CN111704671B

CN111704671B - Ox40抗体及其在治疗癌症中的应用

Info

Publication number: CN111704671B
Application number: CN202010834165.4A
Authority: CN
Inventors: 史辛艺; 王泰华; 刘欢; 戴伟利
Original assignee: Guangdong Cel Biotechnology Co ltd
Current assignee: SHANDONG NEW MEDICINE RESEARCH INSTITUTE OF INTEGRATED TRADITIONAL AND WESTERN MEDICINE LLC
Priority date: 2020-08-19
Filing date: 2020-08-19
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2040-08-19
Also published as: CN111704671A

Abstract

本发明涉及OX40抗体及其在治疗癌症中的应用，该抗体能够更好地结合人OX40,同时促进T细胞活化以及后续的IL‑2分泌及T细胞增殖、诱导T细胞介导的抗肿瘤活性，具有广阔的应用前景。

Description

OX40抗体及其在治疗癌症中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体的涉及一种OX40抗体及其在治疗癌症中的应用。

背景技术

OX4O(CD134)是分子量为48-50kD的I型跨膜糖蛋白,属TNFR超家族成员,主要表达于活化的CD4⁺T细胞表面, 在 CD8⁺T细胞、活化的调节T细胞、自然杀伤性T(NKT)细胞、NK细胞和中性粒细胞表面也有少量表达。其配体OX4OL(CD134L)为TNF超家族成员,分子量为34-40kD的II型跨膜糖蛋白,主要表达于成熟的树突状细胞(DC)、活化的B细胞、血管内皮细胞(VEC)、脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC)、巨噬细胞以及某些组织器官包括心、骨骼肌、辜丸和肺等。OX40/0X40L介导的共刺激信号,参与了T细胞的活化、增殖和迁移,维持T细胞的长期生成,以及协同CD28信号促进生发中心的形成。CD28/B7主要在初次免疫应答中起作用,而OX40/OX4OL信号在初次免疫的后期,二次免疫应答及免疫记忆中发挥重要的调节效应。

Vetto等在黑色素瘤、头颈部磷癌的浸润性淋巴细胞TILs(31%)和肿瘤导管淋巴结细胞DLNCs(28%)均发现OX40+T细胞的存在。Weinberg等通过动物实验证实,运用激发型OX40单抗可阻止小鼠肿瘤形成,同时提高荷瘤小鼠的生存率。联合运用OX40单抗和IL-2在小鼠肿瘤模型的过继性免疫治疗中也取得良好效果,使得肺和脑中的转移灶消除。在小鼠的多种肿瘤模型中,包括肉瘤、乳腺癌、肠癌、神经胶质瘤和黑色素瘤等,运用OX40/OX40L免疫干预策略均获得成功。由于OX40主要表达在炎症部位的抗原特异性T细胞上,使其成为一个理想的免疫干预的靶分子,有望通过在体内激活OX4O信号、促进细胞因子的分泌和增加抗原特异性记忆细胞的数量,从而提高机体抗肿瘤的能力。OX40抗体的开发具有十分重要的临床意义，现有技术中已有一些公开的OX40抗体，如US20160137740A,WO2015153513A,CN110078825B,CN111196854A,CN108623686等，但对新的抗OX40抗体仍然存在很大的需求。

发明内容

基于上述发现，本发明提供一种激动型OX40抗体, 其能够更好地结合人OX40,同时促进T细胞活化以及后续的IL-2分泌及T细胞增殖、诱导T 细胞介导的抗肿瘤活性。

本发明提供以下技术方案：

一种人源化OX40抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其中轻重轻链可变区各有3个互补决定区（CDR）。所述OX40抗体的重链可变区3个CDR序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3；轻链可变区3个CDR序列分别为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7。

在一些实施方案中，本发明所述OX40抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区序列为SEQ ID NO:4，轻链可变区序列为SEQ ID NO:8。

在一些实施方案中，本发明所述OX40抗体含重链和轻链，该重链包含重链可变区和重链恒定区，轻链包含轻链可变区和轻链恒定。

在一些实施方案中，本发明所述OX40抗体轻链恒定区包含人源κ、λ链序列, 进一步优选为κ链。所述抗体重链恒定区包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM，进一步优选为IgG1。

在一些实施方案中，本发明所述OX40 抗体具有激动剂活性。抗OX40抗体的激动剂活性由T细胞活化后释放的细胞因子的水平来评估。该细胞因子是炎性细胞因子,例如通过γ-干扰素(例如IFNg)、白细胞介素2(例如IL-2)、白细胞介素10(例如IL-10)水平来评估。

在一些实施方案中，本发明所述OX40 抗体具有激动剂活性。抗OX40抗体的激动剂活性由T细胞增殖水平来评估。

在一些实施方案中,本发明所述OX40 抗体对人OX40的结合通过Elisa或流式细胞术(例如FACS )测定法进行测定。

本发明提供了一种药物组合，包括本发明所述的OX40抗体，此外还可包括第二药物或活性剂。第二药物可以是CTLA4抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体、4-1BB抗体或其他免疫治疗药物。

本发明所述的OX40抗体可应用于制备治疗和/或预防癌症的药物中，所述癌症选自下组：乳腺癌、黑色素瘤、B细胞淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌。

有益效果

本发明的有益效果主要体现在：提供一种新的激动型OX40抗体, 其能够更好地结合人OX40,同时促进T细胞活化以及后续的IL-2分泌及T细胞增殖、诱导T 细胞介导的抗肿瘤活性。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

图1 抗OX40抗体对T细胞的促增殖作用。

图2 抗OX40抗体对T细胞分泌细胞因子的影响。

图3 抗OX40抗体的抗肿瘤效果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1. 抗OX40抗体制备及纯化

使用重组人OX40胞外结构域(OX40-ECD)蛋白作为免疫原（购自义翘神州，Cat#：10481-H08H）。将免疫抗原溶于PBS，与等体积的弗氏佐剂混合均匀，形成油包水乳剂。初次免疫采用皮下多点免疫，免疫剂量为100μg/只。初次免疫7-10天后，使用不完全弗氏佐剂与免疫抗原等体积混合乳化，以同样的途径和剂量免疫小鼠。之后每隔7-10天加强免疫数次，使小鼠血清的抗体效价达一万以上。在最后一次加强免疫一周之后进行眼球取血，ELISA测定血清效价。若小鼠血清效价未达到一万，必须继续加强免疫数次。效价达一万以上的小鼠，融合前三天进行冲击免疫，取不加佐剂抗原，尾静脉注射。

融合前10-14d,复苏小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,用含10%FCS的DMEM培养基培养。融合前24-36h用新鲜培养基将细胞浓度调整为3x105/m1。融合前将DMEM、PEG溶液置于37℃水浴中预温。收集2x107个生长良好的SP20/细胞,DMEM洗涤2遍后,与(1-2)x108个脾脏细胞充分混匀于50ml透明塑料离心管中,用DMEM再洗涤一遍,1OO0rPm离心5min后,弃尽上清,轻轻弹松细胞使之成糊状。将离心管置于37℃保温杯中,预热5min后,吸取lml经37℃预温的50%的PGE溶液,将吸管轻轻插入细胞底部,在lmin内匀速加完融合剂,且边加边搅拌,然后静置lmin。再加入4Om1 37℃预温的DMME,先慢后快,边加边轻轻搅拌,然后37℃静置5-10min。800rpm离心10min后弃上清,将细胞重悬于55一60ml 37℃预温的含1%HAT、20%FCS的DMEM培养基中。轻轻混匀后滴加到含有饲养细胞的96孔板中,每孔60μl,37℃、5%C02培养,4-5d后半量换液。待细胞克隆布满l/3培养孔时,吸取培养上清，采用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株。利用有限稀释法筛选单克隆化阳性杂交瘤细胞株，同时将阳性杂交瘤细胞进行扩大培养，冻存保种。将最终筛选出的阳性杂交瘤细胞株命名为4F9-2。

实施例2. 抗体人源化

将实施例1中获得的杂交瘤细胞株4F9-2用TRNzol-A+裂解后，置入离心管，每mlTRNzol-A+加入200μl氯仿，漩涡振荡15秒，放置3分钟。13000 rpm 4°C离心10分钟，Trizol-A+ 细胞溶液分为三层：上层无色水相、中层和下层黄色有机相，将溶有RNA的水相转移至离心管中，向水相中加入等体积异丙醇，混匀，室温静置25分钟。13000 rpm 4°C离心10分钟，弃去废液得到沉于底部的RNA沉淀。用75%乙醇洗涤RNA沉淀两次后，用DEPC水溶解RNA，-80℃保存。随后用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(TRANS，AT311-02)反转录试剂盒合成cDNA第一条链；以cDNA为模板，利用PCR扩增出含有抗体重链可变区和轻链可变区的DNA产物，利用琼脂糖凝胶电泳分离并回收纯化含有抗体重链可变区和轻链可变区的目的片断。将其克隆到pGEM-T载体中，筛选阳性克隆测序，根据测序结果进一步获得可变区基因对应的氨基酸序列。

根据杂交瘤细胞株4F9-2分泌的抗体的可变区序列，对抗体进行人源化改造，首先利用目前有效的公共数据库，将杂交瘤细胞株4F9-2的VH区和VK 区与NCBI数据库中已有人源抗体序列进行比对，选出

与其最为接近的人胚胎系框架序列，将CDR区植到所选的人抗体框架编码序列上来产生人源化抗体。之后确定一些对维持结合亲和力及维护空间构架的关键氨基酸，将其嫁接回已经选择的人胚胎系抗体框架，确定最终改造后的人源化抗体轻重链可变区序列。合成抗体VH结构域和VK结构域，并克隆至特化的哺乳动物表达载体中，该表达载体使相应的结构域能够在完整的人IgG1或κ抗体骨架中表达。将ⅠgG1构建体与κ构建体共转染至293F细胞中，进行人源化抗体的小批量制备。将瞬时转染的上清液通过蛋白A或G树脂，获得纯化的OX40抗体。最终，将人源化改造后的抗体命名为h4F9-2，测序结果显示，抗体h4F9-2的VH-CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；抗体VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；h4F9-2的VL-CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:7所示；抗体VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

实施例3.人源化抗体的亲和力测定

用HBS-EP缓冲液平衡芯片后，用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片，即CM5芯片。将抗原蛋白（OX40-HIS）用10mM pH4.8的醋酸钠稀释至5μg/ml，然后以10μl/min的流速注射3min进行抗原偶联，再以10μl/min的流速注入乙醇胺以封闭未反应基团。将抗OX40抗体hF9-2以及对照抗体tavolimab设置6个不同浓度梯度，用HBS-EP缓冲液依次进行2倍梯度稀释，浓度从100nM到1.56nM。对照抗体tavolimab的序列参照IMGT/mAb-DB ID：608（参见：www.imgt.org/mAb-DB/search.action）。从低浓度开始，将抗OX40抗体以50μL/min的流速注射3 min，再用HBS-EP缓冲液以50μL/min的流速解离时间为10 min。使用3M MgCl₂作为再生缓冲液，按照再生程序对芯片进行再生。此后以同样的方法对其它浓度的抗体进行测定。通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(K_a)和解离速率(K_d)。平衡解离常数(K_d)用解离速率(K_d)/ 结合速率(K_a)计算。

表一

抗体	K<sub>a</sub>（1/Ms）	K<sub>d</sub>（1/s）	K<sub>D</sub>(M)
				h4F9-2	3.66×10<sup>5</sup>	2.57×10<sup>-4</sup>	7.02×10<sup>-10</sup>
tavolimab	3.31×10<sup>5</sup>	8.49×10<sup>-4</sup>	2.56×10<sup>-9</sup>

实施例4. OX40抗体对T细胞的促增殖作用

取肝素钠抗凝的正常人新鲜外周血, 按常规的Ficoll(购自GE Healthcare)梯度离心分离法获得单个核细胞(PBMC),细胞浓度调至2x10⁶/m1,加入10%SRBC -AET细胞悬液(体积比为2:1),混匀后置于37℃水浴中放置15min,然后低速离心(500rpm)5min,再转移至4℃冰箱结合45min,经PBS稀释后用Ficoll密度梯度离心,沉淀细胞经ACK溶液(每100ml溶液中含NH₄Cl 0.83g,NaHCO₃ 0.1g,EDTA-Na 3.7g)溶解红细胞,一般重复溶解2-3次，最终获得PBTC细胞。抗CD3抗体(购自Biolegend)包被96孔板（1μg/ml）,每孔50μl,4℃过夜。吸弃上清,PBS洗涤1遍。用含10%FCS的RMPI1640培养基将PBTC调整为0.8x10⁶/ml,将抗CD28抗体（购自Biolegend）终浓度调整为2μg/ml,接种于该96孔板(100μl/孔),37℃、5%C02培养24h。然后加入100μl /孔不同浓度的抗OX40抗体h4F9-2(终浓度分别为0.5、1、2μg/m1)共3组,每组3个复孔,同时设对照，其中tavolimab用作阳性对照, IgG1作为阴性对照抗体。继续培养72h后,每孔加入20μl MTT(5mg/ml)溶液,再培养4-6h,吸去上清,200μl /孔PBS洗涤一遍,加入100ul/孔异丙醇溶解,放置5min,测定0D₅₇₀值。实验结果如图1所示：抗OX40抗体h4F9-2、tavolimab均能剂量依赖性地促进T细胞的细胞增殖，且抗OX40抗体h4F9-2促进T细胞增殖的效果更优。

实施例5.OX40抗体对T细胞分泌细胞因子的影响

取肝素钠抗凝的正常人新鲜外周血, 按常规的Ficoll(购自GE Healthcare)梯度离心分离法获得单个核细胞(PBMC),细胞浓度调至2x106/m1,加入10%SRBC -AET细胞悬液(体积比为2:1),混匀后置于37℃水浴中放置15min,然后低速离心(500rpm)5min,再转移至4℃冰箱结合45min,经PBS稀释后用Ficoll密度梯度离心,沉淀细胞经ACK溶液(每100ml溶液中含NH4Cl 0.83g,NaHCO3 0.1g,EDTA-Na 3.7g)溶解红细胞,一般重复溶解2-3次，最终获得PBTC细胞。抗CD3抗体(购自Biolegend)包被96孔板（1μg/ml）,每孔50μl,4℃过夜。吸弃上清,PBS洗涤1遍。用含10%FCS的RMPI1640培养基将PBTC调整为0.8x10⁶/ml,将抗CD28抗体（购自Biolegend）终浓度调整为2μg/ml,接种于该96孔板(100μl/孔),37℃、5%C02培养24h。然后加入100μl /孔不同浓度的抗OX40抗体h4F9-2(终浓度分别为0.4、2、10μg/m1)，共3组,每组3个复孔,同时设对照，其中tavolimab用作阳性对照, IgG1作为阴性对照抗体。继续培养72h后收集培养上清，测量细胞因子IL2分泌量。细胞因子含量的测定按照ELISA试剂盒上操作步骤进行。实验结果如图2所示：抗OX40抗体h4F9-2、tavolimab均能剂量依赖性地提高T细胞中IL-2的分泌，增强T细胞活性。

实施例6. 抗OX40抗体的体内药效实验

为了探讨OX40单克隆抗体h4F9-2在体内的抗肿瘤效果，取6-8周大小的雌性OX40人源化小鼠（购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司）构建MC38结肠癌模型。用DMEM培养基培养足够的处于对数生长期的MC38肿瘤细胞，收集细胞并用PBS洗涤，随后将细胞浓度稀释至1x10⁷个/ml。取100μl MC38细胞悬液接种于小鼠腹部皮下。待MC38肿瘤体积生长至约80m³时，我们将荷瘤裸鼠随机分为3组，每组6只并给药实验，包括：(a)第1组：PBS(媒介物对照)；(b)第2组：抗OX40抗体h4F9-2，5mg/kg；(c)第3组：抗OX40对照抗体h4F9-2，5mg/kg；给药的途径为：抗OX40抗体采用每周尾缘静脉注射的方式,每3天给药1次，共给药7次。每3天测量肿瘤长、短径，并计算肿瘤大小，计算公式为：移植肿瘤的体积=肿瘤的长径×肿瘤的宽径×肿瘤的宽径×0.5。当整个实验到达观察终点时，采用颈椎脱臼法处死裸鼠。实验结果如图3所示，阴性对照组的裸鼠肿瘤体积大部分呈进行性生长。抗OX40抗体h4F9-2和阳性对照抗体tavolimab均能明显的抑制肿瘤生长。

序列表

<110> 北京广未生物科技有限公司

<120> OX40抗体及其在治疗癌症中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ile Gly Met Tyr

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Ile Gly Thr Pro Asn Glu Thr Gly Lys Gly His Lys Phe Leu Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Asp Ala Lys Ser Phe Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Asp Ile

20 25 30

Gly Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Gly Thr Pro Asn Glu Thr Gly Lys Gly His Lys Phe Leu

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Asp Ala Lys Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Arg Ala Ile Ser Asn Val Gly Lys Leu Ala Ala

1 5 10

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ser Ala Ile Gly Lys Tyr Ser

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Ile Asn Gly Phe Asn Asp Tyr Thr

1 5

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ile Ser Asn Val Gly Lys Leu

20 25 30

Ala Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ile Gly Lys Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ile Asn Gly Phe Asn Asp Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

Claims

1.一种抗OX40抗体，由重链和轻链组成，所述抗体的重链可变区3个CDR序列分别为SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3；轻链可变区3个CDR序列分别为SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7。

2.根据权利要求1所述的抗OX40抗体，其特征在于：所述重链包含如SEQ ID No :4所示的重链可变区；所述轻链包含如SEQ ID No :8所示的轻链可变区。

3.一种药物组合物，其特征在于：包含权利要求1-2任一项所述的抗体。

4.权利要求1-2任一项的抗OX40抗体在制备用于治疗结肠癌的药物中的用途。