWI27和随后的详细序列比对工具align0组成的软件管道，从外显子组读数和参考人类基因组hg19调用体细胞变异体。避免任何类型的不确定性预测因素，优先考虑将假阴性最小化的途径，并且与GATK的交叉比较(作为自愿变异检测/预测方法)达到了96％以上的一致性。肿瘤样本中存在而相应血液样本中不存在的变异被认为是体细胞变异。

分离新抗原特异性T细胞

使用内部可逆多聚体(NTAmers)，对循环和浸润肿瘤的新抗原特异性CD8+T细胞进行FACS分选(参见美国专利号10,023,657，出于所有目的整体并入本文)。

新抗原预测

使用netMHC算法v3.4(Lundegaard等人，Nucleic Acids Research 36，W509-512(2008))进行掺入体细胞非同义突变的所有候选肽对I类HLA等位基因的结合预测。在Protein and Peptide Chemistry Facility(PPCF)，University of Lausanne合成预测结合亲和力≤500nM的候选新抗原肽(即在每个可能位置含有体细胞性改变的残基的9聚和10聚突变肽序列)以及它们的野生型天然预测肽(HPLC纯度>90％)。

TIL的扩增和研究

如其他地方(Dudley等，JImmunother 2008)所述，由肿瘤酶促消化物和肿瘤片段产生常规的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。具体来说，将单细胞肿瘤悬液以1x10⁶个细胞/孔的密度接种在p24孔板中的完全培养基(CM)中，该培养基由补充8％人血清AB(Biowest)、1％Hepes1M(Amimed)、1％非必需氨基酸(Invitrogen)、1％丙酮酸钠100mM(Invitrogen)、2mML-谷氨酰胺(BioConcept)、1％100U/mL青霉素-100μg/mL链霉素(BioConcept)+1％₀β-巯基乙醇50mM(Invitrogen)、100μg/mL卡那霉素和6000IU/mL hrIL-2(GlaxoSmithKline)的RMPI 1640Glutamax(Gibco)组成。或者，将1-2mm³的单个肿瘤块置于p24孔的每个孔中，并在CM中培养。从培养开始后第2天开始，将板置于37℃和5％CO₂下，并且一半培养基每周更换3次，无论是否可见淋巴细胞生长。在通常的2-3周内，将TILs培养物的密度维持在1x10⁶个细胞/mL，然后收集细胞并合并。这种细胞群是pre-REP TIL。

引发的TIL类似于常规TIL生成，但具有以下修改:对于肿瘤消化物在第0天、对于肿瘤片段在第0、2和4天向培养物中添加预测肽的汇集物，每种1M(最多50种肽/汇集物，终浓度0.5％DMSO(Chevalier，Bobisse等人，Oncoimm 2015))。引发是在pre-REP阶段开始时进行的。由于肿瘤物质的限制，每个汇集物接种较少的重复(孔)。当描述时，在TIL培养的整个过程中，向CM中补充10μg/mL抗PD1 mAb(eBiosciences)和10μg/mL抗CTLA-4 mAb(Ipilimumab，Bristol-Myers)(即图1和2)。

通过pre-REP TILs上的IFNγELISpot测试了针对预测的新抗原的T细胞反应性。在≥2个独立实验中证实了阳性。使用预包被的96孔ELISpot板(Mabtech)进行ELISpot分析，并使用Bioreader-6000-E(BioSys)进行计数(Harari等，The Journal ofExperimental Medicine 205，63-77(2008))。

实施例1和2(以下)中使用的肽列于表1。

结果与讨论

尽管常规的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增方法已很好地应用于黑色素瘤患者，但可能需要优化TIL培养物以最大程度地回收新抗原特异性T细胞克隆或在新抗原特异性T细胞中富集TIL培养物。为此，本实施例试图优化TIL扩增方法，以有利于新抗原特异性T细胞的扩增。上述目标是通过多种策略实现的。

通过免疫检查点阻滞改善抗肿瘤反应是治疗晚期实体恶性肿瘤的新方法。特别地，用抗PD1和抗CTLA4抗体进行治疗可带来重大的临床益处。其他研究表明，表达PD1的TIL富含新抗原特异性T细胞。基于该证据，本实施例测试了抗PD1和抗CTLA4抗体的组合添加是否会导致TIL培养物中新抗原特异性T细胞的富集。酶解处理并用IL-2、抗PD1抗体和抗CTLA4抗体处理卵巢癌患者的重悬肿瘤细胞，然后研究它们对所有预测I类新抗原的合成9聚体和10聚体肽(汇集物中50-100种不同肽)的反应性。数据显示，添加抗PD1和抗CTLA4抗体不会导致TIL培养物中新抗原特异性T细胞的富集(图1A)。

接下来，使用来自卵巢癌患者的重悬肿瘤细胞，在pre-REP启动时添加预测新抗原的汇集物(所有预测的I类新抗原的合成9聚和10聚肽汇集物)的效果经过测试。与在常规条件下(即单独的IL-2)培养的TIL相比，用预测新抗原的汇集物培养的TIL富含新抗原特异性T细胞(图1B)，包括识别相同的新抗原(图2A；右上图中的TIL数量显示，常规方法中可检测到的TIL数量为0.13，而在引发的TIL中增加至3.32)或在常规扩增方案中无法检测到的新的新抗原(图2B)的T细胞克隆频率明显更高。

使用特异性肽-MHC多聚体证明了新抗原特异性T细胞的富集。综上所述，与相同患者产生的常规TILs相比，在新抗原特异性T细胞(例如，CD8+T细胞；图3)的大小和广度方面，用预测新抗原的汇集物培养的TILs显著富集了新抗原特异性T细胞。

接下来，确定是否可以使用肿瘤片段而不是由肿瘤酶促消化产生的TIL来扩增新抗原特异性的TIL。将来自黑色素瘤患者的肿瘤片段与单独的IL-2或IL-2合并预测新抗原汇集物一起培养，然后分析对预测新抗原汇集物的反应性。与卵巢癌样品一致，在用预测的新抗原培养的TIL中，针对预测新抗原汇集物的反应性更高(图4)。

总的来说，与从相同患者产生的常规TIL相比，用预测新抗原汇集物培养的TIL显著富集了新抗原特异性T细胞。当起始材料是重悬的肿瘤细胞或肿瘤片段时，用预测新抗原汇集物培养的TIL显著富集了新抗原特异性T细胞。当起始材料来自黑色素瘤或卵巢癌时，用预测新抗原汇集物培养的TIL会明显富集新抗原特异性T细胞。

在与预测新抗原汇集物一起培养的TIL中，新抗原特异性T细胞的大小和广度都增加了。用预测新抗原汇集物培养的TILs中新抗原特异性T细胞的富集是定量的和定性的，并已使用多种工具进行了证明，包括直接用肽-MHC多聚体进行枚举，通过IFN-γELISpot对产生细胞因子的细胞进行定量和通过多重生物测定(例如MSD)确定多种细胞因子的产生。

实施例2

实施例1依赖于使用源自I类预测新抗原的9聚体和10聚体合成肽，其限于研究CD8+TIL应答。因此，实施例1没有研究潜在的CD4+新抗原应答。鉴于II类新抗原的临床相关性及其在某些肿瘤中的发生频率[15,16]，本实施例研究了这种TIL产生的途径。为了研究CD4+新抗原应答的潜力，采用了串联小基因(TMG)方法。TMG是由可变数量的小基因(最多15个)组成的DNA序列，每个小基因编码一个25-31聚体，其中心是通过全外显子组测序鉴定的单个突变氨基酸(图6A)^8、17、18。将TMG克隆到合适的表达载体中，将其用作模板以产生体外转录(IVT)mRNA，然后将其电穿孔到抗原呈递细胞(APC)中(图6B)。在本实施例中，APC是源自所述患者的CD40激活的B细胞。重要的是，使用患者的自体专业APC(例如树突状细胞DC或CD40激活的B细胞)可以在患者自身的I类和II类人类白细胞抗原(HLA)等位基因的背景下呈递新抗原，由此直接研究患者的CD4+和CD8+T细胞(图6B)。为了在TIL培养物中进一步富集新抗原特异性T细胞，在pre-REP阶段测试了自体工程化B细胞(用编码不同新抗原的mRNA瞬时转染)(图6B)。

材料和方法

IVT mRNA的产生

从Geneart(Thermofisher Scientific)订购了串联编码5个小基因(TMG)并且上游有T7启动子、下游有非翻译区(UTR)的质粒DNA结构(图7)(增加mRNA稳定性的作用)。五个小基因包含五个31聚体，在第16位具有突变，这些31聚体被非免疫原性的甘氨酸/丝氨酸接头隔开(序列详细描述于图7中)^11,19。所得到的TMG旁接一个信号肽(SP)和I类MHC运输信号(MHC-class I trafficking signals，MITD)²⁰(图7)，以通过I类和II类途径加工和呈递每个31聚体。用限制酶Hind III将DNA线性化，用苯酚:氯仿纯化，并用乙醇沉淀。分光光度定量后，使用mMAchinemMessage T7 Ultra试剂盒(Thermofisher Scientific)将1g线性化的DNA用作模板进行体外转录和聚腺苷酸化。根据制造商的说明，用LiCl沉淀得到的IVTmRNA。在变性条件下通过凝胶电泳验证了聚腺苷酸化和完整性。最终通过Qbit荧光计(Thermofisher Scientific)对mRNA进行定量。4-1BBL和OX-40L先前已克隆到pCMV6载体(Addgene)的多克隆位点中。IL-12alpha/P2A/IL-12beta核苷酸序列在GeneArt订购，并合成和克隆到pMA-RQ质粒中T7启动子下游。有关免疫调节子的序列，请参见图21-23。线性化后，每个分子的整个编码区已按照TMG所述进行了逆转录。在某些情况下，实验中使用的TMG由总共5个小基因组成，其中一个编码同源抗原，而另外四个可能不具有反应性。这样做是为了能够以最具成本效益的方式将相同的基因构建体用于不同的患者样品。

自体CD40激活的B细胞的生成

使用重组多聚体CD40-配体(mCD40-L)(Adipogen)和hrIL-4(Miltenyi)产生自体B细胞(图6B)。首先从自体的冷冻PBMC或血液分离术样本中采用微珠(Miltenyi)阳性选择CD19+细胞来分离B细胞。然后将CD19+细胞在B细胞培养基中培养10至14天，以扩增活化的CD40-B细胞。B细胞培养基由补充有8％人血清、1μg/ml mCD40-L和200IU/ml hrIL-4的RPMI组成。

将IVT mRNA电穿孔进入APC

在用未分选的PBMC共培养测定之前或在TIL产生测定之前，将CD40激活的B细胞在补充有8％人血清和200IU/ml hrIL-4的RPMI中静置过夜。收集CD40活化的B细胞，并用PBS轻轻洗涤两次，然后将它们用Nepen电穿孔试剂盒(Thermofisher Scientific)的缓冲液T以10-15e6细胞/ml的浓度悬浮在Eppendorf管中。每次电穿孔100,000-150,000细胞，添加1μg IVT mRNA。然后用Neon电穿孔移液器(Thermofisher Scientific)在10μl(0.1-0.15e6细胞)或100μl(1-1.5e6细胞)吸头中收集细胞，并通过Neon系统(ThermofisherScientific)用以下参数进行电穿孔:1400V，20ms，2个脉冲。立即将细胞添加至从mCD40-L中消耗的预热B细胞培养基(如上所述)。将电穿孔的细胞在37℃下孵育4至17小时(过夜)，并在共培养测定或TIL产生测定之前用RPMI洗涤两次。

APC的肽脉冲

对于最小的抗原加载(即，对于I类抗原为9-10聚体，对于II类抗原为12-15聚体)，收集细胞，用RPMI洗涤两次，并以1e6个细胞/ml用RPMI 1％人血清(补充肽或肽汇集物)重悬。将9-10聚体和12-15聚体与B细胞分别以1μg/ml和2μg/ml孵育(即预加载)。将细胞在37℃下孵育1-2小时，并在用于共培养实验之前使用RPMI洗涤两次。对于长肽预加载(即31聚体)，收集APC，用RPMI洗涤两次，并用补充1至20μg/ml长肽的RPMI 8％人血清(补充了200IU/ml hrIL4(Miltenyi))的RPMI以1e6细胞/ml重悬。然后将APC在37℃下孵育16-20小时(例如过夜)，并在用于共培养测定前用RPMI洗涤两次。

共培养测定法：IFNγELISPOT测定法和细胞内细胞因子染色

使用预包被的96孔ELISpot板(Mabtech)进行ELISpot分析，并用Bioreader-6000-E(BioSys)计数。在ELISpot中使用APC刺激肿瘤特异性TIL或ELA克隆(识别MelanA肽的E细胞克隆)时，将3e4 APC(自体B细胞或HLA匹配的细胞系)与1-2e3特异性T细胞共培养。在筛选条件下，用2.5e4至1e5的自体B细胞(分别为4:1至1:1的比例)分析0.5-1.5e5的总TIL(富集或未经富集)。还可以通过在ELISpot孔中直接添加所述肽(最小肽或长肽)来分析TIL(即肽加标)。16至20小时后，根据制造商的说明对ELISpot平板显色。

对于ICS，用brefeldinA(BD Biosciences)在RPMI 8％人血清中以1:1或2:1的比例将T细胞与B细胞一起铺板。16至18小时后，收获细胞并用抗CD3、抗CD4、抗IFN、抗TNF(BDbiosciences)、抗CD137(Miltenyi)和活性染料(Thermofisher Scientific)染色。在四激光Fortessa和FACSCanto(BD Biosciences)细胞分析仪上获得染色的细胞。

pre-REP：生成TIL

通过在p24孔板中以1e6个细胞/孔的密度在补充了8％人血清和hrIL-2(6000IU/ml)、同时不添加(常规)或添加(肽引发的)1μg/ml I类预测肽(≤50种肽的汇集物)的RMPI中将解离的完全肿瘤铺板，由肿瘤酶促消化物产生TILs。当在pre-REP启动时在转染的B细胞存在下产生TIL时，将解离的肿瘤以每孔5e5个细胞的密度与2.5-5e5 B细胞(B细胞引发)一起铺板。B细胞是未被转染的或被编码新抗原的mRNA转染。随后，每2-3天更换一半培养基，并将TIL保持在1-2e6/ml的密度。通过IFN-γELISpot在pre-REP TILs上测试了针对预测的新抗原的T细胞反应性。进行描述时，在整个TIL培养期间，向培养基中添加了10μg/mL抗PD1 mAb(eBiosciences)和10μg/mL抗CTLA-4 mAb(Ipilimumab，Bristol-Myers)(即图10、12、14(仅第3和4行)和15(CDC20和SGOLI)。

结果与讨论

首先，通过与在pre-REP阶段脉冲的APC(即预加载肽)相比，对电穿孔的APC(即TMG-APC)产生的抗原刺激水平进行比较，验证了转染的APC对HLA I类和II类模型抗原的加工和呈递。如描绘了代表性实验的图8突出显示的，TMG-APC在pre-REP阶段产生的抗原刺激水平与在pre-REP阶段期间用1μM MelanA肽(常规I类肽脉冲浓度)脉冲的APC相似。实际上，对于两个准备好的APC汇集物，IFN斑点数和具有上调的激活标记物CD137的T细胞克隆的百分比都在相同范围内。

但是，由于图8A中使用的模型细胞是ELA克隆，下一步是用来自患者CTE-009的肿瘤样品-卵巢多克隆COPG2_T37I肽引发的TIL(即对其通过添加肽汇集物进行pre-REP的新抗原TIL)挑战TMG方法的敏感性(图8B)。同样地，用1μM肽脉冲的CD40激活的B细胞和mRNA转染的B细胞均产生相似水平的抗原刺激。后面的细胞分析提供了HLA I类抗原加工以及通过TMG mRNA引入的含有突变的31聚体的呈递的证据。

为了证明HLA II类抗原的加工和呈递，使用了模型抗原:病毒和肿瘤相关抗原。与应用于HLA I类抗原的方法类似，比较了脉冲的APC和电穿孔的APC产生的抗原刺激水平。如图9A和图9B所示，实现了病毒抗原(图9A)和肿瘤相关抗原Mage-A3(图9B)的加工和呈递。重要的是，这表明TMG方法可用于筛选HLA I类和II类新抗原反应性。这不仅使它可以独立于预测算法，而且还具有自体APC对推定的新抗原进行加工的额外证据。

接下来，与基于肽引发(添加肽汇集物)的已经建立的富集方法相比，测试了在pre-REP起始时添加TMG转染的自体CD40激活的B细胞。为了从患者CTE-006生成TIL，将添加3种肽的汇集物(每种浓度为1μg/ml)与添加CD40激活的B细胞(APC，图10B)进行比较，以及与添加用编码相同的三种新抗原的mRNA电穿孔的B细胞(TMG B细胞)进行比较。每100,000个pre-REP TIL有约70个IFNγ斑点显示了肽汇集物的富集(图10A，灰色条)。值得注意的是，通过将第0天(D0)的TMG电穿孔B细胞以1:1的比例添加到RE-REP TIL中(TMG B细胞1:1，图10B)，可以进一步富集新抗原特异性T细胞，如图所示，超过100,000个pre-REP TIL上有约100个IFNγ分泌细胞，比仅与新抗原汇集物一起孵育高出两倍。

应当注意的是，后者(即TMG-B细胞，比例为1:1)是最佳条件，并且在pre-REP的D5用TMG-B细胞1:1进行第二轮刺激没有进一步的富集(TMG B细胞1:1R，图10A)。有趣的是，新抗原特异性TIL也可以通过添加未刺激的(未转染的)自体CD40激活的B细胞来富集(尽管程度较低)(图10B，APC)。不受理论的束缚，B细胞的活化可能足以改善该过程。但是，当使用新抗原肽或TMG时，该过程更好，而当使用共刺激分子(OX40L，41BBL，IL12)时，该过程更好。

工程化的B细胞成功表达OX40L和41BBL，并分泌了大量的IL-12(图11)。

除TMG之外，与编码OX40L、41BBL和IL-12的mRNA共电穿孔的B细胞的使用还导致新抗原特异性T细胞的频率进一步增加(图12:TMG-APC和工程化TMG-APC之间的比较)。同样，在pre-REP起始后的第10天用编码OX40L、41BBL和IL-12的mRNA共电穿孔的B细胞以及TMG一起进行重新刺激步骤能够进一步增加新抗原特异性T细胞的频率(图12和14)。值得注意的是，还可以通过在TIL培养开始时添加B细胞以及含有新抗原的长肽来富集新抗原特异性T细胞(图12)。

重要的是，在TIL产生过程中添加B细胞似乎可以提高pre-REP的产量，这可以通过存在B细胞(无论是否工程化，图13)的倍数扩增说明。

最后，在不同肿瘤类型、不同来源的肿瘤细胞中实现了TIL培养物中新抗原特异性T细胞的富集。特别是，在卵巢癌患者(CTE-006和CTE-007)、结直肠癌患者(CrCp5)和黑素瘤患者(Mel0011)中一致地观察到富集(图14)。此外，解离的肿瘤细胞(卵巢癌:图14，第三和第四行；图15，CDC20和SGOL1)以及肿瘤片段(黑素瘤:图14，第一行；图15，NBEA；结直肠癌:图14，第二行；图15，PHLPP2)都证明了适合用于TIL富集(图14-15)。

总体而言，这些数据表明TIL富集新抗原特异性T细胞是:1)仅通过可溶性肽即可实现；2)通过添加B细胞得到改善；3)通过添加用肽脉冲的B细胞得到改善；4)通过添加用编码新抗原的TMG电穿孔的B细胞得到改善；5)通过添加用编码OS40L、41BBL和/或IL-12的载体工程化的B细胞得到改善；6)通过增加或多轮B细胞刺激得到改善；7)适合于解离的肿瘤细胞或肿瘤碎片；8)适合于多种肿瘤适应症，包括但不限于卵巢、结肠直肠和黑素瘤；和9)适合加入抗PD1和/或抗CTLA-4抗体治疗。

实施例3

TIL消耗的分析

本文所公开的方法导致较低的TIL消耗发生。在一些实施方案中，新抗原的存在(直接的或通过APC的)导致较低的TIL消耗频率。

为了评估TIL的消耗情况，可以将全局基因表达谱用于将通过常规方式(例如，在pre-REP阶段仅IL-2)生成的TIL与通过常规方式添加新抗原(例如，富集的)生成的TIL进行比较。使用一致性分层聚类分析基因表达谱可显示富集样品和常规样品的不同簇，其几乎准确地对应于未消耗和消耗的TIL，表明本文描述的实施方案自pre-REP阶段以来提高了TIL的质量。基因表达谱的分析将显示与微阵列非常相似的结果。预期富集的和传统的TIL将显示不同的基因表达簇，并且这些簇将分别对应于未消耗和消耗的TIL。检查差异表达基因的列表可能会揭示在T细胞生物学中具有已知作用的基因，包括抑制性受体PD-1和CTLA-4的表达增加，它们随着消耗而上调。

为了鉴定在引发的TIL与传统的TIL中具有不同活性的生物学过程，可以使用基因集的基因本体集合进行基因集富集分析。

另外，可以分析细胞表面蛋白的表达以确定T细胞消耗标记的存在情况。T细胞消耗与下述相关：i)多种抑制性受体如PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、2B4/CD244/SLAMF4、CD160、TIGIT、TCF1、CD39、BATF的表达；ii)IL-2产生、增殖能力、细胞溶解活性的丧失；iii)TNFalpha，IFNgamma和cc(beta)趋化因子的产生受到损害；iv)脱粒和颗粒酶B的高水平表达；v)对IL-7或IL-15反应差；vi)GATA-3、Bcl-6和Helios的表达改变；vii)T细胞表型的改变(例如T细胞显示T滤泡辅助细胞表型)；viii)细胞死亡。

因此，可以对通过本文所述的方法和常规方法产生的pre-REP TIL中的这些消耗标记进行比较分析，以确定哪个组或多或少被消耗。

可以通过在刺激之前用细胞增殖追踪剂(例如CFSE)标记TIL，在体外确定引发的与常规的TIL进一步扩增的能力。

通过将TILs过继转移到小鼠模型中，可以在体内确定引发的合常规的TILs进一步扩增的能力。

可以使用不同的表面和细胞内标记物(例如TMRM或mitotracker)来确定引发的TIL与传统的TIL的适合度和干度(stemness)。

实施例4

TIL的稀释作用

用于产生新抗原特异性TIL的常规TIL方法受到限制，因为这样的方法可能不能有效地仅仅扩增新抗原特异性TIL，因此新抗原特异性TIL被稀释了。

在常规方法的pre-REP阶段中，TILs在肿瘤和其他细胞上扩增而不富集。这导致对共享或免疫优势抗原具有反应性的TIL数量急剧增加，而对与新抗原反应的TIL的作用有限。

由于这个问题，常规方法需要一种选择与新抗原反应的TIL的方法(例如确定TIL等分试样的反应性)。因此，本文所述的方法不需要选择TIL的方法，因为没有稀释作用。例如，利用常规的TIL扩增方案，新抗原反应性TIL趋于扩增，但比其他淋巴细胞少，因此被稀释。在本文公开的方法中，新抗原特异性淋巴细胞被特异性刺激，更好地扩增，并在pre-REP结束时以及最终REP达到更高的频率。

为了更好地理解这个概念，可以假设在第0天，TIL培养物中有18个识别已知抗原A的T细胞，9个识别已知抗原B的T细胞，2个识别新抗原X的T细胞和3个识别新抗原Y的T细胞。假设指数细胞生长为2x10^3，那么在传统方法中，TILs培养物对于已知抗原A将有5832个T细胞，对于已知抗原B将具有729个T细胞，对于新抗原X具有8个T细胞，对于新抗原Y具有27个T细胞。因此，对新抗原X和Y具有反应性的级分将在细胞培养物中被稀释以有利于已知的抗原A和B。然而，本文公开的方法提供了对新抗原反应性T细胞的富集，因此对新抗原X和Y具有反应性的级分未被稀释。

为了证明和确定这种稀释作用(在常规方法观察到的)的减少和/或不存在，可以将稳定表达荧光蛋白的免疫细胞注射入免疫受损的动物模型中(例如，将其移植到免疫受损的小鼠模型中)。该动物模型具有可通过荧光蛋白追溯的免疫系统。然后通过注射肿瘤细胞例如B16黑色素瘤使动物模型受到肿瘤攻击。荧光免疫细胞将到达肿瘤部位以浸润组织。

现在可以用本文描述的方法加工具有荧光肿瘤浸润淋巴细胞的肿瘤片段，并且可以确定抗原特异性TIL的频率以及倍数增加。例如，可以用荧光染料标记细胞，荧光染料可以确定细胞的增殖史，并将抗原特异性细胞的增殖史与其他淋巴细胞的增殖史进行比较。相对于其他淋巴细胞，新抗原特异性淋巴细胞的相对增殖将表明新抗原特异性的增殖是否较少(即被稀释)。结果将表明，在常规方法中，新抗原特异性细胞的频率被“稀释”了。

可以纯化在pre-REP结束时鉴定的新抗原特异性TIL，并根据T细胞受体(TCR)序列分析其组成。然后可以检测来自新抗原特异性TIL的特定TCR序列，并在原发肿瘤中定量以估计其频率。换句话说，在适应性转移到患者体内后，富集的TILs比传统方法扩增的TILs更好地浸润肿瘤。证明这一点的一种方法是确定从以常规或富集条件扩增的TIL获得的淋巴细胞的TCR序列，并确定来自患者的肿瘤活检中这种TCR的相对和绝对频率。在患者过继转移后，可以比较使常规方法与引发方法从新抗原特异性TIL中得到的TCR序列的相对扩增倍数。

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本发明的范围不受本文描述的具体实施方案的限制。实际上，除了本文描述的那些之外，根据前述描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。

本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其他材料通过引用整体并入本文，就如同其物理性地存在于本说明书中一样。

Claims (124)

1.一种离体扩增抗原特异性淋巴细胞的方法，包括:

a)扩增获自受试者的样品中的淋巴细胞或从这样的样品分离的淋巴细胞，其中扩增包括至少两个阶段的扩增；

b)在所述至少两个扩增阶段的至少第一阶段中添加一种或多种肽，其中每种所述肽包含不同的抗原，并且其中抗原特异性淋巴细胞被扩增。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两个阶段的扩增包括第一扩增和第二扩增。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第二扩增在CD3复合激动剂、促细胞分裂剂或饲养细胞中的至少一种的存在下进行。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤b)包括在所述至少两个阶段的扩增中的至少一个阶段期间添加两种或更多种肽，其中，每种所述肽包含不同的抗原。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤b)包括在所述至少两个阶段的扩增中的至少一个阶段期间添加所述肽。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤b)还包括重新添加所述肽至少一次。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤b)还包括在所述第一次添加后每天重新添加所述肽。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤b)还包括在所述第一次添加之后每隔一天重新添加所述肽。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中在所述第一天之后至少两天重新添加所述肽。

10.根据权利要求2-9中任一项所述的方法，其中所述肽在所述第二扩增期间不存在。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述肽为可溶形式。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述肽的浓度为约0.1nM至约100μM。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述肽以约1μM的浓度存在。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述肽在所述第一扩增的开始时被添加。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述肽在所述第一扩增的起始时以及隔天添加两天。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述肽存在于抗原呈递细胞(APC)的表面上。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述样品中存在的细胞与APC的比率为约1:1至约1:100。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述比率是大约1:1。

19.根据权利要求16的方法，其中淋巴细胞与APC的比例为约0.01:1至约100:1，其中所述淋巴细胞是从样品中分离的。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述比率是大约1:1。

21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其中在所述第一扩增的开始时添加所述APC。

22.根据权利要求16至21中任一项所述的方法，其中所述APC已经与可溶形式的所述肽一起预孵育。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，所述肽的长度为约9个氨基酸至约31个氨基酸。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述肽长9或10个氨基酸。

25.根据权利要求23所述的方法，其中所述肽长12至15个氨基酸。

26.根据权利要求23所述的方法，其中所述肽长约25至约31个氨基酸。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述肽存在于约2至约300种不同肽的库中。

28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述肽存在于约2至约100种不同肽，约10至约100种、约20至约100种、约30 至约100种、约40至约100种、约50至约100种，约60至约100种、约70至约100种、约80至约100种或约90至约100种不同肽的库中。

29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述肽存在于约20至约50种不同肽的库中。

30.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述肽存在于约2至约10种不同肽的库中。

31.根据权利要求1-28和30中任一项所述的方法，其中所述肽存在于约2至约5种不同肽的库中。

32.如权利要求16-31中任一项所述的方法，其中所述APC已经被工程化而在其表面上表达所述肽。

33.根据权利要求32所述的方法，其中通过转染、转导或暂时性细胞膜破坏中的至少一种来工程化所述APC，以将至少一种编码所述肽的多核苷酸引入所述APC。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述至少一种多核苷酸是编码所述肽的DNA质粒和/或mRNA。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述mRNA包含约50至约5000个核苷酸。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述mRNA包含约75至约4000、约75至约3000、约75至约2000、约75至约1000、约75至约500个核苷酸。

37.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含1至约15个编码所述肽的基因。

38.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中，所述多核苷酸基本上由编码单个肽的一个基因组成。

39.根据权利要求34-37中任一项所述的方法，其中所述mRNA是至少一种多核苷酸，其包含串联的编码所述肽的至少两个基因。

40.根据权利要求34-37中任一项所述的方法，其中所述mRNA是包含串联的编码所述肽的至少两个基因的单个多核苷酸。

41.根据权利要求39或40所述的方法，其中总共存在约2至约40个编码肽的基因。

42.根据权利要求39-41中任一项所述的方法，其中总共存在约2至约15个编码肽的基因。

43.根据权利要求39-42中任一项所述的方法，其中总共存在约2至约5个编码肽的基因。

44.根据权利要求34-37或39-43中任一项的方法，其中每个多核苷酸包含5个编码肽的基因。

45.根据权利要求37-44中任一项的方法，其中每个基因编码长约9至约31个氨基酸并且以抗原内发现的单个突变氨基酸为中心的多肽。

46.根据权利要求34-37或39-43中任一项所述的方法，其中所述基因被接头分开。

47.根据权利要求16-44中任一项的方法，其中所述APC被工程化以表达至少一种免疫调节剂，其中所述免疫调节剂是下述中的至少一种:OX40L、4-1BBL、CD80、CD86、CD83、CD70、CD40L、GITR-L、CD127L、CD30L(CD153)、LIGHT、BTLA、ICOS-L(CD275)、SLAM(CD150)、CD662L、白介素-12(IL-12)、白介素-7(IL-7)、白介素-15(IL-15)、白介素-17(IL-17)、白介素-21(IL-21)、白介素-4(IL-4)、Bcl-6、Bcl-XL、BCL-2、MCL1、或STAT-5或者JAK/STAT途径、PI3K-AKT信号传导途径、BCR信号传导途径或BAFF-BAFFR信号传导途径中的至少一种的激活剂。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述免疫调节剂是OX40L、4-1BBL或IL-12中的至少一种。

49.根据权利要求47或权利要求48所述的方法，其中通过转染、转导或暂时性细胞膜破坏中的至少一种来工程化所述APC，以引入所述至少一种免疫调节剂。

50.根据权利要求47-49中任一项所述的方法，其中所述APC经工程化以瞬时表达所述免疫调节剂。

51.根据权利要求47-49中任一项所述的方法，其中所述APC经工程化以稳定表达所述免疫调节剂。

52.根据权利要求47-51中任一项所述的方法，其中所述APC在所述第一扩增的开始时被添加，并且还在至少另外一天添加。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述APC在第一扩增开始时添加，并且在第一次添加之后10天再次添加。

54.根据权利要求33-53中任一项所述的方法，其中通过电穿孔进行转染。

55.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中所述肽已经通过预测建模来鉴定。

56.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中所述肽已经通过全外显子组测序、全基因组测序或RNA测序来鉴定。

57.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中所述肽已经通过质谱法鉴定。

58.根据权利要求1-57中任一项的方法，其中已经基于鉴定抗原特异性突变来预先选择所述抗原。

59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述抗原已经基于鉴定抗原特异性突变而预先选择

60.根据权利要求1-59中任一项的方法，其中步骤a)包括在至少一种扩增促进剂的存在下扩增淋巴细胞。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述扩增促进剂中的至少一种是免疫调节剂。

62.根据权利要求60所述的方法，其中所述扩增促进剂中的至少一种是细胞因子。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述细胞因子是白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素15(IL-15)、白介素17(IL-17)或白介素21(IL-21)中的至少一种。

64.根据权利要求60所述的方法，其中所述至少一种扩增促进剂是可溶性分子。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述可溶性分子是PD-1、CTLA-4、4-1BB、LAG-3、TIM-3、2B4/CD244/SLAMF4、CD160、TIGIT、TCF1、CD39或BATF中的至少一种的拮抗剂。

66.根据权利要求60所述的方法，其中所述扩增促进剂中的至少一种是促进淋巴细胞扩增的抗体。

67.根据权利要求66所述的方法，其中所述促进淋巴细胞扩增的抗体是针对PD-1、CTLA-4、4-1BB、LAG-3、TIM-3、2B4/CD244/SLAMF4、CD160、TIGIT、TCF1、CD39或BATF中至少一种的抗体。

68.根据权利要求67所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。

69.根据权利要求60-68中任一项所述的方法，其中所述扩增促进剂中的至少一种是IL-2。

70.根据权利要求69所述的方法，其中在第一扩增期间IL-2以约100IU/ml至约10,000IU/ml的范围存在。

71.根据权利要求70所述的方法，其中IL-2在第一扩增期间以约6,000IU/ml的浓度存在。

72.根据权利要求69-71中任一项所述的方法，其中在第二扩增期间IL-2以约50IU/ml至约10,000IU/ml的范围存在。

73.根据权利要求72所述的方法，其中IL-2在第二扩增期间以约3,000IU/ml的浓度存在。

74.根据权利要求3-73中任一项所述的方法，其中所述CD3复合物激动剂是抗CD3复合物激动剂抗体。

75.根据权利要求74所述的方法，其中所述抗CD3复合物抗体是OKT-3。

76.根据权利要求3-75中任一项所述的方法，其中所述促细胞分裂剂是植物血凝素(PHA)、伴刀豆球蛋白A(Con A)、商陆有丝分裂原(PWM)、美泽林(Mzn)或十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)中的至少一种。

77.根据权利要求3-76中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞是自体的。

78.根据权利要求3-76中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞是同种异体的。

79.根据权利要求3-76中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞被辐射。

80.根据权利要求3-79中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞是外周血单核细胞(PBMC)。

81.根据权利要求3-80中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞和淋巴细胞以约1000:1至约1:1的比例存在。

82.根据权利要求3-81中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞和淋巴细胞以100:1的比例存在。

83.根据权利要求1-82中任一项所述的方法，其中所述第一扩增包括在比所述样品中可能存在的其他细胞更有利于淋巴细胞生长的条件下扩增所述淋巴细胞。

84.根据权利要求1-83中任一项所述的方法，其中所述抗原特异性淋巴细胞比非抗原特异性淋巴细胞优先扩增。

85.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。

86.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞是外周血淋巴细胞(PBL)。

87.根据权利要求1至86中任一项所述的方法，其中所述样品获自引流淋巴结。

88.根据权利要求1-87中任一项所述的方法，其中所述样品是未治疗的肿瘤片段、酶处理过的肿瘤片段、解离/悬浮的肿瘤细胞、淋巴结样品或体液样品。

89.根据权利要求88所述的方法，其中所述酶处理过的肿瘤片段已经用胶原酶、分散酶、透明质酸酶、游离酶或脱氧核糖核酸酶(DNase) 中的至少一种进行处理。

90.根据权利要求88所述的方法，其中所述体液是血液、腹水或淋巴液。

91.根据权利要求1-90中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞是T细胞。

92.根据权利要求91所述的方法，其中所述T细胞是CD8+T细胞。

93.根据权利要求91所述的方法，其中所述T细胞是CD4+T细胞。

94.根据权利要求16-93中任一项所述的方法，其中所述APC被激活。

95.根据权利要求16-94中任一项所述的方法，其中所述APC是自体的。

96.根据权利要求16-94中任一项所述的方法，其中所述APC是同种异体的。

97.根据权利要求16-94中任一项所述的方法，其中所述APC是人工APC。

98.根据权利要求16-97中任一项所述的方法，其中所述APC是B细胞、树突状细胞、巨噬细胞或朗格汉斯细胞中的至少一种。

99.根据权利要求16-98中任一项所述的方法，其中所述APC是B细胞。

100.根据权利要求98或权利要求99所述的方法，其中通过正选择CD19+细胞分离所述B细胞。

101.根据权利要求98-100中任一项所述的方法，其中所述B细胞通过与CD40L、IL-21或IL-4中的至少一种孵育而被激活。

102.根据权利要求97-101中任一项所述的方法，其中将B细胞进一步与Bcl-6、Bcl-XL、BCL-2、MCL1、STAT-5中的至少一种或者与JAK/STAT途径、PI3K-AKT信号传导途径、BCR信号传导途径或BAFF-BAFFR信号传导途径中的至少一种的激活剂一起培养。

103.根据权利要求1至102中任一项所述的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原、翻译后修饰、长非编码抗原或病毒抗原。

104.根据权利要求103所述的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原，是共享的肿瘤抗原、过表达的肿瘤抗原、异常表达的肿瘤抗原或肿瘤特异性新抗原。

105.根据权利要求104所述的方法，其中所述肿瘤特异性新抗原是经典新抗原或非经典新抗原。

106.根据权利要求104或105所述的方法，其中所述肿瘤抗原来自实体肿瘤。

107.根据权利要求103-106中任一项的方法，其中所述肿瘤抗原来自卵巢肿瘤、黑素瘤、肺肿瘤、乳腺肿瘤、白血病或胃肠道抗原中的至少一种。

108.根据权利要求1至107中任一项所述的方法，所述方法还包括在培养后分离所述抗原特异性淋巴细胞。

109.根据权利要求1-108中任一项所述的方法，所述方法还包括在培养之前从受试者获得样品。

110.根据权利要求1-109中任一项所述的方法，所述方法还包括在培养之前从样品中分离淋巴细胞。

111.根据权利要求1-110中任一项所述的方法，还包括在培养之前从样品中分离抗原特异性淋巴细胞。

112.根据权利要求1-110中任一项所述的方法，其中所述方法增加淋巴细胞的频率。

113.根据权利要求1-111中任一项所述的方法，其中所述方法增加抗原特异性淋巴细胞的频率。

114.根据权利要求1-113中任一项所述的方法，其中与仅在第二扩增中暴露于所述肽的抗原特异性淋巴细胞相比，在所述第一扩增期间暴露于所述肽导致抗原特异性淋巴细胞的消耗更少。

115.根据权利要求10-113中任一项所述的方法，其中与在第一扩增和第二扩增中暴露于所述肽的抗原特异性淋巴细胞相比，在所述第一扩增期间暴露、但不在第二扩增期间暴露于所述肽导致抗原特异性淋巴细胞的消耗更少。

116.根据权利要求10-113中任一项所述的方法，其中与仅在第二扩增中暴露于所述肽的抗原特异性淋巴细胞相比，在所述第一扩增中暴露于所述肽、但不在第二扩增期间暴露于所述肽导致抗原特异性淋巴细胞的消耗更少。

117.根据权利要求1-116中任一项所述的方法，其进一步包括将所述抗原特异性淋巴细胞重新引入所述受试者。

118.根据权利要求1-117中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。

119.通过权利要求1-118中任一项的方法产生的抗原特异性淋巴细胞的群体。

120.一种在有此需要的受试者中治疗肿瘤的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的权利要求119所述的淋巴细胞。

121.根据权利要求120所述的方法，其中所述肿瘤是实体瘤。

122.根据权利要求121所述的方法，其中所述肿瘤是卵巢肿瘤、黑素瘤、肺肿瘤、胃肠道肿瘤、乳腺肿瘤或白血病。

123.根据权利要求122所述的方法，其中所述肿瘤表达与包含肿瘤抗原的至少一种肽一致的突变。

124.根据权利要求118-123中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

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