CN111751468A - 溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法，对交联后得到的溶菌酶单体/多聚体混合物，采用高效液相系统进行体积排阻色谱分离纯化。色谱柱为亲水硅胶柱；流动相为50mMPB，尿素0.5M，硫酸铵0.3M，乙腈10％；以0.35ml/min的流速驱动，样品的分析时间设置为40分钟；使用UV 280nm紫外检测器进行检测。对混合物中二聚体馏分进行收集，冷冻干燥后采用超滤管进行脱盐处理。得到的溶菌酶二聚体水溶液采用BCA定量试剂盒进行浓度测定，按照分装后冻干，得到溶菌酶二聚体标准品。本发明方法过程在室温下5小时即可完成，工艺步骤简单、操作简易可行，溶菌酶二聚体收率高，成本低，效果好。
Description
技术领域
本发明涉及一种二聚体的纯化制备的方法，特别是涉及一种溶菌酶二聚体的分离纯化制备的方法，应用于化学物质分离纯化和试验标准品制备技术领域。
背景技术
溶菌酶是自然界常见的一种球状碱性蛋白，其分子量MW约为14.4kDa，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。溶菌酶二聚体是以蛋清溶菌酶为原料，将单体溶菌酶改性为溶菌酶二聚体，该二聚体保留了单体溶菌酶的酶活性，而且还具有相当新的性质和抗菌活性[Ibrahim et al.1991,
et al.2009]。在实验动物身上显示，二聚体提高了非特异性抗原反应和免疫球蛋白的产生，刺激肺巨噬细胞的酶活性，防止抗生素免疫抑制，消除环磷酰胺的免疫抑制作用，并降低血液中的氧自由基水平和发炎乳腺的分泌物。
溶菌酶二聚体作为替代抗生素的一种饲料添加剂，主要用于提高断奶仔猪平均日增重；显著增加十二指肠绒毛高度，降低空肠隐窝深度，显著增加十二指肠和空肠绒毛高度和隐窝深度的比值，从而改善仔猪肠道发育，促进营养物质吸收；显著增强腹腔巨噬细胞的吞噬率及其吞噬指数，提高血液中性细胞的吞噬率，从而提高断奶仔猪的非特异性免疫功能。
对于交联后得到的溶菌酶单体/多聚体混合物的分离纯化，通常可以采用反相高效液相色谱法(RP)、离子交换色谱法(IEC)、体积排阻色谱法(SEC)、凝胶电泳分离和分子过滤，以消除试剂和洗脱液残留物，并纯化溶菌酶二聚体。其中体积排阻色谱法(SEC)，蛋白质因其大小而分离，或更准确地通过其流体动力学体积分离。公开号为CN101734671A的专利文献公开了一种利用体积排阻色谱法监控硅胶微球合成的方法，来监控硅胶微球合成进度及批次的重现性；公开号为CN 105486792A的专利文献公开了一种银杏二萜内酯葡胺注射液及其制备原料中大分子化合物的检测方法，用于过程质量控制和终产品质量评价；公开号为CN111220720A的专利文献公开了一种胰蛋白酶及其酶原的纯度检测方法，用于过程质量控制和终产品质量评价；公开号为CN 104219957A的专利文献公开了一种用于精炼甘油酯油的方法和通过这种方法获得的纯化的甘油三酯油，以使高纯度的精炼的甘油三酯油能够有成本效益地生产。现有技术主要采用利用体积排阻色谱法来监控化学物质合成制备过程。体积排阻色谱法(SEC)这种分离方法的分离效果主要受固定相和流动相选择的影响，不同的纯化目标物质所采用的条件参数存在很大区别，利用体积排阻色谱法测定溶菌酶二聚体的分子量，从而有效控制溶菌酶二聚体的纯度，具有准确、直观、快速、取样量少等优点，但是，迄今为止还未有采用体积排阻色谱法直接监控溶菌酶二聚体分离提纯过程的相关报道。
发明内容
为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法，分离纯化溶菌酶二聚体并制备其标准品，整个过程在室温下5小时内的较短时间内即可完成，工艺步骤简单，操作简易可行，提纯和检测效率高；原材料消耗少，溶菌酶二聚体收率高，溶菌酶单体可再次回收利用，成本低；所制备的溶菌酶二聚体标准品质量高，效果好，满足实验试样纯度要求和产品制备后处理的产品质量标准的需要。
为达到上述发明创造目的，本发明采用如下技术方案：
一种溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法，包括如下步骤：
a.取交联后得到的溶菌酶单体和多聚体混合物，采用高速离心机进行离心处理，以去除不溶解的杂质，取上清液分装到色谱进样瓶中，备用；
b.采用高效液相系统，对在所述步骤a中得到的上清液进行体积排阻色谱分离纯化处理，得到分离纯化的溶菌酶二聚体；
在进行分离纯化过程中，采用的色谱柱为亲水硅胶柱，流动相的流速设定为0.35ml/min，分析时间设置为40分钟，采用UV 280nm紫外检测器进行检测；溶菌酶单体、二聚体、多聚体都能得到非常好的基线分离；
进行分离纯化时，将得到的在所述步骤a中得到的上清液中的二聚体馏分进行收集，经冷冻干燥后，采用超滤管进行脱盐处理，将得到的溶菌酶二聚体水溶液采用BCA定量试剂盒进行浓度测定，然后按照100微克/管进行分装后再进行冻干，得到纯度不低于99％的溶菌酶二聚体标准品。优选得到纯度为99.2％的溶菌酶二聚体标准品。
作为本发明优选的技术方案，在所述步骤a中，进行离心处理时，设置离心力不低于15000g，离心处理至少10分钟。
作为本发明优选的技术方案，在所述步骤b中，所采用的亲水硅胶柱参数如下：7.8*300ID，5μm。非常适合溶菌酶单体、二聚体、多聚体蛋白混合物进行体积排阻色谱分离。
作为本发明优选的技术方案，在所述步骤b中，所采用的亲水硅胶柱为东曹株式会社的亲水硅胶，型号规格为TSKgel G2000SWXL。
作为本发明优选的技术方案，在所述步骤b中，所采用的流动相中，PB的浓度为50mM，尿素的浓度为0.5M，硫酸铵的浓度为0.3M，乙腈的体积浓度为10％(v/v.)。
作为本发明优选的技术方案，在所述步骤b中，调节所采用的流动相的pH为3。
作为本发明优选的技术方案，在所述步骤b中，所使用的化学试剂为分析纯，溶液为色谱纯。
作为本发明优选的技术方案，在所述步骤b中，所述超滤管采用截流分子量不大于14KD的超滤离心管。进一步优选所述超滤管采用截流分子量不大于3KD的超滤离心管。更进一步优选所述超滤管采用密理博超滤管，型号规格为UFC900396，截流分子量为3KD。由于溶菌酶单体分子量大约为14KD，选择截流为3KD超滤离心管最适合。
作为本发明优选的技术方案，在所述步骤b中，将超滤管的超滤离心转速设置不低于8000rpm，分为至少6次加入色谱纯水进行溶液置换，并分别离心处理，每次离心不少于20分钟。
作为本发明优选的技术方案，在所述步骤b中，所采用的BCA定量试剂盒为赛默飞世尔公司生产的化学试剂盒子产品。
作为本发明优选的技术方案，在所述步骤b中，采用MALDI-TOF质谱仪和SDS-PAGE凝胶分离进行检测，得知溶菌酶二聚体纯度。
本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
1.本发明方法采用体积排阻色谱分离方法，适合溶菌酶单体、二聚体、多聚体蛋白混合物进行分离提纯的监控；使溶菌酶单体、二聚体、多聚体都能得到非常好的基线分离；
2.本发明分离纯化溶菌酶二聚体并制备其标准品，整个过程在室温下5小时内较短时间内的即可完成，效率高，工艺步骤简单、操作简易可行；原材料消耗少，溶菌酶二聚体收率高，溶菌酶单体可再次回收利用，成本低；所制备的溶菌酶二聚体标准品质量高，效果好；
3.本发明方法简单易行，成本低，适合推广使用。
附图说明
图1是本发明优选实施例方法的单体、二聚体和多聚体体积排阻色谱分离图。
图2是本发明优选实施例方法的溶菌酶二聚体MALDI-TOF质谱图。
图3是本发明优选实施例方法的单体、二聚体和多聚体SDS-PAGE凝胶图。
图4是本发明优选实施例方法绘制的BSC标准曲线。
具体实施方式
以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：
在本实施例中，一种溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法，包括如下步骤：
a.取交联后得到的溶菌酶单体和多聚体混合物100mL，采用高速离心机进行离心纯化处理，设置离心力为15000g，离心处理10分钟，以去除不溶解的杂质，取上清液分装到色谱进样瓶中，备用；
b.采用高效液相系统，对在所述步骤a中得到的上清液进行体积排阻色谱分离处理，得到分离纯化的溶菌酶二聚体；
在进行分离纯化过程中，采用的色谱柱为亲水硅胶柱，流动相的流速设定为0.35mL/min，分析时间设置为40分钟，采用UV 280nm紫外检测器进行检测；
进行分离纯化时，流动相配方为：PB的浓度为50mM的，尿素的浓度为0.5M，硫酸铵的浓度为0.3M，乙腈的体积浓度为10％(v/v.)，所使用的化学试剂为分析纯，溶液为色谱纯，配制1L流动相的方法按照下表1进行：
表1.本实施例的流动相配方表
在进行分离纯化过程中，采用NanoAcuity超高压液相色谱系统，对溶菌酶单体/多聚体混合物进行体积排阻色谱分离实验；色谱柱为亲水硅胶柱采用东曹株式会社(TOSOHCorporation)的亲水硅胶，型号规格为TSKgel G2000SWXL，7.8*300ID，5μm；非常适合溶菌酶单体、二聚体、多聚体蛋白混合物进行体积排阻色谱分离；自动进样器上样体积为20uL；以0.35mL/min的流速驱动，样品的分析时间设置为40分钟；使用UV 280nm紫外检测器进行检测；溶菌酶单体、二聚体、多聚体都能得到非常好的基线分离；如图1所示，单体、二聚体和多聚体得到了非常好的分离；手工收集溶菌酶二聚体馏分，冷冻干燥后，采用选择截流分子量为3KD的超滤离心管进行盐处理，超滤离心管采用密理博超滤管，型号规格为UFC900396，设置超滤离心速度设置为8000rpm，分为6次加入色谱纯水进行溶液置换，并分别离心处理，每次离心20分钟；得到的溶菌酶二聚体采用MALDI-TOF质谱分析，如图2所示；将纯化的二聚体与单体、多聚体SDS-PAGE凝胶分离进行检测，如图3所示；得知溶菌酶二聚体纯度达到99％以上；
然后将得到的溶菌酶二聚体的水溶液采用赛默飞世尔公司出产的BCA定量试剂盒进行浓度测定；标曲BSA的浓梯度为0,0.025,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5μg/μL，体积为20μL；样品采用水稀释40倍后取20μL，每个样品设置3个复孔；将标曲溶液和样品溶液加入96孔板中，以A液和B液的体积比为50:1的比例配制显色剂，每孔加200ML，37℃恒温孵育约45min，利用酶标仪在562nm的条件下检测吸光度值，根据标曲计算出样品的浓度为5.49ug/uL，参见图4，BSC标准曲线：y＝1.2463x+0.1209，R2＝0.9963。
最后按照100微克/管进行分装后再进行冻干，得到纯度不低于99.2％的溶菌酶二聚体标准品。
采用本实施例方法分离纯化溶菌酶二聚体并制备其标准品，整个过程在室温下5小时内即能完成，工艺步骤简单、操作简易可行；原材料消耗少，溶菌酶二聚体收率高，溶菌酶单体可再次回收利用，成本低；所制备的溶菌酶二聚体标准品质量高，效果好。
上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.取交联后得到的溶菌酶单体和多聚体混合物，采用高速离心机进行离心处理，以去除不溶解的杂质，取上清液分装到色谱进样瓶中，备用；
b.采用高效液相系统，对在所述步骤a中得到的上清液进行体积排阻色谱分离纯化处理，得到分离纯化的溶菌酶二聚体的混合物；
在进行分离纯化过程中，采用的色谱柱为亲水硅胶柱，流动相的流速设定为0.35ml/min，分析时间设置为40分钟，采用UV 280nm紫外检测器进行检测；
进行分离纯化时，将得到的在所述步骤a中得到的上清液中的二聚体馏分进行收集，经冷冻干燥后，采用超滤管进行脱盐处理，将得到的溶菌酶二聚体水溶液采用BCA定量试剂盒进行浓度测定，然后按照100微克/管进行分装后再进行冻干，得到纯度不低于99％的溶菌酶二聚体标准品。
2.根据权利要求1所述溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法，其特征在于：在所述步骤a中，进行离心处理时，设置离心力不低于15000g，离心处理至少10分钟。
3.根据权利要求1所述溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法，其特征在于：在所述步骤b中，所采用的亲水硅胶柱参数如下：7.8*300ID，5μm。
4.根据权利要求1所述溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法，其特征在于：在所述步骤b中，所采用的流动相中，PB的浓度为50mM，尿素的浓度为0.5M，硫酸铵的浓度为0.3M，乙腈的体积浓度为10％(v/v.)。
5.根据权利要求1所述溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法，其特征是：在所述步骤b中，调节所采用的流动相的pH为3。
6.根据权利要求1所述溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法，其特征在于：在所述步骤b中，所使用的化学试剂为分析纯，溶液为色谱纯。
7.根据权利要求1所述溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法，其特征是：在所述步骤b中，所述超滤管采用截流分子量不大于14KD的超滤离心管。
8.根据权利要求7所述溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法，其特征是：在所述步骤b中，所述超滤管采用截流分子量不大于3KD的超滤离心管。
9.根据权利要求1所述溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法，其特征是：在所述步骤b中，将超滤管的超滤离心转速设置不低于8000rpm，分为至少6次加入色谱纯水进行溶液置换，并分别离心处理，每次离心不少于20分钟。
10.根据权利要求1所述溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法，其特征是：在所述步骤b中，采用MALDI-TOF质谱仪和SDS-PAGE凝胶分离进行检测，得知溶菌酶二聚体纯度。
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