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CN111781047A - 一种用于血液分析的溶血素及其制备方法、试剂 - Google Patents

一种用于血液分析的溶血素及其制备方法、试剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于血液分析的溶血素及其制备方法、试剂，包括十八烷基硫酸钠、乙醇、柠檬酸、氯化钠、氯化钾和碳酸氢钠，通过以上技术方案，本发明达到了制备简单、检测精度高及适用范围广的有益效果。

Description

一种用于血液分析的溶血素及其制备方法、试剂
技术领域
本发明涉及血液分析技术领域，尤其是一种用于血液分析的溶血素及其制备方法、试剂。
背景技术
血细胞分析对于开展科学研究，疾病的预防、诊断和治疗有着重要的价值，从最初研究细胞的形态、大小、数量到最近的细胞表面的抗原成分。传统的细胞免疫和非特异性免疫功能检测技术，不能从单细胞水平对靶细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构进行多参数，高灵敏度的分析，流式细胞仪可以快速测量、分选、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来，目前应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞遗传学、细胞生物学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域，如细胞表面分子的淋巴细胞及其亚群分析、细胞内细胞因子分析、白血病免疫分型、肿瘤耐药相关蛋白分析、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析、移植免疫中的交叉配型、线粒体膜电位、细胞凋亡、细胞内钙离子浓度、中性粒细胞功能分析等。
由于体内发挥免疫功能的多数为白细胞，而人类血液中含量最多的是红细胞，为了减少对靶细胞分析影响，需要剔除血液中红细胞的干扰作用，在进行红细胞溶血时要避免破坏白细胞的结构和功能，保留白细胞表面的膜蛋白，因此，对溶血的要求非常高，现有的流式细胞用于血液分析的溶血素多为低渗用于血液分析的溶血素，即低于渗透压的溶液，等渗液用于血液分析的溶血素是与渗透压相等的溶液，以前认为红细胞在等渗溶液中，能保持其正常形态(不皱缩、不溶血)，但有的分子还能够自由通过细胞膜，使红细胞溶血，它们都是利用细胞内外渗透压差异而导致细胞膜破裂，通过改变红细胞的物理结构实现溶血反应。一些化学物质如药物、细菌毒素、蛇毒等，与红细胞中的亚铁血红蛋白结合，变成高铁血红蛋白，使红细胞结构发生改变，导致溶血反应。
目前我国使用的用于血液分析的溶血素多为进口原装试剂、存在着成本高、购买渠道繁琐等弊端，无法及时满足国内医院的正常使用，并且用于血液分析的溶血素的配方和仪器有一定的关系，不同的仪器使用不同的用于血液分析的溶血素，同一用于血液分析的溶血素在不同仪器上显示的效果不一，主因是用于血液分析的溶血素裂解后的白细胞形态有差异，再结合FSC/SSC的光路设计会导致淋巴、单核、粒细胞分群的差异。目前市面上许多用于血液分析的溶血素只适合某一类流式细胞仪，不能达到一种溶血素通用多类流式细胞仪的作用。
因此，本发明公开了一种制备简单、检测精度高及适用范围广的用于血液分析的溶血素及其制备方法、试剂。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于血液分析的溶血素及其制备方法、试剂，本发明采用的技术方案如下：
一种用于血液分析的溶血素，每升所述的用于血液分析的溶血素包括以下组分：十八烷基硫酸钠0.5～1.5g、乙醇0.02～0.09g、柠檬酸2～3g、氯化钠1～10g、氯化钾5.1～5.5g、碳酸氢钠0.1×10-3～0.9×10-3g。
进一步地，每升所述的用于血液分析的溶血素包括以下组分：十八烷基硫酸钠0.8～1.5g、乙醇0.04～0.09g、柠檬酸2.5～3g、氯化钠3～10g、氯化钾5.2～5.5g、碳酸氢钠0.3×10-3～0.9×10-3g。
进一步地，每升所述的用于血液分析的溶血素包括以下组分：十八烷基硫酸钠1.0～1.5g、乙醇0.06～0.09g、柠檬酸2.8～3g、氯化钠7～10g、氯化钾5.4～5.5g、碳酸氢钠0.6×10-3～0.9×10-3g。
进一步地，每升所述的用于血液分析的溶血素包括以下组分：十八烷基硫酸钠1.4～1.5g、乙醇0.07～0.09g、柠檬酸2.9～3g、氯化钠9～10g、氯化钾5.4～5.5g、碳酸氢钠0.8×10-3～0.9×10-3g。
进一步地，一种用于血液分析的溶血素的制备方法，包括以下步骤：
步骤S01、根据每升所述用于血液分析的溶血素包括的组分含量，按需称取十八烷基硫酸钠、乙醇、柠檬酸、氯化钠、氯化钾和碳酸氢钠，备用；
步骤S02、将步骤S01中称取得到的十八烷基硫酸钠、柠檬酸、氯化钠和氯化钾组分加入至M1g水中充分溶解后得到初混合液；
步骤S03、在步骤S02制备得到的混合液中加入乙醇，再加M2g水定容至1升，制备得到预混合液；
步骤S04、在步骤S03制备得到的预混合液中加入步骤S01称取的碳酸氢钠，将预混合液的PH值调至7.4～7.5；
步骤S05、将步骤S04制备得到的混合液用孔径为0.1～0.2μm的微孔滤膜进行过滤，制备得到所述用于血液分析的溶血素。
进一步地，包括根据所述的用于血液分析的溶血素制备方法制备得到的用于血液分析的溶血素。
进一步地，包括不对称菁类染料，如权利1～4和权利要求6任一项所述的用于血液分析的溶血素。
更进一步地，每升用于血液分析的溶血素中包括不对称菁类染料0.2～0.5g。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明制备得到的用于血液分析的溶血素能在改变细胞结构的同时又不破坏白细胞的形态、结构和功能，具有检测精度高，干扰杂质少，使用成本低，适用范围广的有益效果。
(2)本发明制备得到的用于血液分析的溶血素具备达到通用多类流式细胞仪的有益效果。
(3)本发明采用所述制备方法得到的用于血液分析的溶血素可以实现在一个通道里同时对有血液中的核红细胞、核酸及其他类型的白细胞进行准确的检测。
(4)本发明巧妙地在用于血液分析的溶血素中加入了不对称菁类染料制备得到用于血液检测的试剂，在对血液进行分析的过程中，制备得到的用于血液分析的溶血素不但修饰固定了有核红细胞、嗜碱白细胞的核酸进行染色，多角度光散射可检测出这两类细胞，并且还保证了嗜碱白细胞的计数的精确度。
(5)本发明制备得到的用于血液分析的溶血素是检测白细胞抗原及细胞免疫功能分析的关键试剂，其根据细胞大小和颗粒度通过流式细胞仪上的前向角和侧向角散光将白细胞群体分为淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞以及碎片，处理样本后白细胞各群里分区明显，细胞碎片少，不损伤白细胞膜蛋白，就可以保留其原有的生物学活性，又能完全裂解红细胞，本发明制备得到的用于血液分析的溶血素具有检测结果准确、性能稳定、可替代进口原装产品的有益效果。
本发明一种用于血液分析的溶血素及其制备方法、试剂在血液分析技术领域具有很高的实用价值、经济价值和推广价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需使用的附图作简单介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对保护范围的限定，对于本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明具体实施例4所述试剂实验测得的白细胞个数的实验结果对比折线图；
图2为本发明具体实施例4所述试剂实验测得的血红蛋白衍生物的吸光度的实验结果对比折线图；
图3为本发明具体实施例4所述试剂实验测得的红细胞个数的实验结果对比折线图。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更为清楚，下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，本发明的实施方式包括但不限于下列实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1
具体来说，一种用于血液分析的试剂，包括用于血液分析的溶血素和染色液。
本实施例中，所述用于血液分析的溶血素的制备方法包括以下步骤：
步骤S01、称取十八烷基硫酸钠0.5g、乙醇0.02g、柠檬酸2g、氯化钠1g、氯化钾5.1g、碳酸氢钠0.1×10-3g，备用；
步骤S02、将步骤S01中称取得到的十八烷基硫酸钠0.5g、柠檬酸2g、氯化钠1g和氯化钾5.1g的各组分加入至600g水中充分溶解，得到初混合液；
步骤S03、加入乙醇0.02g至步骤S02制备得到的初混合液中，再加入390g水定容至1升，制备得到预混合液；
步骤S04、加入碳酸氢钠0.1×10-3g至步骤S03制备得到的预混合液中，经预混合液的PH值稳定在7.4，得到混合液；
步骤S05、使用孔径为0.2μm的微孔滤膜对步骤S04制备得到的混合液进行过滤，制备得到用于血液分析的溶血素。
本实施例中，所述用于血液分析的试剂，包括以下步骤：
步骤S01、称取不对称菁类染料0.3g，备用；
步骤S02、将步骤S01称取得到的不对称菁类染料加入至上述制备到的用于血液分析的溶血素中。
实施例2
一种用于血液分析的试剂，包括用于血液分析的溶血素和染色液。
本实施例中，每升所述的用于血液分析的溶血素中包括以下组分：十八烷基硫酸钠0.8g、乙醇0.04g、柠檬酸2.5g、氯化钠3g、氯化钾5.2g、碳酸氢钠0.3×10-3g。
本实施例中，所述用于血液分析的溶血素的制备方法包括以下步骤：
步骤S01、称取十八烷基硫酸钠0.8g、乙醇0.04g、柠檬酸2.5g、氯化钠3g、氯化钾5.2g、碳酸氢钠0.3×10-3g，备用；
步骤S02、将步骤S01中称取得到的十八烷基硫酸钠0.8g、柠檬酸2.5g、氯化钠3g和氯化钾5.2g的各组分加入至600g水中充分溶解，得到初混合液；
步骤S03、加入乙醇0.04g至步骤S02制备得到的初混合液中，再加入390g水定容至1升，制备得到预混合液；
步骤S04、加入碳酸氢钠0.3×10-3g至步骤S03制备得到的预混合液中，经预混合液的PH值稳定在7.4，得到混合液；
步骤S05、使用孔径为0.2μm的微孔滤膜对步骤S04制备得到的混合液进行过滤，制备得到用于血液分析的溶血素。
本实施例中，所述用于血液分析的试剂，包括以下步骤：
步骤S01、称取不对称菁类染料0.3g，备用；
步骤S02、将步骤S01称取得到的不对称菁类染料加入至上述制备到的用于血液分析的溶血素中。
实施例3
一种用于血液分析的试剂，包括用于血液分析的溶血素和染色液。
本实施例中，每升所述的用于血液分析的溶血素中包括以下组分：十八烷基硫酸钠1.0g、乙醇0.06g、柠檬酸2.8g、氯化钠7g、氯化钾5.4g、碳酸氢钠0.6×10-3g。
本实施例中，所述用于血液分析的溶血素的制备方法包括以下步骤：
步骤S01、称取十八烷基硫酸钠1.0g、乙醇0.06g、柠檬酸2.8g、氯化钠7g、氯化钾5.4g、碳酸氢钠0.6×10-3g，备用；
步骤S02、将步骤S01中称取得到的十八烷基硫酸钠1.0g、柠檬酸2.8g、氯化钠7g和氯化钾5.4g的各组分加入至600g水中充分溶解，得到初混合液；
步骤S03、加入乙醇0.06g至步骤S02制备得到的初混合液中，再加入390g水定容至1升，制备得到预混合液；
步骤S04、加入碳酸氢钠0.6×10-3g至步骤S03制备得到的预混合液中，经预混合液的PH值稳定在7.4，得到混合液；
步骤S05、使用孔径为0.1μm的微孔滤膜对步骤S04制备得到的混合液进行过滤，制备得到用于血液分析的溶血素。
本实施例中，所述用于血液分析的试剂，包括以下步骤：
步骤S01、称取不对称菁类染料0.4g，备用；
步骤S02、将步骤S01称取得到的不对称菁类染料加入至上述制备到的用于血液分析的溶血素中。
实施例4
一种用于血液分析的试剂，包括用于血液分析的溶血素和染色液。
本实施例中，每升所述的用于血液分析的溶血素中包括以下组分：十八烷基硫酸钠1.4g、乙醇0.07g、柠檬酸2.9g、氯化钠9g、氯化钾5.4g、碳酸氢钠0.8×10-3g。
本实施例中，所述用于血液分析的溶血素的制备方法包括以下步骤：
步骤S01、称取十八烷基硫酸钠1.4g、乙醇0.07g、柠檬酸2.9g、氯化钠9g、氯化钾5.4g、碳酸氢钠0.8×10-3g，备用；
步骤S02、将步骤S01中称取得到的十八烷基硫酸钠1.4g、柠檬酸2.9g、氯化钠9g和氯化钾5.4g的各组分加入至600g水中充分溶解，得到初混合液；
步骤S03、加入乙醇0.07g至步骤S02制备得到的初混合液中，再加入390g水定容至1升，制备得到预混合液；
步骤S04、加入碳酸氢钠0.8×10-3g至步骤S03制备得到的预混合液中，经预混合液的PH值稳定在7.4，得到混合液；
步骤S05、使用孔径为0.2μm的微孔滤膜对步骤S04制备得到的混合液进行过滤，制备得到用于血液分析的溶血素。
本实施例中，所述用于血液分析的试剂，包括以下步骤：
步骤S01、称取不对称菁类染料0.4g，备用；
步骤S02、将步骤S01称取得到的不对称菁类染料加入至上述制备到的用于血液分析的溶血素中。
对比例
该对比例提供了一种用于血液分析的进口原装试剂。
准确度测定实验：在相同的实验环境下，取15份血液样品，分别用上述实施例4提供的试剂与现有的市面上销售的进口原装试剂进行检测对比分析，其分析结果如下表所示。
表1：
Figure BDA0002568973500000081
表2：
Figure BDA0002568973500000091
从表1和表2可以很直观的看出，本发明实施例提供的只含有一种用于血液分析的溶血素和一种染色液的试剂，可以同时准确地检测血液中有核红细胞和嗜碱细胞含量，其检测分析效果与现有市售的进口原装试剂相近度极高，可替代原装试剂进行使用，以降低血液分析研发成本及各医疗机构的试剂使用成本，并解决了各级医疗机构对进口试剂的依赖性。
上述施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明保护范围的限制，但凡采用本发明的设计原理，以及在此基础上进行非创造性劳动而作出的变化，均应属于本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于血液分析的溶血素，其特征在于，每升所述的用于血液分析的溶血素包括以下组分：十八烷基硫酸钠0.5～1.5g、乙醇0.02～0.09g、柠檬酸2～3g、氯化钠1～10g、氯化钾5.1～5.5g、碳酸氢钠0.1×10-3～0.9×10-3g。
2.根据权利要求1所述的一种用于血液分析的溶血素，其特征在于，每升所述的用于血液分析的溶血素包括以下组分：十八烷基硫酸钠0.8～1.5g、乙醇0.04～0.09g、柠檬酸2.5～3g、氯化钠3～10g、氯化钾5.2～5.5g、碳酸氢钠0.3×10-3～0.9×10-3g。
3.根据权利要求2所述的一种用于血液分析的溶血素，其特征在于，每升所述的用于血液分析的溶血素包括以下组分：十八烷基硫酸钠1.0～1.5g、乙醇0.06～0.09g、柠檬酸2.8～3g、氯化钠7～10g、氯化钾5.4～5.5g、碳酸氢钠0.6×10-3～0.9×10-3g。
4.根据权利要求3所述的一种用于血液分析的溶血素，其特征在于，每升所述的用于血液分析的溶血素包括以下组分：十八烷基硫酸钠1.4～1.5g、乙醇0.07～0.09g、柠檬酸2.9～3g、氯化钠9～10g、氯化钾5.4～5.5g、碳酸氢钠0.8×10-3～0.9×10-3g。
5.一种用于血液分析的溶血素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S01、根据每升所述用于血液分析的溶血素包括的组分含量，按需称取十八烷基硫酸钠、乙醇、柠檬酸、氯化钠、氯化钾和碳酸氢钠，备用；
步骤S02、将步骤S01中称取得到的十八烷基硫酸钠、柠檬酸、氯化钠和氯化钾组分加入至M1g水中充分溶解后得到初混合液；
步骤S03、在步骤S02制备得到的混合液中加入乙醇，再加M2g水定容至1升，制备得到预混合液；
步骤S04、在步骤S03制备得到的预混合液中加入步骤S01称取的碳酸氢钠，将预混合液的PH值调至7.4～7.5；
步骤S05、将步骤S04制备得到的混合液用孔径为0.1～0.2μm的微孔滤膜进行过滤，制备得到所述用于血液分析的溶血素。
6.一种用于血液分析的溶血素，其特征在于，包括权利要求5所述的一种用于血液分析的溶血素制备方法得到的用于血液分析的溶血素。
7.一种用于血液分析的试剂，其特征在于，包括不对称菁类染料，如权利1～4任一项及权利要求6所述的用于血液分析的溶血素。
8.根据权利要求7所述的一种用于血液分析的试剂，其特征在于，每升用于血液分析的溶血素中包括不对称菁类染料0.2～0.5g。
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