CN111712508B - 核酸单元及其聚合核酸与应用 - Google Patents
核酸单元及其聚合核酸与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了新型的可用于构建聚合核酸的核酸单元及可用于干扰目的基因表达的聚合核酸。本发明通过设计和构建新型的核酸单元及其自组装聚合核酸，实现了多靶标干扰，可用于抑制疾病发生或发展的信号通路中的多个基因表达，或同时抑制多个疾病靶基因表达，在生物学、化学等多个学科领域具有广阔的应用前景。该聚合核酸可实现同时靶向多个序列，所述序列可在一个基因中，或位于多个基因中。本发明优势在于：1)RNAi效能高；2)稳定性好；3)降低脱靶率；4)导入细胞能力增强；5)可模块化设计。
Description
技术领域
本发明属于核酸技术领域，具体涉及新型结构的核酸单元与其自组装聚合核酸，所述聚合核酸可干扰一个或多个目的基因的表达。
背景技术
CON(互补寡核苷酸)技术使得人工合成的寡核苷酸分子能够通过序列互补作用与靶向分子结合，并改变靶向分子的生物特性。CON技术包括RNAi(RNA干扰)技术和ASO(反义寡核苷酸)技术两大类，目前已广泛应用于功能基因组学研究，并有望成为除小分子化合物和生物制剂以外的第三大治疗手段。如用于治疗纯合子型家族性高胆固醇血症(homozygous familial hypercholesterolemia，FoFH)的米泊美生(mipomersen)，其是Genzyme研发的一种合成的硫代磷酸寡核苷酸，通过与Apo B-100蛋白mRNA的编码区互补配对，抑制Apo B-100蛋白(LDL和VLDL的主要载脂蛋白)的翻译合成，从而有效降低FoFH患者的LDL-C、TC、Non-HDL-C水平。尽管CON技术已经取得了一定成功，但这项技术仍有待完善之处。如传统的RNAi试剂有下述不足：1)繁琐的合成步骤及相对高的生产成本；2)对内切酶和外切酶高度敏感，稳定性不高；3)抑制有效率不够高，不能保证单个分子一定能抑制靶基因表达；4)非特异活性导致的副作用，该非特异性的作用主要源自正义链；5)难以导入细胞尤其是动物体内。
纳米技术研究的是直径在1～100nm纳米范围内物质的性质和应用。纳米结构物质所具有的小尺寸效应、表面效应、高扩散率等特性为科学研究和技术应用开拓了新领域。寡核苷酸结构灵活，如RNA结构，能够自我组装形成纳米结构。以DNA和RNA为代表的核酸纳米技术，是纳米技术领域发展的一个新方向。
发明公开
本发明要解决的技术问题是如何抑制或降低或干扰靶基因的表达。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种用于抑制或降低或干扰靶基因表达的聚合核酸分子。
本发明提供的用于抑制或干扰靶基因表达的聚合核酸分子由n条X型核酸分子组成；
每条所述X型核酸分子自5’端起依次由靶向片段一、靶向片段二和接头片段三组成。每条所述X型核酸分子的靶向片段一与其相邻的X型核酸分子的接头片段三互补配对。具体的，将n条X型核酸分子分别命名为X1单元、X2单元、X3单元，依次类推，Xn-1单元、Xn单元；所述X1单元的接头片段三与所述X2单元的靶向片段一互补配对(完全互补)，所述X2单元的接头片段三与所述X3单元的靶向片段一互补配对(完全互补)，依次类推，所述Xn-1单元的接头片段三与所述Xn单元的靶向片段一互补配对(完全互补)，所述Xn单元的接头片段三与所述X1单元的靶向片段一互补配对(完全互补)。每条所述X型核酸分子的靶向片段一与其他X型核酸分子序列均不互补。
每条所述聚合核酸分子的靶向片段一和靶向片段二均与靶基因互补配对；每条所述聚合核酸分子通过靶向片段一和靶向片段二与靶基因的特定序列结合，实现抑制或降低或干扰靶基因的表达。在某些特定的情况下，与靶基因序列互补的区域可以延长至接头片段三的部分序列。同一条X型核酸分子中的靶向片段一和靶向片段二可以相同，也可不同。两条不同的X型核酸分子中的靶向片段一或靶向片段二可以相同，也可不同。
每条所述X型核酸分子的长度相同(结构也相同)。
所述n为大于或等于3的整数。
在本发明的具体实施例中，所述n条X型核酸分子依次首尾相接(通过前一条X型核酸分子的接头片段三与下一条相邻的X型核酸分子的靶向片段一互补实现)，最终形成具有环状二级结构的聚合核酸分子。
上述聚合核酸分子中，所述n条X型核酸分子还可形成具有线性结构的聚合核酸分子，所述具有线性结构的聚合核酸分子还包括H型核酸分子；所述H型核酸分子由H1型核酸分子和Hn型核酸分子组成。
将n条X型核酸分子分别命名为X1单元、X2单元、X3单元，依次类推，Xn-1单元、Xn单元；所述X1单元的接头片段三与所述X2单元的靶向片段一互补配对，所述X2单元的接头片段三与所述X3单元的靶向片段一互补配对，依次类推，所述Xn-1单元的接头片段三与所述Xn单元的靶向片段一互补配对；所述H1型核酸分子与所述X1单元的靶向片段一互补配对；所述Hn型核酸分子与所述Xn单元的接头片段三互补配对。
进一步的，所述H型核酸分子的5’端或3’端还包括Hy片段；所述H型核酸分子由Hx片段和Hy片段组成。
所述H1型核酸分子与所述X1单元的互补区可延伸至所述X1单元的靶向片段二的部分或全部序列；所述Hn型核酸分子与所述Xn单元的互补区可延伸至所述Xn单元的靶向片段二的部分或全部序列。
所述H1型核酸分子的Hx片段与所述X1单元的靶向片段一互补配对；所述Hn型核酸分子的Hx片段与所述Xn单元的接头片段三互补配对；所述Hy片段与所述X1单元或所述Xn单元的靶向片段二自5’端或3’端起1个、2个或多个连续的核酸分子互补配对。
上述聚合核酸分子中，具有环状结构的聚合核酸分子还包括C型核酸分子；所述C型核酸分子由n个片段依次连接而成，n个片段分别为n条所述X型核酸分子中的靶向片段二的反向互补序列。具体的，所述C型核酸分子自3’端起依次由帽端片段1、帽端片段2、帽端片段3，依次类推，帽端片段Cn-1、帽端片段n组成；将n条X型核酸分子分别命名为X1单元、X2单元、X3单元，依次类推，Xn-1单元、Xn单元；
所述X1单元的接头片段三与所述X2单元的靶向片段一互补配对，所述X2单元的接头片段三与所述X3单元的靶向片段一互补配对，依次类推，所述Xn-1单元的接头片段三与所述Xn单元的靶向片段一互补配对，所述Xn单元的接头片段三与所述X1单元的靶向片段一互补配对；所述帽端片段1与所述X1单元的靶向片段二互补配对，所述帽端片段2与所述X2单元的靶向片段二互补配对，依次类推，所述帽端片段Cn-1与所述Xn-1单元的靶向片段二互补配对，所述帽端片段n与所述Xn单元的靶向片段二互补配对。
上述聚合核酸分子中，所述核酸分子(X型核酸分子、H型核酸分子或C型核酸分子)可为DNA或RNA或由DNA和RNA组成的寡核苷酸。
进一步的，所述核酸分子(X型核酸分子、H型核酸分子或C型核酸分子)为单链RNA分子。
上述聚合核酸分子中，所述X型核酸分子的长度为15-50nt，优选为24-36nt；
所述靶向片段一的长度为5-24nt；
所述靶向片段二的长度为1-20nt；
所述接头片段三的长度为5-24nt；
所述靶向片段一和所述靶向片段二的长度总和至少为14-16nt；
所述Hy片段的长度为2-6nt或更长。
进一步的，所述X型核酸分子的长度为24-36nt。
上述聚合核酸分子中，所述聚合核酸分子至少包括一个修饰的核苷酸。
进一步的，所述修饰为磷酸骨架修饰、碱基修饰和/或核糖修饰。所述核糖修饰为核糖2位羟基基团被卤素基团或O-烷基基团取代。所述烷基为甲基、乙基、丙基或甲乙基。
更进一步的，所述X型核酸分子的接头片段三自3’端第一位核苷酸起连续的5-9个核苷酸的核糖2位羟基基团被卤素基团或O-烷基基团取代；
所述H型核酸分子的Hx片段自3’端第一位核苷酸起连续的5-9个核苷酸的核糖2位羟基基团被卤素基团或O-烷基基团取代；
所述H型核酸分子自3’端第一位核苷酸起连续的8-30个核苷酸的核糖2位羟基基团被卤素基团或O-烷基基团取代；优选的，所述H型核酸分子自3’端第一位核苷酸起连续的14-18个核苷酸的核糖2位羟基基团被卤素基团或O-烷基基团取代；
所述C型核酸分子中每个帽端片段自5’端第一位核苷酸起连续的2-6个核苷酸的核糖2位羟基基团被卤素基团或O-烷基基团取代。
上述聚合核酸分子中，所述n为3或4或5或6或7或8。
进一步的，所述n为4或5或6。
上述聚合核酸分子中，所述靶基因的个数为一个或两个或多个，且所述靶基因的个数不超过n个；每条X型核酸分子对应一个靶基因，或者多条X型核酸分子对应同一个靶基因的不同区域。
进一步的，所述靶基因的个数为1个或4个或6个。
所述靶基因为如下基因中至少一种：PPIB基因、p65基因、BIRC5基因、CTNNB基因、COPS5基因、CLU基因、EIF4E基因、HIF1A基因、TP53基因、VEGFA基因和SOD1基因。
更进一步的，用于干扰靶基因PPIB表达的聚合核酸分子为如下a1)-a5)：
a1)由序列1、序列2、序列3和序列4所示的单链RNA分子组成；
a2)由序列1、序列2、序列3、序列4、序列20和序列21所示的单链RNA分子组成；
a3)由序列1、序列2、序列3、序列4和序列8所示的单链RNA分子组成；
a4)由序列2、序列3、序列9、序列10、序列11和序列12所示的单链RNA分子组成；
a5)由序列2、序列3、序列6、序列9、序列10、序列11、序列13和序列14所示的所示的单链RNA分子组成；
用于干扰靶基因P65表达的聚合核酸分子为如下b1)-b5)：
b1)由序列15、序列16、序列17和序列18所示的单链RNA分子组成；
b2)由序列6、序列7、序列15、序列16、序列17和序列19所示的单链RNA分子组成；
b3)由序列15、序列16、序列17、序列18和序列22所示的单链RNA分子组成；
b4)由序列15、序列16、序列17、序列23、序列24和序列25所示的单链RNA分子组成；
b5)由序列15、序列16、序列17、序列20、序列23、序列24、序列26和序列27所示的所示的单链RNA分子组成；
用于同时干扰靶基因BIRC5、CTNNB、COPS5和CLU表达的聚合核酸分子为由序列28、序列29、序列30和序列31所示的单链RNA分子组成；
用于同时干扰靶基因BIRC5、CTNNB、COPS5、CLU、EIF4E和HIF1A表达的聚合核酸分子为由序列28、序列29、序列30、序列32、序列33和序列34所示的单链RNA分子组成；
用于同时干扰靶基因SOD1、PPIB、P65和VEGFA表达的聚合核酸分子为如下c1)-c3)：
c1)由序列35、序列36、序列37和序列38所示的单链RNA分子组成；
c2)由序列35、序列36、序列37、序列38、序列39和序列40所示的单链RNA分子组成；
c3)由序列35、序列36、序列37、序列38和序列41所示的单链RNA分子组成：
用于干扰靶基因VEGFA表达的聚合核酸分子为如下d1)-d11)：
d1)由序列42、序列43、序列44、序列45、序列46和序列47所示的单链RNA分子组成；
d2)由序列48、序列49、序列50、序列51、序列52和序列53所示的单链RNA分子组成；
d3)由序列54、序列55、序列56、序列57、序列58和序列59所示的单链RNA分子组成；
d4)由序列42、序列43、序列45、序列46和序列47所示的单链RNA分子组成；
d5)由序列48、序列49、序列51、序列52和序列53所示的单链RNA分子组成；
d6)由序列54、序列55、序列57、序列58和序列59所示的单链RNA分子组成；
d7)由序列42、序列45、序列46和序列47所示的单链RNA分子组成；
d8)由序列48、序列51、序列52和序列53所示的单链RNA分子组成；
d9)由序列54、序列57、序列58和序列59所示的单链RNA分子组成；
d10)由序列60、序列61、序列62、序列63、序列64和序列65所示的单链RNA分子组成；
d11)由序列66、序列67、序列68、序列69、序列70和序列71所示的单链RNA分子组成；
用于干扰靶基因TP53表达的聚合核酸分子为如下e1)-e11)：
e1)由序列72、序列73、序列74、序列75、序列76和序列77所示的单链RNA分子组成；
e2)由序列78、序列79、序列80、序列81、序列82和序列83所示的单链RNA分子组成；
e3)由序列84、序列85、序列86、序列87、序列88和序列89所示的单链RNA分子组成；
e4)由序列73、序列74、序列75、序列76和序列77所示的单链RNA分子组成；
e5)由序列79、序列80、序列81、序列82和序列83所示的单链RNA分子组成；
e6)由序列54、序列55、序列57、序列58和序列59所示的单链RNA分子组成；
e7)由序列74、序列75、序列76和序列77所示的单链RNA分子组成；
e8)由序列80、序列81、序列82和序列83所示的单链RNA分子组成；
e9)由序列序列86、序列87、序列88和序列89所示的单链RNA分子组成；
e10)由序列90、序列91、序列92、序列93、序列94和序列95所示的单链RNA分子组成；
e11)由序列96、序列97、序列98、序列99、序列100和序列101所示的单链RNA分子组成。
为了解决上述技术问题，本发明又提供了上述聚合核酸分子的衍生物。
本发明提供的上述聚合核酸分子的衍生物为如下(m1)-(m5)中任一种：
(m1)将上述聚合核酸分子删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述聚合核酸分子具有相同功能的聚合核酸分子的衍生物；
(m2)将上述聚合核酸分子进行核苷酸取代或修饰，得到与所述聚合核酸分子具有相同功能的聚合核酸分子的衍生物；
(m3)将上述聚合核酸分子的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述聚合核酸分子具有相同功能的聚合核酸分子的衍生物；
(m4)由上述聚合核酸分子编码的肽核酸、锁核酸或解锁核酸，得到与所述聚合核酸分子具有相同功能的聚合核酸分子的衍生物；
(m5)将上述聚合核酸分子的一端或中间接上信号分子和/或活性分子和/或功能基团，得到与所述聚合核酸分子具有相同功能的聚合核酸分子的衍生物。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述聚合核酸分子的制备方法。
本发明提供的上述聚合核酸分子的制备方法包括如下步骤：
M1)合成上述X型核酸分子和/或H型核酸分子和/或C型核酸分子；
M2)将所述X型核酸分子和/或所述H型核酸分子和/或所述C型核酸分子退火，得到所述聚合核酸。
上述方法中，所述退火的反应体系为将等摩尔量的各单链RNA分子、RNA退火buffer和水混匀得到的体系。所述退火的反应条件为PCR仪中90℃，2min使其充分变性，随后PCR仪中降温至25℃使其退火。
n为4时，退火体系如下(总体积为100μL)：各单链RNA分子溶液(浓度为100μM)20μL、RNA退火buffer(5X)15μL、DEPC水5μL。
n为5时，退火体系如下(总体积为150μL)：各单链RNA分子溶液(浓度为150μM)20μL、RNA退火buffer(5X)30μL、DEPC水20μL。
n为6时，退火体系如下(总体积为200μL)：各单链RNA分子溶液(浓度为200μM)20μL、RNA退火buffer(5X)40μL、DEPC水40μL。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述聚合核酸分子或衍生物的新用途。
本发明提供了上述聚合核酸分子或衍生物在如下A1)或A2)中的应用；
A1)调控细胞中靶基因表达水平；
A2)制备预防和/或缓解和/或治疗由靶基因表达引起的疾病的产品。
上述应用中，所述调控为抑制或降低或干扰。
上述应用中，所述细胞为肿瘤细胞。
上述应用中，所述靶基因为疾病相关基因；所述疾病相关基因具体为肿瘤相关基因；所述肿瘤相关基因具体为如下基因中至少一种：PPIB基因、p65基因、BIRC5基因、CTNNB基因、COPS5基因、CLU基因、EIF4E基因、HIF1A基因、TP53基因、VEGFA基因和SOD1基因。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种抑制或降低或干扰细胞中靶基因表达水平的试剂或试剂盒或药物。
本发明提供的抑制或降低或干扰细胞中靶基因表达水平的试剂或试剂盒或药物包括上述聚合核酸分子或上述衍生物。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种抑制或降低或干扰细胞中靶基因表达水平的方法。
本发明提供的抑制或降低或干扰细胞中靶基因表达水平的方法包括如下步骤：将上述聚合核酸分子或衍生物导入所述细胞，实现抑制或降低所述细胞中靶基因的表达水平。
上述方法中，所述导入的方法为将所述聚合核酸分子、转染试剂和缓冲液混匀后加入细胞培养基中，得到反应体系；所述聚合核酸分子在所述反应体系中的终浓度为1-300nM。
上述方法中，所述细胞为肿瘤细胞。
上述方法中，所述靶基因为疾病相关基因；所述疾病相关基因具体为肿瘤相关基因；所述肿瘤相关基因具体为如下基因中至少一种：PPIB基因、p65基因、BIRC5基因、CTNNB基因、COPS5基因、CLU基因、EIF4E基因、HIF1A基因、TP53基因、VEGFA基因和SOD1基因。
本发明优势在于：
1)RNAi效能提高；
2)结构更稳定，化学稳定性好，抗核酸酶降解能力增强，尤其是血液中的稳定性增强，半衰期延长；
3)降低脱靶率；
4)能形成纳米颗粒结构，导入细胞能力增强；
5)可模块化设计核酸分子。
6)一些结构的聚合核酸发挥RNAi作用不需要Dicer酶的参与，因此对化学修饰的耐受程度更高，可以部分修饰或完全修饰。
本发明将CON技术与纳米技术结合，通过构建具有可准确设计的，且具有自我组装能力的核酸结构，从而实现多靶标干扰作用，可用于抑制疾病发生或发展的信号通路中的多个基因表达，或同时抑制多个疾病靶基因表达，在生物学、化学等多个学科领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为靶向核酸单元-X型示意图。
图2为侧翼核酸单元-H型示意图。
图3为帽端核酸单元-C型示意图。
图4为R结构聚合核酸平面和成环示意图。上图为R结构聚合核酸平面示意图。下图为R结构聚合核酸成环示意图(左：R＝(Xi)4；右：R＝(Xi)6)。
图5为L结构聚合核酸平面示意图。
图6为Cr结构聚合核酸平面示意图。
图7为单基因相对表达水平。
图8为多基因相对表达水平。
图9为多基因相对表达水平(n＝4)。
实施发明的最佳方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、核酸单元、聚合核酸的设计与合成
一、核酸单元的设计
本发明设计了3种型态的核酸单元，分别命名为X型靶向核酸单元、H型侧翼核酸单元、C型帽端核酸单元。这些核酸单元可以自由组合为多种结构的聚合核酸。
1、靶向核酸单元：X型
X型靶向核酸单元的结构如下：5’-T1-T2-A3-3’。其中T1为靶向片段一，T2为靶向片段二，A3为接头片段三，T1和T2组成一段与靶基因序列互补的序列。在某些特定的情况下，与靶基因序列互补的区域可以延长至A3的部分序列。X型靶向核酸单元的长度为15-50nt，优选为24-36nt。其中T1长度为5-24nt；T2长度为1-20nt，A3长度为5-24nt。X型靶向核酸单元示意图见图1。
2、侧翼核酸单元：H型
H型侧翼核酸单元的结构如下：3’-Hx-Hy-5’或3’-Hy-Hx-5’。其中Hx为侧翼主体片段，Hy为侧翼延伸片段(Hy可以不存在)。Hx与Hy通过磷酸二酯键连接。Hy位于Hx的5’端或3’端。Hx与X单元的T1片段或A3片段互补配对；Hy与X单元的T2片段自5’端或3’端起1个、2个或多个连续的核苷酸互补配对。Hy的长度可为2-6nt或更长。H型侧翼核酸单元示意图见图2。
3、帽端核酸单元：C型
C型帽端核酸单元的结构如下：3’-C1-C2-……Cn-5’。其中C1为帽端片段1，与X1单元的T2片段反向互补；C2为帽端片段2，与X2单元的T2片段反向互补，依次类推，Cn为帽端片段n，与Xn单元的T2片段反向互补。C型帽端核酸单元示意图见图3。
二、聚合核酸分子的设计
本发明根据步骤一的三种核酸单元设计了3种结构的聚合核酸，分别命名为R结构聚合核酸、L结构聚合核酸、Cr结构聚合核酸。这些结构能够同时靶向同一个基因的不同位点，也能够同时靶向不同基因的不同位点，实现干扰靶基因的表达。
1、聚合核酸结构一：R结构
R结构聚合核酸的结构如下：(Xi)n。其中Xi为靶向核酸单元。n为大于或等于3的整数，优选为3-8的整数，更优选为4、5、6。
将n个X型靶向核酸单元分别命名为X1单元、X2单元、X3单元，依次类推，Xn-1单元、Xn单元；
本发明的R结构聚合核酸中，每个靶向核酸单元均通过序列互补作用与聚合核酸中除自身外的另外两个靶向核酸单元形成双链区域，即相邻X单元通过T1片段和A3片段互补配对连接，具体的，X1单元的A3片段与X2单元的T1片段互补配对，X2单元的A3片段与X3单元的T1片段互补配对，依次类推，Xn单元的A3片段与X1单元的T1片段互补配对(每个靶向核酸单元的T1片段与其相邻的靶向核酸单元的A3片段互补配对，且每个靶向核酸单元的T1片段与其他靶向核酸单元序列均不互补配对)，从而形成环状二级结构。在这个环状结构中，每个靶向核酸单元的结构和长度相同。
每个靶向核酸单元能通过其T1和T2与靶基因的特定序列结合，从而调控靶基因的表达。
R结构聚合核酸的平面和成环示意图见图4。
2、聚合核酸结构二：L结构
L结构聚合核酸的结构如下：H1-(Xi)n-Hn。其中H1、Hn均为侧翼核酸单元，Xi为靶向核酸单元。n为大于或等于3的整数，优选为3-8的整数，更优选为4、5、6。
将n个X型靶向核酸单元分别命名为X1单元、X2单元、X3单元，依次类推，Xn-1单元、Xn单元。
本发明的L结构聚合核酸中，X1单元的A3片段与X2单元的T1片段互补配对，X2单元的A3片段与X3单元的T1片段互补配对，依次类推，Xn-1单元的A3片段与Xn单元的T1片段互补配对；H1单元与X1单元的T1片段互补配对。H1单元与X1单元的互补区还可延伸至X1单元的T2片段的部分或全部；Hn单元与Xn单元的A3片段互补配对，Hn单元与Xn单元的互补区还可延伸至Xn单元的T2片段的部分或全部。H1单元的5’端或Hn单元的3’端还包括Hy片段，Hy片段与所述X1单元或所述Xn单元的靶向片段二自5’端或3’端起1个、2个或多个连续的核酸分子互补配对。
L结构聚合核酸的平面示意图见图5。
3、聚合核酸结构三：Cr结构
Cr结构聚合核酸的结构如下：(Xi)n-C。其中Xi为靶向核酸单元，C为帽端核酸单元。n为大于或等于3的整数，优选为3-8的整数，更优选为4、5、6。
将n个X型靶向核酸单元分别命名为X1单元、X2单元、X3单元，依次类推，Xn-1单元、Xn单元。
本发明的Cr结构聚合核酸中，X1单元的A3片段与X2单元的T1片段互补配对，X2单元的A3片段与X3单元的T1片段互补配对，依次类推，Xn-1单元的A3片段与Xn单元的T1片段互补配对；帽端核酸单元C由帽端片段1、帽端片段2，依次类推，帽端片段n组成，帽端片段1与X1单元的T2片段互补配对，帽端片段2与X2单元的T2片段互补配对，依次类推，帽端片段n与Xn单元的T2片段互补配对，帽端片段1、帽端片段2、……和帽端片段n均通过磷酸二酯键连接为一条单链核酸。
Cr结构聚合核酸的平面示意图见图6。
三、聚合核酸的合成方法及核酸单元的修饰方法
1、聚合核酸的合成方法
本发明的核酸单元以序列特异性方式彼此退火，其互补性促进此聚合核酸的自装配，形成具有二级结构的聚合核酸分子。具体合成方法如下：
1)合成聚合核酸结构所需的核酸单元；
2)将核酸单元置于退火条件中，使其相互退火，自组装形成二级结构体。
退火反应体系为将等摩尔量的各核酸单元、RNA退火buffer(5X)(碧云天Annealing Buffer for RNA oligos(5X)，R0051)和水(DEPC水)混匀得到的体系。
退火反应条件为PCR仪中90℃，2min使其充分变性，随后PCR仪中降温至25℃使其退火。
2、核酸单元的修饰方法
为了增加核酸酶稳定性和生物学活性可在核酸中引入适当的核苷酸糖、碱基和磷酸部分的修饰，包括对核糖进行化学修饰，如2’核糖羟基基团被卤素基团或O-烷基基团取代，烷基包括甲基、乙基、丙基或甲乙基等，该类核酸修饰不会降低聚合核酸的干扰活性。本发明设计的核酸单元包括如下修饰：
1)靶向核酸单元中的A3接头片段自3’端第一位核苷酸起连续的5-9个核苷酸的核糖2位羟基基团被卤素基团或O-烷基基团取代。
2)侧翼核酸单元的侧翼主体片段自3’端第一位核苷酸起连续的5-9个核苷酸的核糖2位羟基基团被卤素基团或O-烷基基团取代；或侧翼核酸单元自3’端第一位核苷酸起连续的8-30个核苷酸的核糖2位羟基基团被卤素基团或O-烷基基团取代。优选的，侧翼核酸单元自3’端第一位核苷酸起连续的14-18个核苷酸的核糖2位羟基基团被卤素基团或O-烷基基团取代。
3)帽端核酸单元的每个帽端核酸片段从5’端到3’端的2-6个核苷酸的核糖2位羟基基团被卤素基团或O-烷基基团取代。
实施例2、聚合核酸的制备及其在干扰靶基因表达中的应用
(一)R结构聚合核酸：靶向同一基因的不同区域的抑制实验
1、聚合核酸
制备如下结构的聚合核酸，每个结构的靶向核酸单元分别靶向VEGFA、TP53基因的4个、5个或6个不同区域。
A表示靶向核酸单元的T1和A3片段为12nt，T2片段为6nt。
B表示靶向核酸单元的T1和A3片段为12nt，T2片段为5nt。
C表示靶向核酸单元的T1和A3片段为12nt，T2片段为3nt。
D表示靶向核酸单元的T1和A3片段为11nt，T2片段为6nt。
E表示靶向核酸单元的T1和A3片段为10nt，T2片段为6nt。
n为4时，退火体系如下(总体积为100μL)：各核酸单元溶液(浓度为100μM)20μL、RNA退火buffer(5X)15μL、DEPC水5μL。
n为5时，退火体系如下(总体积为150μL)：各核酸单元溶液(浓度为150μM)20μL、RNA退火buffer(5X)30μL、DEPC水20μL。
n为6时，退火体系如下(总体积为200μL)：各核酸单元溶液(浓度为200μM)20μL、RNA退火buffer(5X)40μL、DEPC水40μL。
靶基因为VEGFA的聚合核酸为如下1)-11)：
1)VEGFA-R6-A(R结构，n＝6)：其X单元序列从X1-X6依次为表1的序列42-47。
2)VEGFA-R6-B(R结构，n＝6)：其X单元序列从X1-X6依次为表1的序列48-53。
3)VEGFA-R6-C(R结构，n＝6)：其X单元序列从X1-X6依次为表1的序列54-59。
4)VEGFA-R5-A(R结构，n＝5)：其X单元序列从X1-X5依次为表1的序列42、43、45、46、47。
5)VEGFA-R5-B(R结构，n＝5)：其X单元序列从X1-X5依次为表1的序列48、49、51、52、53。
6)VEGFA-R5-C(R结构，n＝5)：其X单元序列从X1-X5依次为表1的序列54、55、57、58、59。
7)VEGFA-R4-A(R结构，n＝4)：其X单元序列从X1-X4依次为表1的序列42、45、46、47。
8)VEGFA-R4-B(R结构，n＝4)：其X单元序列从X1-X4依次为表1的序列48、51、52、53。
9)VEGFA-R4-C(R结构，n＝5)：其X单元序列从X1-X4依次为表1的序列54、57、58、59。
10)VEGFA-R6-D(R结构，n＝6)：其X单元序列从X1-X6依次为表1的60-65。
11)VEGFA-R6-E(R结构，n＝6)：其X单元序列从X1-X6依次为表1的序列66-71。
靶基因为TP53的聚合核酸为如下1)-11)：
1)TP53-R6-A(R结构，n＝4)：其X单元序列从X1-X6依次为表2的序列72-77。
2)TP53-R6-B(R结构，n＝6)：其X单元序列从X1-X6依次为表2的序列78-83。
3)TP53-R6-C(R结构，n＝6)：其X单元序列从X1-X6依次为表2的序列84-89。
4)TP53-R5-A(R结构，n＝5)：其X单元序列从X1-X5依次为表2的序列73-77。
5)TP53-R5-B(R结构，n＝5)：其X单元序列从X1-X5依次为表2的序列79-83。
6)TP53-R5-C(R结构，n＝5)：其X单元序列从X1-X5依次为表2的序列85-89。
7)TP53-R4-A(R结构，n＝4)：其X单元序列从X1-X4依次为表2的序列74-77。
8)TP53-R4-B(R结构，n＝4)：其X单元序列从X1-X4依次为表2的序列80-83。
9)TP53-R4-C(R结构，n＝5)：其X单元序列从X1-X4依次为表2的序列86-89。
10)TP53-R6-D(R结构，n＝6)：其X单元序列从X1-X6依次为表2的序列90-95。
11)TP53-R6-E(R结构，n＝6)：其X单元序列从X1-X6依次为表2的序列96-101。
表1、核酸单元的序列
表2、核酸单元序列
注：小写字母表示该核苷酸核糖经过2′-O-甲基核糖修饰。下划线标记的序列为靶序列。
2、抑制实验
将5×105个HeLa细胞(ATCC编号为CRL-1958)接种于含10％胎牛血清的DMEM培养基的12孔培养板中，分别将步骤1制备的聚合核酸转染HeLa细胞：将聚合核酸与转染试剂、缓冲液(广州市锐博生物科技有限公司，名称riboFECTTM CP Buffer，货号C10511-1)混合后加入细胞培养基中，每孔体积1mL，使聚合核酸的转染终浓度为50nM，将培养板置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养48h。转染试剂及转染具体步骤参照riboFectTM(广州市锐博生物科技有限公司)中的方法。
每次细胞铺板除了试验组，还设置阴性对照组(NC)和未处理对照组(NT)。试验组和对照组均有3个重复。NC组的对照序列为siRNA，为如下两条单链RNA分子互补结合得到的双链RNA分子：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3′和5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3′。
37℃、5％C02孵育48h后收集转染后细胞，rizol法提取转染后细胞的RNA进行实时定量PCR，检测靶基因mRNA表达水平，q-PCR重复3次，结果均用平均值±SD表示。检测靶基因的实时定量PCR引物序列如附表所示。
检测结果见表3。实验结果表明，以上不同结构的聚合分子均可高效抑制靶基因的表达。
表3、mRNA相对表达水平
注：阴性对照表达水平为1。
(二)R结构聚合核酸：低浓度抑制实验
1、聚合核酸
制备VEGFA-R6-A聚合核酸的X单元序列和聚合核酸TP53-R6-A的X单元序列同步骤(一)；制备P65-R6-A聚合核酸的X单元序列从X1-X6依次为表5中的序列15、16、17、23、24、25。
2、抑制实验
仅将步骤(一)中的抑制实验的聚合核酸的转染终浓度变为1nM，其他步骤保持不变。
检测结果见表4。实验结果表明，低浓度的本发明的聚合核酸也可实现降低靶基因表达水平的目的。
表4、mRNA相对表达水平
| VEGFA | TP53 | P65 | |
| R6-A(1nM) | 0.53 | 0.64 | 0.51 |
注：阴性对照表达水平为1。
(三)三种结构聚合核酸：靶向同一基因的不同区域的抑制实验
1、聚合核酸
制备如下结构的聚合核酸，每个结构的靶向核酸单元分别靶向PPIB或P65基因的4个或6个不同区域。
靶基因为PPIB的聚合核酸为如下1)-5)：
1)PPIB-R4(R结构，n＝4)：其X单元序列从X1-X4依次为表5中的序列1-4。
2)PPIB-L4(L结构，n＝4)：其X单元序列从X1-X4依次为表5中的序列1-3和序列5，其H1单元序列为序列20，其H4单元序列为序列21。
3)PPIB-Cr4(Cr结构，n＝4)：其X单元序列从X1-X4依次为表5中的序列1-4，其C单元序列为序列8。
4)PPIB-R6(R结构，n＝6)：其X单元序列从X1-X6依次为表5中的序列2、3、9、10、11、12。
5)PPIB-L6(L结构，n＝6)：其X单元序列从X1-X6依次为表5中的序列2、3、9、10、11、13，其H1单元序列为序列6，其H6单元序列为序列14。
靶基因为P65的聚合核酸为如下1)-5)：
1)P65-R4(R结构，n＝4)：其X单元序列从X1-X4依次为表5中的序列15-18。
2)P65-L4(L结构，n＝4)：其X单元序列从X1-X4依次为表5中的序列15-17和序列19，其H1单元序列为序列6，其H4单元序列为序列7。
3)P65-Cr4(Cr结构，n＝4)：其X单元序列从X1-X4依次为表5中的序列15-18，其C单元序列为序列22。
4)P65-R6(R结构，n＝6)：其X单元序列从X1-X6依次为表5中的序列15、16、17、23、24、25。
5)P65-L6(L结构，n＝6)：其X单元序列从X1-X6依次为表5中的序列15、16、17、23、24、26，其H1单元序列为序列20，其H6单元序列为序列27。
表5、核酸单元的序列
注：小写字母表示该核苷酸核糖经过2-O-甲基核糖修饰。下划线标记的序列为靶序列。X单元：第1-12位为T1；第13-18位为T2；第19-30为A3。H1单元：第1-4位为Hy；第5-16位为Hx。H4单元：第1-12位为Hx；第13-16位为Hy。C单元：第1-6位为C4，第7-12位为C3，第13-18位为C2，第19-24位为C1。
2、抑制实验
抑制实验步骤同步骤(一)。
抑制结果见图7。结果表明，5种结构的聚合核酸均有效抑制了靶基因的表达。针对靶基因PPIB的抑制水平均在80％以上，针对靶基因P65的抑制水平均在75％以上。
(四)R结构聚合核酸靶向不同基因的抑制实验(n＝4和6)
1、聚合核酸
制备如下R结构的聚合核酸，该聚合核酸靶向4个或6个不同的靶基因。
BCCC-R4：靶基因为BIRC5、CTNNB、COPS5、CLU，其X单元序列从X1-X4依次为表3中的序列28-31。
BCCCEH-R6：靶基因为BIRC5、CTNNB、COPS5、CLU、EIF4E、HIF1A，其X单元序列从X1-X6依次为表6中的序列32、33、28、29、30、34。
2、抑制实验
抑制实验步骤同步骤(一)。
表6、核酸单元的序列
| 靶基因 | 序列(5′-3′) | 序列编号 |
| BIRC5 | AGAAGAAACACUGGGCCAACUGCugaucuu | 28 |
| CTNNB1 | AAGAUCAGCAGUCUCAUUUGGUCaggucuu | 29 |
| COPS5 | AAGACCUGACCAGUGGUAUUUGAcucugau | 30 |
| CLU | AUCAGAGUCAAAGAGCUUAGUGUuucuucu | 31 |
| HIF1A | UCAAGUUGCUGGUCAUCAGGAGGuugcuaa | 32 |
| EIF4E | UUAGCAACCUCCUGAUUAAGUGUuucuucu | 33 |
| CLU | AUCAGAGUCAAAGAGCUUCCAGCaacuuga | 34 |
注：小写字母表示该核苷酸核糖经过2-O-甲基核糖修饰。下划线标记的序列为靶序列。X单元：第1-12位为T1；第13-18位为T2；第19-30为A3。
抑制实验结果见图8。结果表明，2种结构的聚合核酸均有效抑制了4个或6靶基因的表达。R4结构的聚合核酸靶向的4种基因的表达水平均降低至0.2以下。
(五)R结构、L结构和Cr结构聚合核酸靶向不同基因的抑制实验(n＝4)
1、聚合核酸
制备如下各结构的聚合核酸，该聚合核酸靶向4个不同的靶基因。
SPPV-R4：靶基因为SOD1、PPIB、P65、VEGFA，其X单元序列从X1-X4依次为表7中的序列35-38。
SPPV-L4：靶基因为SOD1、PPIB、P65、VEGFA，其X单元序列从X1-X4依次为表7中的序列35-38，其H1单元序列为序列39，其H4单元序列为序列40。
SPPV-Cr4：靶基因为SOD1、PPIB、P65、VEGFA，其X单元序列从X1-X4依次为表7中的序列35-38，其C单单元序列为序列41。
2、抑制实验
同步骤(一)中的抑制实验。
抑制实验结果见图9。结果表明，3种结构的聚合核酸均有效抑制了4种靶基因的表达。并发现，在三种聚合结构中，Cr4结构的聚合核酸的抑制效果最好，其每个靶基因的表达水平均为最低。
表7、核酸单元的序列
| 靶基因 | 序列(5′-3′) | 序列编号 |
| SOD1 | UACUUUCUUCAUUUCCACCUGUUccaaaaa | 35 |
| PPIB | UUUUUGGAACAGUCUUUCUGAGAccuucaa | 36 |
| P65 | UUGAAGGUCUCAUAUGUCCAUGCagauuau | 37 |
| VEGFA | AUAAUCUGCAUGGUGAUGAUGAAgaaagua | 38 |
| H | GGAAAUGAAgaaagua | 39 |
| H4 | uacuuucuucaucauc | 40 |
| C | caucACgacaUAgaaaGAguggAA | 41 |
注：小写字母表示该核苷酸核糖经过2-O-甲基核糖修饰。下划线标记的序列为靶序列。X单元：第1-12位为T1；第13-18位为T2；第19-30为A3。H1单元：第1-4位为Hy；第5-16位为Hx。H4单元：第1-12位为Hx；第13-16位为Hy。C单元：第1-6位为C4，第7-12位为C3，第13-18位为C2，第19-24位为C1。
上述各实验中检测靶基因的实时定量PCR引物序列如表8所示。
表8、检测靶基因的实时定量PCR引物序列
工业应用
本发明提供了新型的可用于构建聚合核酸的核酸单元及可用于干扰目的基因表达的聚合核酸。本发明通过设计和构建新型的核酸单元及其自组装聚合核酸，实现了多靶标干扰，可用于抑制疾病发生或发展的信号通路中的多个基因表达，或同时抑制多个疾病靶基因表达，在生物学、化学等多个学科领域具有广阔的应用前景。该聚合核酸可实现同时靶向多个序列，所述序列可在一个基因中，或位于多个基因中。本发明优势在于：1)RNAi效能高；2)稳定性好；3)降低脱靶率；4)导入细胞能力增强；5)可模块化设计。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州市锐博生物科技有限公司
<120> 核酸单元及其聚合核酸与应用
<130> GNPLY18029
<160> 101
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
agaugcucuu uccuccugca agguguauuu 30
<210> 2
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaauacaccu ugacggugga ugaagaugua 30
<210> 3
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
uacaucuuca ucuccaauuc ucuucggaaa 30
<210> 4
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
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uuuccgaaga gaccaaagga aagagcaucu 30
<210> 5
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
uuuccgaaga gaccaaaguc uacgagaaag 30
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<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggaggaaaga gcaucu 16
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<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 7
cuuucucgua gacuuu 16
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<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 8
cuuuggauug gacaccguca ggag 24
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<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 9
agaugcucuu uccuccugca ugaaggugcu 30
<210> 10
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 10
agcaccuuca uguugcguca agguguauuu 30
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<212> RNA
<213> 人工序列
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uuuccgaaga gaccaaagcg uguaaucaag 30
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<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
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cuugauuaca cgauggaaga aagagcaucu 30
<210> 13
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<212> RNA
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cuugauuaca cgauggaauc uacgagaaag 30
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<212> RNA
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cuuucucgua gauucc 16
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<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 15
uguguagcca uugaucuugc aucaugaaga 30
<210> 16
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
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ucuucaugau gcucuugaau accaccaaga 30
<210> 17
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 17
ucuugguggu aucugugcuc gucaccggau 30
<210> 18
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 18
auccggugac gaucgucuaa uggcuacaca 30
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<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
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auccggugac gaucgucuac acaucgguaa 30
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gaucaauggc uacaca 16
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<211> 16bp
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uuaccgaugu guagac 16
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<211> 24bp
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<213> 人工序列
<400> 22
agacgagcac agucaagaaa gauc 24
<210> 23
<211> 30bp
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<213> 人工序列
<400> 23
auccggugac gaucgucuuc aggagaugaa 30
<210> 24
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 24
uucaucuccu gaaaggagau cagcuccuaa 30
<210> 25
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<213> 人工序列
<400> 25
uuaggagcug aucugacuaa uggcuacaca 30
<210> 26
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<213> 人工序列
<400> 26
uuaggagcug aucugacuac acaucgguaa 30
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<213> 人工序列
<400> 27
uuaccgaugu guaguc 16
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<211> 30bp
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<400> 28
agaagaaaca cugggccaac ugcugaucuu 30
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<212> RNA
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aagaucagca gucucauuug gucaggucuu 30
<210> 30
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 30
aagaccugac cagugguauu ugacucugau 30
<210> 31
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 31
aucagaguca aagagcuuag uguuucuucu 30
<210> 32
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 32
ucaaguugcu ggucaucagg agguugcuaa 30
<210> 33
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 33
uuagcaaccu ccugauuaag uguuucuucu 30
<210> 34
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 34
aucagaguca aagagcuucc agcaacuuga 30
<210> 35
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 35
uacuuucuuc auuuccaccu guuccaaaaa 30
<210> 36
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 36
uuuuuggaac agucuuucug agaccuucaa 30
<210> 37
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 37
uugaaggucu cauaugucca ugcagauuau 30
<210> 38
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 38
auaaucugca uggugaugau gaagaaagua 30
<210> 39
<211> 16bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 39
ggaaaugaag aaagua 16
<210> 40
<211> 16bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 40
uacuuucuuc aucauc 16
<210> 41
<211> 24bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 41
caucacgaca uagaaagagu ggaa 24
<210> 42
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 42
agcagaaagu ucaugguuuc uugggugcau 30
<210> 43
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 43
augcacccaa gacagcagag aucgaguaca 30
<210> 44
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 44
uguacucgau cucaucaggg uggacaucuu 30
<210> 45
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 45
aagaugucca ccagggucau gcggaucaaa 30
<210> 46
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 46
uuugauccgc auaaucuggg ccagcacaua 30
<210> 47
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 47
uaugugcugg ccuuggugga acuuucugcu 30
<210> 48
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 48
agcagaaagu ucaugguucu ugggugcau 29
<210> 49
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 49
augcacccaa gacagcaaga ucgaguaca 29
<210> 50
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 50
uguacucgau cucaucaggu ggacaucuu 29
<210> 51
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 51
aagaugucca ccaggguaug cggaucaaa 29
<210> 52
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 52
uuugauccgc auaaucuggc cagcacaua 29
<210> 53
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 53
uaugugcugg ccuuggugaa cuuucugcu 29
<210> 54
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 54
agcagaaagu ucaugucuug ggugcau 27
<210> 55
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 55
augcacccaa gacagagauc gaguaca 27
<210> 56
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 56
uguacucgau cucauggugg acaucuu 27
<210> 57
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 57
aagaugucca ccaggaugcg gaucaaa 27
<210> 58
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 58
uuugauccgc auaauggcca gcacaua 27
<210> 59
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 59
uaugugcugg ccuuggaacu uucugcu 27
<210> 60
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 60
agcagaaagu ucauggucuu gggugcau 28
<210> 61
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 61
augcacccaa gacagcagau cgaguaca 28
<210> 62
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 62
uguacucgau cucaucagug gacaucuu 28
<210> 63
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 63
aagaugucca ccaggguugc ggaucaaa 28
<210> 64
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 64
uuugauccgc auaaucugcc agcacaua 28
<210> 65
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 65
uaugugcugg ccuugguaac uuucugcu 28
<210> 66
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 66
agcagaaagu ucaugguugg gugcau 26
<210> 67
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 67
augcacccaa gacagcaucg aguaca 26
<210> 68
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 68
uguacucgau cucaucugga caucuu 26
<210> 69
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 69
aagaugucca ccaggggcgg aucaaa 26
<210> 70
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 70
uuugauccgc auaaucccag cacaua 26
<210> 71
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 71
uaugugcugg ccuuggacuu ucugcu 26
<210> 72
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 72
uguggaauca acccacaguu ugcgugugga 30
<210> 73
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 73
uccacacgca aauuuccuac agaaacacuu 30
<210> 74
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 74
aaguguuucu gucauccaac uacaugugua 30
<210> 75
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 75
uacacaugua guuguaguug guaaucuacu 30
<210> 76
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 76
aguagauuac cacuggaguc uccgcaagaa 30
<210> 77
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 77
uucuugcgga gauucucugu ugauuccaca 30
<210> 78
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 78
uguggaauca acccacauuu gcgugugga 29
<210> 79
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 79
uccacacgca aauuuccaca gaaacacuu 29
<210> 80
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 80
aaguguuucu gucauccacu acaugugua 29
<210> 81
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 81
uacacaugua guuguagugg uaaucuacu 29
<210> 82
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 82
aguagauuac cacuggaucu ccgcaagaa 29
<210> 83
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 83
uucuugcgga gauucucguu gauuccaca 29
<210> 84
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 84
uguggaauca acccauuugc gugugga 27
<210> 85
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 85
uccacacgca aauuuacaga aacacuu 27
<210> 86
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 86
aaguguuucu gucauacuac augugua 27
<210> 87
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 87
uacacaugua guuguuggua aucuacu 27
<210> 88
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 88
aguagauuac cacugucucc gcaagaa 27
<210> 89
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 89
uucuugcgga gauucguuga uuccaca 27
<210> 90
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 90
uguggaauca acccacauug cgugugga 28
<210> 91
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 91
uccacacgca aauuucccag aaacacuu 28
<210> 92
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 92
aaguguuucu gucaucccua caugugua 28
<210> 93
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 93
uacacaugua guuguagggu aaucuacu 28
<210> 94
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 94
aguagauuac cacuggacuc cgcaagaa 28
<210> 95
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 95
uucuugcgga gauucucuug auuccaca 28
<210> 96
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 96
uguggaauca acccacugcg ugugga 26
<210> 97
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 97
uccacacgca aauuucagaa acacuu 26
<210> 98
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 98
aaguguuucu gucaucuaca ugugua 26
<210> 99
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 99
uacacaugua guuguaguaa ucuacu 26
<210> 100
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 100
aguagauuac cacugguccg caagaa 26
<210> 101
<211> 25bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 101
ucuugcggag auucuugauu ccaca 25
Claims (10)
1.一种用于干扰靶基因表达的聚合核酸分子，所述聚合核酸分子由n条X型核酸分子与其它核酸分子组成，所述其它核酸分子为H型核酸分子或C型核酸分子；
每条所述X型核酸分子自5’端起依次由靶向片段一、靶向片段二和接头片段三组成；
每条所述X型核酸分子的靶向片段一与其相邻的X型核酸分子的接头片段三互补配对；
每条所述聚合核酸分子的靶向片段一和靶向片段二均与靶基因互补配对；
每条所述X型核酸分子的长度相同；
所述n为大于或等于3的整数；
所述H型核酸分子由H1型核酸分子和Hn型核酸分子组成；
将n条X型核酸分子分别命名为X1单元、X2单元、X3单元，依次类推，Xn-1单元、Xn单元；
所述X1单元的接头片段三与所述X2单元的靶向片段一互补配对，所述X2单元的接头片段三与所述X3单元的靶向片段一互补配对，依次类推，所述Xn-1单元的接头片段三与所述Xn单元的靶向片段一互补配对；
所述H1型核酸分子与所述X1单元的靶向片段一互补配对，所述Hn型核酸分子与所述Xn单元的接头片段三互补配对；
所述C型核酸分子由n个片段依次连接而成，n个片段分别为n条所述X型核酸分子中的靶向片段二的反向互补序列；
所述靶基因为如下基因中至少一种：PPIB基因、p65基因、VEGFA基因和SOD1基因；
其中，用于干扰靶基因PPIB表达的聚合核酸分子为如下a1）-a3）任一一种：
a1）由序列1、序列2、序列3、序列5、序列20和序列21所示的单链RNA分子组成；
a2）由序列1、序列2、序列3、序列4和序列8所示的单链RNA分子组成；
a3）由序列2、序列3、序列6、序列9、序列10、序列11、序列13和序列14所示的所示的单链RNA分子组成；
或，用于干扰靶基因P65表达的聚合核酸分子为如下b1）-b3）任一一种：
b1）由序列6、序列7、序列15、序列16、序列17和序列19所示的单链RNA分子组成；
b2）由序列15、序列16、序列17、序列18和序列22所示的单链RNA分子组成；
b3）由序列15、序列16、序列17、序列20、序列23、序列24、序列26和序列27所示的所示的单链RNA分子组成；
或，用于同时干扰靶基因SOD1、PPIB、P65和VEGFA表达的聚合核酸分子为如下c1）或c2）：
c1）由序列35、序列36、序列37、序列38、序列39和序列40所示的单链RNA分子组成；
c2）由序列35、序列36、序列37、序列38和序列41所示的单链RNA分子组成。
2.根据权利要求1所述的聚合核酸分子，其特征在于：所述聚合核酸分子至少包括一个修饰的核苷酸；所述修饰为核糖修饰。
3.根据权利要求2所述的聚合核酸分子，其特征在于：所述核糖修饰为核糖2位羟基基团被卤素基团或O-烷基基团取代。
4.根据权利要求3所述的聚合核酸分子，其特征在于：所述烷基为甲基、乙基、丙基或甲乙基。
5.根据权利要求3所述的聚合核酸分子，其特征在于：所述X型核酸分子的接头片段三自3’端第一位核苷酸起连续的5-9个核苷酸的核糖2位羟基基团被卤素基团或O-烷基基团取代；
或，所述H型核酸分子的Hx片段自3’端第一位核苷酸起连续的5-9个核苷酸的核糖2位羟基基团被卤素基团或O-烷基基团取代；
或，所述H型核酸分子自3’端第一位核苷酸起连续的8-30个核苷酸的核糖2位羟基基团被卤素基团或O-烷基基团取代；
或，所述C型核酸分子中与X型核酸分子的靶向片段二互补配对的每个片段自5’端第一位核苷酸起连续的2-6个核苷酸的核糖2位羟基基团被卤素基团或O-烷基基团取代。
6.根据权利要求5所述的聚合核酸分子，其特征在于：所述H型核酸分子自3’端第一位核苷酸起连续的14-18个核苷酸的核糖2位羟基基团被卤素基团或O-烷基基团取代。
7.权利要求1-6任一所述的聚合核酸分子的制备方法，包括如下步骤：
M1）合成权利要求1-6中任一所述的X型核酸分子和H型核酸分子或C型核酸分子；
M2）将所述X型核酸分子和所述H型核酸分子或所述C型核酸分子退火，得到所述聚合核酸分子。
8.权利要求1-6任一所述的聚合核酸分子在如下A1）或A2）中的应用；
A1）制备调控细胞中靶基因表达水平的产品；
A2）制备预防或缓解或治疗由靶基因表达引起的疾病的产品；
所述细胞为肿瘤细胞；
所述靶基因为肿瘤相关基因；
所述肿瘤相关基因为如下基因中至少一种：PPIB基因、p65基因、VEGFA基因和SOD1基因。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述调控为抑制或降低或干扰。
10.一种抑制或降低或干扰细胞中靶基因表达水平的试剂或试剂盒或药物，包括权利要求1-6任一所述的聚合核酸分子。
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