CN111717909B - 一种富勒烯-四氧化三锡检测降钙素原的夹心型光电化学传感器的制备方法 - Google Patents
一种富勒烯-四氧化三锡检测降钙素原的夹心型光电化学传感器的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基于一种富勒烯‑四氧化三锡检测降钙素原的夹心型光电化学传感器的制备方法。本发明采用富勒烯量子点和硒化镉共同敏化的四氧化三锡复合材料作为基底光敏材料，富勒烯具有优异的传递电子的效能，能够有效的增强氧化锡材料的光电流响应，其次，羧基功能化的硒化镉能够有效的连接生物分子，同时作为敏化剂进一步促进了基础光电流响应，提高了传感器的稳定性。二硫化铁具有良好的光吸收性能，其作为标记物标记降钙素原第二抗体构建夹心型传感器，能有效提高传感器的灵敏度，实现了对降钙素原的超灵敏检测。其检测限为3.5 fg/mL。
Description
技术领域
本发明涉及基于一种富勒烯-四氧化三锡检测降钙素原的夹心型光电化学传感器的制备方法。具体是采用富勒烯量子点与硒化镉共同敏化的四氧化三锡作为基底光敏材料，用二硫化铁作为标记物标记第二抗体，制备了一种检测降钙素原的夹心型光电化学传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
背景技术
降钙素原（PCT）是一种蛋白质，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高，细菌内毒素在诱导过程中担任了至关重要的作用，局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症不会导致其升高，自身免疫、过敏和病毒感染时PCT也不会升高，因此PCT是严重细菌性炎症和真菌感染的特异性指标，而且也是脓毒症和炎症活动有关的多脏器衰竭的可靠指标，它反映了全身炎症反应的活跃程度。在严重的细菌性感染疾病中如脓毒症和MODS，PCT升高的程度是炎症活动的反映。PCT不仅是用于鉴别诊断的急性指标，而且是监控炎症活动的参数。其优于其他炎症指标的优势在于，严重的感染引起PCT浓度显著升高（>10ug/L），而较轻的感染或不太严重的脓毒症仅引起PCT中度升高。并且，PCT还可以作为严重炎症的愈后监控指标。如果炎性刺激不再存在，PCT在几天内恢复到正常参考范围内。因此，建立一种快速、准确地检测降钙素原的分析方法非常必要。目前已有的降钙素原抗原的检测方法有很多，如利用时间分辨荧光免疫层析方法检测（黄德智,应昊俊,刘飞等.降钙素原时间分辨荧光免疫层析检测方法的建立及性能评价[J].第三军医大学学报, 2019, 41(06):581-586.）；酶联免疫方法（一种唾液降钙素原酶联免疫检测方法，CN201610401787.1）；化学发光免疫方法（基于纳米抗体的降钙素原化学发光检测试剂及检测方法，CN201810235448.X）等等，但由于酶联免疫分析操作繁琐，价格昂贵；荧光分析可控性差、毒性大；电化学发光分析检测时间长等。本发明设计了一种新型的夹心型光电化学传感器，其分析速度快，操作简单，稳定性好，检测限低，本发明设计的夹心型光电化学传感器对降钙素原抗原的检测限达到3.5 fg/mL。
四氧化三锡，一种含有多价态金属元素的半导体材料，具有优异的光敏活性和光催化性能，不同于单价态的二氧化锡或氧化亚锡，含有多金属价态的半导体光敏材料具有优异的光稳定性，光生电子会更加有利于产生和传递，并且其制备简单，成本低，具有一定的热稳定性。但是单纯的四氧化三锡材料，在受到光激发后，光生电子在快速形成的过程中，也会有部分电子与空穴复合，使得其自身的优异表现不明显。富勒烯结构的碳材料具有优异的电子传递性能，其自身能够作为电子受体，接收电子并快速的进行传递。并且由于碳纳米结构的材料本身具有的良好的导电性，富勒烯量子点在本发明中用于敏化四氧化三锡材料，能够更加有效的实现光生电子的传递过程，以获得更高的光电流响应。本发明设计的四氧化三锡为花状结构，为富勒烯量子点的负载提供了更多的活性位点，但是由于富勒烯很难进行基团功能化，不利于后续生物分子的连接，羧基功能化的硒化镉材料被应用，用于连接生物分子。此外，硒化镉作为一种优异的敏化剂，从另一方面也进一步提高了基底光电响应，提高了传感器的稳定性。在后续生物分子修饰的过程中，光电流会逐渐降低，利用对光能有吸收作用的二硫化铁纳米颗粒作为标记物标记第二抗体，使得传感器在修饰到最后一层时，光电流大幅度降低，提高了光电流的改变值，利用改变值与检测物浓度的关系，判断检测物的含量，二硫化铁的引入，提高了传感器的灵敏度，实现了对降钙素原的超灵敏检测，检测限达到3.5 fg/mL。
光电化学检测方法具有操作简单、灵敏度高、背景信号低等特点，已经发展成为一种极具应用潜力的分析方法，在食品安全、环境卫生和医药等领域具有广阔的应用前景。四氧化三锡材料在光电化学传感器方面的应用未见报道。本发明基于富勒烯量子点敏化的四氧化三锡花状材料成功构建了在可见光下检测降钙素原的夹心型光电化学传感器。该传感器以富勒烯量子点和硒化镉纳米颗粒共敏化的花状四氧化三锡作为基底光敏材料，富勒烯高效的电子传递功能和羧基化的硒化镉优异的敏化作用，提高了材料的光电响应和传感器的稳定性，同时硒化镉羧基功能化之后易与生物分子连接，为传感生物平台的建立提供了保障。以二硫化铁作为标记物，标记第二抗体，实现了目标物浓度变化时，光电流信号改变的灵敏性，实现了对降钙素原的超灵敏检测。本发明制备的光电化学传感器，具有低成本、高灵敏、特异性好、快速检测、易于制备等优点，实现了在可见光区域对降钙素原的快速、超灵敏检测，有效克服了目前降钙素原检测方法的不足。
发明内容
本发明目的之一是采用花状的四氧化三锡材料作为光敏材料，含有多价态金属的半导体材料具有优异的光电活性和光稳定性。
本发明目的之二是利用富勒烯量子点敏化四氧化三锡材料，富勒烯具有快速传递电子的作用，能够提高导电性和光电响应，此外花状的氧化锡提供了大的比表面积以负载大量的富勒烯。
本发明目的之三是利用羧基功能化的硒化镉进一步敏化基底材料，一方面进一步提高光电流，提高传感器的稳定性，另一方面，羧基易与生物分子连接，为后续传感器的修饰提供保障。
本发明目的之四是利用二硫化铁作为标记物标记降钙素原第二抗体，传感器在层层修饰抗原和抗体的过程中，生物分子会阻碍电子传递，降低光电流，二硫化铁能够吸收光能，从而进一步降低光电流，光电流信号变化增大，有利于目标物检测灵敏度的提高。
本发明目的之五是以富勒烯量子点和硒化镉共同敏化的四氧化三锡作为基底光敏材料，以二硫化铁作为标记物标记降钙素原第二抗体，制备一种灵敏度高、稳定性好、检测速度快的夹心型光电化学传感器，实现了在可见光条件下对降钙素原超灵敏检测的目的。
本发明的技术方案如下：
1、基于一种富勒烯-四氧化三锡检测降钙素原的夹心型光电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）花状四氧化三锡材料的制备
取1.0 ~ 1.5 g二水合氯化亚锡和3.0 ~ 3.5 g二水合柠檬酸三钠共同溶解于10~ 15 mL的超纯水中，此溶液在室温下搅拌混合均匀后，作为溶液A；取0.25 ~ 0.35 g氢氧化钠溶于10 ~ 15 mL的超纯水中，在室温下搅拌均匀，作为溶液B；将溶液A与溶液B混合，室温下搅拌18 ~ 24 h后，将混合溶液转入高压反应釜中，于150 ~ 200 °C下进行水热反应10~ 16 h，反应结束后，自然冷却，产物用超纯水洗涤5次，在30 ~ 60 °C下干燥10 ~14 h，制得花状四氧化三锡材料；
（2）富勒烯量子点的制备
取1 ~ 5 mg的富勒烯粉末溶解于1 ~ 5 mL的无水甲苯溶剂中，室温下搅拌均匀得到紫红色溶液，之后向该溶液中加入1 ~ 5 mL的超纯水，进行超声处理16 ~ 24 h，直至将甲苯全部去除，之后将所得到的淡黄色富勒烯量子点溶液储存于4 °C冰箱中备用；
（3）硒化镉纳米颗粒的制备
取0.02 ~ 0.04 g硒粉与0.02 ~ 0.04 g硼氢化钠共同溶解于1 ~ 5 mL的超纯水中，在室温下剧烈搅拌直至溶液变澄清，此溶液作为溶液A；取0.02 ~ 0.04 g二水合氯化镉溶解于50 ~ 100 mL超纯水中，在搅拌下加入100 ~ 300 µL巯基乙酸溶液，之后该溶液用0.5 ~ 1 M的氢氧化钠水溶液调节pH至9，此溶液作为溶液B；将溶液A倒入溶液B中，混合溶液下在室温下搅拌2 ~ 6 h后，所得产品用超纯水洗涤5次，在30 ~ 60 °C下干燥10 ~14 h，制得羧基功能化的硒化镉纳米颗粒；
（4）二硫化铁纳米颗粒的制备
取0.5 ~ 0.8 g的二水合柠檬酸三钠与0.1 ~ 0.5 g的聚乙烯吡咯烷酮K-30在搅拌下共同溶解于50 ~ 100 mL超纯水中，之后向该溶液中加入1.0 ~ 1.5 g七水合硫酸亚铁，继续搅拌30 min后，向混合溶液中逐滴加入10 ~ 20 mL浓度为1.0 ~ 2.0 M的氢氧化钠水溶液，随后向该溶液中加入0.2 ~ 0.5 g硫粉，持续剧烈搅拌，以获得均匀的混合溶液，最后将此混合溶液转入高压反应釜中，于150 ~ 200 °C下反应16 ~ 24 h，反应结束后，产品用超纯水和无水乙醇各洗涤3次，在30 ~ 60 °C下干燥10 ~14 h，制得二硫化铁纳米颗粒；
（5）PBS缓冲溶液的配置
取11.94 g十二水合磷酸氢二钠定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15mol/L的水溶液，作为甲液；取4.54 g磷酸二氢钾定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15 mol/L的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成一系列pH在5.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液；
（6）二硫化铁标记的降钙素原第二抗体的制备
取1.0 ~ 5.0 mg所制备的二硫化铁纳米颗粒溶液于1.0 mL pH为7.4的PBS缓冲溶液中，之后加入10 ~ 30 µL交联剂，所述交联剂为由5 mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐和1 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺组成的混合溶液，在37 °C下活化10 ~30 min，之后向该溶液中加入100 ~ 500 μL浓度为1 μg/mL降钙素原第二抗体，于37 °C下活化5 ~ 10 h后，用PBS缓冲溶液离心洗涤，所得产品分散在1 mL的PBS缓冲溶液中，于4 °C冰箱中储存备用；
（7）光电化学传感器的制备
1）将导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，氮气氛围下烘干；
2）取10 µL、1 ~ 5 mg/mL的四氧化三锡水溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面，室温下自然晾干；
3）在修饰的电极表面滴加10 µL所制备的富勒烯量子点溶液，室温下自然晾干；
4）在修饰的电极表面继续滴加10 µL、1 ~ 5 mg/mL的硒化镉水溶液，室温下自然晾干；
5）在修饰电极表面滴加体积比为1:1的5 ~ 10 mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐和1 ~ 5 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺的混合液4 μL，室温下自然晾至湿润薄膜状态；
6）滴加6 µL、1 ~ 5 μg/mL的降钙素原第一抗体，室温下自然晾至湿润薄膜状态，后用PBS缓冲溶液冲洗电极；
7）滴加3 µL、用pH为7.4的PBS缓冲溶液配置的质量分数为1% ~ 3%的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面，4 ℃冰箱中晾干，之后用PBS缓冲溶液冲洗电极；
8）滴加6 µL、1 ~ 5 μg/mL的降钙素原抗原，4 ℃冰箱中自然晾干，后用PBS缓冲溶液冲洗电极；
9）滴加6 µL所制备的带有二硫化铁标记的降钙素原第二抗体，4 ℃冰箱中自然晾干，后用PBS缓冲溶液冲洗电极；制得一种检测降钙素原的夹心型光电化学传感器。
2. 如权利要求1所述制备方法制备得到的光电化学传感器的检测方法，其特征在于，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，制备的ITO修饰的传感器为工作电极，在10 mL、pH 5.0 ~ 8.0的PBS，0.01 ~0.5 mol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对降钙素原抗原进行检测，设置电压为-0.1 ~ 0.1 V，运行时间120 s，光源波长为400 ~ 450 nm；
（3）电极放置好之后，每隔20 s开灯持续照射20 s，记录光电流，绘制工作曲线；
（4）将待测的降钙素原抗原样品溶液代替降钙素原抗原标准溶液进行检测。
本传感器对降钙素原的检测线性范围为0.01 pg/mL ~ 10 ng/mL，检测限达3.5fg/mL。
材料合成所需要的化学试剂均为当地试剂店购得，没有经过再处理。
本发明的有益成果
（1）本发明成功制备了含有多价态金属的四氧化三锡花状材料，材料本身含有多种价态的金属元素，受可见光激发，光生电子形成之后更利于传递，具有可见光稳定性和敏感性。
（2）利用具有优异导电性能的富勒烯量子点敏化四氧化三锡材料，花状的氧化锡具有大的比表面积，能够负载大量的富勒烯，并且富勒烯拥有极好的电子传递作用，能够高效促进电子传递，提高光电流。
（3）利用羧基功能化的硒化镉进一步敏化基底材料克服富勒烯不易官能化的缺点，以实现与生物分子的连接，同时硒化镉作为一种优秀的敏化剂，进一步提高了光电流，提高了传感器的稳定性。
（4）利用可以吸收可见光能量的二硫化铁作为标记物，标记降钙素原第二抗体，经过二硫化铁的标记，传感器在生物分子层层修饰时，电流的改变值增大，使得在检测物浓度改变时，光电流的变化值变大，提高了传感器检测的灵敏度。
（5）本发明制备的夹心型光电化学传感器，用于降钙素原的检测，响应时间短，线性范围宽，检测限低，稳定性和重现性好，可实现简单、快捷、高灵敏和特异性的检测。本发明对降钙素原的检测线性范围为0.01 pg/mL - 10 ng/mL，检测限达3.5 fg/mL。
具体实施方案
实施例1 光电化学传感器的制备
（1）花状四氧化三锡材料的制备
取1.0 g二水合氯化亚锡和3.0 g二水合柠檬酸三钠共同溶解于10 mL的超纯水中，此溶液在室温下搅拌混合均匀后，作为溶液A；取0.25 g氢氧化钠溶于10 mL的超纯水中，在室温下搅拌均匀，作为溶液B；将溶液A与溶液B混合，室温下搅拌18 h后，将混合溶液转入高压反应釜中，于150 °C下进行水热反应10 h，反应结束后，自然冷却，产物用超纯水洗涤5次，在30 °C下干燥10 h，制得花状四氧化三锡材料；
（2）富勒烯量子点的制备
取1 mg的富勒烯粉末溶解于1 mL的无水甲苯溶剂中，室温下搅拌均匀得到紫红色溶液，之后向该溶液中加入1 mL的超纯水，进行超声处理16 h，直至将甲苯全部去除，之后将所得到的淡黄色富勒烯量子点溶液储存于4 °C冰箱中备用；
（3）硒化镉纳米颗粒的制备
取0.02 g硒粉与0.02 g硼氢化钠共同溶解于1 mL的超纯水中，在室温下剧烈搅拌直至溶液变澄清，此溶液作为溶液A；取0.02 g二水合氯化镉溶解于50 mL超纯水中，在搅拌下加入100 µL巯基乙酸溶液，之后该溶液用0.5 M的氢氧化钠水溶液调节pH至9，此溶液作为溶液B；将溶液A倒入溶液B中，混合溶液下在室温下搅拌2 h后，所得产品用超纯水洗涤5次，在30 °C下干燥10 h，制得羧基功能化的硒化镉纳米颗粒；
（4）二硫化铁纳米颗粒的制备
取0.5 g的二水合柠檬酸三钠与0.1 g的聚乙烯吡咯烷酮K-30在搅拌下共同溶解于50 mL超纯水中，之后向该溶液中加入1.0 g七水合硫酸亚铁，继续搅拌30 min后，向混合溶液中逐滴加入10 mL浓度为1.0 M的氢氧化钠水溶液，随后向该溶液中加入0.2 g硫粉，持续剧烈搅拌，以获得均匀的混合溶液，最后将此混合溶液转入高压反应釜中，于150 °C下反应16 h，反应结束后，产品用超纯水和无水乙醇各洗涤3次，在30 °C下干燥10 h，制得二硫化铁纳米颗粒；
（5）PBS缓冲溶液的配置
取11.94 g十二水合磷酸氢二钠定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15mol/L的水溶液，作为甲液；取4.54 g磷酸二氢钾定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15 mol/L的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成一系列pH在5.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液；
（6）二硫化铁标记的降钙素原第二抗体的制备
取1.0 mg所制备的二硫化铁纳米颗粒溶液于1.0 mL pH为7.4的PBS缓冲溶液中，之后加入10 µL交联剂，所述交联剂为由5 mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐和1 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺组成的混合溶液，在37 °C下活化10 min，之后向该溶液中加入100 μL浓度为1 μg/mL降钙素原第二抗体，于37 °C下活化5 h后，用PBS缓冲溶液离心洗涤，所得产品分散在1 mL的PBS缓冲溶液中，于4 °C冰箱中储存备用；
（7）光电化学传感器的制备
1）将导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，氮气氛围下烘干；
2）取10 µL、1 mg/mL的四氧化三锡水溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面，室温下自然晾干；
3）在修饰的电极表面滴加10 µL所制备的富勒烯量子点溶液，室温下自然晾干；
4）在修饰的电极表面继续滴加10 µL、1 mg/mL的硒化镉水溶液，室温下自然晾干；
5）在修饰电极表面滴加体积比为1:1的5 mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐和1 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺的混合液4 μL，室温下自然晾至湿润薄膜状态；
6）滴加6 µL、1 μg/mL的降钙素原第一抗体，室温下自然晾至湿润薄膜状态，后用PBS缓冲溶液冲洗电极；
7）滴加3 µL、用pH为7.4的PBS缓冲溶液配置的质量分数为1 %的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面，4 ℃冰箱中晾干，之后用PBS缓冲溶液冲洗电极；
8）滴加6 µL、1 μg/mL的降钙素原抗原，4 ℃冰箱中自然晾干，后用PBS缓冲溶液冲洗电极；
9）滴加6 µL所制备的带有二硫化铁标记的降钙素原第二抗体，4 ℃冰箱中自然晾干，后用PBS缓冲溶液冲洗电极；制得一种检测降钙素原的夹心型光电化学传感器。
实施例2 光电化学传感器额制备
（1）花状四氧化三锡材料的制备
取1.3 g二水合氯化亚锡和3.2 g二水合柠檬酸三钠共同溶解于14 mL的超纯水中，此溶液在室温下搅拌混合均匀后，作为溶液A；取0.28 g氢氧化钠溶于14 mL的超纯水中，在室温下搅拌均匀，作为溶液B；将溶液A与溶液B混合，室温下搅拌20 h后，将混合溶液转入高压反应釜中，于160 °C下进行水热反应12 h，反应结束后，自然冷却，产物用超纯水洗涤5次，在40 °C下干燥12 h，制得花状四氧化三锡材料；
（2）富勒烯量子点的制备
取3 mg的富勒烯粉末溶解于3 mL的无水甲苯溶剂中，室温下搅拌均匀得到紫红色溶液，之后向该溶液中加入3 mL的超纯水，进行超声处理16 h，直至将甲苯全部去除，之后将所得到的淡黄色富勒烯量子点溶液储存于4 °C冰箱中备用；
（3）硒化镉纳米颗粒的制备
取0.03 g硒粉与0.03 g硼氢化钠共同溶解于3 mL的超纯水中，在室温下剧烈搅拌直至溶液变澄清，此溶液作为溶液A；取0.03 g二水合氯化镉溶解于80 mL超纯水中，在搅拌下加入200 µL巯基乙酸溶液，之后该溶液用0.5 M的氢氧化钠水溶液调节pH至9，此溶液作为溶液B；将溶液A倒入溶液B中，混合溶液下在室温下搅拌3 h后，所得产品用超纯水洗涤5次，在40 °C下干燥12 h，制得羧基功能化的硒化镉纳米颗粒；
（4）二硫化铁纳米颗粒的制备
取0.6 g的二水合柠檬酸三钠与0.3 g的聚乙烯吡咯烷酮K-30在搅拌下共同溶解于80 mL超纯水中，之后向该溶液中加入1.3 g七水合硫酸亚铁，继续搅拌30 min后，向混合溶液中逐滴加入15 mL浓度为1.5 M的氢氧化钠水溶液，随后向该溶液中加入0.4 g硫粉，持续剧烈搅拌，以获得均匀的混合溶液，最后将此混合溶液转入高压反应釜中，于180 °C下反应18 h，反应结束后，产品用超纯水和无水乙醇各洗涤3次，在60 °C下干燥14 h，制得二硫化铁纳米颗粒；
（5）PBS缓冲溶液的配置
取11.94 g十二水合磷酸氢二钠定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15mol/L的水溶液，作为甲液；取4.54 g磷酸二氢钾定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15 mol/L的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成一系列pH在5.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液；
（6）二硫化铁标记的降钙素原第二抗体的制备
取3.0 mg所制备的二硫化铁纳米颗粒溶液于1.0 mL pH为7.4的PBS缓冲溶液中，之后加入20 µL交联剂，所述交联剂为由5 mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐和1 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺组成的混合溶液，在37 °C下活化20 min，之后向该溶液中加入300 μL浓度为1 μg/mL降钙素原第二抗体，于37 °C下活化10 h后，用PBS缓冲溶液离心洗涤，所得产品分散在1 mL的PBS缓冲溶液中，于4 °C冰箱中储存备用；
（7）光电化学传感器的制备
1）将导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，氮气氛围下烘干；
2）取10 µL、4 mg/mL的四氧化三锡水溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面，室温下自然晾干；
3）在修饰的电极表面滴加10 µL所制备的富勒烯量子点溶液，室温下自然晾干；
4）在修饰的电极表面继续滴加10 µL、4 mg/mL的硒化镉水溶液，室温下自然晾干；
5）在修饰电极表面滴加体积比为1:1的8 mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐和3 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺的混合液4 μL，室温下自然晾至湿润薄膜状态；
6）滴加6 µL、5 μg/mL的降钙素原第一抗体，室温下自然晾至湿润薄膜状态，后用PBS缓冲溶液冲洗电极；
7）滴加3 µL、用pH为7.4的PBS缓冲溶液配置的质量分数为2 %的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面，4 ℃冰箱中晾干，之后用PBS缓冲溶液冲洗电极；
8）滴加6 µL、4 μg/mL的降钙素原抗原，4 ℃冰箱中自然晾干，后用PBS缓冲溶液冲洗电极；
9）滴加6 µL所制备的带有二硫化铁标记的降钙素原第二抗体，4 ℃冰箱中自然晾干，后用PBS缓冲溶液冲洗电极；制得一种检测降钙素原的夹心型光电化学传感器。
实施例3 光电化学传感器的制备
（1）花状四氧化三锡材料的制备
取1.5 g二水合氯化亚锡和3.5 g二水合柠檬酸三钠共同溶解于15 mL的超纯水中，此溶液在室温下搅拌混合均匀后，作为溶液A；取0.35 g氢氧化钠溶于15 mL的超纯水中，在室温下搅拌均匀，作为溶液B；将溶液A与溶液B混合，室温下搅拌24 h后，将混合溶液转入高压反应釜中，于200 °C下进行水热反应16 h，反应结束后，自然冷却，产物用超纯水洗涤5次，在60 °C下干燥14 h，制得花状四氧化三锡材料；
（2）富勒烯量子点的制备
取5 mg的富勒烯粉末溶解于5 mL的无水甲苯溶剂中，室温下搅拌均匀得到紫红色溶液，之后向该溶液中加入5 mL的超纯水，进行超声处理24 h，直至将甲苯全部去除，之后将所得到的淡黄色富勒烯量子点溶液储存于4 °C冰箱中备用；
（3）硒化镉纳米颗粒的制备
取0.04 g硒粉与0.04 g硼氢化钠共同溶解于5 mL的超纯水中，在室温下剧烈搅拌直至溶液变澄清，此溶液作为溶液A；取0.04 g二水合氯化镉溶解于100 mL超纯水中，在搅拌下加入300 µL巯基乙酸溶液，之后该溶液用1 M的氢氧化钠水溶液调节pH至9，此溶液作为溶液B；将溶液A倒入溶液B中，混合溶液下在室温下搅拌6 h后，所得产品用超纯水洗涤5次，在60 °C下干燥14 h，制得羧基功能化的硒化镉纳米颗粒；
（4）二硫化铁纳米颗粒的制备
取0.8 g的二水合柠檬酸三钠与0.5 g的聚乙烯吡咯烷酮K-30在搅拌下共同溶解于100 mL超纯水中，之后向该溶液中加入1.5 g七水合硫酸亚铁，继续搅拌30 min后，向混合溶液中逐滴加入20 mL浓度为2.0 M的氢氧化钠水溶液，随后向该溶液中加入0.5 g硫粉，持续剧烈搅拌，以获得均匀的混合溶液，最后将此混合溶液转入高压反应釜中，于200 °C下反应24 h，反应结束后，产品用超纯水和无水乙醇各洗涤3次，在60 °C下干燥14 h，制得二硫化铁纳米颗粒；
（5）PBS缓冲溶液的配置
取11.94 g十二水合磷酸氢二钠定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15mol/L的水溶液，作为甲液；取4.54 g磷酸二氢钾定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15 mol/L的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成一系列pH在5.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液；
（6）二硫化铁标记的降钙素原第二抗体的制备
取5.0 mg所制备的二硫化铁纳米颗粒溶液于1.0 mL pH为7.4的PBS缓冲溶液中，之后加入30 µL交联剂，所述交联剂为由5 mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐和1 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺组成的混合溶液，在37 °C下活化30 min，之后向该溶液中加入500 μL浓度为1 μg/mL降钙素原第二抗体，于37 °C下活化10 h后，用PBS缓冲溶液离心洗涤，所得产品分散在1 mL的PBS缓冲溶液中，于4 °C冰箱中储存备用；
（7）光电化学传感器的制备
1）将导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，氮气氛围下烘干；
2）取10 µL、5 mg/mL的四氧化三锡水溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面，室温下自然晾干；
3）在修饰的电极表面滴加10 µL所制备的富勒烯量子点溶液，室温下自然晾干；
4）在修饰的电极表面继续滴加10 µL、5 mg/mL的硒化镉水溶液，室温下自然晾干；
5）在修饰电极表面滴加体积比为1:1的10 mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐和5 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺的混合液4 μL，室温下自然晾至湿润薄膜状态；
6）滴加6 µL、5 μg/mL的降钙素原第一抗体，室温下自然晾至湿润薄膜状态，后用PBS缓冲溶液冲洗电极；
7）滴加3 µL、用pH为7.4的PBS缓冲溶液配置的质量分数为3%的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面，4 ℃冰箱中晾干，之后用PBS缓冲溶液冲洗电极；
8）滴加6 µL、5 μg/mL的降钙素原抗原，4 ℃冰箱中自然晾干，后用PBS缓冲溶液冲洗电极；
9）滴加6 µL所制备的带有二硫化铁标记的降钙素原第二抗体，4 ℃冰箱中自然晾干，后用PBS缓冲溶液冲洗电极；制得一种检测降钙素原的夹心型光电化学传感器。
实施例4 降钙素原的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，制备的ITO修饰的传感器为工作电极，在10 mL、pH 5.0的PBS，0.01 mol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对降钙素原抗原进行检测，设置电压为-0.1 V，运行时间120s，光源波长为400 nm；
（3）电极放置好之后，每隔20 s开灯持续照射20 s，记录光电流，绘制工作曲线；
（4）将待测的降钙素原抗原样品溶液代替降钙素原抗原标准溶液进行检测。
实施例5 降钙素原的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，制备的ITO修饰的传感器为工作电极，在10 mL、pH 7.0的PBS，0.1 mol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对降钙素原抗原进行检测，设置电压为0 V，运行时间120 s，光源波长为430 nm；
（3）电极放置好之后，每隔20 s开灯持续照射20 s，记录光电流，绘制工作曲线；
（4）将待测的降钙素原抗原样品溶液代替降钙素原抗原标准溶液进行检测。
实施例6 降钙素原的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，制备的ITO修饰的传感器为工作电极，在10 mL、pH 8.0的PBS，0.5 mol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对降钙素原抗原进行检测，设置电压为0.1 V，运行时间120 s，光源波长为450 nm；
（3）电极放置好之后，每隔20 s开灯持续照射20 s，记录光电流，绘制工作曲线；
（4）将待测的降钙素原抗原样品溶液代替降钙素原抗原标准溶液进行检测。
Claims (2)
1.基于一种富勒烯-四氧化三锡检测降钙素原的夹心型光电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）花状四氧化三锡材料的制备
取1.0 ~ 1.5 g二水合氯化亚锡和3.0 ~ 3.5 g二水合柠檬酸三钠共同溶解于10 ~ 15mL的超纯水中，此溶液在室温下搅拌混合均匀后，作为溶液A；取0.25 ~ 0.35 g氢氧化钠溶于10 ~ 15 mL的超纯水中，在室温下搅拌均匀，作为溶液B；将溶液A与溶液B混合，室温下搅拌18 ~ 24 h后，将混合溶液转入高压反应釜中，于150 ~ 200 °C下进行水热反应10 ~ 16h，反应结束后，自然冷却，产物用超纯水洗涤5次，在30 ~ 60 °C下干燥10 ~14 h，制得花状四氧化三锡材料；
（2）富勒烯量子点的制备
取1 ~ 5 mg的富勒烯粉末溶解于1 ~ 5 mL的无水甲苯溶剂中，室温下搅拌均匀得到紫红色溶液，之后向该溶液中加入1 ~ 5 mL的超纯水，进行超声处理16 ~ 24 h，直至将甲苯全部去除，之后将所得到的淡黄色富勒烯量子点溶液储存于4 °C冰箱中备用；
（3）硒化镉纳米颗粒的制备
取0.02 ~ 0.04 g硒粉与0.02 ~ 0.04 g硼氢化钠共同溶解于1 ~ 5 mL的超纯水中，在室温下剧烈搅拌直至溶液变澄清，此溶液作为溶液A；取0.02 ~ 0.04 g二水合氯化镉溶解于50 ~ 100 mL超纯水中，在搅拌下加入100 ~ 300 µL巯基乙酸溶液，之后该溶液用0.5 ~1 M的氢氧化钠水溶液调节pH至9，此溶液作为溶液B；将溶液A倒入溶液B中，混合溶液下在室温下搅拌2 ~ 6 h后，所得产品用超纯水洗涤5次，在30 ~ 60 °C下干燥10 ~14 h，制得羧基功能化的硒化镉纳米颗粒；
（4）二硫化铁纳米颗粒的制备
取0.5 ~ 0.8 g的二水合柠檬酸三钠与0.1 ~ 0.5 g的聚乙烯吡咯烷酮K-30在搅拌下共同溶解于50 ~ 100 mL超纯水中，之后向该溶液中加入1.0 ~ 1.5 g七水合硫酸亚铁，继续搅拌30 min后，向混合溶液中逐滴加入10 ~ 20 mL浓度为1.0 ~ 2.0 M的氢氧化钠水溶液，随后向该溶液中加入0.2 ~ 0.5 g硫粉，持续剧烈搅拌，以获得均匀的混合溶液，最后将此混合溶液转入高压反应釜中，于150 ~ 200 °C下反应16 ~ 24 h，反应结束后，产品用超纯水和无水乙醇各洗涤3次，在30 ~ 60 °C下干燥10 ~14 h，制得二硫化铁纳米颗粒；
（5）PBS缓冲溶液的配置
取11.94 g十二水合磷酸氢二钠定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15 mol/L的水溶液，作为甲液；取4.54 g磷酸二氢钾定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15 mol/L的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成一系列pH在5.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液；
（6）二硫化铁标记的降钙素原第二抗体的制备
取1.0 ~ 5.0 mg所制备的二硫化铁纳米颗粒溶液于1.0 mL pH为7.4的PBS缓冲溶液中，之后加入10 ~ 30 µL交联剂，所述交联剂为由5 mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基 )碳二亚胺盐酸盐和1 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺组成的混合溶液，在37 °C下活化10 ~ 30min，之后向该溶液中加入100 ~ 500 μL浓度为1 μg/mL降钙素原第二抗体，于37 °C下活化5 ~ 10 h后，用PBS缓冲溶液离心洗涤，所得产品分散在1 mL的PBS缓冲溶液中，于4 °C冰箱中储存备用；
（7）光电化学传感器的制备
1）将导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，氮气氛围下烘干；
2）取10 µL、1 ~ 5 mg/mL的四氧化三锡水溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面，室温下自然晾干；
3）在修饰的电极表面滴加10 µL所制备的富勒烯量子点溶液，室温下自然晾干；
4）在修饰的电极表面继续滴加10 µL、1 ~ 5 mg/mL的硒化镉水溶液，室温下自然晾干；
5）在修饰电极表面滴加体积比为1:1的5 ~ 10 mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基 )碳二亚胺盐酸盐和1 ~ 5 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺的混合液4 μL，室温下自然晾至湿润薄膜状态；
6）滴加6 µL、1 ~ 5 μg/mL的降钙素原第一抗体，室温下自然晾至湿润薄膜状态，后用PBS缓冲溶液冲洗电极；
7）滴加3 µL、用pH为7.4的PBS缓冲溶液配置的质量分数为1% ~ 3%的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面，4 ℃冰箱中晾干，之后用PBS缓冲溶液冲洗电极；
8）滴加6 µL、1 ~ 5 μg/mL的降钙素原抗原，4 ℃冰箱中自然晾干，后用PBS缓冲溶液冲洗电极；
9）滴加6 µL所制备的带有二硫化铁标记的降钙素原第二抗体，4 ℃冰箱中自然晾干，后用PBS缓冲溶液冲洗电极；制得一种检测降钙素原的夹心型光电化学传感器。
2.如权利要求1所述制备方法制备得到的光电化学传感器的检测方法，其特征在于，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，制备的ITO修饰的传感器为工作电极，在10 mL、pH 5.0 ~ 8.0的PBS，0.01 ~ 0.5mol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对降钙素原抗原进行检测，设置电压为-0.1 ~ 0.1 V，运行时间120s，光源波长为400 ~ 450 nm；
（3）电极放置好之后，每隔20 s开灯持续照射20 s，记录光电流，绘制工作曲线；
（4）将待测的降钙素原抗原样品溶液代替降钙素原抗原标准溶液进行检测。
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