CN111763718A - 一种检测猪链球菌感染的纳米pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测猪链球菌感染的纳米PCR方法。通过对纳米PCR反应体系的引物、退火温度和引物浓度进行优化，获得高效的检测猪链球菌的纳米PCR扩增体系。本发明纳米PCR敏感度比普通PCR高出100倍，本发明扩增方法最低检出限为1×10¹CFU/ml；特异性强。本发明通过减少增菌和DNA提取步骤，适用于SS低含量临床样品的检测，可直接用于SS临床病料的检测，可应用于SS感染的诊断，为猪链球菌感染的鉴定和防控奠定基础，具有重大的临床应用意义和价值。

Description

一种检测猪链球菌感染的纳米PCR方法

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种检测猪链球菌的纳米PCR引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是革兰式阳性菌，无鞭毛，无芽孢，可形成荚膜，菌体呈球形或卵圆形，常排列成对或者成短链，需氧或兼性厌氧。在含绵羊血或马血的琼脂培养基上形成草绿色针尖大小的α溶血菌落。根据猪链球菌的荚膜多糖的抗原特异性，分为35个血清型。

猪链球菌病是SS感染导致的一种重要人畜共患传染病，主要表现以急性败血症、关节炎、脑膜炎和急性死亡为主要特征，该菌感染人后导致细菌性脑膜炎和中毒性休克，甚至死亡，给全球公共安全带来巨大隐患。欧洲、东南亚、东亚、北美、南美、澳大利亚和新西兰地区先后出现人类感染的病例，目前猪链球菌病在我国属于Ⅱ类地方性疾病，需要严格控制和快速消灭。SS主要通过直接接触传播、空气传播，也可以通过垂直传播侵害仔猪，通常经口腔或鼻腔进入机体，最终定殖于扁桃体，感染猪终生带毒，但不一定表现出临床症状，但发病后，SS进入全身，可从各组织、脏器和分泌物中分离到病原菌。由于SS血清型众多，传播途径多样，临床上多种血清型混合存在或先后存在，且SS毒力因子复杂，致病机制不明确，因此建立快速、高效的检测方法对SS的防治具有重要意义。

目前，对SS的诊断方法主要有细菌分离鉴定、血清学诊断、普通PCR、荧光定量PCR等。细菌分离鉴定费时费力、过程繁琐且有时分离不到致病菌；血清学诊断方法主要用于SS血清分型鉴定，虽然简便快速，但是准确度不够高；分子学诊断技术中，普通PCR的检测是常用技术，但由于该方法灵敏度不足，在检测过程需要先进行增菌试验，核酸提取，才能进行检测，临床检测时间较长，不能满足当前的检测需求；荧光定量PCR灵敏度高，特异性好，但该方法对仪器设备要求较高，难以推广应用。

近年来，随着纳米材料的发展，研究发现纳米金属颗粒能够调节DNA聚合酶的活性，高效启动DNA聚合酶，还能够提高PCR反应体系的导热性能，快速达到目的温度，使非目标温度的停留时间变短，从而减少了非特异性扩增，增加特异性扩增的产量，提高PCR的扩增效率和检测的灵敏度，同时缩短了整个PCR反应过程。该方法目前仍未适用于猪细菌检测，尤其是SS的鉴定检测当中。其中，谷氨酸脱氢酶是新近发现的一个与猪链球菌毒力相关的因子，具有高度的保守性，能够特异性检测不同血清型、不同地区分离的SS菌株，可作为SS检测的特异性基因。因此，本发明旨在通过SS的GDH基因，结合纳米PCR技术，建立新型的SS的核酸检测技术，试图寻求一种更高效、更快捷的检测方法，为猪链球菌的防控和检疫提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测猪链球菌的纳米PCR方法。

本发明的又一目的在于提供上述检测方法的引物。

本发明所采取的技术方案是：

本发明第一方面，提供了一种检测猪链球菌的纳米PCR引物，所述引物的核苷酸序列如下：

P1：5’-CATGGACAGATAAAGATGGA-3’；

P2：5’-CAGCGTATTCTGTCAAACGA-3’。

本发明的又一方面，提供了一种检测猪链球菌的纳米PCR试剂盒，包括前面所述的引物。

根据本发明的实施例，还包括nano PCR buffer、Taq酶。

本发明的又一方面，提供了前面所述纳米PCR引物在制备检测猪链球菌病猪链球菌中的应用。

本发明的又一方面，提供了前面所述纳米PCR试剂盒在制备检测猪链球菌病猪链球菌中的应用。

本发明的又一方面，提供了一种检测猪链球菌的纳米PCR方法，包括以下步骤：

(1)提取样品的DNA；

(2)以提取的DNA为模板，使用前面所述引物进行PCR扩增，得到扩增产物；

(3)结果判定：对扩增产物进行分析，判定样品中是否含有猪链球菌。

根据本发明的实施例，步骤(2)中所述PCR扩增体系：

根据本发明的实施例，步骤(2)所述扩增体系反应条件为：

95℃预变性4min；95℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸35s，循环30次；72℃终延伸10min。

根据本发明的实施例，步骤(3)结果判定的方法：

(1)若样品纳米PCR扩增产物大小为687bp，则判定样品含有猪链球菌。

(2)若样品纳米PCR扩增产物无条带，则判定样品为阴性。

本发明的有益效果是：

1、本发明的纳米PCR(Nano PCR)方法的最低细菌检测限比普通PCR最低细菌检测限高出100倍，具有良好的灵敏度。

2、本发明纳米PCR扩增得到与预期的片段大小一致且特异的产物，克隆测序验证100％准确，本发明所述方法准确性极高。

3、本发明方法适用于SS感染的检测，一步完成，操作简便快捷。综上，本发明提供的用于鉴别SS感染的纳米PCR方法具有极高的灵敏度和特异性，是一种高效的检测手段，可应用于猪链球菌的流行性调查，同时也为SS的鉴定和防控奠定基础。

附图说明

图1是本发明扩增反应退火温度的优化结果，其中M列：DL2000；第1列～第10列：退火温度51℃～60℃；第11列：阴性对照H₂O。

图2是本发明扩增反应引物添加量的优化结果，其中M列：DL2000；第1列～第14列：引物的量0.6μL～1.9μL；第15列：阴性对照H₂O。

图3是SS纳米PCR(A)和普通PCR(B)敏感性试验结果，其中A中M列：DL2000，第1列～第9列：1×10⁹CFU/μL～1×10¹CFU/μL，第10列：阴性对照；B中M列：DL2000，第1列～第9列：1×10⁹CFU/μL～1×10¹CFU/μL，第10列：阴性对照。

图4是纳米PCR的特异性实验，其中A中M列：DL2000Marker，1：猪链球菌，2：副猪嗜血杆菌，3：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，4：大肠杆菌，5：沙门氏菌，6：金色葡萄球菌，7：阴性对照；B中M列：DL2000Marker，1：猪链球菌-1型，2：猪链球菌-2型，3：猪链球菌-7型，4：猪链球菌-9型，5：阴性对照。

具体实施方式

下面将结合说明书附图和具体的实验对本发明所展示的内容进行进一步详细的阐述。本实验实施过程和附图仅用于解释本发明，并非用于限制本发明的范围。实施过程中所使用的实验方法如果没有特别说明，均为常规实验方法。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

本发明使用的猪主要细菌核酸包括猪链球菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和猪金色葡萄球菌，均取自广东省农业科学院动物卫生研究所猪病实验室。

实施例1引物设计

根据SS2-GDH(基因登录号：AY853916)基因序列进行引物设计，通过与已公开的SS-gap其他血清型的基因全长序列进行比对后筛选保守区域，通过大量筛选，筛选了灵敏度高和特异性强的引物，引物核苷酸序列如下：

P1：5’-CATGGACAGATAAAGATGGA-3’(SEQ ID NO:1)；

P2：5’-CAGCGTATTCTGTCAAACGA-3’(SEQ ID NO:2)。

实施例2扩增条件的优化

(1)退火温度

将退火温度梯度设置为52℃～64℃，退火温度间隔1℃进行梯度设置，进行退火温度的优化，反应体系和其他反应条件均相同。用P1和P2引物，进行PCR扩增反应，反应结束后取PCR扩增产物用琼脂糖电泳检测。

结果：如图1所示，最佳的退火温度为53℃。

最佳的纳米PCR扩增反应条件：95℃预变性4min；95℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸35s，循环30次；72℃终延伸10min。

(2)引物添加量

引物(浓度为10μmol/L)的体积从0.6μL到1.9μL进行设置，体积间隔0.1μL进行设置，反应条件为优化后的退火温度为准。其他条件都不变。

结果：如图2所示，引物添加量为1.1μL(10μmol/L)效果最佳。

实施例3标准样品的制备和扩增

(1)标准阳性样品的制备

本实施例中制备猪链球菌阳性标准样品的制备步骤：

将猪链球菌(SS)在TSB液体培养基(胰酪大豆胨液体培养基)培养增殖后，提取SS的核酸，并以引物P1和引物P2为扩增引物进行扩增。回收纯化扩增的产物，克隆至pET-28a载体中构建重组质粒，再进一步测序确认片段已正确插入载体，即质粒pET-28a-SS-gdh(+)作为猪链球菌阳性标准样品。

(2)阳性标准样品

以步骤(1)的阳性标准样品为DNA模板，进行扩增反应；以水作为阴性对照。

反应体系：

反应条件预为：

95℃4min；95℃30s、53℃30s、72℃35s，循环30次；72℃10min。本发明的普通PCR反应体系中，其中的buffer中不加纳米颗粒，其他的反应条件与优化的纳米PCR相同。

(3)阳性标准样品的结果分析

结果：经1％的琼脂糖凝胶电泳，大小约687bp的目的片段即为阳性结果。

下面对本发明的检测方法进一步的效果检测。

敏感性试验：

将SS的纯培养物进行平板计数后，用PBS将细菌进行倍比稀释，每个样品的浓度分别为10⁹～10¹copies/μl，各取1μL作为模板，进行纳米PCR及普通PCR扩增。扩增结束后，取8.0μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，比较纳米PCR和普通PCR两个不同扩增方法对猪链球菌检测的敏感度，重复3次。

结果：纳米PCR最低检出限为1×10¹CFU/ml(图3的A)，而普通PCR的最低检测量为1×10³CFU/ml(图3的B)，表明纳米PCR至少比普通PCR的敏感性要高出100倍。

特异性试验

应用纳米PCR分别提取猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和猪金色葡萄球菌的核酸，分别作为模板进行扩增检测，以此验证其纳米PCR方法的特异性；试验重复3次。

结果：采用P1和P2引物分别对猪链球菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和猪金色葡萄球菌进行纳米PCR检测，结果只有猪链球菌能扩增出688bp的目的片段，其他细菌未扩增出条带(图4中A)。

同时对我国流行的主要致病菌株猪链球菌-1型(SS-1型)、猪链球菌-2型(SS-2型)，猪链球菌-7型(SS-7型)、猪链球菌-9型(SS-9)型检测，均能扩增出目的片段(图4的B)，试验表明使用本发明的纳米PCR方法检测SS的特异性强。

实施例4临床样品检测

(1)选取对来自茂名、河源和韶关的44份临床疑似患有猪链球菌的病料，经研磨后提取各组织样品中的细菌DNA。分别提取送检的44份临床疑似病料的核酸。

(2)使用本发明的引物P1、P2分别进行纳米PCR和普通PCR，对细菌DNA进行扩增，同时以猪链球菌标准样品作为阳性对照。反应体系以及反应程序如实施例2。

(3)临床样品分析

本发明检测的临床样品结果如图4和表1所示，其中阳性标准品作为阳性对照，水为阴性对照。

结果显示，纳米PCR和普通PCR检测SS阳性率分别为72.7％(32/44)和54.5％(24/44)。

为进一步确定所建立方法检测的准确性，将纳米PCR获得的产物送华大基因测序分析。测序结果显示，纳米PCR扩增的688bp是猪链球菌的特异性片段。表明纳米PCR比普通PCR敏感度高，适用于低含量SS临床样品的检测。

表1普通PCR及本发明纳米PCR对临床样品的检测结果

样品来源	样品数	纳米PCR	普通PCR
				茂名	9	7/9	4/9
韶关	16	11/16	9/16
				河源	19	14/19	11/19
合计	44	32/44	24/44

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 一种检测猪链球菌感染的纳米PCR方法

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

catggacaga taaagatgga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cagcgtattc tgtcaaacga 20

Claims (9)

1.一种检测猪链球菌的纳米PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：

P1：5’-CATGGACAGATAAAGATGGA-3’；

P2：5’-CAGCGTATTCTGTCAAACGA-3’。

2.一种检测猪链球菌的纳米PCR试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括nano PCR buffer、Taq酶。

4.权利要求1所述纳米PCR引物在制备检测猪链球菌病猪链球菌中的应用。

5.权利要求2所述纳米PCR试剂盒在制备检测猪链球菌病猪链球菌中的应用。

6.一种检测猪链球菌的纳米PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取样品的DNA；

(2)以提取的DNA为模板，使用权利要求1所述引物进行PCR扩增，得到扩增产物；

(3)结果判定：对扩增产物进行分析，判定样品中是否含有猪链球菌。

7.根据权利要求6所述的纳米PCR方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增体系：

8.根据权利要求6所述的纳米PCR方法，其特征在于，步骤(2)所述扩增体系反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸35s，循环30次；72℃终延伸10min。

9.根据权利要求6所述的纳米PCR方法，其特征在于，步骤(3)结果判定的方法：

(1)若样品纳米PCR扩增产物大小为687bp，则判定样品含有猪链球菌。

(2)若样品纳米PCR扩增产物无条带，则判定样品为阴性。

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