CN111778224B - 尿酸酶或其同源酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别涉及尿酸酶或其同源酶及其应用。通过实验发现，含有新型非同源异构的FAD依赖型尿酸氧化酶的大肠杆菌Nissle 1917，在高尿酸血症大鼠模型内可以以3‑5天的频率进行灌胃，依然能起到降低大鼠模型血液尿酸的效果。采用大肠杆菌Nissle 1917，完成了利用非现有药物原理，且能避免每天服用而缓解高尿酸血症的目的。结果表明，大肠杆菌Nissle 1917可以用于高尿酸血症及痛风患者的治疗。

Description

尿酸酶或其同源酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及尿酸酶或其同源酶及其应用。

背景技术

高尿酸血症是指血中尿酸升高的一种状态，其定义为血清尿酸大于6.8或7.0mg/dL。长期高尿酸血症会导致痛风的发生。近年发现，无症状高尿酸血症可能会引起许多疾病发病风险增加，如心血管疾病、代谢综合征等。这些潜在健康问题造成了较重社会医疗负担，因此，高尿酸血症近年来收到了越来越多的关注。轻度的高尿酸血症人群一般可以通过控制饮食、减轻体重、改变生活方式降低自身尿酸水平。但许多高尿酸血症人群由于该状态不会造成任何疾病表现，因此很难做到上述要求。在该情况下，是否对无症状高尿酸血症人群用药变成了一个很大的问题。目前部分临床医生认为，由于别嘌呤醇这种首选治疗药物通过影响尿酸代谢以达到降低尿酸的目的，长期使用后可能造成人体适应当前有药物状态下的尿酸代谢情况。若停止药物，换为健康的生活方式，可能导致本来通过健康生活方式能降低的高尿酸血症人群再也无法通过健康的生活方式降尿酸控制至理想尿酸范围内。也许是基于上述原因，总之，也没有相关的临床试验正在进行。而由于缺乏临床试验证据，这些无症状高尿酸血症就算启动了降尿酸治疗(比如别嘌呤醇)，长期心血管疾病、代谢综合征的发生概率是否会下降，也是不确切。因此现在临床指南也均不推荐使用药物进行轻度无症状高尿酸血症的治疗，仅部分指南认为“显著增加”时可以考虑用药，但这本身也依然受到质疑。退一步讲，即使该部分人群启动药物降尿酸治疗，极可能由于药物依从性差造成降尿酸效果欠佳。痛风患者反复痛风一大原因正在于：痛风为短期发作疼痛，非长期持续；在非痛风发作期，患者服用药物意愿低，依从性差。对于无症状高尿酸血症人群来讲，虽然没有明确的统计数据支持，但可以预计，在无任何症状情况下，药物依从性会更差。因此对于这类坚持健康生活方式困难，又有轻度高尿酸血症的人群到底该怎么处理，是个相对空白的区域。

同时，目前对于痛风的标准降尿酸治疗方案，首选黄嘌呤氧化酶抑制剂进行治疗，其中别嘌呤醇为首选药物。别嘌呤醇可以抑制黄嘌呤氧化酶，阻止次黄嘌呤和黄嘌呤代谢为尿酸，从尿酸产生的途径上减少尿酸生成。另一类药物为促尿酸排泄药物，如苯溴马隆或丙磺舒，在患者为黄嘌呤氧化酶抑制剂禁忌或不能耐受情况下考虑使用。其可以抑制肾对尿酸的重吸收，从而达到排出更多尿酸的目的(苯溴马隆对肝脏损害的副作用较大，2003年该药的开发公司Sanofi-Synthelabo已宣布全球退市。但部分包括中国在内的国家，其他药企仍在生产该药并上市销售)。但该类药物会加重肾功能负担。若黄嘌呤氧化酶抑制剂治疗后无法使患者尿酸降至理想范围，考虑两类药物联合使用。

对于无症状高尿酸血症人群，由于无明确临床证据，全世界所有国家和地区的指南均不推荐对尿酸轻度增高的无症状高尿酸血症人群使用当前市场上任何药物进行治疗。少数国家和地区指南提出可以对尿酸值明显增高的无症状高尿酸血症人群进行药物治疗，其“明显增高”的阈值从8.0mg/dL到13.0mg/dL不等。对于尿酸轻度增高的无症状高尿酸血症人群，目前建议通过控制饮食、减轻体重、改变生活方式降低血中尿酸含量。

痛风首选治疗药物类型为黄嘌呤氧化酶抑制剂，其代表为别嘌呤醇。别嘌呤醇及其在人体内的代谢产物可以抑制黄嘌呤氧化酶的活性，阻止次黄嘌呤和黄嘌呤代谢为尿酸，通过改变尿酸代谢途径减少尿酸生成。若患者属次黄嘌呤抑制剂禁忌人群或对该药物不能耐受，可考虑换用促尿酸排泄药物。目前认为，对于黄嘌呤氧化酶抑制剂治疗后尿酸无法降至理想范围的痛风患者，可考虑将黄嘌呤氧化酶抑制剂和促尿酸排泄药物联合使用进行治疗。

对于无症状高尿酸血症人群，目前临床指南绝大多数不推荐不在任何情况下使用当前市场上的任何药物治疗，部分指南推荐在“尿酸显著增高时”可开始进行药物治疗。因此，对于绝大部分无症状高尿酸血症人群而言，没有任何可选用的药物或类似药物的治疗方案。由于无症状高尿酸血症本身并不表现出任何症状，高尿酸血症人群通过当前推荐的尿酸控制方法，即控制饮食、减轻体重、改变生活方式降低尿酸水平的意愿低，也有可能通过这类方法依然尿酸无法控制至理想范围，导致该人群尿酸控制水平欠佳。即使要求无症状高尿酸血症人群进行药物降尿酸治疗，按现有治疗方案，也需要每天服药。从痛风治疗的相关数据看，无症状高尿酸血症人群很难在没有症状的情况下，长期坚持每日服药，达到降尿酸的目的。对于使用黄嘌呤氧化酶抑制剂单种药物治疗无法将尿酸降至理想尿酸范围的痛风患者，可考虑黄嘌呤氧化酶抑制剂和促尿酸排泄药物联合使用进行治疗。但促尿酸排泄药物对肾功能不全的病人肾负担较重(指南明确肌酐清除率≤50mL/分钟的患者不推荐使用该类药物)。对于该部分肾功能较差的患者，目前没有进一步的治疗方案。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了尿酸酶或其同源酶及其应用。含有新型非同源异构的FAD依赖型尿酸氧化酶的大肠杆菌Nissle 1917，能制备治疗痛风和/或高尿酸血症的药物。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了尿酸酶或其同源酶，其具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.1或2所示的氨基酸序列；或

(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

(III)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列至少有80％同一性的氨基酸序列。

尿酸降解是由尿酸酶催化的。FAD非依赖型尿酸氧化酶(FAD-independent urateoxidase)70年前就已被发现。乳杆菌就含有这种尿酸酶。近年来，数种新尿酸酶，如FAD依赖型尿酸氧化酶(FAD-dependent urate oxidase)和整合于细胞膜上的尿酸酶被逐个发现。尿酸被尿酸酶降解后，会转化为5-hydroxyisouric acid(5-HIU，无标准中文翻译),该物质在水溶液中性质很不稳定，可以自发转化为2-oxo-4-hydroxy-4-carboxy-5-ureidoimidazoline(OHCU，无标准中文翻译)，在5-HIU水解酶(5-HIU hydrolase)可以加快该自发过程。OHCU可以继续自发反应，转化为R型尿囊素((R)-allantoin)，或在OHCU脱羧酶的作用下转化为S型尿囊素((S)-allantoin)。S型尿囊素可以继续在其他酶的作用下继续降解。FAD依赖型的尿酸酶目前发现了HpxO和HpyO这两种。这两种酶为非同源异构酶(non-homologous isofunctional enzymes)。

大肠杆菌Nissle 1917(Escherichia coli Nissle 1917,EcN))是一种百年前从人体分离出来的益生菌。其抗菌和抗炎的作用已得到广泛的验证，且没有致病性。

本申请人在大肠杆菌Nissle 1917中鉴定出了两种新型的，非同源异构的FAD依赖型尿酸氧化酶，并发现谷氨酸合成酶具有未曾发现过的，降解尿酸的功能。我们发现大肠杆菌Nissle 1917能够成功以三天一次的灌胃频率在高尿酸血症大鼠模型中定植，并降低高尿酸血症大鼠模型血清中的尿酸。我们的研究表明，以大肠杆菌Nissle 1917为基础的益生菌疗法为无症状高尿酸血症人群提供了一种适度、长效的潜在治疗方式，并可能辅助痛风患者的降尿酸治疗。

在上述研究的基础上，本发明还提供了编码所述的尿酸酶或其同源酶的核苷酸，其具有：

(IV)、如SEQ ID No.4或5所示的核苷酸序列；或

(V)、如SEQ ID 4或5所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或

(VI)、与(IV)或(V)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(IV)或(V)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(VII)、与(IV)、(V)或(VI)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(IV)、(V)或(VI)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(VIII)、与(IV)、(V)、(VI)或(VII)所述核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。

更重要的是，在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的尿酸酶或其同源酶在制备治疗痛风和/或高尿酸血症的药物中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，实验特别证明了谷氨酸合成酶的小亚基(GltD)对尿酸有降解作用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的尿酸酶或其同源酶与尿酸的摩尔比至少为1:2000。

此外，本发明还提供了谷氨酸合成酶在制备治疗痛风和/或高尿酸血症的药物中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述药物为口服微生物制剂。

本发明还提供了微生物在制备治疗痛风和/或高尿酸血症的药物中的应用；

所述微生物包括：

(IX)具有如权利要求1所述的尿酸酶或其同源酶和/或谷氨酸合成酶；或

(X)本身不具有如权利要求1所述的尿酸酶或其同源酶和/或谷氨酸合成酶，但后期通过人工修饰能够表达如权利要求1所述的尿酸酶或其同源酶和/或谷氨酸合成酶；或

(XI)对(IX)所述微生物改造，上调如权利要求1所述的尿酸酶或其同源酶和/或谷氨酸合成酶的表达；或

(XII)所述微生物包括大肠杆菌Nissle 1917。

只要某种能够长期在肠道内定植，在细胞壁、细胞膜允许尿酸透过，且具有这两种新FAD依赖型尿酸氧化酶或谷氨酸合成酶的微生物，都可以达到相同的方案。

由于大肠杆菌Nissle 1917降尿酸的原理本质在于其内含有两个我们新鉴定出来的FAD依赖型尿酸氧化酶及谷氨酸合成酶，因此，任何基于这两种酶和谷氨酸合成酶，也就是与上述酶同源的口服微生物(微生物本身可以是天然具备该种酶或其同源酶的微生物，或是本不具有该酶，但后期通过人工修饰获得了该种酶或其同源酶，以及使用Nissle 1917继续改造，加强该种酶或其同源酶的表达)，均在本发明的保护范围之内。大肠杆菌Nissle1917能够定植在宿主的口服剂量和频率只要在可预期的范围之内，均在本发明的保护范围之内。

在本发明的一些具体实施方案中，所述大肠杆菌Nissle 1917的剂量为2×10¹⁰cfu/mL，服用频率为3天/次或5天/次。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的尿酸酶或其同源酶与尿酸的摩尔比至少为1:2000。

在上述研究的基础上，本发明还提供了治疗痛风和/或高尿酸血症的药物，包括如所述的尿酸酶或其同源酶、谷氨酸合成酶和/或微生物；

所述微生物包括：

(IX)具有如权利要求1所述的尿酸酶或其同源酶和/或谷氨酸合成酶；或

(X)本身不具有如权利要求1所述的尿酸酶或其同源酶和/或谷氨酸合成酶，但后期通过人工修饰能够表达如权利要求1所述的尿酸酶或其同源酶和/或谷氨酸合成酶；或

(XI)对(IX)所述微生物改造，上调如权利要求1所述的尿酸酶或其同源酶和/或谷氨酸合成酶的表达；或

(XII)所述微生物包括大肠杆菌Nissle 1917。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的所述药物中，所述大肠杆菌Nissle 1917的剂量为2×10¹⁰cfu/mL，服用频率为3天/次或5天/次。所述的尿酸酶或其同源酶与尿酸的摩尔比至少为1:2000。

申请人通过实验发现，含有新型非同源异构的FAD依赖型尿酸氧化酶的大肠杆菌Nissle 1917，在高尿酸血症大鼠模型内可以以3-5天的频率进行灌胃，依然能起到降低大鼠模型血液尿酸的效果。我们采用大肠杆菌Nissle 1917，完成了利用非现有药物原理，且能避免每天服用而缓解高尿酸血症的目的。我们的结果表明，大肠杆菌Nissle 1917可以用于无症状高尿酸血症患者的治疗。

人体尿酸通过肾(2/3)和肠道(1/3)分泌，而长久没有药物或方法对肠道分泌途径进行控制。利用黄嘌呤氧化酶抑制剂和能降低尿酸的大肠杆菌Nissle 1917，对黄嘌呤氧化酶抑制剂单种药物治疗无法将尿酸降至理想尿酸范围且肾功能较差而无法使用促尿酸排泄药物的患者，相比于当前仅能继续单用黄嘌呤氧化酶抑制剂，可能在无明显额外副作用的情况下，表现出更好的降尿酸效果。

大肠杆菌Nissle 1917可以通过灌胃、胶囊或其他形式载体包裹，经口服用进入人、大鼠或其他动物消化道内。

大肠杆菌Nissle 1917到达小肠和结肠后，通过吸收并降解人、大鼠或其他动物分泌在肠道中的尿酸，加快人体尿酸的肠道途径排出，并抑制肠道的尿酸重吸收功能，达到降低人、大鼠或其他动物血液中尿酸的目的。

目前文献报道，约1×10⁸cfu在小鼠内即可产生＞32天的定植；2×10⁸cfu在乳猪内即可产生＞18天的定植。本发明的一些具体实施例中使用10¹⁰cfu作为治疗剂量。但是本领域的技术人员公知，菌株在动物体内定植后，即可发挥药效，因此，只要EcN能产生定植并引起尿酸降解的剂量，都可以作为本专利保护的剂量。凡是本领域认可的定植剂量，均在本发明的保护范围之内。

本发明的有益效果包括但不限于：

1.通过口服微生物的手段，达到降尿酸的目的。

2.使用的微生物菌种大肠杆菌Nissle 1917为人体分离出的，分布于人类肠道的微生物，定植能力好，且具有抗炎、抗菌的作用。

3.大肠杆菌Nissle 1917本身的抗炎作用可能本身就有利于减少心血管疾病等并发症的发生率。

4.大肠杆菌Nissle 1917能够治疗痛风、高尿酸血症的用途。能够使得该菌定植在肠道的剂量和频率，均在本发明的保护范围之内。

5.可以不通过每天服药达到降尿酸的目的。

6.该微生物降尿酸的原理在于其具有新型FAD依赖型尿酸氧化酶。

7.两种新型尿酸酶YgfT,AegA及其同源酶的序列(如SEQ ID No.1或2所示)、用途。

8.谷氨酸合成酶降解尿酸的用途(序列如SEQ ID No.3所示)。

9.适用于目前没有药物治疗，且不愿意进行或直接控制饮食、减轻体重、改变生活方式失败的无症状高尿酸血症人群进行治疗。

10.适用于黄嘌呤氧化酶抑制剂单种药物治疗无法将尿酸降至理想尿酸范围，且肾功能较差，无法联合使用促尿酸排泄药物继续治疗痛风患者。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示流程图；

图2示大肠杆菌Nissle 1917的生理盐水灌胃(3天/次和5天/次)降低大鼠高尿酸血症模型的血清尿酸含量；

图3示大肠杆菌Nissle 1917组以3天/次为频率进行含2×10¹⁰cfu大肠杆菌Nissle1917的生理盐水灌胃，相对于高尿酸血症组表现出了有统计学意义的降尿酸效果；

图4示本发明所示两种FAD依赖型尿酸氧化酶存在同源关系，完全相似率55％，阳性率69％；

图5示YgfT,AegA和GltD这三种酶表现出了显著的降解尿酸的能力；

图6示Nissle 1917表现出了良好的尿酸降解能力。其他的大肠杆菌菌株(DH5α,BL21)，即使含有上述的酶，也无法表现出Nissle 1917良好降解尿酸的功能。

具体实施方式

本发明公开了尿酸酶或其同源酶及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

术语：

尿酸：尿酸是含有碳、氮、氧、氢的杂环化合物，其分子式为C5H4N4O3。尿酸在人体内是嘌呤的最终代谢物。

高尿酸血症(Hyperuriceima,HUA)：高尿酸血症是指在正常嘌呤饮食状态下，非同日两次空腹血尿酸水平男性高于420μmol/L(7mg/dL)，女性高于360μmol/L(6mg/dL)，即称为高尿酸血症。高尿酸血症是痛风的发病基础，但不足以导致痛风，只有尿酸盐在机体组织中沉积下来造成损害才出现痛风。

无症状高尿酸血症：无症状高尿酸血症指患者仅有高尿酸血症而无关节炎、痛风石、尿酸结石等临床症状。

痛风：痛风是一种尿酸盐沉积所致的晶体相关性关节病，与嘌呤代谢紊乱及(或)尿酸排泄减少所致的高尿酸血症直接相关，属代谢性风湿病范畴。痛风可并发肾脏病变，严重者可出现关节破坏、肾功能损害，常伴发高脂血症、高血压病、糖尿病、动脉硬化及冠心病等。痛风患者经常会在夜晚出现突然性的关节疼痛，关节部位出现严重的疼痛、水肿、红肿和炎症。关节疼痛常发于第一跖骨，也可出现在手部关节、膝盖、肘部等。随后，疼痛感慢慢减轻直至消失，持续几天或几周不等。

心血管疾病：心脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病。心脑血管疾病是一种严重威胁人类，特别是50岁以上中老年人健康的常见病，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点，即使应用目前最先进、完善的治疗手段，仍可有50％以上的脑血管意外幸存者生活不能完全自理，全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位。

代谢综合征：代谢综合征是指人体的蛋白质、脂肪、碳水化合物等物质发生代谢紊乱的病理状态，是一组复杂的代谢紊乱症候群，是导致糖尿病心脑血管疾病的危险因素。其具有以下特点：①多种代谢紊乱集于一身，包括肥胖、高血糖、高血压、血脂异常、高血黏、高尿酸、高脂肪肝发生率和高胰岛素血症，这些代谢紊乱是心、脑血管病变以及糖尿病的病理基础。可见糖尿病不是一个孤立的病，而是代谢综合征的组成部分之一。②有共同的病理基础，目前多认为它们的共同原因就是肥胖尤其是中心性肥胖所造成的胰岛素抵抗和高胰岛素血症。③可造成多种疾病增加，如高血压、冠心病、脑卒中、甚至某些癌症，包括与性激素有关的乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌，以及消化系统的胰腺癌、肝胆癌、结肠癌等。④有共同的预防及治疗措施，防治住一种代谢紊乱，也就有利于其他代谢紊乱的防治。

依从性：依从性指病人按医生规定进行治疗、与医嘱一致的行为。俗称为病人的“合作”。依从性可分为完全依从、部分依从(超过或不足剂量用药、增加或减少用药次数等)和完全不依从3类。病人对于具体用药的依从性，即为该具体药物的依从性。

转运蛋白：转运蛋白(transportproteins)是膜蛋白的一大类，介导生物膜内外的化学物质以及信号交换。

尿酸酶：可降解尿酸的酶，均可称为尿酸酶。

动物模型：指各种医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物。

FAD依赖型/非依赖型：反应过程是否需要黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD,flavinadenine dinucleotide)参与。如需要，称为FAD依赖；反之称为非依赖。

非同源异构酶：进化上没有关联，却能催化相同的生化反应的酶，称为非同源异构酶。

本发明提供的尿酸酶或其同源酶及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

通过在普通鼠饲料中添加5％的氧氰酸钾(成都达硕实验动物有限公司)持续喂养2周建立的大鼠高尿酸血症模型(参考文献Lu,J.,et al.,Mouse models for humanhyperuricaemia:a critical review.Nature reviews.Rheumatology,2019.15(7):p.413-426.)中，在2周的实验周期内，在开始实验前，先用含2mg/mL的链霉素及1mg/mL的氨苄西林的无菌饮用水喂养大鼠(起始体重为120g-150g，成都达硕实验动物有限公司，分为6组。除1天组外，每组起始只数为6只，1天组为7只)三天，再换用普通无菌水喂养一天后，进行1天/次，3天/次，5天/次或7天/次，含2×10¹⁰cfu大肠杆菌Nissle 1917的生理盐水灌胃(约200μL)，高尿酸血症组以1天/次为频率进行0.2mL生理盐水灌胃。对照组使用普通饲料(成都达硕实验动物有限公司)并以1天/次为频率进行0.2mL生理盐水灌胃。在实验终点时，利用全自动生化分析仪测量大鼠血清中尿酸含量显示，3天/次和5天/次的灌胃均可以在统计学意义上降低大鼠高尿酸血症模型的血清尿酸含量(图2、表1)。

表1

Control	HUA	1Day	3Day	5Day	7Day
						90	214	182	140	172	224
78	246	170	168	170	156
						42	176	166	146	142	194
60	168	194	136	140	134
							176	172	166	160	146
	204	166	120	138	174
								140
P＜0.001		P＜0.05	P＝0.001	P＜0.01	P＞0.05

实施例2

通过在普通鼠饲料中添加5％的氧氰酸钾(成都达硕实验动物有限公司)持续喂养2周建立的大鼠高尿酸血症模型中，在2周的实验周期内，在开始实验前，先用含2mg/mL的链霉素及1mg/mL的氨苄西林的无菌饮用水喂养大鼠(起始体重为120g-150g，成都达硕实验动物有限公司，分为6组。每组起始只数为6只)三天，再换用普通无菌水喂养一天后，别嘌呤醇组以3天/次为频率进行1.2mg/100g的高强度别嘌呤醇灌胃给药(相当于3天的别嘌呤醇人类剂量上限总和一次性给药)，大肠杆菌Nissle 1917组以3天/次为频率进行含2×10¹⁰cfu大肠杆菌Nissle 1917的生理盐水灌胃(约200μL)，高尿酸血症组以3天/次为频率进行0.2mL生理盐水灌胃。对照组使用普通饲料(成都达硕实验动物有限公司)并以3天/次为频率进行0.2mL生理盐水灌胃。2周后，利用全自动生化分析仪测量大鼠血清中尿酸含量，大肠杆菌Nissle 1917组相对于高尿酸血症组表现出了有统计学意义的降尿酸效果，而别嘌呤醇组没有(图3、表2)。

表2

Control	HUA	EcN	Allopurinol
				196	276	288	268
144	332	152	344
				64	328	328	264
148	368	300	220
				120	344	248
252	296	156
				P＜0.001		P＜0.05	P＞0.05

实施例3

两种FAD依赖型尿酸氧化酶，和谷氨酸合成酶的名称及序列分别为：

ygfT:如SEQ ID No.1所示

MNKFIAAEAA ECIGCHACEI ACAVAHNQEN WPLSHSDFRP RIHVVGKGQAANPVACHHCNNAPCVTACPV NALTFQSDSV QLDEQKCIGC KRCAIACPFGVVEMVDTIAQ KCDLCNQRSS GTQACIDVCPTQALRLMDDKGLQQIKVARQRKTAAGKASSDAQPSRSAALLPVNSRKGADKISASERKTHFGEIYCGLDPQQATYESDRCVYCAEKANCNWHCPLHNAIPDYIRLVQEGKIIEAAELCHQTSSLPEICGRVCPQDRLCEGACTLKDHSGAVSIGNLERYITDTALAMGWRPDVSKVVPRSEKVAVIGAGPAGLGCADILARAGVQVDVFDRHPEIGGMLTFGIPPFKLDKTVLSQRREIFTAMGIDFHLNCEIGRDISFNELTAEYDAVFLGVGTYGMMRADLPHEDAPGVIQALPFLTAHTRQLMGLPESAEYPLTDVEGKRVVVLGGGDTTMDCLRTSIRLNAASVTCAYRRDEVSMPGSRKEVVNAREEGVEFQFNVQPQYIACDEDGRLTAVGLIRTAMGEPGPDGRRRPRPVAGSEFELPADVLIMAFGFQAHTMPWLQGSGIKLDKWGLIQTGDVGYLPTQTHLKKVFAGGDAVHGADLVVTAMAAGRQAARDMLTLFDTKAS*

AegA：如SEQ ID No.2所示

MNRFIMANSQ QCLGCHACEI ACVMAHNDEQ HVLSQHHFHPRITVIKHQQQRSAVTCHHCEDAPCARSCPNGAISHVDDSIQVNQQKCIGCKSCVVACPFGTMQIVLTPVAVGKVKATAHKCDLCAGRENGPACVENCPADALQLVTDAALSGMAKSRRLRTARQEHQPWHASTAAQEMPVMSKVEQMQATPARGEPDKLAIEARKTGFDEIYLPFRADQAQREASRCLKCGEHSVCEWTCPLHNHIPQWIELVKAGNIDAAVELSHQTNTLPEITGRVCPQDRLCEGACTIRDEHGAVTIGNIERYISDQALAKGWRPDLSHVTKVDKRVAIIGAGPAGLACADVLTRNGVAVTVYDRHPEIGGLLTFGIPSFKLDKSLLARRREIFSAMGIHFELNCEVGKDVSLNSLLEQYDAVFVGVGTYRSMKAGLPNEDAPGVYDALPFLIANTKQVMGLEELPEEPFINTAGLNVVVLGGGDTAMDCVRTALRHGASNVTCAYRRDEANMPGSKKEVKNAREEGANFEFNVQPVALELNEQGHVCRIRFLRTRLGEPDAQGRRRPVPVEGSEFVMPADAVIMAFGFNPHGMPWLESHGVTVDKWGRIIADVESQYRYQTTNPKIFAGGDAVRGADLVVTAMAEGRHAAQGIIDWL GVKSVKSH*

谷氨酸合成酶(Glutamate Synthase),gltD，如SEQ ID No.3所示

MSQNVYQFIDLQRVDPPKKPLKIRKIEFVEIYEPFSEGQAKAQADRCLSCGNPYCEWKCPVHNYIPNWLKLANEGRIFEAAELSHQTNTLPEVCGRVCPQDRLCEGSCTLNDEFGAVTIGNIERYINDKAFEMGWRPDMSGVKQTGKKVAIIGAGPAGLACADVLTRNGVKAIVFDRHPEIGGLLTFGIPAFKLEKEVMTRRREIFTGMGIEFKLNTEVGRDVQLDDLLSDYDAVFLGVGTYQSMHGGLENEDADGVYAALPFLIANTKQLMGFGETRDEPFVSMEGKRVVVLGGGDTAMDCVRTSVRQGAKHVTCAYRRDEENMPGSRREVKNAREEGVEFKFNVQPLGIEVNGNGKVSGVKMVRTEMGEPDAKGRRRAEIVAGSEHIVPADAVIMAFGFRPHNMEWLAKHSVELDSQGRIIAPEDNDNAFQTSNPKIFAGGDIVRGSDLVVTAIAEGRKAADGIMNWLEV*

YgfT：如SEQ ID No.4所示

ATGAATAAGTTTATCGCTGCTGAAGCTGCGGAATGTATAGGCTGCCATGCTTGTGAAATTGCCTGTGCGGTGGCACATAATCAAGAAAACTGGCCGCTGAGTCACAGTGACTTTCGACCGCGTATCCACGTTGTAGGGAAAGGCCAGGCTGCGAATCCGGTGGCCTGCCATCACTGCAACAATGCCCCTTGCGTTACGGCTTGTCCGGTTAATGCTCTGACTTTCCAGTCCGATAGCGTACAACTGGACGAGCAAAAATGTATTGGTTGTAAAAGATGCGCAATCGCTTGCCCCTTTGGCGTCGTTGAGATGGTCGATACGATTGCACAGAAATGCGACCTTTGTAACCAGCGCAGTTCCGGCACGCAAGCCTGTATTGACGTCTGCCCAACACAGGCGTTACGGCTGATGGACGATAAAGGGTTGCAGCAGATAAAGGTGGCCCGCCAGCGCAAAACGGCAGCAGGAAAAGCGTCATCAGACGCTCAGCCATCTCGCAGTGCAGCGTTGCTCCCCGTTAACTCGCGTAAAGGCGCAGATAAAATTTCAGCGAGTGAACGGAAAACCCACTTTGGCGAAATCTATTGCGGGCTGGATCCACAACAAGCGACTTATGAGAGTGACCGCTGTGTTTATTGTGCCGAAAAAGCTAACTGCAACTGGCATTGTCCGCTGCATAACGCTATTCCGGATTACATCCGTCTGGTACAGGAAGGAAAGATTATTGAAGCGGCAGAACTTTGCCACCAGACCAGTTCCTTACCCGAAATCTGCGGCAGGGTATGTCCACAGGACCGTCTTTGTGAAGGTGCATGTACTTTGAAAGATCACTCTGGCGCAGTCTCTATCGGTAATCTGGAACGCTACATCACCGATACTGCGCTGGCGATGGGCTGGCGTCCCGATGTCAGCAAAGTTGTTCCCCGTAGCGAAAAAGTGGCGGTGATTGGCGCTGGACCTGCAGGATTAGGGTGTGCTGATATTCTGGCGCGCGCGGGAGTTCAGGTTGATGTCTTTGATCGCCATCCAGAAATTGGCGGTATGCTGACTTTTGGCATTCCTCCTTTCAAACTCGATAAAACGGTATTAAGCCAGCGGCGAGAGATATTCACCGCAATGGGAATCGATTTCCATCTCAACTGTGAAATTGGCCGCGATATCTCTTTCAACGAATTAACGGCGGAATATGATGCTGTTTTCCTCGGCGTGGGGACTTACGGGATGATGCGAGCAGATCTGCCGCATGAAGATGCGCCTGGTGTCATTCAGGCGTTACCGTTCCTGACCGCCCATACCCGCCAGCTCATGGGATTGCCGGAGTCTGCAGAGTATCCGCTGACGGATGTGGAAGGTAAGCGAGTTGTGGTATTGGGCGGTGGCGATACGACAATGGATTGTTTGCGGACTTCCATCCGCCTTAATGCTGCCAGCGTGACCTGTGCGTATCGTCGTGATGAAGTCAGTATGCCGGGTTCGCGCAAAGAGGTGGTCAATGCCCGCGAGGAAGGTGTTGAGTTTCAGTTCAATGTTCAGCCGCAATATATCGCTTGTGATGAAGATGGACGCTTAACGGCGGTGGGCCTGATTCGTACCGCTATGGGTGAGCCGGGGCCGGATGGCCGCCGTCGTCCTCGTCCGGTTGCGGGTTCAGAGTTTGAATTGCCCGCCGATGTTCTCATTATGGCCTTTGGTTTCCAGGCACATACCATGCCGTGGTTGCAGGGCAGCGGAATTAAACTCGATAAATGGGGCCTGATTCAAACCGGCGACGTCGGGTATTTACCCACCCAGACGCATCTGAAAAAAGTCTTTGCTGGTGGTGATGCAGTTCATGGCGCAGATCTGGTTGTCACTGCAATGGCCGCAGGAAGGCAGGCGGCGCGCGATATGTTAACTCTGTTTGATACGAAGGCATCGTGA

AegA：如SEQ ID No.5所示

ATGAATCGTTTTATTATGGCCAACAGTCAGCAATGTCTGGGTTGTCATGCTTGTGAAATCGCCTGTGTCATGGCTCACAATGACGAGCAACATGTCCTGAGCCAACACCATTTTCATCCCCGAATTACGGTTATCAAACATCAGCAGCAACGTAGTGCAGTGACCTGTCACCATTGTGAAGATGCGCCCTGCGCCCGTAGCTGCCCTAATGGCGCAATCAGCCACGTTGATGACAGCATTCAGGTCAATCAGCAAAAGTGTATTGGCTGTAAATCCTGCGTGGTGGCCTGTCCATTTGGTACGATGCAAATCGTTCTGACACCCGTTGCGGTAGGAAAAGTAAAAGCCACGGCGCATAAATGCGACCTTTGTGCAGGGCGCGAAAACGGTCCTGCCTGTGTCGAAAATTGCCCGGCGGACGCGCTGCAACTGGTCACTGACGCCGCACTCTCCGGCATGGCGAAATCCCGCCGCTTGCGCACCGCACGTCAGGAACATCAACCGTGGCATGCCAGTACCGCGGCGCAAGAAATGCCGGTAATGAGTAAAGTCGAGCAAATGCAGGCAACGCCCGCGCGTGGCGAGCCAGATAAACTGGCGATTGAAGCGCGCAAAACCGGTTTTGATGAAATTTATCTGCCATTCCGTGCCGATCAGGCACAACGGGAAGCCTCGCGCTGCCTTAAGTGCGGCGAGCACAGCGTTTGTGAATGGACCTGCCCGCTGCATAACCATATACCGCAGTGGATTGAACTGGTGAAAGCCGGAAACATCGACGCCGCCGTCGAGCTTTCTCACCAGACCAACACCCTGCCGGAAATTACCGGACGCGTTTGCCCGCAAGACCGTTTGTGTGAAGGTGCCTGTACTATTCGCGATGAGCACGGCGCAGTAACTATCGGTAACATTGAACGCTACATTTCAGATCAGGCGTTGGCGAAAGGTTGGCGTCCTGACTTAAGCCATGTCACCAAAGTGGACAAGCGGGTGGCGATTATCGGTGCGGGTCCGGCAGGGCTGGCCTGTGCAGATGTTCTCACCCGCAATGGCGTGGCGGTGACGGTGTACGATCGCCATCCAGAAATCGGTGGCTTGCTCACTTTCGGCATTCCTTCTTTCAAACTGGATAAATCCCTGCTGGCACGCCGTCGGGAAATCTTCAGCGCGATGGGGATTCACTTCGAACTCAATTGTGAAGTGGGTAAAGATGTCTCTTTGAATTCGCTTTTGGAACAATACGACGCGGTCTTCGTTGGCGTAGGCACTTACCGTTCCATGAAAGCGGGTTTACCCAATGAAGATGCGCCGGGCGTTTATGACGCGCTGCCGTTCCTCATCGCCAATACTAAACAGGTGATGGGACTCGAAGAGCTACCGGAAGAGCCGTTTATCAATACTGCCGGACTTAACGTCGTGGTACTGGGCGGCGGCGACACCGCGATGGACTGTGTGCGTACTGCGCTGCGCCACGGCGCGAGTAACGTCACCTGCGCTTATCGTCGTGATGAAGCTAACATGCCAGGCTCGAAGAAAGAGGTGAAGAACGCCCGTGAAGAGGGGGCCAACTTCGAATTTAACGTCCAGCCGGTGGCGCTTGAACTGAATGAACAAGGTCACGTCTGCAGGATTCGTTTCCTGCGCACGCGTCTTGGCGAGCCGGACGCCCAGGGACGTCGGCGTCCAGTGCCGGTGGAAGGCAGTGAATTTGTCATGCCAGCCGATGCGGTGATTATGGCGTTTGGCTTCAATCCGCACGGGATGCCGTGGCTGGAGTCGCACGGTGTAACGGTAGACAAATGGGGCCGCATCATCGCGGATGTGGAAAGCCAGTACCGTTACCAGACCACGAATCCGAAAATCTTCGCCGGTGGTGACGCCGTGCGTGGTGCGGATCTGGTGGTTACCGCAATGGCAGAAGGACGTCATGCGGCACAGGGGATCATTGACTGGCTGGGCGTAAAATCAGTCAAATCTCACTGA

GltD：如SEQ ID No.6所示

ATGAGTCAGAATGTTTATCAATTTATCGACCTGCAGCGCGTTGATCCGCCAAAGAAACCGCTGAAGATCCGCAAAATTGAGTTTGTTGAAATTTACGAGCCGTTTTCCGAAGGCCAGGCCAAAGCGCAGGCTGACCGCTGCCTGTCGTGCGGCAACCCATACTGCGAGTGGAAATGCCCGGTACACAACTACATCCCAAACTGGCTGAAGCTCGCCAATGAGGGGCGTATTTTTGAAGCGGCGGAACTGTCGCACCAGACAAACACCCTGCCGGAAGTTTGCGGACGTGTCTGCCCGCAAGACCGTCTGTGCGAAGGTTCCTGCACCCTGAACGATGAGTTCGGTGCGGTGACCATCGGCAACATTGAGCGTTATATCAATGATAAAGCGTTCGAGATGGGCTGGCGTCCGGATATGTCCGGCGTGAAACAGACCGGTAAAAAAGTAGCGATTATCGGCGCAGGTCCGGCGGGTCTGGCGTGCGCGGATGTCCTGACGCGCAACGGCGTAAAAGCGATCGTCTTCGACCGTCACCCGGAAATTGGCGGCTTGCTGACCTTCGGTATTCCGGCTTTCAAGCTGGAAAAAGAGGTAATGACGCGCCGCCGTGAAATCTTCACCGGCATGGGTATTGAATTCAAACTCAATACCGAAGTGGGCCGCGACGTGCAGCTGGACGATCTGCTGAGTGATTACGATGCCGTGTTCCTTGGCGTCGGGACTTATCAGTCAATGCACGGCGGGCTGGAAAACGAAGACGCCGATGGCGTGTACGCAGCACTGCCGTTCCTTATCGCCAACACCAAACAGTTAATGGGCTTTGGTGAAACCCGCGACGAACCGTTCGTCAGCATGGAAGGCAAACGCGTGGTGGTCCTTGGCGGTGGCGACACTGCGATGGACTGCGTGCGCACGTCTGTACGCCAGGGGGCAAAGCACGTTACCTGTGCCTATCGTCGTGATGAAGAGAACATGCCGGGTTCCCGCCGCGAAGTGAAAAACGCGCGGGAAGAAGGCGTAGAGTTCAAATTCAACGTCCAGCCGCTGGGTATAGAAGTGAATGGCAACGGCAAAGTCAGCGGCGTAAAAATGGTGCGCACAGAAATGGGCGAACCGGATGCCAAAGGCCGTCGCCGCGCGGAGATTGTGGCAGGTTCCGAACATATCGTTCCGGCAGATGCGGTGATCATGGCGTTTGGTTTCCGTCCACACAACATGGAATGGCTGGCAAAACACAGCGTCGAGCTGGATTCGCAGGGGCGCATTATCGCCCCGGAAGACAACGACAACGCTTTCCAGACCAGCAACCCGAAAATCTTTGCTGGCGGCGATATCGTCCGTGGTTCCGATCTGGTGGTGACCGCTATTGCCGAAGGTCGTAAGGCGGCAGACGGTATTATGAACTGGCTGGAAGTTTAA

将YgfT，AegA，GltD序列插入pET28a载体，在其N端插入6xHis-tag。将对应质粒转入大肠杆菌BL21菌株，在500mL LB培养基培养4～5h至OD600值达到0.5～0.6，再加入1mMIPTG。随后，YgfT在25℃过夜培养，AegA在18℃过夜培养，GltD在20℃过夜培养。将培养液于4℃，3800rpm条件下离心20分钟后，去除上清液，并加入15mL PBS溶液，重悬菌体。随后，通过超声破碎法裂解菌体15分钟。将裂解液于4℃，14500rpm条件下离心60分钟，将上清液和5mL Ni溶液混合并静置1小时，并将该混合溶液加入镍柱。镍柱用10mL清洗液清洗3次，并用500mL洗脱液(200mM咪唑，50mM磷酸二氢钠[pH 8.0]，300mM氯化钠)洗脱3次。将洗脱液在超滤管中以3800rpm浓缩40-60分钟，得到纯化后的YgfT,AegA和GltD蛋白。在这三种酶纯化后，在以Tris-HCl为缓冲液的100μL反应体系中，加入100mM NADH,100mM FAD,100mM PBS,2000μM尿酸和1μM纯化后蛋白，在37℃恒温反应90min的条件下，利用高效液相色谱仪分析反应体系中尿酸情况，结果表现出了显著的降解尿酸的能力(图5、表3)。

表3

实施例4

以初始接菌量为OD₆₀₀＝0.02，将E.coliNissle 1917在10mL试管中加入3mL含200μM尿酸的LB培养基中培养16小时后，Nissle 1917表现出了良好的尿酸降解能力。利用One-Way ANOVA方法进行统计分析，各组P<0.0001。其他的大肠杆菌菌株(DH5α,BL21)，即使含有上述的酶，也无法表现出Nissle 1917良好降解尿酸的功能(图6)。

表4

E.coliBL21	E.coliDH5α	E.coliNissle1917
			221.9955	192.923175	16.81543
220.9595	208.3838062	16.11412
			220.9595	190.5482945	113.3248
173.0383	193.1293202	12.9216
			196.9085	180.5550731	12.9216
199.6179		139.095
					84.5203
		17.99969
					20.81703
		38.50368
					14.55627
P＜0.001	P＜0.001

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 成都薇合生物科技有限公司

<120> 尿酸酶或其同源酶及其应用

<130> MP2004267

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 639

<212> PRT

<213> ygfT

<400> 1

Met Asn Lys Phe Ile Ala Ala Glu Ala Ala Glu Cys Ile Gly Cys His

1 5 10 15

Ala Cys Glu Ile Ala Cys Ala Val Ala His Asn Gln Glu Asn Trp Pro

20 25 30

Leu Ser His Ser Asp Phe Arg Pro Arg Ile His Val Val Gly Lys Gly

35 40 45

Gln Ala Ala Asn Pro Val Ala Cys His His Cys Asn Asn Ala Pro Cys

50 55 60

Val Thr Ala Cys Pro Val Asn Ala Leu Thr Phe Gln Ser Asp Ser Val

65 70 75 80

Gln Leu Asp Glu Gln Lys Cys Ile Gly Cys Lys Arg Cys Ala Ile Ala

85 90 95

Cys Pro Phe Gly Val Val Glu Met Val Asp Thr Ile Ala Gln Lys Cys

100 105 110

Asp Leu Cys Asn Gln Arg Ser Ser Gly Thr Gln Ala Cys Ile Asp Val

115 120 125

Cys Pro Thr Gln Ala Leu Arg Leu Met Asp Asp Lys Gly Leu Gln Gln

130 135 140

Ile Lys Val Ala Arg Gln Arg Lys Thr Ala Ala Gly Lys Ala Ser Ser

145 150 155 160

Asp Ala Gln Pro Ser Arg Ser Ala Ala Leu Leu Pro Val Asn Ser Arg

165 170 175

Lys Gly Ala Asp Lys Ile Ser Ala Ser Glu Arg Lys Thr His Phe Gly

180 185 190

Glu Ile Tyr Cys Gly Leu Asp Pro Gln Gln Ala Thr Tyr Glu Ser Asp

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Arg Cys Val Tyr Cys Ala Glu Lys Ala Asn Cys Asn Trp His Cys Pro

210 215 220

Leu His Asn Ala Ile Pro Asp Tyr Ile Arg Leu Val Gln Glu Gly Lys

225 230 235 240

Ile Ile Glu Ala Ala Glu Leu Cys His Gln Thr Ser Ser Leu Pro Glu

245 250 255

Ile Cys Gly Arg Val Cys Pro Gln Asp Arg Leu Cys Glu Gly Ala Cys

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Thr Leu Lys Asp His Ser Gly Ala Val Ser Ile Gly Asn Leu Glu Arg

275 280 285

Tyr Ile Thr Asp Thr Ala Leu Ala Met Gly Trp Arg Pro Asp Val Ser

290 295 300

Lys Val Val Pro Arg Ser Glu Lys Val Ala Val Ile Gly Ala Gly Pro

305 310 315 320

Ala Gly Leu Gly Cys Ala Asp Ile Leu Ala Arg Ala Gly Val Gln Val

325 330 335

Asp Val Phe Asp Arg His Pro Glu Ile Gly Gly Met Leu Thr Phe Gly

340 345 350

Ile Pro Pro Phe Lys Leu Asp Lys Thr Val Leu Ser Gln Arg Arg Glu

355 360 365

Ile Phe Thr Ala Met Gly Ile Asp Phe His Leu Asn Cys Glu Ile Gly

370 375 380

Arg Asp Ile Ser Phe Asn Glu Leu Thr Ala Glu Tyr Asp Ala Val Phe

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Leu Gly Val Gly Thr Tyr Gly Met Met Arg Ala Asp Leu Pro His Glu

405 410 415

Asp Ala Pro Gly Val Ile Gln Ala Leu Pro Phe Leu Thr Ala His Thr

420 425 430

Arg Gln Leu Met Gly Leu Pro Glu Ser Ala Glu Tyr Pro Leu Thr Asp

435 440 445

Val Glu Gly Lys Arg Val Val Val Leu Gly Gly Gly Asp Thr Thr Met

450 455 460

Asp Cys Leu Arg Thr Ser Ile Arg Leu Asn Ala Ala Ser Val Thr Cys

465 470 475 480

Ala Tyr Arg Arg Asp Glu Val Ser Met Pro Gly Ser Arg Lys Glu Val

485 490 495

Val Asn Ala Arg Glu Glu Gly Val Glu Phe Gln Phe Asn Val Gln Pro

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Gln Tyr Ile Ala Cys Asp Glu Asp Gly Arg Leu Thr Ala Val Gly Leu

515 520 525

Ile Arg Thr Ala Met Gly Glu Pro Gly Pro Asp Gly Arg Arg Arg Pro

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Arg Pro Val Ala Gly Ser Glu Phe Glu Leu Pro Ala Asp Val Leu Ile

545 550 555 560

Met Ala Phe Gly Phe Gln Ala His Thr Met Pro Trp Leu Gln Gly Ser

565 570 575

Gly Ile Lys Leu Asp Lys Trp Gly Leu Ile Gln Thr Gly Asp Val Gly

580 585 590

Tyr Leu Pro Thr Gln Thr His Leu Lys Lys Val Phe Ala Gly Gly Asp

595 600 605

Ala Val His Gly Ala Asp Leu Val Val Thr Ala Met Ala Ala Gly Arg

610 615 620

Gln Ala Ala Arg Asp Met Leu Thr Leu Phe Asp Thr Lys Ala Ser

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<210> 2

<211> 659

<212> PRT

<213> AegA

<400> 2

Met Asn Arg Phe Ile Met Ala Asn Ser Gln Gln Cys Leu Gly Cys His

1 5 10 15

Ala Cys Glu Ile Ala Cys Val Met Ala His Asn Asp Glu Gln His Val

20 25 30

Leu Ser Gln His His Phe His Pro Arg Ile Thr Val Ile Lys His Gln

35 40 45

Gln Gln Arg Ser Ala Val Thr Cys His His Cys Glu Asp Ala Pro Cys

50 55 60

Ala Arg Ser Cys Pro Asn Gly Ala Ile Ser His Val Asp Asp Ser Ile

65 70 75 80

Gln Val Asn Gln Gln Lys Cys Ile Gly Cys Lys Ser Cys Val Val Ala

85 90 95

Cys Pro Phe Gly Thr Met Gln Ile Val Leu Thr Pro Val Ala Val Gly

100 105 110

Lys Val Lys Ala Thr Ala His Lys Cys Asp Leu Cys Ala Gly Arg Glu

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Asn Gly Pro Ala Cys Val Glu Asn Cys Pro Ala Asp Ala Leu Gln Leu

130 135 140

Val Thr Asp Ala Ala Leu Ser Gly Met Ala Lys Ser Arg Arg Leu Arg

145 150 155 160

Thr Ala Arg Gln Glu His Gln Pro Trp His Ala Ser Thr Ala Ala Gln

165 170 175

Glu Met Pro Val Met Ser Lys Val Glu Gln Met Gln Ala Thr Pro Ala

180 185 190

Arg Gly Glu Pro Asp Lys Leu Ala Ile Glu Ala Arg Lys Thr Gly Phe

195 200 205

Asp Glu Ile Tyr Leu Pro Phe Arg Ala Asp Gln Ala Gln Arg Glu Ala

210 215 220

Ser Arg Cys Leu Lys Cys Gly Glu His Ser Val Cys Glu Trp Thr Cys

225 230 235 240

Pro Leu His Asn His Ile Pro Gln Trp Ile Glu Leu Val Lys Ala Gly

245 250 255

Asn Ile Asp Ala Ala Val Glu Leu Ser His Gln Thr Asn Thr Leu Pro

260 265 270

Glu Ile Thr Gly Arg Val Cys Pro Gln Asp Arg Leu Cys Glu Gly Ala

275 280 285

Cys Thr Ile Arg Asp Glu His Gly Ala Val Thr Ile Gly Asn Ile Glu

290 295 300

Arg Tyr Ile Ser Asp Gln Ala Leu Ala Lys Gly Trp Arg Pro Asp Leu

305 310 315 320

Ser His Val Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Ala Ile Ile Gly Ala Gly

325 330 335

Pro Ala Gly Leu Ala Cys Ala Asp Val Leu Thr Arg Asn Gly Val Ala

340 345 350

Val Thr Val Tyr Asp Arg His Pro Glu Ile Gly Gly Leu Leu Thr Phe

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Gly Ile Pro Ser Phe Lys Leu Asp Lys Ser Leu Leu Ala Arg Arg Arg

370 375 380

Glu Ile Phe Ser Ala Met Gly Ile His Phe Glu Leu Asn Cys Glu Val

385 390 395 400

Gly Lys Asp Val Ser Leu Asn Ser Leu Leu Glu Gln Tyr Asp Ala Val

405 410 415

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Glu Asp Ala Pro Gly Val Tyr Asp Ala Leu Pro Phe Leu Ile Ala Asn

435 440 445

Thr Lys Gln Val Met Gly Leu Glu Glu Leu Pro Glu Glu Pro Phe Ile

450 455 460

Asn Thr Ala Gly Leu Asn Val Val Val Leu Gly Gly Gly Asp Thr Ala

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Met Asp Cys Val Arg Thr Ala Leu Arg His Gly Ala Ser Asn Val Thr

485 490 495

Cys Ala Tyr Arg Arg Asp Glu Ala Asn Met Pro Gly Ser Lys Lys Glu

500 505 510

Val Lys Asn Ala Arg Glu Glu Gly Ala Asn Phe Glu Phe Asn Val Gln

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Pro Val Ala Leu Glu Leu Asn Glu Gln Gly His Val Cys Arg Ile Arg

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Pro Val Pro Val Glu Gly Ser Glu Phe Val Met Pro Ala Asp Ala Val

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Ile Met Ala Phe Gly Phe Asn Pro His Gly Met Pro Trp Leu Glu Ser

580 585 590

His Gly Val Thr Val Asp Lys Trp Gly Arg Ile Ile Ala Asp Val Glu

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Cys Ala Asp Val Leu Thr Arg Asn Gly Val Lys Ala Ile Val Phe Asp

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Met Gly Ile Glu Phe Lys Leu Asn Thr Glu Val Gly Arg Asp Val Gln

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Leu Asp Asp Leu Leu Ser Asp Tyr Asp Ala Val Phe Leu Gly Val Gly

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Val Tyr Ala Ala Leu Pro Phe Leu Ile Ala Asn Thr Lys Gln Leu Met

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Gly Phe Gly Glu Thr Arg Asp Glu Pro Phe Val Ser Met Glu Gly Lys

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Arg Val Val Val Leu Gly Gly Gly Asp Thr Ala Met Asp Cys Val Arg

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Asp Glu Glu Asn Met Pro Gly Ser Arg Arg Glu Val Lys Asn Ala Arg

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Glu Glu Gly Val Glu Phe Lys Phe Asn Val Gln Pro Leu Gly Ile Glu

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Val Asn Gly Asn Gly Lys Val Ser Gly Val Lys Met Val Arg Thr Glu

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aatgcccctt gcgttacggc ttgtccggtt aatgctctga ctttccagtc cgatagcgta 240

caactggacg agcaaaaatg tattggttgt aaaagatgcg caatcgcttg cccctttggc 300

gtcgttgaga tggtcgatac gattgcacag aaatgcgacc tttgtaacca gcgcagttcc 360

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gggttgcagc agataaaggt ggcccgccag cgcaaaacgg cagcaggaaa agcgtcatca 480

gacgctcagc catctcgcag tgcagcgttg ctccccgtta actcgcgtaa aggcgcagat 540

aaaatttcag cgagtgaacg gaaaacccac tttggcgaaa tctattgcgg gctggatcca 600

caacaagcga cttatgagag tgaccgctgt gtttattgtg ccgaaaaagc taactgcaac 660

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gtatgtccac aggaccgtct ttgtgaaggt gcatgtactt tgaaagatca ctctggcgca 840

gtctctatcg gtaatctgga acgctacatc accgatactg cgctggcgat gggctggcgt 900

cccgatgtca gcaaagttgt tccccgtagc gaaaaagtgg cggtgattgg cgctggacct 960

gcaggattag ggtgtgctga tattctggcg cgcgcgggag ttcaggttga tgtctttgat 1020

cgccatccag aaattggcgg tatgctgact tttggcattc ctcctttcaa actcgataaa 1080

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tgtgaaattg gccgcgatat ctctttcaac gaattaacgg cggaatatga tgctgttttc 1200

ctcggcgtgg ggacttacgg gatgatgcga gcagatctgc cgcatgaaga tgcgcctggt 1260

gtcattcagg cgttaccgtt cctgaccgcc catacccgcc agctcatggg attgccggag 1320

tctgcagagt atccgctgac ggatgtggaa ggtaagcgag ttgtggtatt gggcggtggc 1380

gatacgacaa tggattgttt gcggacttcc atccgcctta atgctgccag cgtgacctgt 1440

gcgtatcgtc gtgatgaagt cagtatgccg ggttcgcgca aagaggtggt caatgcccgc 1500

gaggaaggtg ttgagtttca gttcaatgtt cagccgcaat atatcgcttg tgatgaagat 1560

ggacgcttaa cggcggtggg cctgattcgt accgctatgg gtgagccggg gccggatggc 1620

cgccgtcgtc ctcgtccggt tgcgggttca gagtttgaat tgcccgccga tgttctcatt 1680

atggcctttg gtttccaggc acataccatg ccgtggttgc agggcagcgg aattaaactc 1740

gataaatggg gcctgattca aaccggcgac gtcgggtatt tacccaccca gacgcatctg 1800

aaaaaagtct ttgctggtgg tgatgcagtt catggcgcag atctggttgt cactgcaatg 1860

gccgcaggaa ggcaggcggc gcgcgatatg ttaactctgt ttgatacgaa ggcatcgtga 1920

<210> 5

<211> 1980

<212> DNA

<213> AegA

<400> 5

atgaatcgtt ttattatggc caacagtcag caatgtctgg gttgtcatgc ttgtgaaatc 60

gcctgtgtca tggctcacaa tgacgagcaa catgtcctga gccaacacca ttttcatccc 120

cgaattacgg ttatcaaaca tcagcagcaa cgtagtgcag tgacctgtca ccattgtgaa 180

gatgcgccct gcgcccgtag ctgccctaat ggcgcaatca gccacgttga tgacagcatt 240

caggtcaatc agcaaaagtg tattggctgt aaatcctgcg tggtggcctg tccatttggt 300

acgatgcaaa tcgttctgac acccgttgcg gtaggaaaag taaaagccac ggcgcataaa 360

tgcgaccttt gtgcagggcg cgaaaacggt cctgcctgtg tcgaaaattg cccggcggac 420

gcgctgcaac tggtcactga cgccgcactc tccggcatgg cgaaatcccg ccgcttgcgc 480

accgcacgtc aggaacatca accgtggcat gccagtaccg cggcgcaaga aatgccggta 540

atgagtaaag tcgagcaaat gcaggcaacg cccgcgcgtg gcgagccaga taaactggcg 600

attgaagcgc gcaaaaccgg ttttgatgaa atttatctgc cattccgtgc cgatcaggca 660

caacgggaag cctcgcgctg ccttaagtgc ggcgagcaca gcgtttgtga atggacctgc 720

ccgctgcata accatatacc gcagtggatt gaactggtga aagccggaaa catcgacgcc 780

gccgtcgagc tttctcacca gaccaacacc ctgccggaaa ttaccggacg cgtttgcccg 840

caagaccgtt tgtgtgaagg tgcctgtact attcgcgatg agcacggcgc agtaactatc 900

ggtaacattg aacgctacat ttcagatcag gcgttggcga aaggttggcg tcctgactta 960

agccatgtca ccaaagtgga caagcgggtg gcgattatcg gtgcgggtcc ggcagggctg 1020

gcctgtgcag atgttctcac ccgcaatggc gtggcggtga cggtgtacga tcgccatcca 1080

gaaatcggtg gcttgctcac tttcggcatt ccttctttca aactggataa atccctgctg 1140

gcacgccgtc gggaaatctt cagcgcgatg gggattcact tcgaactcaa ttgtgaagtg 1200

ggtaaagatg tctctttgaa ttcgcttttg gaacaatacg acgcggtctt cgttggcgta 1260

ggcacttacc gttccatgaa agcgggttta cccaatgaag atgcgccggg cgtttatgac 1320

gcgctgccgt tcctcatcgc caatactaaa caggtgatgg gactcgaaga gctaccggaa 1380

gagccgttta tcaatactgc cggacttaac gtcgtggtac tgggcggcgg cgacaccgcg 1440

atggactgtg tgcgtactgc gctgcgccac ggcgcgagta acgtcacctg cgcttatcgt 1500

cgtgatgaag ctaacatgcc aggctcgaag aaagaggtga agaacgcccg tgaagagggg 1560

gccaacttcg aatttaacgt ccagccggtg gcgcttgaac tgaatgaaca aggtcacgtc 1620

tgcaggattc gtttcctgcg cacgcgtctt ggcgagccgg acgcccaggg acgtcggcgt 1680

ccagtgccgg tggaaggcag tgaatttgtc atgccagccg atgcggtgat tatggcgttt 1740

ggcttcaatc cgcacgggat gccgtggctg gagtcgcacg gtgtaacggt agacaaatgg 1800

ggccgcatca tcgcggatgt ggaaagccag taccgttacc agaccacgaa tccgaaaatc 1860

ttcgccggtg gtgacgccgt gcgtggtgcg gatctggtgg ttaccgcaat ggcagaagga 1920

cgtcatgcgg cacaggggat cattgactgg ctgggcgtaa aatcagtcaa atctcactga 1980

<210> 6

<211> 1419

<212> DNA

<213> gltD

<400> 6

atgagtcaga atgtttatca atttatcgac ctgcagcgcg ttgatccgcc aaagaaaccg 60

ctgaagatcc gcaaaattga gtttgttgaa atttacgagc cgttttccga aggccaggcc 120

aaagcgcagg ctgaccgctg cctgtcgtgc ggcaacccat actgcgagtg gaaatgcccg 180

gtacacaact acatcccaaa ctggctgaag ctcgccaatg aggggcgtat ttttgaagcg 240

gcggaactgt cgcaccagac aaacaccctg ccggaagttt gcggacgtgt ctgcccgcaa 300

gaccgtctgt gcgaaggttc ctgcaccctg aacgatgagt tcggtgcggt gaccatcggc 360

aacattgagc gttatatcaa tgataaagcg ttcgagatgg gctggcgtcc ggatatgtcc 420

ggcgtgaaac agaccggtaa aaaagtagcg attatcggcg caggtccggc gggtctggcg 480

tgcgcggatg tcctgacgcg caacggcgta aaagcgatcg tcttcgaccg tcacccggaa 540

attggcggct tgctgacctt cggtattccg gctttcaagc tggaaaaaga ggtaatgacg 600

cgccgccgtg aaatcttcac cggcatgggt attgaattca aactcaatac cgaagtgggc 660

cgcgacgtgc agctggacga tctgctgagt gattacgatg ccgtgttcct tggcgtcggg 720

acttatcagt caatgcacgg cgggctggaa aacgaagacg ccgatggcgt gtacgcagca 780

ctgccgttcc ttatcgccaa caccaaacag ttaatgggct ttggtgaaac ccgcgacgaa 840

ccgttcgtca gcatggaagg caaacgcgtg gtggtccttg gcggtggcga cactgcgatg 900

gactgcgtgc gcacgtctgt acgccagggg gcaaagcacg ttacctgtgc ctatcgtcgt 960

gatgaagaga acatgccggg ttcccgccgc gaagtgaaaa acgcgcggga agaaggcgta 1020

gagttcaaat tcaacgtcca gccgctgggt atagaagtga atggcaacgg caaagtcagc 1080

ggcgtaaaaa tggtgcgcac agaaatgggc gaaccggatg ccaaaggccg tcgccgcgcg 1140

gagattgtgg caggttccga acatatcgtt ccggcagatg cggtgatcat ggcgtttggt 1200

ttccgtccac acaacatgga atggctggca aaacacagcg tcgagctgga ttcgcagggg 1260

cgcattatcg ccccggaaga caacgacaac gctttccaga ccagcaaccc gaaaatcttt 1320

gctggcggcg atatcgtccg tggttccgat ctggtggtga ccgctattgc cgaaggtcgt 1380

aaggcggcag acggtattat gaactggctg gaagtttaa 1419

Claims (2)

1.大肠杆菌（Escherichia coli）Nissle 1917在制备治疗痛风和/或高尿酸血症的药物中的应用，其特征在于，所述大肠杆菌Nissle 1917包含YgfT和AegA；

其中，YgfT的序列如SEQ ID No.1所示；

AegA的序列如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所制备得到的药物中，所述大肠杆菌Nissle1917的剂量为2×10¹⁰ cfu/ mL，服用频率为3天/次或5天/次；

所述大肠杆菌Nissle 1917表达的YgfT和AegA与尿酸的摩尔比至少为1:2000。

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