CN111712568A - 从基于三酰基甘油的油酶促除去叶绿素底物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种处理包含叶绿素底物的油的方法，所述方法包括使所述油与具有脱色酶活性的多肽或包含该多肽的组合物接触，其中所述多肽选自：a.与SEQ ID NO:1的氨基酸1‑318具有至少80%同一性的多肽；和b.由与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少80%同一性的核酸序列编码的多肽。

Description

从基于三酰基甘油的油酶促除去叶绿素底物

领域

本发明涉及具有脱色酶(decolorase)活性的新型多肽和处理包含叶绿素底物的油的方法。

背景

从压榨或溶剂萃取方法获得的三酰基甘油原油是三酰基甘油、磷脂、甾醇、生育酚、二酰基甘油、游离脂肪酸、痕量金属、叶绿素、β-胡萝卜素和其它较少化合物的复杂混合物。需要除去磷脂、游离脂肪酸、痕量金属、叶绿素和β-胡萝卜素以产生具有温和味道、浅色和长的保存期的色拉油或优质的完全精制油。

除去磷脂产生最大量的与三酰基甘油油的精制相关的中性油损失。除去叶绿素产生第二大量的与基于三酰基甘油的油的精制相关的中性油损失。

数种不同的技术可用于磷脂除去，包括水脱胶、酶辅助水脱胶、酸脱胶、碱法精制和酶促处理。

水脱胶通常应用于含有大量的可水合磷脂的原油。由于其温和的特性，得到的磷脂可用作卵磷脂(天然乳化剂)。从该技术获得的油在工业中通常称为“脱胶的”，尽管仅仅是部分脱胶的。由于水脱胶油仍含有大量的磷脂，特别是不可水合的磷脂，可能需要使用其它方法技术，例如碱法精制或磷脂酶A (PLA)酶脱胶，以产生具有高稳定性和低颜色的高品质的成品油。

在水脱胶方法中，将水加入原油，同时混合以帮助所述油中存在的磷脂的水合。磷脂或“胶”的水合引起胶溶胀和附聚为絮凝物，其随后从油的剩余部分分离。从水脱胶方法的油损失可能是显著的，对精制油过程成本的总体经济平衡具有负面影响。

酶辅助水脱胶通常应用于含有大量的可水合磷脂的原油，其中目的是使所有的可水合磷脂反应并将它们转化为二酰基甘油，增加油产量，同时维持所述油中的不可水合的磷脂。用于该方法的酶是磷脂酶C (PLC)和磷脂酰肌醇磷脂酶(PI-PLC)。

在酶辅助水脱胶方法中，将水和PLC加入原油，同时混合。然后允许酶与油中的磷脂反应，同时剪切混合以帮助油中的磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和PI转化为二酰基甘油。重相(水、变性蛋白和磷-化合物)具有高于油的比重，并且可通过沉降、过滤或工业实施离心来分离。酶辅助水脱胶方法主要仅除去可水合磷脂。剩余的磷脂，作为磷脂酸的盐测量，可在随后的处理操作中除去。

当目的是全部除去磷脂时酸脱胶通常应用于原油。获得的油在工业中通常称为“超级-脱胶的”或“全部脱胶的”。原油用磷酸或柠檬酸处理。酸改进不可水合的磷脂(NHP)的亲水性质，从而帮助其除去。然后将水加入酸处理的原油，并将油混合以帮助磷脂的水合。磷脂或“胶”的水合引起胶溶胀和附聚为絮凝物，其随后被除去。酸脱胶方法除去大部分磷脂，但足够的磷脂仍保留在脱胶油中以需要另外的处理。如在水脱胶方法中，一些油被乳化，并且被认为是一种过程损失，对精制油过程成本的总体经济平衡具有负面经济影响。

当目的是除去所有的磷脂和游离脂肪酸时碱法精制通常应用于原油或水脱胶油。原油或水脱胶油用磷酸或柠檬酸处理。酸改进NHP的亲水性质，从而帮助其除去。将稀氢氧化钠溶液加入酸处理的油。碱溶液中和游离脂肪酸(产生钠皂)，中和过量的酸，并且用产生的钠皂帮助水合和乳化所有剩余磷脂。混合氢氧化钠溶液/油，然后通过沉降、过滤或工业离心来分离。然后将碱处理的油“洗涤”和再次离心。来自离心机的油被称为“一次精制的”，和水通常称为“洗涤水”。对于食品应用，“一次精制”油通常进行漂白和除臭以产生色拉油。水洗涤的替换方案是用吸附性硅胶处理碱处理的油，和滤出在初始离心中未除去的剩余的皂和磷脂。

当目的是全部除去磷脂时使用“酶促精制”或“酶促脱胶”。通常，现有技术的酶促脱胶处理已对之前已通过一种其它方法(通常是水脱胶)脱胶的油实施。对于食品应用，酶脱胶油序贯地进行漂白和除臭，一种在工业中称为“物理精制”的方法。酶促脱胶提供了比水、酸或碱脱胶更好的油产量，具有改进的经济结果。

酶促反应改变了磷脂的性质，裂解一些磷脂部分。这减少磷脂的乳化性质，使得当胶从油分离时损失较少的油，从而节省油。显示对磷脂的活性的酶通常称为“磷脂酶”。磷脂酶的类型基于磷脂分子上酶反应的位置，并且称为PLA1、PLA2、PLC和PLD。不同类型的磷脂酶在与磷脂反应时产生不同的化合物。

具有磷脂酶活性的商品化的PLA1酶是Lecitase® Ultra和QuaraLowP。具有磷脂酶活性的商品化的PLA2酶是Rohalase Xtra和LysoMax。已知这些产品当用1-1.5%水柠檬酸-NaOH缓冲液在4.5<pH<7.0和40℃<T<55℃下与脱胶油混合时，产生极性溶血磷脂和极性脂肪酸。PLA1选择性地水解甘油骨架上在磷酸酯官能团对面的脂肪酸，和PLA2选择性地水解磷脂的甘油骨架的中央的脂肪酸。PLA对它们所反应的磷脂没有选择性。

得到的反应产生溶血磷脂和脂肪酸。溶血磷脂分子已损失了一个亲水官能团，并且在反应位点的剩余醇基团是亲水的。现在具有两个亲水位点，溶血磷脂分子是水溶性的，并且已损失了其乳化性质。因此，PLA1或PLA2脱胶方法通过不再除去含胶的任何中性油，减少精制损失，并且唯一的损失是初始的磷脂分子。

本领域中已知PLC酶通过选择性地水解磷酸酯官能团与磷脂反应。得到的反应产生二酰基甘油(“DAG”)和磷脂基团。二酰基甘油分子不再具有磷酸酯官能团，和不需要被除去。PLC脱胶方法通过保留初始磷脂分子，同时仅除去磷酸酯官能团，减少精制损失。然而，PLC不与油中存在的所有磷脂反应。通常，PLC不与磷脂酸(PA)或磷脂酰肌醇(PI)反应。与PLC组合使用的PI-PLC能够反应和除去PC、PE和PI。然而，不可水合的磷脂在水脱胶后保留在油中。因此，酶促辅助水脱胶处理的油必须用碱进一步处理以除去残留胶。

来自油籽例如大豆和低芥酸菜籽(canola)以及油果实例如棕榈和藻类来源油的三酰基甘油油含有叶绿素。叶绿素在油生产过程的许多阶段中被除去，所述阶段包括种子压碎、油萃取、脱胶、碱处理和漂白步骤。在这些的最后一步中，漂白过程残留叶绿素被除去以达到可接受的水平。该叶绿素通常在漂白过程步骤中从油中除去，所述步骤包括加热油和使其通过吸附剂以除去叶绿素和影响成品油的外观和/或稳定性的其它带色化合物。

高水平的叶绿素色素产生不需要的颜色，并在储存期间引起油的氧化，导致油变质。在食用油处理工业中，漂白步骤用于降低叶绿素水平至低至0.02 ppm以在颜色和器官感觉性方面保证油品质。该漂白步骤增加处理成本和由于漂白粘土中的夹带导致减少油产量。“用过的”粘土然后必须经环境处理，并且由于自燃性质酸处理材料和吸附的油(大约30% wt)导致是一种运输危险材料。

叶绿素在油处理期间通过从卟啉(氯)环丢失镁离子，被修饰为称为脱镁叶绿素的衍生物(参见图1)。通常，脱镁叶绿素在处理期间在油中比叶绿素更丰富。脱镁叶绿素可进一步降解为焦脱镁叶绿素(pyropheophytin)(参见Behavior of ChlorophyllDerivatives in Canola Oil Processing”, JAOCS, Vol. no. 9 1993年9月, p. 837-841)。焦脱镁叶绿素主要在处理植物油中形成(参见例如‘The lipid handbook’ ed.Frank D. Gunstone, John L. Harwood, Albert J. Dijkstra. 2007--第3版, p. 56)。叶绿素、脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素以两种形式存在：A和B形式。A组分在C7位置具有甲基。B组分在C7位置具有醛。

使用酶来除去植物油中的焦脱镁叶绿素从WO2010/143149和WO2013/160372已知。WO2010/143149公开了使用例如衍生自小麦(Triticum aestivum)和莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的能够水解焦脱镁叶绿素的酶处理含有焦脱镁叶绿素的组合物的方法。WO2013/160372公开了例如来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)和小麦的几种叶绿素酶，其能够转化油中的脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素。

需要可供选择的能够水解叶绿素底物例如焦脱镁叶绿素的酶和酶促水解叶绿素底物例如焦脱镁叶绿素的方法。

简述

本发明涉及具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽，其选自：

a. 分离的多肽，其与SEQ ID NO: 1的氨基酸1-318具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%或100%同一性；和

b. 由与SEQ ID NO: 2的核酸序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%或100%同一性的核酸序列编码的多肽。

本发明进一步涉及核酸，其选自：

a. 编码本文公开的多肽的核酸序列；

b. 与SEQ ID NO: 2具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%或100%同一性的核酸；和

c. 根据a)或b)的核酸，其进一步包含启动子序列和/或其它控制序列。

本公开内容还涉及包含编码本文公开的多肽的核酸的载体，其中所述核酸与在宿主细胞中指导所述多肽表达的一个或多个控制序列可操作连接。

还公开了包含编码本文公开的多肽的核酸或本文公开的载体的重组宿主细胞，其中所述核酸对所述宿主细胞是异源的。

在一个方面，本公开内容涉及用于产生本文公开的多肽的方法，其包括在允许表达所述多肽的条件下在合适的发酵培养基中培养包含编码本文公开的多肽的核酸的宿主细胞，和产生所述多肽。

在一个方面，本公开内容涉及用于处理包含叶绿素底物的油的方法，所述方法包括使油与具有脱色酶活性的多肽或包含该多肽的组合物接触，其中所述多肽选自：a. 与SEQ ID NO: 1的氨基酸1-318具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%或100%同一性的多肽；和

b. 由与SEQ ID NO: 2的核酸序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%或100%同一性的核酸序列编码的多肽。

在一个实施方案中，叶绿素底物被转化为叶绿素产物。叶绿素底物可选自叶绿素、脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿素和其组合，以及叶绿素产物可选自叶绿素酸酯、脱镁叶绿甲酯酸、焦脱镁叶绿甲酯酸(pyropheophorbide)和其组合。

在一个方面，本公开内容涉及用于处理包含焦脱镁叶绿素的油的方法，所述方法包括使油与本文公开的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽或包含本文公开的多肽的组合物接触，其中焦脱镁叶绿素被转化为焦脱镁叶绿甲酯酸。

在另一方面，本公开内容涉及用于处理包含叶绿素底物的油的方法，所述方法包括使油与具有脱色酶活性的多肽或包含该多肽的组合物接触，其中与处理之前所述油中的叶绿素底物的总浓度相比，所述处理减少所述油中的叶绿素底物的总浓度至少5重量%。

在另一方面，本公开内容涉及用于处理包含叶绿素底物的油的方法，所述方法包括使油与具有脱色酶活性的多肽或包含该多肽的组合物、水和任选地另外的酶在4-8的pH下接触；搅拌得到的油0.5-24小时；和搅拌后将PLA酶加入油。在一个实施方案中，PLA酶是PLA1酶。

在另一方面，本公开内容涉及通过本文公开的方法产生的油。

定义

术语“控制序列”可与术语“表达调节核酸序列”互换使用。本文使用的该术语是指在特定宿主生物中或在体外表达可操作连接的编码序列所必需的和/或影响在特定宿主生物中或在体外可操作连接的编码序列的表达的核酸序列。当两个核酸序列可操作连接时，它们通常将处于相同的取向，以及处于相同的阅读框中。它们通常将是基本上邻接的，尽管这可能不是必需的。表达调节核酸序列，特别例如合适的转录起始、终止、启动子、前导、信号肽、前肽、前肽原或增强子序列；Shine-Dalgarno序列、阻抑物或激活物序列；有效的RNA加工信号，例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如，核糖体结合位点)；增强蛋白稳定性的序列；和当需要时，增强蛋白分泌的序列，可以是在选择的宿主生物中显示活性的任何核酸序列，并且可衍生自编码对宿主细胞是同源或异源的蛋白的基因。各控制序列对编码多肽的核酸序列可以是天然的或外源的(异源的)。当需要时，为引入特定限制性位点的目的，控制序列可提供有接头，所述限制性位点促进控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区的连接。控制序列可对于它们的特定目的进行优化。

本文使用的叶绿素衍生物包括叶绿素底物和叶绿素产物。叶绿素底物包含叶绿素、脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素。叶绿素产物包含叶绿素酸酯、脱镁叶绿甲酯酸和焦脱镁叶绿甲酯酸。叶绿素衍生物包含所谓的a和b化合物。

本文使用的术语“脱色酶”(以及其变体，包括短语“具有脱色酶活性的多肽”)是指多肽能够将一种或多种叶绿素底物转化为叶绿素产物。例如，多肽可能够水解叶绿素为叶绿素酸酯；水解脱镁叶绿素为脱镁叶绿甲酯酸；和/或水解焦脱镁叶绿素为焦脱镁叶绿甲酯酸。术语“脱色酶活性”因此可包括叶绿素酶活性、脱镁叶绿素酶活性、焦脱镁叶绿素酶活性或其组合。

术语“基于三酰基甘油的油”是指包含三酰基甘油的油。

术语"表达”包括参与多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体包含编码多肽的多核苷酸，其可操作连接至合适的控制序列(例如启动子、RBS/Shine Delgado以及转录和翻译终止信号)，用于在体外或在宿主细胞中多核苷酸的转录和/或翻译。

表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其可便利地进行重组DNA程序并可导致多核苷酸的表达。载体的选择通常取决于载体与将引入载体的细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在并且其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。或者，载体可以是当引入宿主细胞时整合至基因组中并且与其已整合至其中的染色体一起复制的载体。整合型克隆载体可随机或在预定的靶基因座处整合到宿主细胞的染色体中。载体系统可以是单一载体或质粒，或者两种或更多种载体或质粒，它们一起含有待引入宿主细胞的基因组的全部DNA；或者转座子。

本文定义的宿主细胞是适合基因操作的生物，和可在用于工业产生目标产物例如根据本发明的多肽的细胞密度下培养的细胞。宿主细胞可以是天然存在的宿主细胞，或在基因操作或经典诱变后衍生自亲本宿主细胞的宿主细胞。有利地，宿主细胞是重组宿主细胞。

宿主细胞可以是原核、古细菌或真核宿主细胞。原核宿主细胞可以是但不限于细菌宿主细胞。真核宿主细胞可以是但不限于酵母、真菌、变形虫、藻类、植物、动物或昆虫宿主细胞。

本文使用的术语"异源的"是指不天然存在于宿主细胞中的核酸或氨基酸序列。换句话说，核酸或氨基酸序列与天然存在于宿主细胞中的序列不相同。

核酸或多核苷酸序列在本文中定义为包含至少5个核苷酸或核酸单元的核苷酸聚合物。核苷酸或核酸是指RNA和DNA。术语“核酸”和“多核苷酸序列”在本文可互换使用。

“肽”是指通过肽(酰胺)键连接的氨基酸残基的短链。最短的肽二肽由通过单一肽键连接的2个氨基酸组成。

术语"多肽"是指包含通过肽键连接的氨基酸残基和含有超过5个氨基酸残基的分子。本文使用的术语"蛋白"与术语"多肽"同义，并且也可指两种或更多种多肽。因此，术语"蛋白"和"多肽"可互换使用。多肽可任选地被修饰(例如，糖基化、磷酸化、乙酰化、法尼基化、异戊二烯化、磺化等)以添加官能度。在某些条件下在特定底物的存在下显示活性的多肽可称为酶。将理解，由于遗传密码的简并性，可产生大量编码给定多肽的核苷酸序列。

“分离的核酸片段”是不作为片段天然存在并且不会以天然状态发现的核酸片段。

本文使用的术语"分离的多肽"是指从与其天然关联的至少一种组分，例如其它多肽材料移出的多肽。分离的多肽可不含任何其它杂质。分离的多肽可以是至少50%纯的，例如至少60%纯的、至少70%纯的、至少75%纯的、至少80%纯的、至少85%纯的、至少80%纯的、至少90%纯的或至少95%纯的、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%，如通过SDS-PAGE或适合该目的并且本领域技术人员已知的任何其它分析方法测定的。分离的多肽可通过重组宿主细胞产生。

术语"启动子"在本文定义为结合RNA聚合酶并指导聚合酶至核酸序列的正确下游转录起始位点以起始转录的DNA序列。相对于编码多肽的核酸序列，启动子序列可以是天然的或异源的。

当关于细胞、核酸、蛋白或载体使用时术语"重组"是指细胞、核酸、蛋白或载体已通过引入异源核酸或蛋白或改变天然核酸或蛋白而被修饰，或细胞衍生自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内不存在的基因，或表达否则异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。术语“重组”与“遗传修饰”和“转基因”同义。

术语“序列同一性”和“序列同源性”在本文可互换使用。为本发明的目的，本文规定为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的序列同源性或序列同一性的百分比，为最佳比较目的将序列比对。为了优化两个序列之间的比对，可在比较的两个序列的任何一个中引入空位。这样的比对可在比较的序列的整个长度上进行。或者，比对可在较短的长度上，例如在约20、约50、约100或更多个核酸/碱基或氨基酸上进行。序列同一性是在报告的比对区域上在两个序列之间相同匹配的百分比。在两个氨基酸序列之间或在两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比可使用用于比对两个序列的Needleman和Wunsch算法确定。(Needleman, S. B.和Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453)。氨基酸序列和核苷酸序列二者均可通过该算法比对。Needleman-Wunsch算法已经在计算机程序NEEDLE上执行。为本发明的目的，使用来自EMBOSS包的NEEDLE程序(版本2.8.0或更高，EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice,P. Longden,I.和Bleasby,A. Trends in Genetics 16, (6) pp276—277, http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白序列，EBLOSUM62用于取代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。使用的任选参数是10的空位开放罚分和0.5的空位扩展罚分。技术人员将认识到，所有这些不同的参数将产生略微不同的结果，但当使用不同的算法时，两个序列的总体百分比同一性不显著改变。

通过上述程序NEEDLE比对后，如下计算询问序列和本发明的序列之间的序列同一性的百分比：在比对中显示两个序列中相同氨基酸或相同核苷酸的相应位置数除以减去比对中的空位总数后的比对总长度。本文定义的同一性可通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并且在程序的输出中标记为“最长同一性”。

本发明的核酸和蛋白序列可进一步用作“询问序列”以针对公众数据库进行搜索，例如以鉴定其它家族成员或相关序列。这样的搜索可使用Altschul等(1990) J. Mol.Biol. 215:403—10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)进行。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程序，评分= 100，字长= 12进行以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可用XBLAST程序，评分= 50，字长= 3进行以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得有空位的比对用于比较目的，可使用Gapped BLAST，如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402所述。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见National Center forBiotechnology Information的主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

“合成分子”，例如合成核酸或合成多肽通过体外化学或酶促合成产生。其包括但不限于用对于选择的宿主生物的最佳密码子使用制备的变体核酸。

合成核酸可对于密码子使用进行优化，优选根据WO2006/077258和/或WO2008000632 (其通过引用并入本文)中描述的方法进行。WO2008/000632提出了密码子对优化。密码子对优化是一种方法，其中关于其密码子使用、特别是使用的密码子对已进行修饰的编码多肽的核苷酸序列经优化以获得改进的编码多肽的核苷酸序列的表达和/或改进的编码多肽的产生。密码子对被定义为在编码序列中一组两个相继的三联体(密码子)。本领域技术人员将知道密码子使用需要根据宿主物种来修改，可能导致与SEQ ID NO: 1具有明显同源性背离，但仍编码根据本发明的多肽的变体。

本文使用的术语“变体”、“衍生物”、“突变体”或“同源物”可互换使用。它们可以指多肽或核酸。变体包括相对于参考序列在一个或多个位置的取代、插入、缺失、截短、颠换和/或倒置。变体可例如通过位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化以及本领域技术人员已知的各种其它重组方法制备。核酸的变体基因可通过本领域已知的技术人工合成。

详细描述

本文公开了具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽，其选自：

a. 分离的多肽，其与SEQ ID NO: 1的氨基酸1-318具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%同一性，或具有100%同一性；和

b. 由与SEQ ID NO: 2的核酸序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性，或具有100%同一性的核酸序列编码的多肽。

具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽可以是与SEQ ID NO: 1的氨基酸1-318具有至少80%同一性的多肽。本文公开的多肽可与SEQ ID NO: 1的氨基酸1-318具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%同一性。本文公开的多肽可与SEQ ID NO: 1的氨基酸1-318具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%同一性。本文公开的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽可包含SEQ ID NO: 1的氨基酸1-318或含有SEQ ID NO: 1的氨基酸1-318或由SEQ ID NO: 1的氨基酸1-318组成。具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽可包含SEQ ID NO: 1的氨基酸2-318或含有SEQ ID NO: 1的氨基酸2-318或由SEQ ID NO: 1的氨基酸2-318组成。令人惊讶的是，发现与SEQ ID NO: 1的氨基酸1-318或氨基酸2-318具有至少80%同一性的多肽包含焦脱镁叶绿素酶活性。

具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽水解焦脱镁叶绿素为焦脱镁叶绿甲酯酸(亦参见图1)。本文公开的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽优选水解焦脱镁叶绿素a和焦脱镁叶绿素b为它们的焦脱镁叶绿甲酯酸a和b化合物。因此，焦脱镁叶绿素酶活性可通过焦脱镁叶绿甲酯酸的形成测定。

本文公开的多肽可进一步包含脱镁叶绿素酶活性。具有脱镁叶绿素酶活性的多肽水解脱镁叶绿素为脱镁叶绿甲酯酸。优选本文公开的多肽水解脱镁叶绿素a和/或脱镁叶绿素b为它们相应的脱镁叶绿甲酯酸化合物。因此，脱镁叶绿素酶活性可通过脱镁叶绿甲酯酸的形成测定。

本文公开的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽还可包含叶绿素酶活性。具有叶绿素酶活性的多肽水解叶绿素转化为叶绿素酸酯。优选本文公开的多肽水解叶绿素a和/或叶绿素b为它们相应的叶绿素酸酯化合物。

在一个实施方案中，本文公开的多肽具有焦脱镁叶绿素酶活性、脱镁叶绿素酶活性和叶绿素酶活性。

焦脱镁叶绿素、脱镁叶绿素、叶绿素和反应产物焦脱镁叶绿甲酯酸、脱镁叶绿甲酯酸、叶绿素酸酯的测定可通过HPLC进行，如实施例中公开的。

多肽可衍生自任何合适的来源，例如植物、藻类或蓝细菌。本文公开的多肽可衍生自植物，例如大麦属(Hordeum sp.)或小麦属(Triticum sp.)，例如大麦(Hordeum vulgare)或小麦(Triticum aestivum)。本文公开的多肽也可使用标准分子技术例如从头合成产生。

本文公开的具有脱色酶活性例如焦脱镁叶绿素酶活性的多肽可以是分离的、纯的、重组、合成或变体多肽。本文公开的多肽可以经纯化。蛋白的纯化可通过本领域技术人员已知的数种方法进行。

本文公开的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的变体多肽可以是与SEQ ID NO: 1的氨基酸1-318或SEQ ID NO:1的氨基酸2-318具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%同一性的多肽。

本文公开的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽可以是多肽，例如变体多肽，其当与根据SEQ ID NO: 1的氨基酸序列比对时与SEQ ID NO: 1相比在一个或多个氨基酸位置包含取代、缺失和/或插入。例如，本文公开的多肽可以是多肽，其当与SEQ ID NO:1的多肽比对时与SEQ ID NO: 1相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或更多个氨基酸取代、缺失和/或插入，其中所述多肽仍具有本文公开的多肽的活性或功能。技术人员将理解，本文公开的多肽中这些较少的氨基酸改变可存在(例如天然存在的突变)或进行(例如使用r-DNA技术)，而不损失蛋白功能或活性。在这些突变存在于多肽的结合结构域、活性位点或其它功能结构域的情况下，多肽的性质可改变，但多肽可保持其活性。在存在不接近活性位点、结合结构域或其它功能结构域的突变的情况下，可预期较少影响。

本文公开的多肽可由任何合适的多核苷酸序列编码，只要多肽显示本文公开的焦脱镁叶绿素酶活性。通常，编码本文公开的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的多核苷酸序列是用于在特定宿主细胞中表达多肽的密码子优化序列或密码子对优化序列。

组合物

在一个方面，本公开内容涉及包含本文公开的多肽的组合物。

本文公开的组合物可包含载体、赋形剂或其它化合物。通常，组合物或制剂包含具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽可与其一起配制的化合物。合适的制剂包括液体制剂(例如乳剂、混悬剂和溶液剂)、糊剂、凝胶剂、颗粒剂和冻干或喷雾干燥的粉剂。

本文使用的赋形剂是与本文公开的多肽一起配制的无活性物质，例如蔗糖或乳糖、甘油、山梨醇或氯化钠。包含本文公开的多肽的组合物可以是液体组合物或固体组合物。液体组合物通常包含水。当作为液体组合物配制时，组合物通常包含降低水活性的组分，例如甘油、山梨醇或氯化钠(NaCl)。包含本文公开的多肽的固体组合物可包含含有多肽的颗粒，或者所述组合物包含在液体基质如脂质体或凝胶如藻酸盐或角叉菜胶中包封的多肽。本领域已知多种技术将多肽或酶包封或制粒(参见例如N.J. Zuidam和V.A. Nedović(编辑) “Encapsulation Technologies for Active Food Ingredients and foodprocessing” 2010中的G.M.H. Meesters, “Encapsulation of Enzymes and Peptides”,第9章)。

本文公开的组合物还可包含含有本文公开的多肽的载体。例如，本文公开的多肽可固定在二氧化硅上。本文公开的多肽可通过本领域已知的技术结合或固定至载体。

包含本文公开的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的组合物可包含一种或多种另外的酶，例如脂肪酶，例如磷脂酶，例如磷脂酶A、B和/或C，叶绿素酶，脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶。另外的酶可以是磷脂酶C (PLC)、磷脂酰-肌醇PLC和/或磷脂酶A，例如磷脂酶A1或磷脂酶A2。

包含本文公开的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的组合物可包含细胞部分，例如来自其中已产生具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的宿主细胞的细胞部分。细胞部分可通过各种方法产生，例如在通过超声处理和/或使用玻璃珠破坏宿主细胞后。

本公开内容还涉及制备包含本文公开的多肽的组合物的方法，其可包括喷雾干燥包含多肽的发酵培养基，或制粒或包封本文公开的多肽，并制备组合物。

核酸、表达载体和重组宿主细胞

本公开内容还涉及与编码本文公开的多肽的核酸序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%同一性或具有100%同一性的核酸。本文公开的核酸可以是与SEQ ID NO: 2具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%同一性的核酸。本文公开的核酸可包含或含有SEQ ID: NO:2。本文公开的核酸可进一步包含启动子序列和/或其它控制序列。

编码本文公开的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的核酸可以是用于在特定宿主细胞中表达本文公开的多肽的密码子优化或密码子对优化的序列。宿主细胞可例如是假单胞菌属(Pseudomonas sp)，例如萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。

在本发明的一个其它实施方案中，公开了核酸，其是SEQ ID NO: 2的核酸的分离的、纯的、重组、合成或变体核酸。变体核酸序列可例如与SEQ ID NO: 2具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性。

本发明还涉及包含本文公开的核酸的表达载体，其中核酸可操作连接至在宿主细胞中指导多肽表达的一个或多个控制序列。

有数种方式将核酸插入核酸构建体或表达载体，其是本领域技术人员已知的，参见例如Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, CSHLPress, Cold Spring Harbor, NY, 2001。可能需要用控制序列例如启动子和终止子序列操作编码本发明的多肽的核酸。

启动子可以是适合于真核或原核宿主细胞的任何合适的启动子序列，其显示转录活性，包括突变、截短和杂合启动子，并且可获自编码对细胞是内源(天然)或异源(外源)的细胞外或细胞内多肽的多核苷酸。启动子可以是组成型或诱导型启动子。优选，启动子是诱导型启动子，例如淀粉诱导型启动子。

适合于丝状真菌的启动子是可选自以下组的启动子，所述组包括但不限于：获自编码米曲霉(A. oryzae) TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、曲霉属(Aspergillus) gpdA启动子、黑曲霉(A. niger)中性α淀粉酶、黑曲霉酸稳定α淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(A. awamori)葡萄糖淀粉酶(glaA)、黑曲霉或泡盛曲霉木聚糖内切酶(xlnA)或β-木糖苷酶(xlnD)、里氏木霉(T. reesei)纤维二糖水解酶I (CBHI)、米赫根毛霉(R. miehei)脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲酶(A. nidulans)乙酰胺酶、Fusarium venenatum淀粉葡萄糖苷酶(WO 00/56900)、Fusarium venenatum Dania (WO 00/56900)、Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡萄糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶的多核苷酸的启动子，和NA2-tpi启动子(来自编码黑曲霉中性α淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的多核苷酸的启动子的杂合体)，以及其突变、截短和杂合启动子。

适合于细菌宿主的启动子是可选自以下的启动子：大肠杆菌lac启动子、aroH启动子、araBAD启动子、T7启动子、trc启动子、tac启动子和trp启动子。启动子的其它实例是天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)的启动子、迟缓芽胞杆菌(Bacillus lentus)碱性蛋白酶基因(aprH)的启动子、藓样芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)碱性蛋白酶基因(枯草杆菌蛋白酶Carlsberg基因)的启动子、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)的启动子、枯草芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyE)的启动子、藓样芽胞杆菌α淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶(maltogenic amylase)基因(amyM)的启动子或解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) α淀粉酶基因(amyQ)的启动子。另一实例是具有对于"-35"区的序列TTGACA和对于"-10"区的序列TATAAT的"共有"启动子。

本发明还涉及包含本文公开的核酸或公开的表达载体的重组宿主细胞，其中所述核酸对宿主细胞是异源的。本文公开的重组宿主细胞可以是宿主细胞，其中本文公开的核酸和具有焦脱镁叶绿素酶活性的编码多肽对宿主细胞是异源的。

本文公开的宿主细胞可以是任何适合微生物、植物或昆虫细胞。适合的宿主细胞可以是真菌细胞，例如来自支顶孢属(Acremonium)、曲霉属、金孢子菌属(Chrysosporium)、镰刀菌属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)、Rasamsonia属、木霉属(Trichoderma)、酵母菌属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)，例如黑曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、米曲霉、酱油曲霉(A. sojae)、Rasamsonia emersonii、Chrysosporium lucknowense、尖孢镰刀菌、里氏木霉或酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。

宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞。术语“细菌细胞”包括革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物二者。合适的细菌可来自以下属：埃希氏杆菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽胞杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)或链霉菌属(Streptomyces)。细菌细胞可来自以下种：枯草芽孢杆菌、解淀粉芽胞杆菌、藓样芽胞杆菌、B. puntis、巨大芽胞杆菌(B. megaterium)、耐盐芽孢杆菌(B. halodurans)、短小芽孢杆菌(B. pumilus)、Pseudomonas zeaxanthinifaciens、萤光假单胞菌或大肠杆菌。

适合的细菌宿主细胞可例如是假单胞菌属，例如萤光假单胞菌。

多肽产生的方法

本公开内容还涉及产生具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的方法，其包括在允许表达多肽的条件下在适合的发酵培养基中培养本文公开的宿主细胞和产生多肽。本领域技术人员理解如何根据使用的宿主细胞进行产生本文公开的多肽的方法，例如发酵培养基的pH、温度和组成。宿主细胞可在摇瓶中，或在具有0.5或1升或大到10至100或更多立方米的体积的发酵罐中培养。取决于宿主细胞的需要，培养可有氧或厌氧进行。在宿主细胞是假单胞菌属，例如萤光假单胞菌的情况下，宿主细胞的培养在有氧条件下进行。

有利的是，本文公开的多肽例如通过本领域技术人员已知的离心或过滤，从发酵培养基回收或分离。具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的回收也可包括破坏其中产生多肽的细胞。破坏细胞可使用本领域技术人员已知的玻璃珠和/或超声处理进行。

处理包含叶绿素底物的油的方法

在一个实施方案中，本公开内容还涉及处理包含叶绿素底物(例如焦脱镁叶绿素)的油的方法。所述方法包括使包含叶绿素底物(例如焦脱镁叶绿素)的油与本文公开的具有脱色酶活性的多肽或包含上文公开的多肽的组合物接触。在一个实施方案中，本文公开的多肽具有焦脱镁叶绿素酶活性。在另一个实施方案中，多肽具有脱镁叶绿素酶活性。在另一个实施方案中，多肽具有焦脱镁叶绿素酶活性和脱镁叶绿素酶活性。在另一个实施方案中，多肽具有焦脱镁叶绿素酶活性、脱镁叶绿素酶活性和叶绿素酶活性。

如本文所述，具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽能够水解焦脱镁叶绿素为焦脱镁叶绿甲酯酸，具有脱镁叶绿素酶活性的多肽能够水解脱镁叶绿素为脱镁叶绿甲酯酸，和具有叶绿素酶活性的多肽能够水解叶绿素为叶绿素酸酯。因此在一个实施方案中，本公开内容的处理方法可减少油中的一种或多种叶绿素底物的水平。在各种实施方案中，叶绿素底物可以是叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素。例如，与处理之前在油中存在的叶绿素底物(按重量)的总浓度相比，处理可减少所述油中的叶绿素底物的总浓度按重量至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%。叶绿素底物的总浓度减少可能是焦脱镁叶绿素转化为焦脱镁叶绿甲酯酸、脱镁叶绿素转化为脱镁叶绿甲酯酸和/或叶绿素转化为叶绿素酸酯的结果。

在另一个实施方案中，油中的叶绿素底物包含焦脱镁叶绿素，和至少一部分的焦脱镁叶绿素由于处理而被转化为焦脱镁叶绿甲酯酸。例如，与处理之前在油中存在的焦脱镁叶绿素(按重量)的总浓度相比，处理可减少油中焦脱镁叶绿素的总浓度按重量至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%。焦脱镁叶绿素的总浓度减少可能是焦脱镁叶绿素转化为焦脱镁叶绿甲酯酸的结果。在另一个实施方案中，油中的叶绿素底物包含脱镁叶绿素，和至少一部分的脱镁叶绿素由于处理而被转化为脱镁叶绿甲酯酸。例如，与处理之前在油中存在的脱镁叶绿素(按重量)的总浓度相比，处理可减少油中脱镁叶绿素的总浓度按重量至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%。脱镁叶绿素的总浓度减少可能是脱镁叶绿素转化为脱镁叶绿甲酯酸的结果。在这样的实施方案中，多肽显示脱镁叶绿素酶活性。

在另一个实施方案中，油中的叶绿素底物包含叶绿素，和至少一部分的叶绿素由于处理而被转化为叶绿素酸酯。例如，与处理之前在油中存在的叶绿素(按重量)的总浓度相比，处理可减少油中叶绿素的总浓度按重量至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%。叶绿素的总浓度减少可能是叶绿素转化为叶绿素酸酯的结果。在这样的实施方案中，多肽显示叶绿素酶活性。

包含焦脱镁叶绿素、脱镁叶绿素和/或叶绿素的油可进一步包含其它底物，例如磷脂。任选地，本文公开的处理油的方法进一步包括除去磷脂，如下文描述的。

包含叶绿素底物的任何油可根据本发明的方法处理，以从油中除去一种或多种不需要的叶绿素底物。油可以是基于三酰基甘油的油，包括各种基于植物或藻类的油。在一个实施方案中，可与本发明的处理结合使用的适合的油包括但不限于以下：低芥酸菜籽油、蓖麻油、椰子油、芫荽油、玉米油、棉籽油、榛子油、大麻籽油、亚麻籽油、芒果仁油、白池花油(meadowfoam oil)、牛脚油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精、花生油、菜籽油、米糠油、红花油、山茶油(sasanqua oil)、芝麻油、大豆油、葵花或葵花籽油、妥尔油、椿花油(tsubaki oil)、植物油和来自藻类的油。在一个实施方案中，可根据本公开内容处理的油选自低芥酸菜籽油、玉米油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、花生油、菜籽油、米糠油、芝麻油、大豆油和葵花籽油。在一个实施方案中，油是来自藻类的油。

使包含一种或多种叶绿素底物的油与具有脱色酶活性的多肽接触可在任何适合的时间期间和在任何适合的pH和温度下进行。所述接触可在三酰基甘油油的脱胶期间应用的pH和温度下进行。适合的pH可以是pH 2-pH 10，例如pH 3-pH 9、pH 4-pH 8、pH 5-pH 7、pH 5-8或pH 6.5-7.5。在一个实施方案中，多肽与所述油在4.0-7.5或4.5-8.0或4.5-7.0的pH下接触。在一个实施方案中，多肽与所述油在4.0-5.0的pH下，或更特别地在4.5的pH下接触。在另一个实施方案中，多肽在7.0的pH下接触。

使包含一种或多种叶绿素底物的油与本文公开的具有脱色酶活性的多肽接触的适合的温度可以是10℃-90℃，例如20℃-80℃、30℃-70℃、45℃-70℃、40℃-60℃或50℃-65℃。

例如，使包含一种或多种叶绿素底物的油与具有脱色酶活性的多肽接触可在5-8的pH和40℃-60℃的温度下或在4.5-7.0的pH和40℃-60℃的温度下或在7.0的pH和45℃-70℃的温度下或在7.0的pH和50℃-65℃的温度下进行。

具有脱色酶活性的多肽可以任何适合的量投配至包含叶绿素底物的油中。例如，多肽可以1-50 U/克处理油，例如1.4-50 U/克处理油或5-50 U/克处理油的范围投配。一个单位根据在下文的实施例中教导的酶活性定义。

令人惊讶地，发现与参考多肽相比，本文公开的具有脱色酶(例如焦脱镁叶绿素酶)活性的多肽在酸性和碱性条件下将较大量的叶绿素底物转化为叶绿素产物。参考多肽是包含根据SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的多肽。SEQ ID NO: 12包含具有焦脱镁叶绿素酶活性的莱茵衣藻叶绿素酶。

使包含一种或多种叶绿素底物的油与具有脱色酶活性的多肽接触可在油脱胶期间进行。油脱胶包括数个处理步骤，例如压榨和/或己烷萃取、脱胶(例如在脱胶酶例如磷脂酶的存在下，如WO2005/086900或WO2011/046812中公开的)、精制、漂白和除臭。使包含一种或多种叶绿素底物的油与具有焦脱镁叶绿素酶活性、脱镁叶绿素酶活性和/或叶绿素酶活性的多肽接触可在油脱胶处理的漂白步骤期间进行，如下文更详细描述的。

使具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽与油例如三酰基甘油油或藻类油接触可包括将包含本文公开的多肽的水性溶液分散在油中。用具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽处理的油通常包含0.5-10 w/w%的水，例如1-10 w/w%的水、1-5 w/w%的水、2-8 w/w%的水、2-4 w/w%的水、3-6 w/w%的水、0.5-5 w/w %的水、1-3 w/w %、1.5-2 w/w %的水或5 w/w%水。

多肽可与所述油接触5分钟-24小时、10分钟-12小时、15分钟-10小时、0.5-24小时、1-12小时、1.5-6小时或2-4小时的时间。在一个实施方案中，多肽可与所述油接触2小时。在所述接触后，通常分离水相和油相。

在本文公开的方法中处理的油可以是未脱胶原油、脱胶(水脱胶、酶脱胶或酸脱胶)油、碱法精制油或碱法精制和水洗油或水脱胶油。在一个具体的实施方案中，所述油包含未脱胶原油。原油通常是机械压榨或溶剂萃取的油，并且其中所述油通常含有游离脂肪酸(FFA)和磷脂。脱胶油是其中大部分磷脂已从原油除去的油。通常，脱胶油包含0.5-200ppm原子磷，例如1-100 ppm原子磷，例如5-50 ppm原子磷。精制油是其中FFA已通过碱处理中和和除去的油。油的碱处理通常包括用氢氧化钠处理油。

使本文公开的具有脱色酶(例如焦脱镁叶绿素酶)活性的多肽与油例如在油的脱胶期间接触可在任何适合的温度下，例如在45-70℃(包括50-65℃)的温度下进行。

使本文公开的具有脱色酶(例如焦脱镁叶绿素酶)活性的多肽与油例如在油的脱胶期间接触可在任何适合的pH，例如3.5-8.0的pH，例如pH 4-7.5，例如pH 4.5-7.0下进行。

在一个实施方案中，本文公开的处理方法进一步包括使油进行水脱胶。如本文所述，水脱胶通常应用于含有大量的可水合磷脂的原油。由于其温和的特性，获得的磷脂可用作卵磷脂(天然乳化剂)。从该方法获得的油在工业中通常称为“脱胶的”，尽管仅仅是部分脱胶的。

因此，在一个方面，本公开内容的处理方法包括使包含叶绿素底物的油(例如，未脱胶原油)与水和本公开内容的多肽接触。通常，油的温度为45-70℃，包括50-65℃。可加入1-5 w/w%(包括2-4 w/w%)的量的水。可投配1-50 U/克处理油，例如1.4-50 U/克处理油或5-50 U/克处理油的量的多肽。本文公开的多肽和水可作为单一组合物加入，或多肽可与水分开加入。通常，不向得到的混合物中加入酸或碱，并且方法在中性pH (例如，大约pH 7.0)下进行。在与多肽和水接触后，油可任选地使用剪切混合器混合。油随后在搅拌(例如，使用连续搅拌反应器)下孵育0.5-24小时或1-12小时或1.5-6小时或2-4小时，这有助于油中存在的磷脂的水合。在孵育和搅拌后，将油加热至70-85℃的温度。得到的油可通过沉降、过滤或工业实施离心来分离。离心得到两个流，水脱胶油和湿胶。

在另一个实施方案中，本文公开的处理方法进一步包括使油进行酶辅助水脱胶。如本文所述，酶辅助水脱胶通常应用于含有大量的可水合磷脂的原油，其中目的是使所有可水合磷脂反应和将它们转化为二酰基甘油，这增加油产量，同时维持油中的不可水合的磷脂。用于该方法的酶包括磷脂酶C (PLC)和磷脂酰肌醇-磷脂酶(PI-PLC)。

因此，在一个方面，本公开内容的处理方法包括使包含叶绿素底物的油(例如，未脱胶原油)与水、本公开内容的多肽和另外的酶接触。另外的酶可选自PLC、PI-PLC和其组合。在一个实施方案中，另外的酶包括PLC和PI-PLC二者。通常，油的温度为45-70℃，包括50-65℃。可加入1-5 w/w%(包括2-4 w/w%)的量的水。可投配1-50 U/克处理油，例如1.4-50U/克处理油或5-50 U/克处理油的量的多肽。可加入50-500 ppm(包括100-400 ppm或150-250 ppm)的量的PLC (例如，Purifine PLC)。可加入50-500 ppm(包括100-400 ppm或150-250 ppm)的量的PI-PLC。在一个实施方案中，另外的酶是Purifine 4G，其含有PLC和PI-PLC二者。在该实施方案中，可加入50-500 ppm(包括100-400 ppm或150-250 ppm)的量的Purifine 4G。本文公开的多肽、另外的酶和水可作为单一组合物加入，或本文公开的多肽、另外的酶和水可分开加入。通常，不向得到的混合物中加入酸或碱，和方法在中性pH (例如，大约pH 7.0)下进行。在与多肽、另外的酶和水接触后，组合物可任选地使用剪切混合器混合。适合的剪切混合器是连续剪切混合器IKA Dispax Reactor。组合物随后在搅拌(例如，使用连续搅拌反应器)下孵育0.5-24小时或1-12小时或1.5-6小时或2-4小时，这有助于转化油中的PC、PE和PI为二酰基甘油。在孵育和搅拌后，将组合物加热至70-85℃例如85℃的温度。得到的组合物可通过沉降、过滤或工业实施离心来分离。离心得到两个流，水脱胶油和重相(含有水、变性蛋白和磷-化合物)。

在另一个实施方案中，本文公开的处理方法进一步包括使油进行酶脱胶。酶脱胶可应用于原油或之前已通过不同方法(例如水脱胶、酶辅助水脱胶或酸脱胶)脱胶的油。希望产生卵磷脂以供食品或工业市场的处理者可对油进行水脱胶，然后进一步处理。在卵磷脂应用中磷脂的破坏是不可接受的。

因此，在一个方面，本公开内容的处理方法包括使包含叶绿素底物的组合物，例如油(例如，原油或之前脱胶油)与本公开内容的多肽接触。在与多肽接触之前，可例如通过加入100-1000 ppm(包括500 ppm)的量的酸(例如，柠檬酸或磷酸)调整油的pH。通常，pH调整至4.5-8.0(包括4.5-7.0)的pH。通常，在pH调整时油的温度为70-85℃。加入酸之后，可混合得到的油5分钟-24小时，这取决于混合器的类型(例如，高剪切、搅拌器等)。本领域技术人员将理解，当使用高剪切混合器时将需要较少的混合时间，而当应用较少剪切时(例如，当使用简单的搅拌器时)将需要较长的混合时间。在pH调整后，将组合物(例如，油)冷却至45-70℃，包括50-65℃，并加入水、本公开内容的多肽和任选地另外的酶。另外的酶(当使用时)可选自PLC、PI-PLC和其组合。在一个实施方案中，另外的酶包括PLC和PI-PLC二者。可加入1-5 w/w%(包括2-4 w/w%)的量的水。可投配1-50 U/克处理油，例如1.4-50 U/克处理油或5-50 U/克处理油的量的多肽。可加入50-500 ppm(包括100-400 ppm或150-250 ppm)的量的PLC (例如，Purifine PLC)。可加入50-500 ppm(包括100-400 ppm或150-250 ppm)的量的PI-PLC。在一个实施方案中，另外的酶是Purifine 4G，其含有PLC和PI-PLC二者。在该实施方案中，可加入50-500 ppm(包括100-400 ppm或150-250 ppm)的量的Purifine 4G。多肽、另外的酶(当存在时)和水可作为单一组合物加入，或多肽、另外的酶和水可分开加入。

在与多肽、另外的酶(当存在时)和水接触后，组合物可使用剪切混合器混合。适合的剪切混合器是连续剪切混合器IKA Dispax Reactor。剪切混合是任选的，特别是当处理的组合物是或包含未脱胶原油时。随后搅拌(例如，使用连续搅拌反应器)组合物0.5-24小时或1-12小时或1.5-6小时或2-4小时。

搅拌后，将磷脂酶A (PLA)酶加入油。PLA酶可以是PLA1酶和/或PLA2酶。在一个实施方案中，酶是PLA1酶。具有磷脂酶活性的氨基酸的序列在本领域中广泛报道，包括在三酰基甘油油中具有活性的磷脂。商品化的具有磷脂酶活性的PLA1酶包括Lecitase® Ultra和QuaraLowP。商品化的具有磷脂酶活性的PLA2酶包括Rohalase Xtra和LysoMax。任何适合的PLA酶可以是，加入的PLA可改变，这取决于生产商和使用的连续搅拌槽反应器的类型。在加入PLA酶后，油可使用剪切混合器混合。适合的剪切混合器是连续剪切混合器IKA DispaxReactor。油随后在搅拌(例如，使用连续搅拌反应器)下孵育。油可与PLA1酶孵育，允许反应1-8小时或2-7小时或3-6小时。在孵育和搅拌后，将油加热至70-85℃，例如85℃的温度。反应时间可改变，这取决于PLA剂量和存在的不可水合的磷脂(NHP) (例如，磷脂酸的Ca和Mg盐)的水平。得到的油可通过沉降、过滤或工业实施离心来分离。

在另一个实施方案中，本公开内容的处理方法包括使包含叶绿素底物的油、特别是一次精制油与本公开内容的多肽接触。通常，油的温度是45-70℃，包括50-65℃。可投配1-50 U/克处理油，例如1.4-50 U/克处理油或5-50 U/克处理油的量的多肽。可向油中加入1-10 w/w%(包括2-8 w/w%或3-6 w/w%或5 w/w%)的量的水。多肽和水可作为单一组合物加入，或多肽可与水分开加入。通常，不向得到的混合物中加入酸或碱，和方法在中性pH (例如，pH 7.0)下进行。在与多肽和水接触后，油可使用剪切混合器混合。适合的剪切混合器是连续剪切混合器IKA Dispax Reactor。油在搅拌下孵育1.5-3小时，包括2小时。在孵育和搅拌后，将油加热至70-85℃的温度。得到的油可通过沉降、过滤或工业实施离心来分离。

在另一个实施方案中，本文公开的处理包含叶绿素衍生物的油的方法可进一步包括除去焦脱镁叶绿甲酯酸和/或脱镁叶绿甲酯酸。在一个实施方案中，本文公开的处理包含叶绿素衍生物的油的方法可进一步包括除去叶绿素酸酯、焦脱镁叶绿甲酯酸和/或脱镁叶绿甲酯酸。焦脱镁叶绿甲酯酸、脱镁叶绿甲酯酸和/或叶绿素酸酯可在化学精制步骤中在油的水洗涤期间(加入水以除去过量的皂)除去，或通过使用固体吸附剂例如二氧化硅或在除臭步骤中除去，这是本领域技术人员已知的。

在一个实施方案中，处理包含叶绿素衍生物(例如焦脱镁叶绿素)的油的方法可进一步包括用选自磷脂酶、叶绿素酶、脱镁叶绿素酶、焦脱镁叶绿素酶和其组合的另外的酶处理油。适合的磷脂酶可以是磷脂酶A、磷脂酶B和/或磷脂酶C或这些酶的任何适合组合。用磷脂酶处理油(所谓的酶促脱胶)减少油中的磷脂含量，导致油中较低的原子磷含量。

本公开内容还涉及通过本文公开的方法可获得的油(例如，三酰基甘油油、植物油、来自藻类的油等)。油(其可以是通过本文公开的方法可获得的三酰基甘油油)可包含本文公开的具有脱色酶活性(例如焦脱镁叶绿素酶活性)的多肽。

附图

图1：叶绿素转化为脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素并转化为相应的反应产物叶绿素酸酯、脱镁叶绿甲酯酸和焦脱镁叶绿甲酯酸的综述。显示了A化合物，其在C7位置具有甲基。B化合物在C7基团处具有醛，而不是甲基。结构获自PubChem, NCBI。

图2：在pH 7和50℃下孵育脱镁叶绿素a和b和焦脱镁叶绿素a和b与不同的推定叶绿素酶24小时的HPLC结果。底物脱镁叶绿素a和b和焦脱镁叶绿素a和b以及反应产物脱镁叶绿甲酯酸a和b和焦脱镁叶绿甲酯酸a和b的量作为峰表面积给出。前两栏显示反应产物和底物的总和。“nd”是指：不可检出。

图3：在pH 5和50℃下孵育脱镁叶绿素a和b和焦脱镁叶绿素a和b与不同的推定叶绿素酶24小时的HPLC结果。底物脱镁叶绿素a和b和焦脱镁叶绿素a和b以及反应产物脱镁叶绿甲酯酸a和b和焦脱镁叶绿甲酯酸a和b的量作为峰表面积给出。前两栏显示反应产物和底物的总和。“nd”是指：不可检出。

图4：在与来自大麦的CHL26酶或来自莱茵衣藻的参考酶ELDC94孵育24 h后，在低芥酸菜籽油中的a)叶绿素衍生物，b)磷化合物。

图5：在不同反应条件下在与来自大麦的CHL26酶和/或来自莱茵衣藻的参考酶ELDC94数次孵育后，在低芥酸菜籽油和大豆中的a)叶绿素衍生物和b)磷化合物，和c) 获得的胶中的叶绿素衍生物。

图6：在碱法精制后和在与来自大麦的CHL26酶或来自莱茵衣藻的参考酶ELDC94孵育后在低芥酸菜籽油和大豆油中的叶绿素衍生物。

图7：基于三酰基甘油的油的化学精制方法的示意图。

对油籽(菜籽或大豆)、油果实植物(棕榈)或单细胞源(藻类)进行溶剂萃取和/或压榨以获得原油的方法。原油然后用柠檬酸或磷酸处理以与不可水合的磷脂反应，并然后加入氢氧化钠以中和游离脂肪酸和形成钠皂。钠皂与存在的水形成乳液，允许当油离心时除去不可水合的磷脂以产生精制油。精制油可然后用热水洗涤和离心以除去剩余的皂和磷脂。或者，精制油可用酸性二氧化硅处理，以吸附皂、痕量金属和磷脂。工业酸性二氧化硅不具有任何能力来除去叶绿素或叶绿素衍生物。油然后用漂白土处理以除去油中存在的皂、磷脂以及叶绿素和叶绿素衍生物。最后步骤是在升高的温度和少于5 mBar的真空下蒸汽蒸馏的除臭步骤。蒸馏主要除去过氧化物、醛、酮和其它风味化合物。其还破坏β-胡萝卜素和除去剩余的游离脂肪酸(0.1%)以达到0.02-0.05%最终游离脂肪酸(FFA)的水平。

图8：酶促脱胶/物理精制方法的示意图。原油用磷酸或柠檬酸处理以使在大约2的pH下不可水合的磷脂能够丢失与它们结合的钙或镁。然后加入氢氧化钠以使pH高于4 (对于柠檬酸)或高于6 (对于磷酸)，以便磷脂酶可起作用并在与PLA酶促反应后获得非常低的残留磷(<5 ppm)。或者，PLA可与PLC和/或PI-PLC反应以最大化油产量和仍获得非常低的残留磷，这允许物理精制。油然后洗涤或用酸性二氧化硅处理，其接着或组合漂白土。在漂白过程后，其中叶绿素水平低于50 ppb，油在除臭器中物理精制。高温蒸汽蒸馏除去上文图7描述的所有化合物，但其主要目的是除去FFA。FFA被蒸馏和收集在洗涤器中。与水脱胶或化学精制中形成的乳液有关的损失相比，非常有限的中性油在除臭过程中损失。

图9：在水脱胶方法或酶辅助水脱胶方法中使用脱色酶的示意图。脱色酶可与水在60℃下一起加入，或与PLC一起加入，或与PLC和PI-PLC的组合一起加入。2小时孵育后，将油加热至70-85℃和离心以除去反应的胶和反应的叶绿素衍生物。

图10：用脱色酶进行酶促脱胶方法的示意图。原油首先用柠檬酸处理至大约2的pH以离解结合的钙和镁离子，将pH升高至高于4以使PLC和脱色酶处于使得它们能够有效起作用的pH下。加入1-5%的水以供水解反应。在完成PLC和脱色酶孵育后，可加入PLA1或PLA2以与油中存在的不可水合的磷脂反应。在另外孵育2-6小时后，将油加热至70-85℃和离心以除去反应的胶和叶绿素衍生物，产生油，其中在油中具有少于5 ppm残留磷。

图11：用脱色酶进行化学精制方法的示意图。在该方法的早期步骤中，由于极低pH(大约2)和极高pH (大约14)，可不在酸或碱添加步骤中加入脱色酶。脱色酶必须在精制油的初始离心步骤后加入。在适合酶的温度(50-65℃)下随洗涤步骤加入脱色酶是有利的。允许至少2小时的孵育时间，接着加热至70-85℃，然后离心。然后进一步处理油。

序列

SEQ ID NO: 1 = 来自大麦的具有脱色酶(包括焦脱镁叶绿素酶)活性的CHL26多肽。

MASAGDVFDHGRHGTSLARVEQAKNTRCSAASRVDADAQAQQSPPKPLLVAAPCDAGEYPVVVFLHGYLCNNYFYSQLIQHVASHGFIVVCPQLYTVSGPDTTSEINSAAAVIDWLAAGLSSKLAPGIRPNLAAVSISGHSRGGKVAFALGLGHAKTSLPLAALIAVDPVDGTGMGNQTPPPILAYKPNAIRVPAPVMVIGTGLGELPRNALFPPCAPLGVSHAAFYDECAAPACHLVARDYGHTDMMDDVTTGAKGLATRALCKSGGARAPMRRFVAGAMVAFLNKWVEGKPEWLDAVREQTVAAPVVLSAVEFRDE

SEQ ID NO: 2：用于在萤光假单胞菌中表达的编码来自大麦的具有脱色酶(包括焦脱镁叶绿素酶)活性的多肽CHL26的密码子优化的核酸序列。

SEQ ID NO: 3；来自雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)的CHL25假定叶绿素酶。

SEQ ID NO: 4；来自海枣(Phoenix dactylifera)的CHL27假定叶绿素酶。

SEQ ID NO: 5；来自瓦勒迈杉(Wollemia nobilis)的CHL28假定叶绿素酶。

SEQ ID NO: 6；来自黄瓜(Cucumis sativus)的CHL29假定叶绿素酶。

SEQ ID NO: 7；来自醉蝶花(Tarenaya hassleriana)的CHL30假定叶绿素酶。

SEQ ID NO: 8；来自马铃薯(Solanum tuberosum)的CHL31假定叶绿素酶。

SEQ ID NO: 9；来自毛果杨(Populus trichocarpa)的CHL32假定叶绿素酶。

SEQ ID NO: 10；来自绿豆(Vigna radiata)的CHL33假定叶绿素酶。

SEQ ID NO: 11；N1阴性对照，绿色荧光蛋白(GFP)。

SEQ ID NO: 12；P2，具有焦脱镁叶绿素酶活性的莱茵衣藻叶绿素酶。SEQ ID NO:12在文本也称为ELDC94。

实施例

材料和方法

总则

标准基因技术，例如宿主细胞中酶的过表达、宿主细胞的遗传修饰或杂交技术，是本领域已知的方法，例如描述于Sambrook和Russel (2001) "Molecular Cloning: ALaboratory Manual (第3版), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press或F. Ausubel等编辑, "Current protocols in molecular biology",Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)。在没有另外指定的情况下，水是Milli-Q水。

分析方法：

pH– 化学计量加入酸和碱至加入油的水百分比。

在2000克反应中2%的水将是40克，加入2.0克的50%柠檬酸溶液，加上1.6 mL的4 M氢氧化钠，将得到pH 4.5的水溶液。油的pH总是保持为7。

皂– American Oil Chemists’ Society官方方法Cc 13a-43，2017年修订。

游离脂肪酸-- American Oil Chemists’ Society官方方法Ca 5a-40，2017年修订。

颜色– American Oil Chemists’ Society官方方法Ce 13e-92，2017年重新批准。以5¼”池使用Tintometer的PFX-950。

磷和痕量金属 – American Oil Chemists’ Society官方方法Ca 17-01-43，2017年修订。磷脂组合物 – 对于³¹P NMR方法(亦称为31-P NMR)，将10 µL的10% DOL分散体分散在1 mL含有软化水以及10%氧化氘(D₂O，Cambridge Isotope Laboratories，DLM-4)、25mg/mL去氧胆酸(Sigma D2510)、5.84 mg/mL EDTA二Na (Titriplex III，Merck 108418)和5.45 mg/mL TRIS碱(三(羟基甲基)氨基甲烷，Merck 108387)的水性溶剂中，使用4N KOH将其pH调整至pH 9，并向其中加入2 mg/mL TIP内标(三-异丙基磷酸酯，Aldrich 554669)(准确称重)。

所有样品在具有Prodigy BBO探针的Bruker 400 MHz AvanceIII NMR分光计中测量。探针头的温度设定在300K。

用半定量参数进行定量测量：128次扫描，90°脉冲，D1 = 5秒。以µmol/g干重(DOL)样品报告值。

通过HPLC-FLU分析有色化合物

脱镁叶绿素A和B和焦脱镁叶绿素A和B以及它们的脱镁叶绿环类(phorbides)的分析通过HPLC使用荧光检测进行，其是一种基于Hwang等人J. Food Hyg. Soc. Japan Vol. 46,No. 2, 45-48的工作开发的方法，通过对于A化合物在λex 410 nm / λem 666 nm和对于B化合物在λex 436 nm / λem 653 nm的荧光检测扩展。

样品制备

油样品在丙酮中稀释(1g油/9 mL丙酮)，并且在14000 rpm下离心5分钟。将澄清的上清液转移至注射瓶中，和将10 µl的样品注入HPLC。由于叶绿素水平在所有实践的油样品中太低，这些在分析中不考虑。

数据分析

色谱图的峰表面积(以任意单位计)指示油样品中存在的脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿素、脱镁叶绿甲酯酸和焦脱镁叶绿甲酯酸的量。图2和3显示在与假定叶绿素酶在pH 5和pH 7下孵育后油样品中的脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿素、脱镁叶绿甲酯酸和焦脱镁叶绿甲酯酸的峰表面积。显示了脱镁叶绿素类(phytines)的峰表面积的总和、脱镁叶绿环类的峰表面积的总和和各个化合物的峰表面积。脱镁叶绿甲酯酸和焦脱镁叶绿甲酯酸的形成分别是脱镁叶绿素酶活性和焦脱镁叶绿素酶活性的存在的度量。

酶

Purifine®磷脂酶C (PLC)以及Purifine® PI-PLC和真菌PLA1获自DSM。

Purifine®磷脂酶C包含SEQ ID NO: 2的氨基酸38-282，具有氨基酸取代63D、131S和134D，公开于WO2005/086900。

Purifine® PI-PLC包含根据SEQ ID NO: 8的成熟多肽，公开于WO2011/046812。

真菌PLA1包含SEQ ID NO: 1的成熟氨基酸序列，公开于欧洲申请号EP18171015.3。

装置

顶置式混合器是IKA RW 20 Digital，具有平面叶片桨。

离心机是De Laval Gyro – Tester，安装有“转鼓单元(The Bowl Unit)”用于连续分离。离心机转鼓用安装的螺塞封闭。

剪切混合用带有G450转子定子的Ultra-Turrax均化器SD-45以10,000 rpm实现。

实施例1. 假单胞菌属中假定叶绿素酶的表达

图2和3的表中提供的假定叶绿素酶(CHL)在获自Dow Global Technologies Inc.(US20050130160、US20050186666和US20060110747)的假单胞菌属系统中表达。12个基于图2和3所示的假定叶绿素酶蛋白序列的合成基因根据DNA2.0 (GeneGPS® technology)的算法，通过对于假单胞菌属优化基因密码子使用设计。为克隆目的，DNA序列含有在5’-末端的SpeI位点和核糖体结合位点(ACTAGTAGGAGGTAACTAATG)和在3’-末端的终止密码子和XhoI位点(TGATGACTCGAG)。

SEQ ID NO: 2显示密码子优化的核酸序列，其编码大麦的假定叶绿素酶SEQ IDNO:1。

使用SpeI和XhoI限制酶克隆，将DNA序列插入pDOW1169载体(Dow GlobalTechnologies Inc.，US20080058262)。含有在修饰的tac启动子的控制下编码CHL和PPH酶的基因的pDOW1169载体然后引入萤光假单胞菌尿嘧啶营养缺陷型菌株DPfl0。在30℃在没有尿嘧啶的M9基本培养基上孵育48小时后选择转化的细胞(Dow Global TechnologiesInc.，US20050186666) (Schneider等人 2005)。

正确的转化株在含有3 ml M9培养基的24孔预灭菌深孔板(Axygen, CA, USA)中预培养。板用Breathseal (Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany)覆盖并在30℃、550 rpm和80%湿度下在Microton孵育器摇床(Infors AG, Bottmingen, Switzerland)上孵育16小时。从这些培养物，在30℃、550 rpm下24小时，使用30 μl接种第二个含有3 ml M9培养基的24孔预灭菌深孔板(Axygen, CA, USA)。8小时后，培养物用IPTG (0.3 mM终浓度)诱导。通过在2750 rpm离心10分钟收获培养物和除去上清液。将细胞沉淀在-20℃储存过夜。将来自3 ml培养物的细胞沉淀悬浮于1 ml裂解缓冲液中和在37℃孵育1小时。裂解缓冲液(1mM EDTA、50 mM Tris pH 8、0.25 mg/ml溶菌酶、10 mg/ml DnaseI、25 µM MgSO₄和0.03% triton)。将裂解物在2750 rpm离心10分钟，取出上清液并储存。

实施例2. 在低芥酸菜籽原油的无细胞提取物中测定焦脱镁叶绿素酶活性

孵育

来自North American来源的低芥酸菜籽原油，富含脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素，按以下方式用于测定实施例1中产生的上清液中的酶对焦脱镁叶绿素A和B的活性。在高剪切混合下使用Silverson混合器将缓冲液(5% (v/v))加入油。对于pH 5，使用20mM柠檬酸缓冲液。对于pH 7，使用20mM磷酸盐缓冲液。向24孔微量滴定板每孔填充1.425 mL油包缓冲液分散体，并向每孔加入实施例1产生的75 µL 5% (v/v)无细胞提取物(上清液)。测试样品列表在图2和图3的表中提供，并包括含有莱茵衣藻焦脱镁叶绿素酶的阳性参考和阴性对照绿色荧光蛋白(GFP)。微量滴定板用塑料箔[Fasson S695]覆盖。每孔用独立的磁力搅拌棒搅拌。在50℃使用KBMD微量滴定板搅拌器进行孵育。在24小时后取样和使用HPLC-FLU如上所述分析脱镁叶绿素A和B以及焦脱镁叶绿素A和B以及它们的脱镁叶绿环类的存在。

图2和3中的结果显示，仅CHL26，即来自大麦的假定叶绿素酶，在pH 7和pH 5下能够水解所有脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素为它们相应的(焦)脱镁叶绿甲酯酸。

实施例3. 随时间变化用CHL26孵育低芥酸菜籽原油

用如实施例1所述产生的大麦假定叶绿素酶CHL26的5%无细胞提取物孵育低芥酸菜籽原油，以与实施例2所述相同的方式在pH7下重复进行。在30 min、2 hr、5 hr和24 hr后取样。焦脱镁叶绿素a和b以及脱镁叶绿素a和b、焦脱镁叶绿甲酯酸a和b以及脱镁叶绿甲酯酸a和b通过HPLC如上所述测量。

在表1中反应产物焦脱镁叶绿甲酯酸a和b以及脱镁叶绿甲酯酸a和b的形成表示为24 hr后反应产物(相应的脱镁叶绿环类分子)的量的百分比。

表2显示在0.5、2和5 hr后作为时间的函数的脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素的相对量，其表示为相对于在t=0时的值的百分比(4次测量的平均值)。

表1. 在pH 7和50℃下孵育0.5、2、5和24小时后所有反应产物的相对HPLC结果，以相对于24 hr后的值的百分比表示。

表2. 在pH 7和50℃下孵育0.5、2和5小时后所有脱镁叶绿素(phytin)化合物的相对HPLC结果，以相对于t = 0的值的百分比表示。

表1和2的结果显示，来自大麦的酶CHL26能够水解脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素二者，并且a和b化合物二者。在2 hr后所有脱镁叶绿素被转化(低于检测限)，而5小时后几乎所有焦脱镁叶绿素被转化。

实施例4. 通过10L生物反应器发酵产生CHL26和ELDC94

菌株和接种物

如实施例1所述，在具有包含酵母提取物、盐(slat)和甘油作为C源的复杂培养基的单相摇瓶中，从含有CHL26 (SEQ ID NO: 1)和莱茵衣藻(ELDC94；SEQ ID NO: 12)叶绿素酶的萤光假单胞菌菌株制备预培养物，其用作下文描述的10L发酵的接种物，其中接种比为10%。

10L发酵

发酵过程基于工业萤光假单胞菌发酵(分批进料方法，糖限制，IPTG诱导)。发酵过程由在葡萄糖作为C源的指数进料下的生物质产生，接着在IPTG诱导系统下的生产阶段组成。23hr发酵后(生物质产生阶段结束)，加入IPTG至终浓度0.125 mM，以诱导酶产生。C源(葡萄糖)的进料速率减少至最大值的~70%，和延长发酵直到接种后48-55小时。

在发酵结束时，杀灭肉汤，和通过苯甲酸盐处理接着发酵肉汤的pH增加而释放酶。

回收

通过匀浆释放细胞内的酶。应用两次750巴通过，之间具有12小时的冷却期。随后，将匀浆的肉汤用30%水稀释，加入15% DBF (Dicalite BF)、氯化钙(20 g/kg原始肉汤)和絮凝剂C577 (对于原始肉汤，0.1%)。将pH调整至8，并将材料澄清和超滤。UF用50%甘油稳定，并且为了确保完全杀死剩余的细菌，加入MEP (对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸乙酯，在含丙二醇的溶液中)，以约15 % v/v稀释产物。

活性

对p-NP底物的活性

酶活性使用发色底物4-硝基苯基丁酸酯(Sigma N9874)测定。底物贮液：50 mM pNP-丁酸酯/乙腈。底物溶液：使用前，将底物贮液按1:4比率与还含有0.2% BSA和2.0% Triton X-100的0.1 M磷酸盐缓冲液pH 7.0混合。

在微量滴定板中，将120 µL磷酸盐缓冲液(与上述相同)与15 µL底物溶液混合，并在37℃平衡。通过加入15 µL样品开始反应后，测量405 nm的OD，持续5分钟。此外，通过加入15 µL缓冲液代替样品进行空白测量。曲线的线性部分的斜率用作活性的度量。稀释样品以确保5分钟后吸光度增加少于1.0。

活性如下计算：

U/mL = (∆Abs/min样品 – ∆Abs/min空白)/ (ε_pNP x 5) x 1000 x 150/15 x Df/W

ε_pNP = 对硝基苯酚的摩尔消光系数[L.mol-1.cm-1]

5 = 孵育时间[min]

1000 = mmol至μmol的因数

150 = 测定体积[μL]

15 = 样品体积[μL]

Df = 稀释因数

W = 样品重量(g)

活性表示为在测试条件下每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚的酶的量。使用在上述磷酸盐缓冲液中稀释的4-硝基苯酚标准溶液(Sigma N7660)进行计算。

CHL26的最终制剂的活性是1.4 U/g (0.5 w/w%)，以及ELDC94的最终制剂的活性是87 U/g (0.04 w/w%)。

实施例5. 在各种条件下与用来自莱茵衣藻的参考酶(ELDC94)孵育低芥酸菜籽原油相比，用衍生自大麦的具有焦脱镁叶绿素酶活性的酶(CHL26)孵育低芥酸菜籽原油

低芥酸菜籽原油用大麦假定叶绿素酶CHL26的0.5 w/w%无细胞提取物孵育和与莱茵衣藻叶绿素酶(代码ELDC94 = Ref)的0.04 w/w%的无细胞提取物比较，两种酶如实施例4所述产生。以10 g规模(10 g油在15 ml玻璃反应容器中在具有温度控制的热板铝反应模块上孵育。内容物通过磁力棒保持剧烈搅拌)，并且当前在三个不同的温度(40、50和60℃)下并且在具有不同水相酸度的四个方案下进行孵育：

酸性：400 ppm柠檬酸预处理；

温和酸性：用500 ppm柠檬酸和138 ppm碱(NaOH)预处理；

中性：仅水；

温和碱性：用150 ppm NaOH预处理。

孵育期间全部水的水平是3% w/w，这包括酶制剂和预处理溶液。实验前，通过1:1用水稀释预处理的油评价水环境的酸度，然后通过pH计测量pH。这得到以下pH值，指示反应期间分散体的水环境的酸度：酸性：pH 3.4；温和酸性：pH 4.5；中性：pH 5.9和碱性pH 7.9。

对于用柠檬酸的预处理，将柠檬酸(作为50% w/w溶液)在70℃加入油，在70℃保持搅拌30分钟，随后将温度减少至孵育温度，和对于温和酸性条件，加入NaOH (作为2.0 % w/w溶液)。在仅加入NaOH的情况下，将油在孵育温度下搅拌30分钟。

在孵育期间，在0.5、2、4和24小时后取样，并通过HPLC-Flu分析，如实施例2所述，目前针对一组具有已知浓度的标准品。所有底物(叶绿素、脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿素–a和b)和所有反应产物(叶绿素酸酯、脱镁叶绿甲酯酸、焦脱镁叶绿甲酯酸–a和b)的浓度分别求和为总底物和总反应产物(以mg/kg油计)。所有结果以底物和反应产物的百分比在下表中提供。

表3、4和5的结果显示与来自莱茵衣藻的参考叶绿素酶相比，根据SEQ ID NO: 1的大麦酶CHL26在酸和碱的存在下具有更宽的应用范围，和在更高的温度下有活性。

表3. 在不同条件下在40℃用来自大麦的CHL26酶或来自莱茵衣藻的参考酶ELDC94孵育后，低芥酸菜籽原油中的叶绿素衍生物(wt%)

表4. 在不同条件下在50℃用来自大麦的CHL26酶或来自莱茵衣藻的参考酶ELDC94孵育后，低芥酸菜籽原油中的叶绿素衍生物(wt%)

表5. 在不同条件下在60℃用来自大麦的CHL26酶或来自莱茵衣藻的参考酶ELDC94孵育后，低芥酸菜籽原油中的叶绿素衍生物(wt%)

实施例6. 与来自莱茵衣藻的参考酶(ELDC94)相比，用衍生自大麦的具有焦脱镁叶绿素酶活性的酶(CHL26)孵育溶剂萃取的低芥酸菜籽原油

将35磅容器的溶剂萃取的低芥酸菜籽原油倾入大的不锈钢容器中并用IKA混合器使其均匀。

在混合后，将大约1.5 kg的低芥酸菜籽原油置于具有拥有方形桨的顶置式混合器的2升带夹套的玻璃烧杯中和以90转/分钟(rpm)混合。夹套温度设定为65℃。一旦油温度已到达设定点，将如实施例4所述产生的0.7克的酶ELDC94 (反应1)或7.5克的CHL26 (反应2)与100克去离子水一起加入油。将材料剪切混合1分钟，同时用塑料膜覆盖。将带夹套的玻璃烧杯移动回到顶置式混合器和用塑料膜覆盖。将材料用酶以250 rpm孵育24小时。

将1.5克的50% (wt.%)柠檬酸加入混合油。夹套的设定点减少至55℃。一旦材料达到55℃，将油移动至剪切混合器。将1.2 mL的4 N NaOH加入油和剪切混合30秒。加入0.3克的Purifine®磷脂酶C (PLC)和30克的去离子水。将油剪切混合1分钟，同时用塑料膜覆盖。将带夹套的玻璃烧杯移动回到顶置式混合器和再次用塑料膜覆盖。在55℃以250 rpm将油混合2小时。

将烧杯移动回到高剪切混合器和将0.1克的真菌磷脂酶A₁ (PLA₁)酶加入油和剪切混合1分钟，同时用塑料膜覆盖。将带夹套的玻璃烧杯移动回到顶置式混合器和再次用塑料膜覆盖。将油在55℃以250 rpm混合2小时。增加水浴的设定点至75℃。一旦油到达75℃，使用具有转鼓(关闭孔)的Gyro-Centrifuge将油离心。收集油和胶的样品，并分析P、Ca、Mg和Fe和叶绿素衍生物(使用HPLC)的存在，如上所述。

将保持在离心机转鼓中的油和重相的混合物倾入400 mL烧杯中，其中将油倾析出。将剩余的油和重相置于50 mL离心管中并旋转。来自倾析转鼓和在管中的油弃去和将液体重相合并。

表6和图4 a)的结果表明，根据SEQ ID NO: 1的具有焦脱镁叶绿素酶活性的CHL26酶能够减少溶剂萃取的低芥酸菜籽原油中的叶绿素衍生物。叶绿素底物是叶绿素、脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素，以及叶绿素产物是叶绿素酸酯、脱镁叶绿甲酯酸和焦脱镁叶绿甲酯酸。

表6. 在用酶CHL26和参考酶ELDC94处理后，低芥酸菜籽原油中的化合物(以ppm计)

图4 b)的结果表明，在收集的重相中存在仍未反应的磷脂，这指示磷脂酶反应太短而不能完成。

实施例7. 在不同条件下用CHL26酶孵育压榨的低芥酸菜籽原油

将35磅容器的压榨的低芥酸菜籽原油倾入大的不锈钢容器和用IKA混合器使其均匀。

反应3 - 在pH 4.5下CHL26与PLC和PI-PLC一起孵育2 hr，接着与PLA1一起孵育2hr

将约1.5 kg的低芥酸菜籽原油置于具有拥有方形桨的顶置式混合器的2升夹套玻璃烧杯中。油以90 rpm混合。夹套温度设定为70℃。将1.5克的50% (wt.%)柠檬酸加入混合油和剪切混合1分钟。夹套的设定点减少至60℃。一旦材料达到60℃，将油移动至剪切混合器。将1.2 mL的4 N NaOH加入油和剪切混合30秒。0.3克的Purifine PLC (LR79.14 2018年2月)、0.02克的Purifine PI-PLC、7.5克的如实施例4所述产生的CHL26酶[大麦双穗变种(Hordeum vulgare var. distichum)(大麦，植物)]和100克的去离子水。将材料剪切混合1分钟，同时用塑料膜覆盖。将带夹套的玻璃烧杯移动回到顶置式混合器和再次用塑料膜覆盖。将油在60° C以250 rpm混合2小时。

将带夹套的玻璃烧杯再次移动至剪切混合器，其中加入0.075克的PLA₁ (手册(notebook)，0743B2)和将油剪切混合1分钟。将带夹套的玻璃烧杯移动回到顶置式混合器和用塑料膜覆盖。将油混合和允许反应在250 rpm持续2小时。增加水浴的设定点至75℃。一旦油达到75℃，使用具有转鼓(关闭孔)的Gyro-Centrifuge将油离心。收集油和胶的样品。

将保持在离心机转鼓中的油和重相的混合物倾入400 mL烧杯中，其中将油倾析出。将剩余的油和重相置于50 mL离心管中和旋转。来自倾析转鼓和在管中的油弃去和将液体重相合并。

反应4 –在pH 4.5下ELDC94与PLC和PI-PLC一起孵育2 hr，接着与PLA₁一起孵育2hr

与上述反应1相同的程序用于酶ELDC94，使用0.61克的配制酶溶液(如实施例4所述产生)。

反应5 - 在pH 4.5下CHL26与PLC和PI-PLC一起孵育2 hr，接着与PLA₁一起孵育4hr

进行与反应1相同的程序，但PLA1反应允许反应4小时，而不是仅2小时。

反应6 - 在pH 4.5下CHL26与PLC和PI-PLC一起孵育2 hr，接着与PLA₁一起孵育4hr

进行与反应3相同的程序，除了两倍量的CHL26 (总共15克)加入反应之外。

反应7 - 在中性pH下CHL26与PLC和PI-PLC一起孵育2 hr，接着与PLA₁一起孵育4hr

进行与反应1相同的程序，除了不进行pH调整之外。

反应8 –在pH 4.5下SBO CHL26与PLC和PI-PLC一起孵育2 hr，接着与PLA₁一起孵育2hr

进行与反应1相同的程序，但油是溶剂萃取的大豆原油(SBO)。

在表7中显示了根据反应1-6在酶处理之前和之后，油和相应的胶的磷(P)和图5b)、钙(Ca)、镁(Mg)和铁(Fe)含量。与pH 4.5的反应相比，在中性pH下，更大量的P保持在油中。

表8和图5a)的结果显示，当酶在相同条件下孵育时(反应1和2)，与ELDC94相比，CHL26酶转化低芥酸菜籽原油中更大量的叶绿素衍生物。

在本发明的实施例中，与酸性条件(pH 4.5)相比，在中性条件下CHL26酶转化低芥酸菜籽原油中更大量的叶绿素底物为相应的叶绿素产物(比较反应7与反应3、5和6)。

CHL26酶还转化大豆油中的叶绿素底物为相应的叶绿素产物(反应8)。

表8的结果还显示，与同ELDC94酶反应相比，当油与CHL26酶反应时，在胶(重相)中发现更大量的叶绿素产物。

表7. 与参考酶ELDC94和/或没有酶处理相比，在用CHL26酶处理后低芥酸菜籽油(Can)或大豆油(SBO)中的化合物

表8. 与参考酶ELDC94和/或没有酶处理相比，在用CHL26酶处理后低芥酸菜籽油或大豆油和分离的胶中的叶绿素衍生物

实施例8. 在低芥酸菜籽油和大豆油的碱法精制应用中使用CHL26酶

以下实验是CHL26在碱法精制应用中的评价，其中油已用磷酸和氢氧化钠处理，如低芥酸菜籽油和大豆油的工业方法中的情况。“一次精制”产物是用磷酸处理、然后用氢氧化钠处理以转化游离脂肪酸(FFA)为钠皂的油，所述钠皂是水溶性的和在“精制”离心的水或“重”相中除去。然后将油用水(2-10% w/w)洗涤以除去油中存在的剩余皂和剩余磷脂。任选地，酶在水洗涤步骤的精制离心后评价，但以低得多的温度进行。

将5加仑塑料桶的一次精制低芥酸菜籽(ORCAN)油用高剪切混合器混合以使其均匀。取出2-3 kg样品用于下文的实验。

反应9 - ELDC94-比较性

在90 rpm顶置式混合下，将2 kg的一次精制低芥酸菜籽油在热板上置于4升玻璃烧杯中。将油在搅拌下加热至60℃。一旦材料达到60℃，将烧杯移动至剪切混合器。将0.8克的酶ELDC94 (如实施例4所述产生)和100克的去离子水加入油。将材料剪切混合1分钟，同时用塑料膜覆盖以最小化水损失。将玻璃烧杯移动回到顶置式混合器和用塑料膜覆盖。将油在60℃以250 rpm混合4小时。将温度增加至75℃。使用Gyro-Centrifuge将油离心。收集分离的油。

将保留在离心机转鼓中的油和重相的混合物倾入400 mL烧杯中，其中将油倾析出。将剩余的油和重相置于50 mL离心管中和旋转。将来自倾析转鼓和在管中的油弃去和将液体重相合并。重相是深绿色。

反应10 – ELDC94-比较性

反应10是反应9的重复，除了使用3 kg的油和2.0克的ELDC94 (如实施例4所述产生)之外。

在分析来自反应9和10的油后，将油合并混合和再次分析。

反应11 - CHL26

反应11是反应9的重复，除了使用10.1克的CHL26 (如实施例4所述产生)代替ELDC94之外。重相是比反应9和10更浅的绿色。

反应12 – CHL26

反应12是反应10的重复，除了使用20克的CHL26之外。

分析后，将反应11和12的油合并和混合，并且在混合后再次分析。

反应13 - ELDC94-比较性

在水洗涤离心后从碱法精制生产线1号取出3 kg的一次精制大豆油(ORSBO)。将油置于4升玻璃烧杯中和置于热板上，用方形混合桨(90 rpm)顶置式混合。一旦材料冷却至60℃，将烧杯移动至剪切混合器。将1.0克的ELDC94酶(如实施例4所述产生)和150克的去离子水加入油。将材料剪切混合1分钟，同时用塑料膜覆盖以最小化水分损失。将玻璃烧杯移动回到顶置式混合器和再次用塑料膜覆盖。将油在60℃以250 rpm混合4小时。将温度增加至75℃和然后使用Gyro-Centrifuge将油离心。

收集油和重样品以供进一步分析。

将保留在离心机转鼓中的剩余的油和重相倾入400 mL烧杯中，其中将油倾析出。将剩余的油和重相置于50 mL离心管中和旋转。将管中剩余的油弃去和将液体重相合并。重相是无色的，没有可辨别的有色色素。

反应14 - CHL26

反应14是反应13的重复，除了使用15克的CHL26 (如实施例4所述产生)代替ELDC94之外。

反应15 - EDLC94-比较性

在水洗涤离心后，从碱法精制生产线1号取出3 kg克的一次精制大豆油(ORSBO)。将油置于4升玻璃烧杯中和置于热板上，用方形混合桨(90 rpm)顶置式混合。一旦材料冷却至60℃，将烧杯移动至剪切混合器。将1.2克的ELDC94酶(如实施例4所述产生)和150克的去离子水加入油。将材料剪切混合1分钟，同时用塑料膜覆盖以最小化水分损失。将玻璃烧杯移动回到顶置式混合器和用塑料膜再次覆盖。将油在60℃以250 rpm混合4小时。将温度增加至75℃和然后使用Gyro-Centrifuge将油离心。

收集油和重相(胶)样品以供进一步分析。

将保留在离心机转鼓中的剩余的油和重相倾入400 mL烧杯中，其中将油倾析出。将剩余的油和重相置于50 mL离心管中和旋转。将管中剩余的油弃去和将液体重相合并。重相是无色的，没有可辨别的有色色素。

反应16 - CHL26

反应16是反应15的重复，除了使用15克的CHL26之外。

反应9-16的结果以及来自反应9和10和来自反应11和12的合并和混合油的结果显示在表9和图6中。

表9和图6的结果显示，与参考叶绿素酶酶ELDC94相比，具有焦脱镁叶绿素酶的酶CHL26转化更大量的叶绿素底物(叶绿素、脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素)为其叶绿素产物(叶绿素酸酯、脱镁叶绿甲酯酸、焦脱镁叶绿甲酯酸)。

表9. 在碱法精制后和在用CHL26酶和ELDC94 (参考)酶处理后在一次精制低芥酸菜籽油(ORCAN)和一次精制大豆油(ORSBO)中的叶绿素衍生物(底物和产物)

表10的结果显示在上述酶促处理后在一次精制低芥酸菜籽油和一次精制大豆油中的游离脂肪酸(FFA)、皂和磷以及Ca、Mg的含量。

表10. 在碱法精制后和在用CHL26酶和ELDC94 (参考)酶处理后一次精制低芥酸菜籽油(ORCAN)、一次精制大豆(ORSBO)油的组成

。

Claims (41)

1.一种处理包含叶绿素底物的油的方法，所述方法包括使所述油与具有脱色酶活性的多肽或包含该多肽的组合物接触，其中所述多肽选自：

a. 与SEQ ID NO: 1的氨基酸1-318具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%或100%同一性的多肽；和

b. 由与SEQ ID NO: 2的核酸序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%或100%同一性的核酸序列编码的多肽。

2.权利要求1的方法，其中所述多肽具有叶绿素酶活性、脱镁叶绿素酶活性、焦脱镁叶绿素酶活性或其组合。

3.权利要求1的方法，其中所述油包含基于三酰基甘油的油，其选自低芥酸菜籽油、蓖麻油、椰子油、芫荽油、玉米油、棉籽油、榛子油、大麻籽油、亚麻籽油、芒果仁油、白池花油、牛脚油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精、花生油、菜籽油、米糠油、红花油、山茶油、芝麻油、大豆油、葵花籽油、妥尔油、椿花油、植物油和来自藻类的油。

4.权利要求1的方法，其中所述油包含来自藻类的油。

5.权利要求1的方法，其中所述油包含选自未脱胶原油、脱胶油、碱法精制油、碱法精制和水洗油或水脱胶油的油。

6.权利要求1的方法，其中与处理之前所述油中的叶绿素底物的总浓度相比，所述处理减少所述油中的叶绿素底物的总浓度至少5重量%。

7.权利要求6的方法，其中与处理之前所述油中的叶绿素底物的总浓度相比，所述处理减少所述油中的叶绿素底物的总浓度至少50重量%。

8.权利要求1的方法，其中所述叶绿素底物包含焦脱镁叶绿素，和焦脱镁叶绿素的至少一部分被转化为焦脱镁叶绿甲酯酸。

9.权利要求8的方法，其中与处理之前所述油中的焦脱镁叶绿素的总浓度相比，所述处理减少所述油中的焦脱镁叶绿素的浓度至少5重量%。

10.权利要求9的方法，其中与处理之前所述油中的焦脱镁叶绿素的总浓度相比，所述处理减少所述油中的焦脱镁叶绿素的浓度至少50重量%。

11.权利要求1的方法，其中所述叶绿素底物包含脱镁叶绿素，和脱镁叶绿素的至少一部分被转化为脱镁叶绿甲酯酸。

12.权利要求11的方法，其中与处理之前所述油中的脱镁叶绿素的总浓度相比，所述处理减少所述油中的脱镁叶绿素的浓度至少5重量%。

13.权利要求12的方法，其中与处理之前所述油中的脱镁叶绿素的总浓度相比，所述处理减少所述油中的脱镁叶绿素的浓度至少50重量%。

14.权利要求1的方法，其中所述叶绿素底物包含叶绿素，和叶绿素的至少一部分被转化为叶绿素酸酯。

15.权利要求14的方法，其中与处理之前所述油中的叶绿素的总浓度相比，所述处理减少所述油中的叶绿素的浓度至少5重量%。

16.权利要求15的方法，其中与处理之前所述油中的叶绿素的总浓度相比，所述处理减少所述油中的叶绿素的浓度至少50重量%。

17.权利要求1的方法，其中所述多肽在45℃-70℃的温度下与所述油接触。

18.权利要求17的方法，其中所述多肽在50℃-65℃的温度下与所述油接触。

19.权利要求1的方法，其中所述多肽在2-10的pH下与所述油接触。

20.权利要求19的方法，其中所述多肽在4.0-7.5的pH下与所述油接触。

21.权利要求1的方法，其中所述多肽与所述油接触1.5小时-6小时。

22.权利要求21的方法，其中所述多肽与所述油接触2小时。

23.权利要求1的方法，其中以1-50 U/g油的量将所述多肽投配至油中。

24.权利要求1的方法，其包括使所述油与所述多肽和水接触，并搅拌0.5-24小时，其中所述油包含未脱胶原油。

25.权利要求1的方法，其包括使所述油与所述多肽、水和另外的酶接触，并搅拌0.5-24小时，其中所述油包含未脱胶原油。

26.权利要求25的方法，其中所述另外的酶选自PLC、PI-PLC和其组合。

27.权利要求1的方法，其包括使所述油与所述多肽、水和任选地另外的酶在4-8的pH下接触；搅拌得到的油0.5-24小时；和在搅拌后将PLA酶加入所述油。

28.权利要求27的方法，其中所述另外的酶选自PLC、PI-PLC和其组合。

29.权利要求27的方法，其中所述PLA酶是PLA1酶。

30.权利要求27的方法，其中在加入PLA1酶后搅拌所述油1-8小时。

31.权利要求1的方法，其包括使所述油与所述多肽和水接触，并搅拌得到的油，其中所述油包含一次精制油。

32.权利要求1的方法，其进一步包括用选自磷脂酶、脱镁叶绿素酶、焦脱镁叶绿素酶、叶绿素酶和其组合的另外的酶处理所述油。

33.一种处理包含焦脱镁叶绿素的油的方法，其包括使所述油与具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽或包含该多肽的组合物接触，其中焦脱镁叶绿素被转化为焦脱镁叶绿甲酯酸，和任选地其中脱镁叶绿素被转化为脱镁叶绿甲酯酸，和其中所述多肽选自：

a. 与SEQ ID NO: 1的氨基酸1-318具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%或100%同一性的多肽；和

b. 由与SEQ ID NO: 2的核酸序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%或100%同一性的核酸序列编码的多肽。

34.根据权利要求33的方法，其中所述油包含植物油或藻类油。

35.根据权利要求34的方法，其中所述植物油包含低芥酸菜籽油、玉米油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、花生油、菜籽油、米糠油、芝麻油、大豆油和/或葵花籽油。

36.根据权利要求33-35中任一项的方法，其进一步包括用具有磷脂酶、脱镁叶绿素酶和/或叶绿素酶活性的酶处理所述植物油。

37.根据权利要求33-36中任一项的方法，其中所述方法进一步包括除去焦脱镁叶绿甲酯酸和/或脱镁叶绿甲酯酸。

38.通过根据权利要求1-37的方法可获得的植物油。

39.一种处理包含叶绿素底物的油的方法，所述方法包括使所述油与具有脱色酶活性的多肽或包含该多肽的组合物接触，其中与处理之前所述油中的叶绿素底物的总浓度相比，所述处理减少所述油中的叶绿素底物的总浓度至少5重量%。

40.一种处理包含叶绿素底物的油的方法，所述方法包括使所述油与具有脱色酶活性的多肽或包含该多肽的组合物、水和任选地另外的酶在4-8的pH下接触；搅拌得到的油0.5-24小时；和在搅拌后将PLA酶加入所述油。

41.权利要求40的方法，其中所述另外的酶选自PLC、PI-PLC、PLA和其组合。

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