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CN111712566A - 用于筛选靶基因变体的方法 - Google Patents

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CN111712566A
CN111712566A CN201980012416.6A CN201980012416A CN111712566A CN 111712566 A CN111712566 A CN 111712566A CN 201980012416 A CN201980012416 A CN 201980012416A CN 111712566 A CN111712566 A CN 111712566A
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CN
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unidirectional
promoter
variant
cells
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CN201980012416.6A
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A·法鲁吉奥
R·雁如·蔡
孔令洁
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Applied StemCell Inc
Original Assignee
Applied StemCell Inc
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Abstract

提供了用于在真核系统中筛选所需的靶基因变体的方法。还提供了用于筛选所需的靶基因变体的组合物。

Description

用于筛选靶基因变体的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年02月08日提交的美国临时申请号62/628,236的优先权，其公开的内容通过引用并入本申请
技术领域
本发明一般地涉及用于筛选所需的靶基因变体的组合物和方法。
背景技术
变体表达文库平台为研究基因型与表型之间的关系提供了有力的工具。在典型的基于变体表达文库的测定中，将成千上万的变体引入模型系统，施加选择压力，并测量选择期间变体频率的变化。已将这种方法用于测量基因组中所有可能的基因缺失的影响(Shalem O等，Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout,Science(2014)343:84-88；Want T等，Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system,Science(2014)343:80-84)或所有可能的蛋白单突变的影响(Fowler DM和Fields S,Deep mutationalscanning a new style of protein science,Nat Methods(2014)11:801-807)。变体表达文库平台还可用于筛选具有所需表型的变体，例如具有改变的特异性或增强的活性的酶变体，其在生物工程中具有巨大的应用。
基于变体表达文库的测定要求每个细胞或生物体都含有确定的遗传改变，所述改变必须在整个实验中保持稳定。尽管某些系统(如细菌和酵母)能够通过使用单个质粒转化每个细胞来满足这些要求，但很难建立能够以所需规模在每个细胞上引入单一且稳定的变体的哺乳动物系统(例如，使用人细胞)。质粒转染是最简单的选择，会导致将数百或数千个质粒不稳定地导入每个细胞。低滴度病毒(例如，慢病度)感染虽然导致在一些细胞中单一变体的稳定整合，但由于随机病毒整合而增加了噪音且混淆比较结果，从而表现出差异很大的表达。CRISPR/Cas系统提供了一个选择，可以避免每个细胞中多个变体和随机插入的问题，但是受到敲入效率低的限制，特别是对于大尺寸变体而言。因而，需要用于基于哺乳动物细胞的变体表达文库平台的新系统和方法。
发明内容
在一个方面中，本公开内容提供了一种筛选所需的靶基因变体的方法。在一个实施方式中，所述方法包括：(1)获得细胞系，所述细胞系在基因组基因座包含被位点特异性单向重组酶识别的第一单向重组位点；(2)通过下述方法产生细胞文库(i)向所述细胞系引入核酸构建体文库，每个核酸构建体包含：(a)由所述位点特异性单向重组酶识别的第二单向重组位点，和(b)靶基因变体，其中至少一个所述核酸构建体包含所需的靶基因变体，(ii)在所述细胞系中表达所述位点特异性单向重组酶，和(iii)将所述细胞系保持在促进由所述位点特异性单向重组酶介导的所述第一单向重组位点与所述第二单向重组位点之间重组的条件下；和(3)从所述细胞文库选择在其基因组中包含所述所需的靶基因变体的细胞。
在某些实施方式中，所述特异性基因组基因座是Hipp11(H11)基因座。
在某些实施方式中，所述位点特异性单向重组酶是Bxb1整合酶。在某些实施方式中，所述Bxb1整合酶是使用构建体表达的，所述构建体包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述细胞系在所述基因组基因座还包含：第一启动子和第二启动子。在某些实施方式中，所述第一启动子是Tet-on启动子。在某些实施方式中，所述第二启动子是EF-1α启动子。
在某些实施方式中，所述细胞系来源于HEK293细胞。
在某些实施方式中，所述靶基因是酶。在某些实施方式中，所述靶基因是第二位点特异性单向重组酶。在某些实施方式中，所述第二位点特异性单向重组酶是phiC31整合酶。在某些实施方式中，所述第二位点特异性单向重组酶的变体识别变体单向重组位点。
在某些实施方式中，所述选择步骤包括
向所述细胞文库引入选择构建体，其中所述选择构建体包含
第三单向重组位点，
第三启动子，
第四单向重组位点，和
选择标记物，
其中所述第三单向重组位点和所述第四单向重组位点的至少一个是变体，所述变体不被所述第二位点特异性单向重组酶所识别，但是被所述所需的第二位点特异性单向重组酶变体所识别，和
其中所述第三启动子和所述选择标记物以相反方向排列，
将所述细胞文库保持在促进由所述所需的第二位点特异性单向重组酶变体介导的所述第三单向重组位点与所述第四单向重组位点之间重组的条件下，从而反转所述第三启动子或所述选择标记物在所述选择构建体中的所述方向，和
选择表达所述选择标记物的所述细胞。
在某些实施方式中，所述靶基因是Cas蛋白。
在某些实施方式中，所述Cas蛋白的变体识别变体前间区序列邻近基序(PAM)，或具有较高的靶上特异性或具有较低的免疫原性。
在某些实施方式中，所述靶基因是病毒衣壳基因。在某些实施方式中，所述病毒衣壳基因是AAV衣壳基因。在某些实施方式中，所述病毒衣壳基因的所述变体具有包装尺寸>4.7kb DNA的更好的包装能力或增加对靶细胞/组织的感染性。
在某些实施方式中，所述方法还包括从所述细胞产生编码所述所需的靶基因变体的核酸。
在另一个方面中，本公开内容提供了根据本文所述的方法选择的细胞。
在另一个方面中，本公开内容提供了根据本文所述的方法产生的核酸。
在又一个方面中，本公开内容提供了一种用于生产所需靶基因变体的试剂盒。在一个实施方式中，所述试剂盒包含：(i)细胞系，在基因组基因座包含：由位点特异性单向重组酶识别的第一单向重组位点；(ii)核酸构建体，其包含被所述位点特异性单向重组酶识别的第二单向重组位点；和(iii)用于产生靶基因的变体文库的试剂。
附图说明
并入本文的附图构成了说明书的一部分。结合该书面描述，附图还用于解释原理，并使相关领域的技术人员能够实现和使用本发明。
图1示出了本公开内容中提供的用于评价基因座的高效整合效率的方法。
图2中示出了具有双重爪蟾NLS密码子优化的Bxb1基因的核苷酸序列。
图3示出了使用具有双重爪蟾NLS密码子优化的Bxb1基因的高整合效率。
图4示出了靶位点A和一系列中间位点A的序列。
图5示出了含有变体phiC31整合酶基因的构建体。
图6示出了包含整合酶变体的细胞文库的产生。
图7示出了一种从图6的细胞文库筛选识别变体假重组位点的整合酶变体的方法。
图8示出了一种筛选能够更好地包装更大尺寸DNA的突变AAV衣壳基因的方法。
具体实施方式
在更详细地描述本公开内容之前，应当理解的是，本公开内容不限于所描述的特定实施方式，并且因此当然可以变化。还应当理解的是，本文中使用的术语仅处于描述特定实施方式的目的，而无意于限制本发明，因为本公开内容的范围将仅由所附权利要求所限定。
除非另外定义，否则本申请使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本申请所述的那些类似或等同的任何方法和材料也可以用于实施或检测本公开内容，但是目前描述的是优选的方法和材料。
本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本申请，如同每个单独的出版物或专利被具体和单独地指出通过引用并入并且通过引用并入本申请以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用是针对其在申请日之前公开的内容，并且不应将其解释为承认由于在先的公开使得本公开内容无权先于此类出版物。此外，所提供的公开日期可能与可能需要单独确认的实际公开日期是不同的。
本领域技术人员在阅读本公开内容之后将是显而易见的是，本申请所描述和示出的每个单独的实施方式具有离散的组件和特征，在不脱离本公开内容的范围或主旨的前提下，其可以容易地与任意其他若干实施方式的特征分离或组合在一起。任何列举的方法可以按照所述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序进行。
定义
提供以下定义以帮助读者。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语、符号和其他科学或医学术语或术语旨在具有化学和医学领域技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚起见和/或易于参考，在此定义了具有通常理解含义的术语，并且在本文中包括这样的定义不应该被解释为表示与本领域通常理解的术语定义之间具有实质性差异。
如在本申请中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数形式。
如在本申请中所使用的，“细胞”可以是原核细胞或真核细胞。原核细胞包括例如细菌。真核细胞包括例如真菌、植物细胞和动物细胞。动物细胞(例如，哺乳动物细胞或人细胞)的类型包括例如来自循环/免疫系统或器官的细胞(例如，B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、T辅助细胞)、自然杀伤细胞、粒细胞(例如，嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和多叶核嗜中性粒细胞)、单核细胞或巨噬细胞、红细胞(例如，网织红细胞)、肥大细胞、血小板或巨核细胞和树突状细胞)；来自内分泌系统或器官的细胞(例如，甲状腺细胞(例如，甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺细胞(例如，甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞)，肾上腺细胞(例如，嗜铬细胞)和松果体细胞(pineal cell)(例如，松果体细胞,pinealocyte))；来自神经系统或器官的细胞(例如，成胶质细胞(例如，星形胶质细胞和少突胶质细胞)、小胶质细胞、巨细胞神经分泌细胞、星状细胞，伯特歇尔(boettcher)细胞和垂体细胞(例如，促性腺激素、皮质激素、促甲状腺素、促生长激素和催乳激素细胞))；来自呼吸系统或器官的细胞(例如，肺细胞(I型肺细胞和II型肺细胞)、克拉拉(clara)细胞、杯状细胞、肺泡巨噬细胞)；来自循环系统或器官的细胞(例如，心肌细胞和周细胞)；来自消化系统或器官的细胞(例如，胃主细胞、壁细胞、杯状细胞、潘氏(paneth)细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞、肠内分泌细胞、肠嗜铬细胞、APUD细胞、肝脏细胞(例如，肝细胞和枯否(Kupffer)细胞))；来自表皮系统或器官的细胞(例如，骨细胞(例如，成骨细胞、骨细胞和破骨细胞)、牙齿细胞(例如，成牙骨质细胞和成釉细胞)、软骨细胞(例如，成软骨细胞和软骨细胞)、皮肤/毛发细胞(例如，毛细胞、角质形成细胞和黑素细胞(痣细胞))、肌肉细胞(例如，肌细胞)、脂肪细胞、成纤维细胞和肌腱细胞)；来自泌尿系统或器官的细胞(例如，足细胞、肾小球旁细胞、肾小球内系膜细胞、肾小球外系膜细胞、肾近端小管刷状缘细胞和致密斑细胞)，以及来自生殖系统或器官的细胞(例如，精子、睾丸支持细胞、睾丸间质细胞、卵子和卵母细胞)。细胞可以是正常的、健康细胞；或者患病的或不健康的细胞(例如，癌细胞)。细胞还包括哺乳动物受精卵或干细胞，其包括胚胎干细胞、胎儿干细胞、诱导多能干细胞和成体干细胞。干细胞是能够经历细胞分裂周期，同时保持未分化状态并分化成特化细胞类型的细胞。干细胞可以是全能干细胞、多能干细胞(pluripotentstem cell)、多潜能干细胞(multipotent stem cell)、寡能干细胞和单能干细胞，其中任何一种都可以从体细胞诱导。干细胞还可以包括癌症干细胞。哺乳动物细胞可以是啮齿动物细胞，例如小鼠、大鼠、仓鼠细胞。哺乳动物细胞可以是兔形目细胞，例如兔细胞。哺乳动物细胞也可以是灵长类动物细胞，例如人细胞。
“编码序列”或“编码”选定多肽的序列是当置于适当调控序列(或“控制元件”)的控制之下例如在体内被转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA)成多肽的核酸分子。编码序列的边界通常由在5’(氨基)末端的起始密码子和在3’(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA、来自病毒或原核DNA的基因组DNA序列，以及甚至合成DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3’端。其他“控制元件”也可以与编码序列相关联。可以通过使用选定细胞所优选的密码子代表所需多肽编码序列的DNA拷贝，来对编码多肽的DNA序列在选定细胞中的表达进行优化。
在氨基酸序列或多核苷酸序列的上下文中(例如，核酸序列“来源于”野生型attP)，“来源于”指所述多肽或核酸具有基于该参照多肽或核酸(例如，天然存在的phiC31整合酶或编码核酸)的序列，并且并不意味着对所制备蛋白或核酸的来源和方法的限制。如果第一多肽(i)由第一多核苷酸编码，所述第一多核苷酸来源于编码第二多肽的第二多核苷酸或(ii)显示与第二多肽的序列同一性，则第一多肽“来源于”第二多肽。
如在本文中所使用的，“Hipp11(H11)基因座”指“安全港”基因组基因座，其允许基因表达而不破坏内部基因功能。在小鼠中，H11基因座位于Eif4enif1和Drg1基因之间的基因间区域内，其靠近11号染色体的着丝粒(B Tasci等，Proc Natl Acad Sci USA(2011)108:7902-07)。人H11基因座位于人染色体22q12.2，在DRG1和EIF4ENIF1基因之间(F Zhu等，Nucleic Acids Res(2014)42:e34)。
在将核酸序列插入细胞的背景下，术语“引入”指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括将核酸序列掺入真核或原核细胞，其中核酸序列可以瞬时存在于细胞中，或者可以掺入细胞基因组中(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转化成自主复制子。可以使用本领域公知的任何方法将本公开的核酸构建体引入细胞。可以使用转化动物细胞的各种技术，包括例如：显微注射、逆转录病毒介导的基因转移、电穿孔、转染等(参见例如，Keown等，Methods in Enzymology 1990,185:527-537)。
如在本文中所使用的，“基因座”指在染色体上的特定位置。已知基因座可以包含已知的遗传信息，如一个或多个多态性标记位点。
术语“可操作地连接”指其中所述的组件被配置为执行其通常功能的元件排列。在启动子的情况下，与编码序列可操作地连接的启动子将指引所述编码序列的表达。启动子或其他控制元件不需要与编码序列连续，只要其起到指引其表达的作用即可。例如，在启动子序列和编码序列之间可以存在介入的未翻译但转录的序列，并且仍可以将启动子序列认为是与编码序列“可操作地连接”。
术语“核酸构建体”指已经构建为包含一个或多个自然界中未发现的功能单元的核酸序列。实例包括环状、双链、染色体外DNA分子(质粒)、粘粒(包含来自λ噬菌体的COS序列的质粒)、包含非天然核酸序列的病毒基因组等。
在本文中所使用的术语“过表达”指基因表达水平过高，其产生基因相关表型。基因的过表达能够导致编码核酸的拷贝数增加，或mRNA转录物或蛋白水平升高，或转录物和/或蛋白的降解减少。
如在本申请中所使用的，“启动子”和“启动子-增强子”序列是指与RNA聚合酶结合并开启转录的核酸控制序列的阵列。启动子包含转录起始位点附近的必要核酸序列，如TATA元件(就II型聚合酶启动子而言)。启动子-增强子还任选地包含远端增强子或阻遏物元件，其可以位于距转录起始位点多达数千碱基对的位置。启动子通过指定转录哪条DNA链来确定转录物的极性。真核启动子是被RNA聚合酶II所利用的序列的复杂排布。通用转录因子(GTFS)首先在起点附近结合特定序列，然后募集RNA聚合酶II的结合。除了这些最小的启动子元件以外，小序列元件还被调控给定启动子活性的模块化DNA结合/反式激活蛋白(例如，AP-1、SP-1)特异性识别。病毒启动子起着与细菌或真核启动子相同的功能，并提供反式的特异性RNA聚合酶(噬菌体T7)或募集细胞因子和RNA聚合酶(SV40、RSV、CMV)。而且，启动子可以是组成性的或可调控的。可诱导元件是与启动子一起起作用并可以结合阻遏物或诱导物的DNA序列元件。在这种情况下，转录实际上是“关闭”的，直到启动子被去抑制化或诱导为止，此时转录被“开启”。真核启动子的实例包括但不限于下述：小鼠金属硫蛋白I基因序列的启动子(Hamer等，J.Mol.Appl.Gen.(1982)1:273-288)；疱疹病毒的TK启动子(McKnight,Cell(1982)31:355-365)；SV40早期启动子(Benoist等，Nature(1981)290:304-310)；酵母gall基因序列启动子(Johnston等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1982)79:6971-6975；Silver等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1984)81:5951-59SS)、CMV启动子、EF-1启动子、蜕皮激素响应性启动子、四环素响应性启动子等。
在通常情况下，“蛋白”是多肽(即，通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸的串)。蛋白可以包含氨基酸之外的部分(例如，可以是糖蛋白)和/或可以以其他方式加工或修饰。本领域普通技术人员将意识到，“蛋白”可以是由细胞生产的完整多肽链(具有或不具有信号序列)，或者可以是其功能性部分。本领域普通技术人员还将意识到，蛋白有时可以包含一条以上多肽链，例如通过一个或多个二硫键连接或以其他方式结合。
“假重组位点”是被重组酶识别的DNA序列，使得识别位点与野生型重组酶识别序列在一个或多个碱基对上不同和/或作为内源性序列所存在的基因组不同于重组酶野生型识别序列所在的基因组。
“假attP位点”或“假attB位点”指分别类似于噬菌体整合酶的野生型噬菌体或细菌附着位点序列的假位点。“假att位点”是更通用的术语，可以指代假attP位点或假attB位点。
如在本文中所使用的，术语“重组酶”或“位点特异性重组酶”指促进DNA在特定靶位点之间重排的高度特异性的酶家族(Greindley等，2006；Esposito,D.和Scocca,J.J.Nucleic Acids Research(1997)25,3605-3614；Nunes-Duby,S.E.等，Nucleic AcidsResearch(1998)26,391-406；Stark,W.M.等，Trends in Genetics(1992)8,432-439)。实际上，可以将所有位点特异性重组酶归类于两个结构和机制上不同的组中的一个：酪氨酸(例如，Cre、Flp和λ整合酶)或丝氨酸(例如，phiC31整合酶、γ-δ解离酶、Tn3解离酶和Gin转化酶)重组酶。两个重组酶家族均识别由两个反向重复的结合元件组成的靶位点，所述两个反向重复的结合元件位于在其中发生DNA断裂和再连接的间隔序列的侧翼。重组过程需要两个重组酶单体同时结合至每个靶位点：两个DNA结合二聚体(四聚体)，然后连接形成联会复合体(synaptic complex)，导致交叉和链交换。特别地，重组酶能够识别目标基因组中的内源性序列。
“单向重组酶”或“整合酶”指在重组发生后其识别位点被破坏的重组酶。换言之，重组酶识别的序列发生重组后变成重组酶不识别的序列。结果，一旦序列通过单向重组酶进行重组，重组酶的持续存在就不能逆转此前的重组事件。
如在本文中所使用的，“选择标记物”或“选择性标记物”指某种基因，其在细胞中的表达允许细胞在特定培养条件下富集或耗竭。在靶细胞群中，选择性标记物可以是外源基因或不是天然表达的细胞基因，或是虽然天然表达但水平不适合的基因。如果基因的表达使得细胞在特定条件下被富集，则选择性标记物是“正选择性标记物”。通常，正选择性标记物是编码抗生素抗性并选择(包括将抗生素引入培养物)表达选择标记物的那些细胞的基因。在使用中，抗生素的应用选择性地杀死或消灭了不表达标记物的细胞，而留下相对于表达抗生素抗性的那些纯化或富集的细胞群。正选择性标记物的实例包括氨基糖苷磷酸转移酶(新霉素抗性基因)、嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶(嘌呤霉素抗性基因)、潮霉素抗性基因和杀稻瘟素S脱氨酶(杀稻瘟素S抗性基因)。正选择性标记物的其他实例包括可用于通过细胞分选进行选择的基因，例如荧光蛋白(例如GFP和RFP)和细胞表面标记物。相反，如果基因的表达使得细胞在特定培养条件下被消耗，则选择性标记物是“负选择性标记物”。负选择性标记物的实例包括胸苷激酶基因。在使用中，更昔洛韦的应用杀死表达胸苷激酶的细胞。负选择性标记物的其他实例包括DT毒素、细胞死亡基因(如TRAIL)、半胱天冬酶和BCL2家族基因。
当用于描述两条多核苷酸序列时，术语“顺序地”指两条序列不重叠，而第一条序列可以位于第二条序列的上游(5’)或下游(3’)。
如在本文中所使用的，术语“对象”和“患者”可以互换使用。对象是动物，优选地哺乳动物，如非灵长类动物(例如，奶牛、猪、马、猫、犬、大鼠、小鼠等)和灵长类动物(例如，猴(例如，恒河猴、食蟹猴或黑猩猩)和人)，以及最优选地是人。
“转录物”指由基因转录形成的mRNA用于蛋白表达。通过差异剪接由相同DNA片段形成一种或多种转录物变体。在这样的过程中，可以在信使mRNA(mRNA)中包含或排除基因的特定外显子，从而导致翻译的蛋白包含不同氨基酸和/或具有不同生物学功能。
术语“转基因”指引入宿主细胞(例如，HEK293细胞)的外源性多核苷酸，与用于引入的方法无关。这些方法包括本领域公知的那些，包括载体介导的基因转移(例如，通过病毒感染/转染，或各种其他基于蛋白或基于脂质的基因递送复合物)，以及促进“裸”多核苷酸递送的技术(如电穿孔、“基因枪”递送和用于引入多核苷酸的各种其他技术)。
当与基因、核苷酸序列或蛋白结合使用时，术语“变体”指至少一个核苷酸或氨基酸残基与参照或原始基因、核苷酸序列或蛋白不同的基因、核苷酸序列或蛋白。在某些情况下，术语“变体”可以与术语“突变体”互换使用。
筛选靶基因变体的方法
在一个方面中，本公开内容涉及筛选所需的靶基因变体的方法。
如在本文中所使用的，“筛选”指用于在变体群中鉴定和选择具有所关注的表型或功能的基因变体的实验技术。
如在本文中所使用的，“基因”指编码具有功能的分子(例如，多肽或RNA)的DNA或RNA序列。在基因表达过程中，DNA首先被转录成RNA，该RNA可以直接发挥功能，也可以充当执行功能的多肽的中间模板。基因可以在其序列中获得突变，从而产生不同的变体。每个变体可以编码形式略有不同的多肽，其执行不同功能。
在一个实施方式中，筛选方法包括获得细胞系，该细胞系在基因组基因座包含被位点特异性单向重组酶识别的第一单向重组位点。在一些实施方式中，筛选方法进一步包括使用包含单向重组位点和核酸构建体文库的细胞系产生细胞文库，每个核酸构建体包含被位点特异性单向重组酶识别的第二单向重组位点以及靶基因变体。
在一些实施方式中，包含重组位点的基因组基因座是提供包含在该区域中的转基因表达增加的区域。此类基因座的实例包括但不限于ROSA26、ROSA26样基因座、HPRT、AAVS1和Hipp11(H11)。在一个优选的实施方式中，基因座是H11。
重组位点
本发明方法中使用的重组位点包括被单向位点定向重组酶识别的那些，如Bxb1、phiC31、TP901-1和R4、野生型或其变体。还可以使用在US 2010/0190178中描述的由重组酶识别的任何位点。
传统上将噬菌体整合酶作为重组酶(如Bxb1整合酶)的结合位点称为attB和attP(即，整合酶的靶位点)。这些位点具有约34-40个碱基对(bp)的最小长度(GrothAC等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97,5995-6000(2000))。这些位点通常被如下排布：attB以attB5’-核心区-attB3’的相对顺序包含第一DNA序列attB5’、核心区和第二DNA序列attB3’。attP以attP5’-核心区-attP3’的相对顺序包含第一DNA序列(attP5’)、核心区和第二DNA序列(attP3’)。重组酶介导产生的重组产物位点不能再用作重组酶底物。重组产物位点包含例如相对顺序attB5’-重组产物位点-attP3’和attP5’-重组产物位点-attB3’。当重组位点被Bxb1识别时，这些位点可以是天然attP/attB序列的变体，如串联重复序列(例如，三个重复序列，如attPx3)、截短的序列或者两者。在一些实施方式中，第一重组位点和第二重组位点分别是attP和attB，反之亦然。
在本公开内容方法中使用的重组位点还可以包括例如双向重组位点，如FRT重组位点或loxP重组位点。
含有重组位点的细胞系
如在本文中所使用的，“细胞系”指来源于单个细胞的细胞培养物并因此由具有均匀遗传组成的多个细胞组成。在一些实施方式中，在本方法中使用的细胞系是哺乳动物细胞系。在一个实施方式中，细胞系来源于HEK293细胞。
产生在靶基因座中包含目标重组位点的细胞系的方法是本领域公知的。参见例如，Duportet X等，“A platform for rapid prototyping of synthetic gene networksin mammalian cells.”Nucleic Acids Res.(2014)1；42(21):13440-51；和Matreyek K等，“A platform for functional assessment of large variant libraries in mammaliancells”Nucleic Acids Res(2017)45(11):e102。
通常地，建立包含目标重组位点的核酸构建体，所述目标重组位点的翼侧为靶基因座的同源臂。核酸构建体还可以包含促进细胞系产生的其他核酸片段，例如选择标记物序列。在一个实施方式中，核酸构建体含有潮霉素抗性标记物。
在一些实施方式中，核酸构建体还可以包含促进靶基因变体(如启动子序列)选择的其他核酸片段，其将与重组位点一起插入靶基因座。在一些实施方式中，核酸构建体包含四环素(Tet)响应性启动子和EF-1启动子。
当将含有目标重组位点的核酸构建体引入细胞中时，可以通过同源重组将重组位点插入靶基因座。在某些实施方式中，为了提高同源重组的效率，在细胞中表达位点特异性核酸酶以产生双链断裂。在一些实施方式中，位点特异性核酸酶是CRISPR/Cas蛋白、锌指核酸酶(ZFN)或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。
变体文库
使用核酸构建体文库将包含第一单向重组位点的细胞系用于生成细胞文库。在一些实施方式中，每个核酸构建体均包含被位点特异性单向核酸酶识别的第二单向重组位点以及靶基因变体。
产生靶基因变体的方法是本领域公知的。参见例如，Zhou YH等，“Randommutagenesis of gene-sized DNA molecules by use of PCR with Taq DNApolymerase.”Nucleic Acids Res.(1991)19(21):6052；Engler C等，“Golden GateShuffling:A One-Pot DNA Shuffling Method Based on Type IIs RestrictionEnzymes”PLoS One.2009；4(5):e5553；和Ashraf M等，“ProxiMAX randomization:a newtechnology for non-degenerate saturation mutagenesis of contiguous codons.”Biochem Soc Trans.(2013)41(5):1189-94。
Zhou YH等人报道了一种使用Taq DNA聚合酶进行随机诱变的简单方法，该方法缺乏3’-5’核酸外切编辑活性，因此容易出错(Nucleic Acids Res.(1991)19(21):6052)。Engler C等人开发了一种试验方案，可以将多个DNA片段组装到一个载体中，通过组合不同的母模板制备的几个片段集合，可以生成重组基因的文库(PLoS One.2009；4(5):e5553)。该试验方案可以将来源于不具有同源性的模板的DNA片段打乱，并可以用于在给定基因的任何部位引入任何变异。
Ashraf M等人开发了一种随机生成用于饱和诱变的DNA表达盒的方法，即用所有20个氨基酸的密码子代替野生型密码子，而不会发生简并或偏倚(Biochem Soc Trans.(2013)41(5):1189-94，其通过引用并入本文)。简言之，将在其末端带有随机密码子的双链DNA供体分别连接到双链DNA受体序列上，该序列仅在5’末端磷酸化。连接后，将产物扩增、纯化、定量，然后以所需比例合并。使用MlyI对合并后的产物进行消化，其产生由受体序列以及5’端随机密码子组成的双链DNA。然后，使用上一轮的双链DNA产物作为下一轮连接的受体，重复该过程。结果，可以将饱和诱变引入连续的密码子。
上述方法等的组合可以产生靶基因的任何和所有变体。
可以将靶基因的变体克隆到核酸载体上，以产生包含所有靶基因变体的核酸构建体文库。能够从其构建核酸构建体的适宜真核载体是本领域熟知的。参见例如，Broach,Cell(1982)28:203-204；Dilon等，J.Clin.Hematol.Oncol.(1980)10:39-48；Maniatis,In:Cell Biology:A Comprehensive Treatise,Vol.3,Gene Sequence Expression,AcademicPress,NY,pp.563-608,1980。
然后，将核酸构建体文库引入细胞系以产生细胞文库。可以使用本领域公知的方法(如转化或转染)将核酸构建体引入细胞系。在细胞系中表达识别重组位点的重组酶，其介导第一和第二重组位点之间的重组，从而将靶基因的变体并入细胞系的靶基因组基因座。在一些优选的实施方式中，调节核酸构建体文库的浓度，以便将单个变体引入每个细胞中。在一些实施方式中，可以使用选择标记物富集细胞文库。
选择所需的变体
可以将筛选方法设计为从细胞文库筛选所需的靶基因变体。
在一个实施方式中，当靶基因编码整合酶时，可以将筛选方法设计为选择识别重组位点(即，突变体重组位点)(例如，假重组位点)的变体的整合酶变体。在此类筛选方法中，产生选择构建体以包含：第三单向重组位点、第三启动子、第四单向重组位点和选择性标记物(例如，抗生素抗性基因)，其中第三和第四单向重组位点的至少一个是不被原始整合酶识别但被所需整合酶的变体识别的变体或突变体，其中第三启动子和选择性标记物以相反方向排列。
然后，将选择构建体引入包含整合酶基因变体的细胞文库。将转化的细胞文库保持在便于由所需的整合酶变体介导的第三和第四单向重组位点之间重组的条件下，从而反转在选择性构建体中第三启动子或选择性标记物的方向。反转方向后，第三启动子(或选择性标记物)随后引导选择性标记物表达(或当选择性标记物反转方向时，由第三启动子引导)。因此，当使转化的细胞文库经历选择性条件时(例如，在抗生素存在的条件下)，可以选择含有所需整合酶变体的细胞。
在另一个实施方式中，在靶基因是病毒衣壳基因(例如，AAV衣壳基因)的情况下，可以设计筛选方法以选择具有较大包装能力(例如，包装尺寸>4.7kb的DNA)或对靶细胞/组织的感染性增加的变体。参见例如，Ojala DS等，“In Vivo Selection of aComputationally Designed SCHEMA AAV Library Yields a Novel Variant forInfection of Adult Neural Stem Cells in the SVZ.”Mol Ther(2018)26(1):304-19，其通过引用并入本文。
在另一个实施方式中，其中靶基因是CRISPR/Cas蛋白。可以设计筛选方法，以选择识别变体前间区序列邻近基序(PAM)，或者具有较高的靶点特异性或较低的免疫原性的Cas蛋白变体。
逐步选择所需的变体
理论上，本文公开的方法可以通过使用足够大的变体文库产生任何和所有所需的变体。然而，实际上，由于变体文库的尺寸限制，如果所需变体与原始基因/蛋白在太多位置(例如，核苷酸残基或氨基酸残基)不同，则可能在一轮选择中找不到所需变体。因而，在某些实施方式中，本文公开的选择方法涉及通过产生一系列中间变体逐步选择所需的变体，每个中间变体与原始基因或在前一轮选择中产生的中间变体基因在几个位置上都不同。
在一个示例性实施方式中，本文所公开的方法选择能够识别突变体attP序列(例如，SEQ ID NO:3)的变体整合酶(例如，phiC31整合酶)。靶突变体attP序列与野生型attP位点在超过50％的核苷酸残基上是不同的，例如在48个核苷酸残基中有26个是不同的。为了获得识别靶突变体attP序列的变体整合酶，制备了中间突变体attP序列(例如，选自SEQ IDNOS:4-10的序列)，以鉴定识别来自突变体整合酶文库的中间突变体attP序列的中间变体整合酶。然后，将鉴定出的中间变体整合酶基因用作初始整合酶基因，以产生突变体整合酶文库，将其用于下一轮选择中，以鉴定识别靶突变体attP序列的变体整合酶或第二中间变体整合酶，所述第二中间变体整合酶识别第二中间突变体attP序列，其与上一轮选择中使用的中间突变体attP序列相比，与目标突变体attP更加相似。
试剂盒和组合物
在另一个方面中，本公开内容提供了用于筛选所需的靶基因变体的试剂盒和组合物。在一个实施方式中，试剂盒包含：(i)细胞系，在基因组基因座包含：由位点特异性单向重组酶识别的第一单向重组位点；(ii)核酸构建体，其包含被所述位点特异性单向重组酶识别的第二单向重组位点；和(iii)用于产生靶基因的变体文库的试剂。
此类试剂盒的组分可以包括但不限于容器、说明书、溶液、缓冲液、一次性用品和硬件。用于产生靶基因变体文库的试剂通常包含一种或多种核酸构建体，以及说明性材料，其公开了在构建用于本方法的变体文库的过程中使用这些构建体的手段。试剂盒还可以包含其他成分，以便于针对该试剂盒设计的特定应用(例如，阳性对照、阴性对照和/或体内报告基因的表达)。试剂盒可以另外地包含常规用于分子生物学、显微注射和通过PCR评估等的缓冲液和其他试剂。此类试剂盒和适当的内容物是本领域技术人员所熟知的。
已经出于说明和描述目的给出了本发明的前述描述。其并非旨在穷举或将本发明限制为所公开的精确形式。根据以上教导，其他修改和变化是可能的。选择和描述实施方式是为了最好地解释本发明的原理及其实际应用，从而使本领域的其他技术人员能够以各种实施例和适合于预期的特定用途的各种修改来最好地利用本发明。旨在将所附权利要求解释为包括本发明的其他替代实施方式；包括等效的组分、方法和手段。
应当意识到的是，发明内容和摘要部分可以阐述发明人所设想的一个或多个但并非本发明的所有示例性实施方式，因此，并非旨在以任何方式限制本发明和所附权利要求。
实施例
实施例1
本实施例说明了在H11基因座含有Bxb1 attP位点的细胞系的高整合效率。
如图1中所示，建立一个HEK293细胞系，使其含有降落场(landing pad)，以在基因间Hipp1(H11)基因座或AAVS1基因座处接收异源基因。降落场包含翼侧为Tet启动子和EF-1启动子的Bxb1 attP位点。
将核酸构建体转染至上述细胞系。该核酸构建体包含Bxb1 attB位点和GFP基因。在细胞系中表达Bxb1整合酶后，Bxb1 attB和attP位点之间的重组导致GFP基因在EF1启动子的控制下并入细胞系的基因组中。然后，使用流式细胞术测定GFP基因的表达。
如图1和下表1中所示，与AAVS1基因座相比，在H11基因座含有Bxb1 attP位点的细胞系显示出更高的整合效率。与报道的其他系统相比(整合效率约8％)，其整合效率提高的更为显著。参见Duportet X等，“A platform for rapid prototyping of synthetic genenetworks in mammalian cells.”Nucleic Acids Res.(2014)
1；42(21):13440-51；和Matreyek K等，“A platform for functionalassessment of large variant libraries in mammalian cells”Nucleic Acids Res(2017)45(11):e102。
表1：Bxb1整合效率总结
Figure BDA0002622947320000151
Figure BDA0002622947320000161
实施例2
本实施例说明了使用优化的Bxb1整合酶表达构建体的高整合效率。
为提高异源基因的整合效率，产生了Bxb1表达构建体，以包含具有优化的密码子的Bxb1基因和双重爪蟾核定位序列(NLS)(参见图2中的SEQ ID NO:1)。
将Bxb1表达构建体用于检测使用如实施例1中所述的HEK293细胞系(在H11基因座含有attP位点)和GFP报告构建体的整合效率。
如图3中所示，在存在浓度为700nM或1mM的VPA(丙戊酸)的条件下，Bxb1表达构建体的整合效率分别达到43.5％和45.2％，其远高于此前报道的整合效率(Duportet X等，Nucleic Acids Res.(2014)1；42(21):13440-51；和Matreyek K等，Nucleic Acids Res(2017)45(11):e102)。在不存在VPA的条件下，Bxb1表达构建体的整合效率达到27.6％(相比之下，在并行实验中，使用1mM VPA的整合效率为42.7％)。
实施例3
本实施例说明了一种筛选识别突变体attP位点的phiC31整合酶变体的方法。
基于下述标准选择靶突变体attP位点：1)GC含量为20-60％；2)其对称性地类似于野生型phiC31 attP位点；3)其在人类基因组中是独一无二的；4)其是基因间的；5)不靠近癌基因或抗癌基因；和6)其靠近高表达区或DNase I超敏位点。在这些标准下，选择了SEQID NO:3所示的位点A(图4)。
与具有被野生型phiC31整合酶所识别的48个核苷酸残基的野生型attP序列相比，位点A在22个核苷酸残基中是相同的。考虑到可能难以在一轮筛选中直接筛选识别位点A的phiC31整合酶变体，产生了用于筛选中间phiC31整合酶变体的一系列中间位点A序列(SEQID NOS:4-10)。
然后，重复使用易错PCR、使用ProxiMAX的两密码子饱和和杂交生成用于选择识别中间位点A4、A12和A13的突变体phiC31整合酶的突变体phiC31整合酶基因文库。如图5中所示，在突变体phiC31文库中的每个核酸构建体均含有Bxb1 attB位点、杀稻瘟素抗性标记物和突变体phiC31整合酶基因。
然后，将文库转化至如实施例1中所述的细胞系，以产生细胞文库。将如实施例2中所述的Bxb1表达构建体引入细胞文库以表达Bxb1整合酶。如图6中所示，在表达Bxb1整合酶后，Bxb1 attB和attP位点之间的重组导致在Tet启动子控制下在H11基因座中突变体phiC31整合酶的整合和在EF-1启动子控制下杀稻瘟抗性基因的整合。
为了筛选识别特定假-phiC31 attP位点的突变体phiC31整合酶，如图7中所示，产生了含有CMV启动子和GFP报告基因的选择构建体。CMV启动子的翼侧为假-phiC31 attP位点和phiC31 attB位点。CMV启动子和GFP报告基因方向相反，因此当假-phiC31 attP位点与phiC31 attB位点之间没有重组时，GFP报告基因不表达。
然后，将筛选构建体转染至细胞文库。如图7中所示，当细胞含有识别假-attP位点的变体phiC31整合酶时，在假-phiC31 attP位点与phiC31 attB位点之间发生重组，并且在选择构建体中CMV启动子的方向是相反的。然后，反向CMV启动子驱动GFP报告基因的表达。然后，通过FACS或甲壳素小珠结合分离GFP阳性细胞。扩增和分析在分离的细胞中存在的整合酶。富集和鉴定识别中间位点A12的潜在phiC31整合酶变体，并将其用于进行下一轮选择以鉴定出识别位点A的变体。
实施例4
本实施例说明了对更好地包装大尺寸DNA治疗盒(例如，BDD FVIII)的AAV衣壳突变体的筛选。
如图8中所示，生成在H11基因座含有如实施例3中所述的降落场的HEK293细胞系。
然后，将核酸构建体文库(供体)转化至细胞系，以产生细胞文库。每个核酸构建体含有Bxb1 attB位点、杀稻瘟素抗性标记物、突变体衣壳基因和治疗盒(例如，BDD FVIII盒)。在细胞系中表达Bxb1整合酶后，Bxb1 attB与attP位点之间的重组导致在H11基因座中引入了突变衣壳基因，其在Tet启动子的控制下，和治疗盒一起。
为了筛选所需的突变体衣壳基因，使用辅助构建体转染细胞系，以产生包装治疗盒的病毒。使用所产生的病毒感染靶细胞/组织，并且扩增和富集具有更高感染效率的那些。收集细胞/组织以提取含有所需衣壳突变体基因的DNA。
序列表
<110> 应用干细胞有限公司
<120> 用于筛选靶基因变体的方法
<130> 044903-8023WO01
<150> US 62/628,236
<151> 2018-02-08
<160> 10
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1561
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有双重爪蟾NLS的密码子优化的Bxb1基因
<400> 1
cgccaccatg gctagagccc tggtggtcat cagactgagc agagtgaccg acgccaccac 60
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gctgctgaga gtgctgttct gtgccgtgtg tggcgagcct gcctataagt ttgctggcgg 960
cggaagaaag caccccagat acaggtgtcg gagcatgggc ttccctaagc actgtggcaa 1020
tggcaccgtg gccatggctg agtgggatgc cttctgcgaa gaacaggtgc tggatctgct 1080
gggagatgcc gagcggctgg aaaaagtttg ggtggccgga agcgattccg ccgtggaact 1140
ggctgaagtg aatgccgagc tggtggacct gacaagcctg atcggaagcc ccgcctatag 1200
agccggatct cctcagagag aagccctgga cgccagaatt gctgccctgg ctgccagaca 1260
agaagaactc gaaggcctgg aagctagacc ctctggctgg gagtggcgag agacaggcca 1320
gagatttggc gactggtggc gcgaacagga taccgccgct aagaatacct ggctgcggtc 1380
catgaatgtg cggctgacct ttgatgtgcg cggaggcctg accagaacca tcgatttcgg 1440
cgacctgcaa gagtacgagc agcacctgag actgggcagc gtggtggaaa gactgcacac 1500
cggcatgagc aaaaggccgg cggccacgaa aaaggccggc caggcaaaaa agaaaaagta 1560
a 1561
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型phiC31 attP
<400> 2
gtagtgcccc aactggggta acctttgagt tctctcagtt gggggcgtag 50
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
gagcatcccc aacgaagagg actttcaggt ctccttattt gggaaaaccc 50
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 中间位点 A
<400> 4
gtagtgcccc aactggggta acttttaggt tctctcagtt gggggcgtag 50
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 中间位点 A2
<400> 5
gtagtgcccc aactgggagg acctttgagt ctcctcagtt gggggcgtag 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 中间位点 A3
<400> 6
gtagtgcccc aacgaaggta acctttgagt tctcttattt gggggcgtag 50
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 中间位点 A4
<400> 7
gtacatcccc aactggggta acctttgagt tctctcagtt gggaaaatag 50
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 中间位点 A5
<400> 8
gagctgcccc aactggggta acctttgagt tctctcagtt gggggcaccc 50
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 中间位点 A12
<400> 9
gtacatcccc aacgaaggta acctttgagt tctcttattt gggaaaatag 50
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 中间位点 A13
<400> 10
gagcatcccc aactggggta acctttgagt tctctcagtt gggaaaaccc 50

Claims (30)

1.一种筛选所需的靶基因变体的方法，所述方法包括：
(1)获得细胞系，所述细胞系在基因组基因座包含被位点特异性单向重组酶识别的第一单向重组位点；
(2)通过下述方法产生细胞文库
(i)向所述细胞系引入核酸构建体文库，每个核酸构建体包含：
(a)由所述位点特异性单向重组酶识别的第二单向重组位点，和
(b)靶基因变体，
其中至少一个所述核酸构建体包含所需的靶基因变体，
(ii)在所述细胞系中表达所述位点特异性单向重组酶，和
(iii)将所述细胞系保持在促进由所述位点特异性单向重组酶介导的所述第一单向重组位点与所述第二单向重组位点之间重组的条件下；和
(3)从所述细胞文库选择在其基因组中包含所述所需的靶基因变体的细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述特异性基因组基因座是Hipp11(H11)基因座。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述位点特异性单向重组酶是Bxb1整合酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述Bxb1整合酶是使用构建体表达的，所述构建体包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞系在所述基因组基因座还包含第一启动子和第二启动子。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第一启动子是Tet-on启动子。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述第二启动子是EF-1α启动子。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞系来源于HEK293细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶基因是酶。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶基因是第二位点特异性单向重组酶。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述第二位点特异性单向重组酶是phiC31整合酶。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述第二位点特异性单向重组酶的变体识别变体单向重组位点。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述选择步骤包括
向所述细胞文库引入选择构建体，其中所述选择构建体包含
第三单向重组位点，
第三启动子，
第四单向重组位点，和
选择标记物，
其中所述第三单向重组位点和所述第四单向重组位点的至少一个是变体，所述变体不被所述第二位点特异性单向重组酶所识别，但是被所述所需的第二位点特异性单向重组酶变体所识别，和
其中所述第三启动子和所述选择标记物以相反方向排列，
将所述细胞文库保持在促进由所述所需的第二位点特异性单向重组酶变体介导的所述第三单向重组位点与第四单向重组位点之间重组的条件下，从而反转所述第三启动子或所述选择标记物在所述选择构建体中的所述方向，和
选择表达所述选择标记物的所述细胞。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶基因是Cas蛋白。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述Cas蛋白的所述变体识别变体前间区序列邻近基序(PAM)，或具有较高的靶上特异性或具有较低的免疫原性。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶基因是病毒衣壳基因。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述病毒衣壳基因是AAV衣壳基因。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述病毒衣壳基因的所述变体具有包装尺寸>4.7kb DNA的更好的包装能力或增加对靶细胞/组织的感染性。
19.根据权利要求1所述的方法，还包括从所述细胞产生编码所述所需的靶基因变体的核酸。
20.根据权利要求1所述的方法选择的细胞，所述细胞在其基因组中包含所述所需的靶基因变体。
21.根据权利要求19所述的方法产生的核酸。
22.一种用于产生所需靶基因变体的试剂盒，其包含：
(i)细胞系，在基因组基因座包含：由位点特异性单向重组酶识别的第一单向重组位点；
(ii)核酸构建体，其包含被所述位点特异性单向重组酶识别的第二单向重组位点；和
(iii)用于产生靶基因的变体文库的试剂。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述特异性基因组基因座是Hipp11(H11)基因座。
24.根据权利要求22所述的试剂盒，还包含编码所述位点特异性单向重组酶的核酸。
25.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述位点特异性单向重组酶是Bxb1整合酶。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中使用构建体表达所述Bxb1整合酶，所述构建体包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列。
27.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述细胞系在所述基因组基因座还包含：第一启动子和第二启动子。
28.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述第一启动子是Tet-on启动子。
29.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述第二启动子是EF-1α启动子。
30.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述细胞系来源于HEK293细胞。
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