CN111699244B

CN111699244B - 基于水凝胶的器官芯片微流控装置

Info

Publication number: CN111699244B
Application number: CN201880082020.4A
Authority: CN
Inventors: S·O·戈巴
Original assignee: Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2023-11-24
Anticipated expiration: 2038-12-21
Also published as: EP3728553A1; US20200385659A1; JP2021506319A; CN111699244A; US11643625B2; WO2019122434A1; EP3728553B1

Abstract

本发明总体上涉及一种器官芯片的微流控装置(10)，其包括第一元件(11)、第二元件(16)和介于第一元件和第二元件之间的水凝胶层(14)。确定第一元件、第二元件和水凝胶层的形状和尺寸，以使水凝胶层在本文公开的使用条件下能够沿给定方向膨胀和收缩，特别是在体外模拟器官功能。本发明还涉及该微流控装置的制备方法以及该微流控装置在生物医学领域中的应用，特别是用于模拟器官的结构和功能。

Description

基于水凝胶的器官芯片微流控装置

技术领域

本发明总体上涉及一种器官芯片(organ-on-chip)微流控装置。更具体地，本发明涉及一种微流控装置，其包括第一元件、第二元件，以及介于第一元件和第二元件之间的水凝胶层。确定第一元件、第二元件和水凝胶层的形状和尺寸，以使水凝胶层在本文公开的使用条件下能够沿给定方向膨胀和收缩，特别是在体外模拟器官功能。本文公开的装置允许开发生理相关的、遗传的、生化的、细胞的、组织的或基于器官的测定。本发明还涉及生产微流控装置的方法以及所述微流控装置在生物医学领域中的应用，特别是用于模拟器官的结构和功能。

背景技术

开发新的和功能强大的体外细胞测定法对生物医学行业至关重要。除了允许进行基本的机理研究之外，扩大规模的测定是所有现代药物发现和验证流程的基础。

尽管付出了巨大的努力，但是基于2D细胞培养和塑料底物的标准测定仍然存在很差的生理状况再现性，因此大多数无法有效地预测药物的安全性和有效性。

这些失败的主要原因是缺乏在药物开发早期可用的生理相关模型。学术研究也面临着类似缺乏的模型的问题，特别是对于传染病的研究，在传染病中，许多病原体的贮存库仅是人类。获得有用的洞察需要在细胞水平上进行实时成像，这很难在活体动物中捕获。另外，使用小动物模型仍然是一个很大的伦理问题。因此，非常需要替代方法。目前正在出现多种生物工程方法，包括微流控、类器官(organoid)培养和组合筛选，作为缩小标准体外培养测定和动物研究之间差距的可行解决方案。

近年来，已经出现了新的基于细胞的测定方法，其目的是为动物检测提供有效的替代方法。最引人注目的是，人类器官芯片的发展为收集人体细胞生理相关数据开辟了新的场所。

专利申请WO 2010/009307公开了一种微流控装置，其具有由一个或多个多孔膜(例如，一个或多个多孔PDMS膜)隔开的中心微通道，所述多孔膜通过物理方法安装。所述微流控装置的构造需要与中心微通道相邻的附加通道，以便通过附加微通道和中心微通道之间的间接气动机构产生压差，膜响应该压差而膨胀或收缩。

专利申请WO 2015/138032公开了一种仿有机(organomimetic)装置，其具有微通道和膜，该膜物理固定至所述仿有机装置的两个部分，使得所述膜由物理连接到其上的机械驱动系统调节。

专利申请WO 2015/138034公开了一种微流控装置，其具有被膜隔开的两个不同尺寸的通道。所述微流控装置采用复杂的设计，通过利用其中提供的附加微通道，通过间接气动机构和/或机械手段调节膜。

然而，尽管为改善细胞测定的生理相关性(3D细胞培养，灌注(perfusion)，机械力)付出了巨大的努力，但是现有装置需要复杂的配置，该配置包括许多机械固定的微型部件。此外，装置的驱动依赖于通过外部手段或间接机构的机械刺激。这样的设备需要微型和复杂部件的高精度安装/对准。此外，现有装置依赖于不能重现(recapitulate)生理细胞微环境的非生理合成材料。

发明内容

本发明提供了一种先进的器官芯片微流控装置，其通过结合微流控技术和水凝胶技术，重现人类器官微环境，尤其是许多机械活性隔室或组织中的内皮/上皮界面。

基于水凝胶的装置能够在具有可调的机械性能的生理相关底物(水凝胶)上培养细胞，而底物(水凝胶)受到流体(液体或气体)直接施加在底物(水凝胶)上的压力的机械刺激而膨胀或收缩，特别是周期性地扩张或收缩，以模拟生理条件，例如心脏跳动、呼吸、肠的蠕动或肌肉伸展。另外，对蛋白水解降解敏感的水凝胶的使用使接种的细胞能够侵入并与提供的软基材紧密相互作用。与现有方法相反，本发明提供了改进的细胞测定法，其能够精确地在生物物理上和生物化学上重现靶组织的细胞外基质界面。

本发明相应地提供了一种微流控装置，其依赖于所述水凝胶层的驱动，所述水凝胶层能够在体外模拟或重现生物隔室或组织，特别是人体器官的物理和/或生理参数。

本发明涉及一种微流控装置，其包括：

a)第一元件，所述第一元件包括在其表面上的一种以上化学官能团，其中所述一种以上化学官能团包括在与所述表面共价结合的分子中；

b)水凝胶层，所述水凝胶层具有彼此相对的第一面和第二面，所述水凝胶层包括一种以上化学官能团，至少一种所述化学官能团有效地与共价结合于所述第一元件表面的分子中包括的至少一种化学官能团反应；和

c)第二元件，

其中所述水凝胶层在给定轴线上介于所述第一元件和所述第二元件之间，所述给定轴线基本上垂直于所述水凝胶层，并且所述第一元件、所述第二元件和所述水凝胶层具有确定的形状和尺寸，以在所述第一元件和所述水凝胶层的所述第一面之间勾画出和/或形成至少一个微通道，以及在所述第二元件和所述水凝胶的所述第二面之间勾画出和/或形成至少一个腔体，所述至少一个微通道和所述至少一个腔体相对于彼此布置，使得所述给定轴线截断所述至少一个微通道和所述至少一个腔体，并且，

其中，分子中包括的至少一种所述化学官能团和所述水凝胶层的至少一种化学官能团彼此共价结合，所述分子共价结合到所述第一元件的表面。

如本文所用，术语“元件”是指相对于水凝胶层更刚性的微流控装置的零件、块体、主体或基底。相应地，第一元件或第二元件的弹性模量高于水凝胶层的弹性模量，并且第一元件或第二元件的弹性模量通常足够高，使得当施加期望程度的压力(由于引入到第一元件的微通道和/或第二元件的腔体的流体)时，能够选择性刺激水凝胶层。这种直接刺激机制不需要与微通道或腔体相邻的任何附加通道，因此装置的生产相对简单。在具体的实施方案中，元件由刚性材料，特别是平坦的刚性材料部件组成。

如本文所使用的，术语“表面”不一定代表第一元件或第二元件的整个表面或整个外表面，而是涵盖了整个表面的一部分或其外表面的一部分。在一个具体的实施方案中，表面是所述元件的整个表面或基本上是所述元件的整个表面。

在一个具体的实施方案中，共价结合至第一元件表面的分子形成单分子层。单分子层是指分子的单层。术语“单分子层”可以与术语“单分子膜”或“分子单层”互换使用，并且可以称为“自组装单层”。在一个优选的实施方案中，分子是一种类型，因此具有相同的分子式。

术语“化学官能团”用作复数名词以表示两个或更多个“化学官能团”，其在有机化学领域中通常称为“官能团”。化学官能团或简称为官能团是指确定化学性质和反应性的特定原子团。在一个具体的实施方案中，化学官能团在分子或化合物内，并决定所述分子或化合物的化学性质或反应性。不同类型的化学官能团由不同原子团组成。

共价结合到所述第一元件的表面上的分子包括至少一种可用于进行化学反应的官能团。

分子在其原始结构中(即在与第一元件或水凝胶层共价结合之前)，优选包括两个端基(即原子团或化学官能团)，每个端基包括一个或多个化学官能团。分子一端上的官能团与第一元件的表面共价结合，分子另一端上的官能团与水凝胶层的至少一种官能团共价结合。

如本文所用，术语“腔体”是指中空的空间，其不含构成元件和水凝胶的任何材料。在一个实施方案中，腔体是指通道，尤其是微通道，其沿着水凝胶层的表面延伸并且旨在允许液体或气体通过或循环。例如，液体包括细胞培养基。通道的两端用作液体或气体的入口和出口。在另一个实施方案中，腔体是指可以容纳液体而不使所述液体循环的腔室或容器。特别地，腔体的直径(平行于所述水凝胶层)在10mm至40mm的范围内，并且高度(垂直于所述水凝胶层)在10μm至20mm的范围内。

术语“微通道”是指，除了长度，其尺寸(例如，宽度和高度)小于1mm的通道。特别地，微通道的宽度(平行于水凝胶层)和高度(垂直于水凝胶层)在10μm至999μm的范围内。微通道的长度(平行于水凝胶层)沿着水凝胶层的第一面延伸，并且旨在允许液体通过或循环。微通道的所述长度在0.1mm和15mm之间的范围内。微通道的两端用作液体或气体的入口和出口。

如本文所用，术语“水凝胶层”是指，当从水凝胶层的第一面或第二面观察时，可以被视为整体平坦的层，例如，任何形状(例如矩形、圆形或正方形)的水凝胶片。所述两个面被所述水凝胶层的厚度分开，所述厚度小于水凝胶层的任何其他尺寸。术语“水凝胶”涵盖能够通过在其结构内吸收或捕获水分子而溶胀的交联的亲水性聚合物或大分子单体的聚合物网络。在一个实施方案中，水凝胶层的厚度在其整个表面上是均匀的。在另一个实施方案中，水凝胶层的厚度在其整个表面上(特别是在水凝胶的第一面面向微通道而水凝胶的第二面面向腔体的区域上)是不均匀的。例如，相对于水凝胶层的其余部分，水凝胶层在所述区域中可具有变化的厚度或较低的厚度。

发明人有利地设计了依赖于水凝胶层的驱动的新型器官芯片平台。所述装置包括通过形成共价键而化学结合到其上的水凝胶层，使所述水凝胶层能够响应于水凝胶层的一侧(即第一面)的微通道与水凝胶层的相对侧(即第二面)的腔体之间的流体压力差而膨胀或收缩。与这样的装置组件相关的技术优势包括部件的机械操作的复杂性降低以及设备的长期稳定性提高。特别地，水凝胶层的不可逆的共价附着有助于装置的简化和直接驱动，同时降低意外拆卸、破裂或泄漏的风险。装置的设计进一步确保了没有压力被施加到水凝胶层的不希望被驱动的部分上(即，在装置内的两种元件/组件之间，水凝胶层没有被挤压)；如上所述，水凝胶层所经受的唯一压力是由水凝胶层基于流体压差的驱动引起的。本发明首次展示了水凝胶如何在生物装置中用作动力传感器。

本文公开的水凝胶层能够再生间充质(也称为基质(Stroma))。所述水凝胶层不是惰性的；例如，它对蛋白水解降解敏感。所述水凝胶层还允许在微通道和位于水凝胶层的相对侧上的腔体之间产生化学梯度。

根据本发明，本文公开的微流控装置的布置使水凝胶层能够沿朝向第一元件和水凝胶层的第一面之间的至少一个微通道或朝向第二元件和水凝胶层的第二面之间的至少一个腔体的方向驱动和变形，在刺激水凝胶层时，例如在所述至少一个微通道和所述至少一个腔体之间施加流体压差，所述至少一个微通道和所述至少一个腔体相对于彼此布置在给定轴线上，该给定轴线截断所述至少一个微通道和所述至少一个腔体。

如本文所用，术语“水凝胶层的驱动”是指诱导水凝胶层移动或弹性变形的行为。

如本文所用，术语“水凝胶层的变形”是指水凝胶层的形式的可逆改变或变化，特别是通过水凝胶层的膨胀或收缩。特别地，变形是可逆的，并且可以通过刺激水凝胶层而停止。

膨胀和收缩的行为的特征在于水凝胶层的周期性拉伸，因为水凝胶层承受的压力是由于流体施加的垂直于水凝胶的接触表面(第一面或第二面)的压力，从而导致水凝胶层弯曲或收缩。特别地，水凝胶层所经受的压力是由于在水凝胶的第一面上的微通道和在水凝胶的第二面上的腔体之间的流体压力差。

如本文所用，术语“水凝胶层的刺激”是指刺激的施加，该刺激通过响应于压力差的膨胀或收缩来驱动水凝胶移动或弹性变形(即，使水凝胶运动)，该压力差在由第一元件和水凝胶层的第一面所勾画出的微通道以及在第二元件和水凝胶层的第二面之间的腔体之间。

所述压力差，特别是流体压力差，是由在水凝胶的第一面上的微通道中流动的流体(气体或液体)和在水凝胶的第二面上的腔体中流动的流体(气体或液体)产生的。所述流体通过调节液体的流速和/或气体的压力在水凝胶层的第一面和第二面上施加变化量的压力。

因此，对水凝胶层的驱动是通过改变微通道和/或腔体中的液体流速或气体压力来驱动的。

在水凝胶层的第一面上的微通道中的流体和在水凝胶层的第二面上的腔体中的流体可以沿相同方向或相反方向流动。

在一个实施方案中，在水凝胶层的第一面上的至少一个微通道中或在水凝胶层的第二面上的至少一个腔体中的流体是气体。使用气体向水凝胶层施加压力可以使得例如肺泡重建。

在一个实施方案中，在水凝胶层的第一面上的至少一个微通道中或在水凝胶层的第二面上的至少一个腔体中的流体是液体。由于与气体相比液体的可压缩性低，液体的使用允许更好地控制腔体内的压力，并因此可以很好地控制对水凝胶层的调节(即弹性变形)。

在一个优选的实施方案中，装置中包括的所有微通道和腔体中的流体是液体。

在一个实施方案中，第一元件与水凝胶层的第一面物理接触，并且第二元件与水凝胶层的第二表面可以接触或可以不接触。

在另一个实施方案中，第二元件与第一元件物理接触，并且水凝胶层与第一元件或第二元件中的一个或两个物理接触。

在本发明的所有实施方案中，第一元件和第二元件之间的接触不会在水凝胶层上施加任何压力。所述第一元件和所述第二元件彼此直接或间接地紧固，使得所述水凝胶层被密封地容纳在流体回路中，该流体回路配置有用于在所述至少一个微通道和所述至少一个腔体之间产生压差的器件。

在一个具体的实施方案中，面对水凝胶层的第二元件的表面包括一种以上化学官能团，并且至少一种所述化学官能团与水凝胶层的至少一种化学官能团共价结合。所述一种以上化学官能团包括在与第二元件的表面共价结合的分子中。所述包括一种以上化学官能团的分子可以与包括与第一元件的表面共价结合的一种以上化学官能团的分子相同或不同。相应地，所述第二元件的表面上的所述一种以上化学官能团可以与所述第一元件的表面上的所述一种以上化学官能团相同或不同。

在本发明的另一个实施方案中，所述装置可以被配置为使得第一元件和第二元件中的至少一个由至少两个部件制成，即第一部件和第二部件。例如，第一元件的第二部件位于第一元件的第一部件和第二元件之间。第一元件的第二部件如下构造：使得第一元件的第二部件的第一面与第一元件的第一部件接触，并且第一元件的第二部件的第二面(与第一面相对)与第二元件接触。在另一个类似的例子中，第二元件的第二部件位于第二元件的第一部件和第一元件之间。第二元件的第二部件如下构造：第二元件的第二部件的第一面与第二元件的第一部件接触，并且第二元件的第二部件的第二面(与第一面相对)与第一元件接触。

在一个实施方案中，第一元件或第二元件的第二部件用作隔离元件，其在水凝胶层的第二面和第二元件之间产生一个或多个腔体。在另一个实施方案中，第一元件或第二元件的第二部件是具有一个或多个中空结构(例如中空的圆形、正方形或矩形)的环形元件。例如，所述第二部件是任何形状的环形密封元件，例如圆形、正方形或矩形，特别是具有圆形截面的环，即O形环，其防止液体或气体在水凝胶层的第二面和第二元件之间泄漏。在特定实施方案中，第一元件或第二元件的第二部件具有双重功能：它用作在水凝胶层的第二面和第二元件之间形成一个或多个腔体的间隔件，以及防止液体或气体在水凝胶层的第二面和第二元件之间泄漏的环形密封元件。

在一个实施方案中，第一元件或第二元件或两者在其中包括至少一个凹陷或压痕，特别是在其至少一个平坦侧面或表面中。至少一个凹陷或压痕通过包括但不限于光刻、激光烧蚀、微铣、蚀刻或模塑的各种技术产生，并且可以具有任何形状或尺寸。在一个特定实施方案中，凹陷或压痕包括至少一个垂直于包括凹陷或压痕的表面的壁，壁定义了凹陷或压痕的高度或深度。

包括在第一元件和第二元件中的至少一个凹陷或压痕可以具有相同或不同的形状和尺寸。在一个实施方案中，与包括在第一元件中的至少一个凹陷或压痕的宽度相比，包括在第二元件中的至少一个凹陷或压痕具有更宽的宽度，该第二元件在水凝胶层的第二面和第二元件之间形成/勾勒出至少一个腔体，该第一元件在在水凝胶层的第一面和第一元件之间形成/勾勒出至少一个微通道。

术语“凹陷”或“压痕”涵盖凹槽。在一个具体的实施方式中，第一元件包括至少一个被水凝胶层覆盖的凹槽，从而形成至少一个微通道。

如本文所用，术语“凹槽(groove)”是指表面上的狭长的凹陷或压痕，其范围为纳米至厘米，特别是微米，其通过各种技术产生，包括但不限于光刻、激光烧蚀、微铣、蚀刻或模塑。凹槽沿其延伸方向可以是任何形状，并且可以具有任何形状的截面。例如，凹槽可以是弯曲的，但是优选是直线的，即直的，并且可以具有弯曲的或矩形的截面。

在具体的实施方式中，第一元件的一侧包括凹槽，凹槽被水凝胶层覆盖，形成微通道。水凝胶层的第一面的表面积的尺寸确定为覆盖包括在第一元件的所述侧面中的凹槽。水凝胶层的所述第一面在由所述凹槽的宽度隔开的两个表面上共价结合至包括凹槽的第一元件的所述侧面。被所述凹槽的宽度分开的两个表面的表面积足以使共价结合的水凝胶层在装置的使用期间(即，通过流体压差驱动)保持附着。

根据一个实施方案，第一元件和第二元件中的至少一个包括凹口(recess)，水凝胶层安装在该凹口中。水凝胶层可以覆盖形成在所述第一元件的所述表面上的至少一个凹槽，从而形成至少一个微通道。而且，所述凹口可以形成在所述第一元件上并且可以包括具有所述至少一个凹槽的底部。

在一个特定实施方案中，凹口在施加到所述第二元件上的环形表面上开口，以形成至少一个腔体，该至少一个腔体相对于水凝胶层、与所述至少一个微通道相对设置。

第一元件和第二元件各自包含选自但不限于以下的材料或材料的任意组合：硅橡胶(即，聚硅氧烷)，结晶硅，聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)，二氧化硅(例如，石英和玻璃)，热塑性塑料(例如，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，聚碳酸酯(PC)，聚苯乙烯(PS)，聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)，聚氨酯(PU)，全氟化合物(例如，全氟烷氧基(Teflon PFA)和氟化乙烯丙烯(Teflon FEP))和聚烯烃(例如，环烯烃共聚物(COC)，环烯烃聚合物(COP)，环嵌段共聚物(CBC)和聚氯乙烯(PVC))，聚酰亚胺(PI)，聚乳酸-乙醇酸(PLGA))，热固性聚酯(TPE)，非化学计量的硫醇-烯(OSTE)，透明陶瓷(例如氧化铝(Al₂O₃)，尖晶石(MgAl₂O₄)，钇铝石榴石(YAG)和钕掺杂钇铝石榴石(Nd:YAG))和纸(例如透明或半透明的纸)。在一个实施方案中，第一元件和第二元件包含二氧化硅(例如，石英和玻璃)。在另一个实施方案中，第一元件和第二元件包含聚二甲基硅氧烷(PDMS)，热塑性塑料(例如，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，聚碳酸酯(PC)，聚苯乙烯(PS)，聚氨酯(PU)，全氟化合物(例如全氟烷氧基(Teflon PFA)和氟化乙烯丙烯(Teflon FEP))和聚烯烃(例如，环烯烃共聚物(COC)，环烯烃聚合物(COP)，环嵌段共聚物(CBC)和聚氯乙烯(PVC))，聚乳酸-乙醇酸(PLGA)，热固性聚酯(TPE)。

第一元件和第二元件可以包括或可以不包括相同的材料。在特定实施方案中，第一元件和第二元件由相同的材料制成。在另一个实施方案中，第一元件和第二元件由不同的材料制成。

在特定实施方案中，第一元件和/或第二元件由适合于能够检测在使用微流控装置时产生的信号的材料制成，信号例如通过光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜产生。所述材料尤其使得能够检测至少一个电磁波长，该电磁波长由所述至少一个微通道和/或所述至少一个腔体和/或水凝胶层的第一或第二面或水凝胶主体中的组分(例如生物、化学或生化化合物)发射。特别地，所述检测是荧光的检测。

在一个优选的实施方案中，第一元件、第二元件中的至少一个或所有所述元件包含选自以上列出的材料的透明或半透明材料。

在另一优选实施方案中，第一元件包含PDMS或由PDMS组成。在另一个优选的实施方案中，第二元件包含二氧化硅或由二氧化硅组成。

在一个具体的实施方案中，包括在与第一元件或第二元件的表面共价结合的分子中的化学官能团包括硫醇基(-SH)。共价结合到第一元件或第二元件表面的分子可以具有通式X(CH₂)n SiY3，其包括反应性官能团X和Y。X是官能团，例如巯基，暴露在第一元件、第二元件或这两种元件的表面上，其能够进行化学反应，特别是与水凝胶层的官能团(例如，乙烯基砜基团)发生化学反应以形成共价键；n为1至3的整数；Y为甲氧基、乙氧基、甲基等官能团。Y是与第一元件或第二元件的表面共价结合的基团。此类分子的实例包括但不限于(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，(3-巯基丙基)三乙氧基硅烷和(3-巯基丙基)甲基二甲氧基硅烷。在一个具体的实施方案中，所述分子包含(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPS)或由其组成。

在一个具体的实施方案中，共价结合至第一元件或第二元件的至少一部分表面的分子中包含的化学官能团包括硫醇基，并且水凝胶层中包含的化学官能团包括乙烯基砜基团。在另一个实施方案中，与第一元件或第二元件的至少一部分表面共价结合的分子中包含的化学官能团包含硫醇基，并且水凝胶层中包含的化学官能团包含丙烯酸酯或马来酰亚胺基团或任何硫醇反应性官能团。

在一个具体的实施方案中，水凝胶层的弹性模量(剪切模量)为1kPa至50kPa。在一个优选的实施方案中，水凝胶层的剪切模量为10kPa至30kPa。弹性模量(剪切模量)值的选择取决于微通道或腔体的宽度、水凝胶层的密度和厚度、所需的变形程度，水凝胶层内部或上方的细胞的存在(水凝胶刚度的选择取决于培养的细胞)以及使用过程中装置的温度。当使用时，在上述范围内的剪切弹性模量有利地使得水凝胶层能够拉伸(即，膨胀或收缩)高达25％。水凝胶层的拉伸程度可通过以下方式量化：i)比较施加液压前后在水凝胶层上接种的细胞面积，或ii)将荧光微球(例如聚苯乙烯磁珠)嵌入水凝胶中，并通过牵引力显微镜(TFM)测量磁珠之间距离的变化。

术语“弹性模量”指一个数值常数，其描述了在诸如水凝胶之类的材料的给定区域上施加的力与由于所述施加的力而导致的材料变形的比值。本文公开的弹性模量的值是指剪切模量或刚度模量，其描述材料的刚度并定义为剪切应力与剪切应变的比值。水凝胶层的弹性模量(剪切模量)通过本领域已知的技术来测量，例如微量流变仪(microrheometer)。例如，“Substrate elasticity modulates the responsiveness ofmesenchymal stem cells to commitment cues.”(Gobaa S,Hoehnel S,Lutolf MP.,Integr Biol(Camb).2015年10月；7(10):1135-42)中描述了使用微量流变仪的方法(例如参见“Measurements of substrate stiffness”段落)。本领域技术人员能够确定适合于测量弹性模量的参数。

在一个具体的实施方案中，水凝胶层的厚度为30μm至500μm，更优选为150μm至350μm，特别是170μm至340μm，更特别是150μm至200μm。

在一个具体的实施方案中，装置包括两层或多层水凝胶。例如，装置可以包括1至3层水凝胶，每个水凝胶层的厚度为30μm至500μm。在一个实施方案中，一层或多层水凝胶层的总厚度在170μm至340μm的范围内。在另一个实施方案中，一个或多个水凝胶层的厚度为170μm。两层或多层水凝胶有利地通过化学键(即共价键)连接在一起。

水凝胶层包括聚合物基材，聚合物基材包含或由一种以上大分子单体的聚合物或聚合网络组成，该大分子单体具有连接至聚合物主链的亲水性官能团或具有亲水性。在一个具体的实施方案中，聚合物基材包括聚乙二醇(PEG)，特别是官能化的PEG。在一个优选的实施方案中，聚合物基材包括两种不同的官能化的PEG大分子单体(即一种PEG大分子单体含有一种官能团，另一种PEG大分子单体含有另一种官能团)的聚合网络。

在一个具体的实施方案中，PEG水凝胶浓度在2.5％至10％(w/v)的范围内。在一个优选的实施方案中，PEG水凝胶浓度为5％至10％(w/v)。在另一个优选的实施方案中，PEG水凝胶浓度为5％(w/v)。

在一个优选的实施方案中，一种以上大分子单体的聚合物基材包括乙烯基砜基团、硫醇基团或这两种基团。优选通过交联PEG-SH大分子单体(特别是星形或多臂PEG-SH大分子单体)和PEG-VS大分子单体(特别是星形或多臂PEG-VS大分子单体)，通过SH基团和VS基团之间的反应(特别是迈克尔型加成反应(Michael-type addition reaction))，形成水凝胶层的聚合物基材。在这种情况下，SH基团和VS基团之间的共价键使大分子单体交联以形成聚合物基材。在一个具体的实施方案中，聚合物基材包含不饱和SH基团和/或不饱和VS基团。

在另一个实施方案中，例如通过使用在Lutolf和Hubbel(2003)中公开的方法，包括PEG的聚合物基材包括多肽作为PEG大分子单体之间的交联剂。包括经由多肽交联的PEG大分子单体的所述聚合物基材对各种蛋白酶(包括金属蛋白酶(MMP))敏感。

术语“聚合物基材”是指通过大分子单体交联而形成的聚合物网络或聚合网络。根据本发明的公开，包括两个或两个以上具有不同官能团的大分子单体通过在易于相互反应的不同官能团之间形成共价键而交联以形成所述聚合物基材。假定满足两个反应性官能团的化学计量摩尔比(即，等摩尔量)，官能团保持不饱和(即，可用于反应)直至交联完成。在一个具体的实施方案中，不满足两个反应性官能团的化学计量摩尔比，导致聚合物基材中以摩尔过量加入的不饱和官能团。官能团在聚合物基材的形成中用作交联连接。

术语“大分子单体”是指大分子，例如聚合物或低聚物，其充当随后的交联的前体，从而导致形成具有更高分子量的聚合物或大分子。大分子单体可具有各自结构/构造，包括线性，环状和支链结构/构造(例如，星形、梳形或刷形、超支化、树枝状、H形、长链支化、哑铃形等)。

在一个具体的实施方案中，水凝胶层包含的硫醇基团的量相对于乙烯基砜基团在0至10％范围内摩尔过量。在这种情况下，在水凝胶层的主体和表面上存在不饱和硫醇基团，该不饱和硫醇基团易于发生化学反应，并且特别适用于与细胞粘附分子结合，特别是与交联剂(其与不饱和硫醇基共价结合)偶联的细胞粘附分子。

在一个具体的实施方案中，水凝胶层含有1.2mM的游离硫醇基团，以进一步固定蛋白质或肽。

在一个具体的实施方案中，水凝胶层包括微结构或微图案。通过光刻、微铣或模塑生产的地形结构化的压模(例如，由PDMS、硅树脂、玻璃、塑料、陶瓷或金属制成的压模)可用于在水凝胶层的至少一部分表面上形成微结构或微图案，以重现靶器官的结构，特别是肠道的隐窝/绒毛。这些压模可以以两种方式使用：

1.对部分交联的水凝胶的表面进行软压花(Kobel等，2009)。简而言之，技术需要将结构化的压模压在部分交联的水凝胶上。交联反应完成后，被压制结构的负片永久转移到水凝胶中。

2.在浇铸水凝胶层时模塑结构(Lutolf等，2009)。该技术需要将水凝胶前体溶液夹在压模和平坦的Teflon或硅烷化的玻璃载玻片之间。所用间隔物的厚度决定了所生产的结构化水凝胶层的厚度。

本发明的微流控装置适合并旨在用于细胞(特别是哺乳动物细胞)的接种，以进行与观察细胞或合成组织的生长、扩增、分化或生物学活性有关的包括结构或功能测定。相应地，微流控装置允许通过附着分子例如粘附分子将接种的细胞维持在水凝胶层上和/或之内。对蛋白水解降解敏感的水凝胶的使用使接种的细胞能够侵入并与提供的软基材紧密相互作用。

在一个具体的实施方案中，至少一种细胞粘附分子连接(例如，共价或非共价附着)至水凝胶层的第一面、水凝胶层的第二面、水凝胶层的主体中的至少一个或其任意组合。术语“水凝胶层的主体”是指水凝胶层的第一面和第二面之间的在水凝胶层的厚度内的部分。通过以下方式使所述至少一种细胞粘附分子附着至水凝胶层：i)在所述水凝胶层的聚合步骤期间引入到水凝胶层的主体中(例如，可以加入到PEG大分子单体的混合物中)，和/或ii)将包括细胞粘附分子的液体引入微通道或腔体。

优选地，细胞粘附分子，例如细胞粘附蛋白共价连接至水凝胶层的至少一种化学官能团。在一个具体的实施方案中，细胞粘附分子共价连接到水凝胶层的硫醇基团。

在一个具体的实施方案中，标记或修饰细胞粘附分子以改善其对细胞的粘附功能。在一个具体的实施方案中，它们用fc抗体片段标记或用异双功能蛋白交联剂例如异双功能NHS-PEG-马来酰亚胺连接子(linker)修饰。该连接子首先在生理pH下，与结构中具有伯胺或仲胺的任何感兴趣的分子(氨基酸、肽、蛋白质)反应。这将允许在感兴趣的分子和异功能连接子之间形成酰胺键。这样，通过调节目标分子和异功能连接子之间的化学计量比，我们可以产生具有可变马来酰亚胺功能(通常在1至20之间)的感兴趣的分子。

在一个具体的实施方案中，通过在所述异双功能蛋白交联剂和水凝胶层的所述硫醇基团之间形成共价键，将用异双功能蛋白交联剂修饰的细胞粘附分子与水凝胶层的硫醇基团连接。

在另一个实施方案中，用Fc抗体片段修饰的细胞粘附分子被吸附到含有蛋白A或蛋白G或对Fc片段具有亲和力的任何其他分子的水凝胶层(基于亲和力)上。与先前的实施方案相似，蛋白A共价结合至异双功能蛋白交联剂，其共价连接至水凝胶层的硫醇基团。在特定实施方案中，在微通道或腔体中提供的被测流体不包括抗体或抗体的Fc片段。

在一个具体的实施方案中，细胞粘附分子包括纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白中的任何一种或其任意组合或部分。在一个具体的实施方案中，将细胞沉积在水凝胶层的第一面上，其表面预先用细胞粘附分子特别是细胞粘附蛋白或肽功能化。可以在水凝胶层的第二面中的任何一个上、在水凝胶层的主体中或其任意组合上进行相同的操作。在一个具体的实施方案中，水凝胶层的第一面、水凝胶层的第二面、水凝胶层的主体中的任何一个或其任意组合包括相同或不同类型的细胞。

在一个特定实施方案中，细胞形成一层或多层。

细胞包括人类细胞。人类细胞可以选自原代细胞，永生细胞系，上皮细胞，内皮细胞，间充质干细胞，脑细胞，肌肉细胞，免疫细胞，诱导性多能干细胞，胚胎干细胞。在表面上呈现整联蛋白受体的所有粘附细胞可以被接种并附着到水凝胶层的两个表面(即第一面和第二面)。非粘附细胞和粘附细胞可以被包封在水凝胶的主体中。

在具体的实施方案中，装置可用于模拟间充质，其中间充质来源的细胞例如但不限于成纤维细胞，骨髓来源的间充质原代细胞和/或肠基质细胞易于驻留和迁移(例如，流通或驻留)。

在一个实例中，将TC7 CaCo2上皮细胞接种在水凝胶层的第一面上，将HUVEC(人脐带静脉内皮细胞)接种在水凝胶层的第二面上。

在本发明的特定实施方式中，上述微流控装置是集成装置，其包括：

水凝胶层、第一元件和第二元件，所述水凝胶层具有彼此相对的第一面和第二面，

其中，水凝胶层在基本上垂直于水凝胶层的给定轴线上介于第一元件和第二元件之间，并且其中第一元件、第二元件和水凝胶层具有确定的形状和尺寸，在第一元件和水凝胶层的第一面勾画出至少一个微通道，以及在第二元件和水凝胶的第二面之间的至少一个腔体，至少一个微通道和至少一个腔体相对于彼此布置，使得给定轴线既截断至少一个微通道又截断至少一个腔体；和

其中水凝胶层在给定轴线上介于第一元件和第二元件之间，所述给定轴线基本上垂直于水凝胶层，并且第一元件、第二元件和水凝胶层具有确定的形状和尺寸，以在第一元件和水凝胶层的第一面之间定义至少一个微通道，以及在第二元件和水凝胶的第二面之间定义和/或形成至少一个腔体，所述至少一个微通道和所述至少一个腔体相对于彼此布置，使得给定轴线截断所述至少一个微通道和所述至少一个腔体，并且，

其中，集成装置包括用于在所述至少一个微通道和所述至少一个腔体之间产生压力差的器件。

所述器件可以包括泵、阀和管道，以将来自存储单元的液体或来自压缩气瓶的气体传输至所述至少一个微通道和所述至少一个腔体。所述器件可以进一步包括流量计、压力计、传感器、指示器和开关。

所述装置可以包括导管(conduit)，所述导管穿过第一元件和/或第二元件，以将液体或气体引入所述至少一个微通道和/或所述至少一个腔体和/或从所述至少一个微通道和/或所述至少一个腔体中抽出。

在一个具体的实施方案中，微流控装置还包括穿过第一元件和水凝胶层的导管，以将液体或气体引入所述至少一个腔体和/或从所述至少一个腔体抽出。

优选地，与导管的连接是在微流控装置的同一侧进行的。

在特定实施方案中，所述第一元件和所述第二元件中的至少一个对至少一个电磁波长是透明的，电磁波长将由所述至少一个微通道和/或所述至少一个腔体内的组分(例如，生物、化学或生化化合物)发射，以使得能够，例如使用显微镜进行视觉或信号检测。

在一个具体的实施方案中，所述第一元件、第二元件和水凝胶层被安装在固定器上，安装在固定器的支座和夹持元件之间，夹持元件优选是可拆卸的，例如螺母。

本发明还涉及一种用于生产本发明的微流控装置的方法，所述方法包括：

a)生产或提供第一元件和第二元件；

b)用包括一种以上化学官能团的分子将第一元件(例如，PDMS)的表面官能化；

c)可选地，用包括一种以上化学官能团的分子将第二元件(例如PDMS)的表面官能化；

d)生产或提供包括一种以上化学官能团的水凝胶层，所述化学官能团有效地与第一元件或第二元件或这两种元件的表面上的分子的至少一种化学官能团反应；

e)将水凝胶层置于第一元件和第二元件之间；以及

f)允许第一元件、第二元件或这两种元件的表面上的分子的至少一种化学官能团与水凝胶层中的至少一种化学官能团共价反应。

在本发明的另一个实施方案中，所述用于生产本发明的微流控装置的方法包括以下步骤：

a)生产或提供第一元件的第一部件、第一元件的第二部件和第二元件；

b)用包括一种以上化学官能团的分子将第一元件(例如PDMS)的第一部件的表面官能化；

d)生产或提供包括一种以上化学官能团的水凝胶层，所述化学官能团有效地与第一元件的第一部件和/或第二元件的表面上的分子的至少一种化学官能团反应；

e)将水凝胶层置于第一元件和第二元件之间；以及

f)允许第一元件的第一部件和/或第二元件的表面上的分子的至少一种化学官能团与水凝胶层的至少一种化学官能团共价反应。

在本发明的又一个实施方案中，所述用于生产本发明的微流控装置的方法包括以下步骤：

a)生产或提供第一元件、第二元件的第一部件和第二元件的第二部件；

b)用包括一种以上化学官能团的分子将第一元件(例如PDMS)的表面官能化；

c)可选地，用包括一种以上化学官能团的分子将第二元件(例如PDMS)的第一部件的表面官能化；

d)生产或提供包括一种以上化学官能团的水凝胶层，所述化学官能团有效地与第一元件和/或第二元件的第一部件的表面上的分子的至少一种化学官能团反应；

e)将水凝胶层置于第一元件和第二元件之间；以及

f)允许第一元件和/或第二元件的第一部件的表面上的分子的至少一种化学官能团与水凝胶层的至少一种化学官能团共价反应。

在一个特定实施方案中，所述方法还在所述步骤d)和e)之间包括以下步骤：

i)产生或提供至少一种细胞粘附分子，特别是细胞粘附蛋白；

ii)可选地，在生产所述水凝胶层的步骤期间，允许至少一种细胞粘附分子与水凝胶层的至少一种化学官能团共价结合，使得至少一种细胞粘附分子存在于水凝胶层的主体中；

iii)可选地，在生产所述水凝胶层的步骤中，将细胞接种在水凝胶层的主体中；

以及，在步骤f)之后，进行以下步骤：

g)共价结合至少一种细胞粘附分子和水凝胶层的至少一种化学官能团，使得至少一种细胞粘附分子存在于水凝胶层的第一面、第二面或两个面；以及

h)将相同或不同类型的细胞接种在所述水凝胶层的第一面，第二面或两个面。

术语“官能化”是指通过形成共价键将分子、化合物或原子附着在材料表面上。

如本文所用，术语“官能化”是指修饰材料的表面性质的过程，例如通过经由分子的附着或通过官能团取代化学键来添加新的功能。

在本发明的一个实施方案中，用氧等离子体处理第一元件、第二元件或这两种元件的表面。在另一个实施方案中，用氧等离子体处理第一元件的第一部件和/或第二部件的表面或第二元件的第一部件和/或第二部件的表面。进行氧等离子体以便引入极性表面基团，例如硅烷醇基团(SiOH)。氧等离子体处理经改性处理的表面以改善表面粘附性能来“活化”所述经处理的表面。本领域技术人员将能够确定适合于氧等离子体处理的参数和条件，以便修饰给定的材料。例如，可以通过在35mbars，50mW的氧等离子体中暴露1分钟来修饰PDMS的表面。

在一个具体的实施方案中，使第一元件、第二元件或这两种元件的经氧等离子体处理的表面进一步与包含硫醇基或巯氢基官能团的分子接触。该步骤涉及将所述分子接枝或附着到经氧等离子体处理的表面上。该分子可以包括在浓度范围为0.1至10％(v/v)的溶液中。

该分子可以具有通式X(CH₂)n SiY3，其含有反应性官能团X和Y。X是暴露在第一元件、第二元件或这两种元件的表面上的官能团(例如巯基)，其能够进行化学反应，特别是与水凝胶层的官能团(如乙烯基砜基团)进行化学反应以形成共价键；n为1至3的整数；Y为甲氧基、乙氧基、甲基等官能团。Y是与第一元件或第二元件的表面结合的基团。此类分子的实例包括但不限于(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，(3-巯基丙基)三乙氧基硅烷和(3-巯基丙基)甲基二甲氧基硅烷。在一个具体的实施方案中，所述分子包括(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPS)或由其组成。

可用于使分子与第一元件、第二元件或这两种元件的所述经氧等离子体处理的表面接触的技术包括但不限于浸入(即溶液浴)、滴加、旋涂、浸涂、气相沉积。

在一个具体的实施方案中，将第一元件、第二元件或这两种元件的经氧等离子体处理的表面浸入1％(v/v)(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPS)在乙醇和乙酸的混合物的溶液中一小时。然后将经MPS处理的表面用70％(v/v)乙醇洗涤，并在110℃下烘烤1小时。

在一个具体的实施方案中，将第一元件、第二元件或这两种元件的功能化表面在10mM二硫苏糖醇(DTT)溶液中孵育。该步骤确保在所述官能化表面上还原的二硫键。然后用纯水冲洗表面并用压缩空气干燥。

在一个优选的实施方案中，通过交联乙烯基砜官能化的聚乙二醇(PEG-VS)大分子单体和硫醇官能化的聚乙二醇(PEG-SH)大分子单体，来生产水凝胶层。所述交联通过使用适合于制备的预定化学计量比将所述PEG大分子单体(PEG-VS和PEG-SH)的储备溶液混合而引发，例如，乙烯基砜可以以与硫醇相比1.2mM的摩尔过量加入。然后将所得的凝胶状混合物转移至合适的载体材料上，并与平坦的疏水材料(例如疏水载玻片)接触。一旦例如通过乙烯基砜基团和硫醇基团之间的迈克尔型加成反应达到所需的聚合度或交联度，然后将所得的水凝胶在室温下固化。聚合或交联持续时间取决于PEG的浓度。在完成凝胶化之前，将水凝胶转移至第一元件或第二元件(例如，表面活化的PDMS主体)以覆盖其中包括的一个或多个凹槽，从而形成一个或多个微通道。

在另一个实施方案中，PEG大分子单体(包括PEG-VS大分子单体和/或PEG-SH大分子单体)通过多肽交联以产生水凝胶层。包含多肽作为交联剂的所述水凝胶层对各种蛋白酶(包括金属蛋白酶(MMP))敏感。

在一个具体的实施方案中，至少一种细胞粘附蛋白(特别是通过异双功能蛋白交联试剂)附着于水凝胶层的第一面、第二面或两个面。所述细胞粘附蛋白的所述附着可以如下进行：在微通道和/或腔体中灌注含有所述细胞粘附蛋白的液体，然后进行孵育期。所述细胞粘附蛋白优选与异双功能蛋白交联剂偶联，该异双功能蛋白交联剂与水凝胶层的第一面、第二面或两个面的表面官能团反应。

所述细胞粘附蛋白与所述异双功能蛋白交联剂的化学计量比在1：1至1：20的范围内。

在一个具体的实施方案中，在与PEG-VS大分子单体交联之前，至少一种细胞粘附蛋白(特别是通过异双功能蛋白交联剂)附着到PEG-SH大分子单体的硫醇基团上。

细胞粘附蛋白包括纤连蛋白的重组结构域片段，例如FN 9-10片段。

异双功能蛋白质交联剂包括胺-巯氢基(amine-to-sulfhydryl)交联剂，例如NHS-PEG-马来酰亚胺交联剂。

在本发明的一个实例中，NHS-PEG-马来酰亚胺交联剂的马来酰亚胺基团与水凝胶层的第一面、第二面或两个面上的硫醇基(-SH)反应。

在一个具体的实施方案中，通过将悬浮在液体中的细胞经由微通道或腔体依次递送或注射至水凝胶层的第一面或第二面来接种细胞，随后进行孵育期。

在一个具体的实施方案中，通过将细胞添加到附着于至少一种细胞粘附分子的PEG-VS大分子单体和PEG-SH大分子单体的混合物中，将细胞接种在水凝胶的主体中。

所述细胞粘附分子(特别是细胞粘附蛋白)有利地被Fc抗体片段或异功能蛋白交联剂修饰。Fc抗体片段被吸附(例如，非共价连接)至含有蛋白A或蛋白G或对Fc片段具有亲和力的任何其他分子的水凝胶层。可以在水凝胶合成步骤期间，将蛋白A或蛋白G或对Fc片段具有亲和力的任何其他分子掺入到水凝胶层中(例如，可以加入到PEG大分子单体的混合物中)。

通过在所述异双功能蛋白质交联试剂和水凝胶层的所述至少一个官能团(特别是硫醇基团)之间形成共价键，所述异功能团蛋白质交联试剂与水凝胶层的至少一个官能团(特别是硫醇基团)相连。

在具体的实施方案中，在水凝胶层的交联完成之前，使包括一种以上化学官能团的水凝胶层与第一元件、第二元件或这两种元件的表面接触以引发化学反应，所述第一元件、第二元件或这两种元件包含具有一种以上化学官能团的分子，其中，所述水凝胶层的至少一种化学官能团与在第一元件、第二元件或这两种元件的表面的所述分子的至少一种化学官能团形成共价键。

本发明还涉及一种用于驱动本发明的微流控装置的水凝胶层的方法，所述方法包括：

a)将液体或气体引入第一元件与水凝胶层的第一面之间的至少一个微通道；

b)将液体或气体引入第二元件与水凝胶层的第二面之间的至少一个腔体；

c)使所述液体或气体流过第一元件与水凝胶层的第一面之间的所述至少一个微通道；

d)使所述液体或气体流过第二元件与水凝胶层的第二面之间的所述至少一个腔体；以及

e)调节或改变所述至少一个微通道或所述至少一个腔体中的所述液体的流速或所述气体的压力，在所述至少一个微通道和所述至少一个腔体之间产生压差，通过交替地在垂直于水凝胶层的平面的两个相反方向上朝向所述至少一个微通道或所述至少一个腔体的折曲或弯曲，使水凝胶层膨胀或收缩。

根据本发明，微流控装置可用作器官芯片装置，特别是包括人类细胞并模拟生理状况的装置。相应地，如实施例所示，水凝胶层的驱动可以被实现，特别是使用以下步骤和/或参数。

在特定实施方案中，通过施加微通道中的液体(即，在第一元件和水凝胶层的第一面之间)和腔体中的液体(即在第二元件和水凝胶层的第二面之间)的不同流速，来施加流体压力差。在一个实施方案中，仅改变在所述微通道中的所述液体的流速，在所述腔体中的所述液体的流速在大气压下保持恒定或静态。

在一个具体的实施方案中，所述液体在所述微通道中的流速在0μl.h^-1至10,000μl.h^-1的范围内。在一个优选的实施方案中，所述液体在所述微通道中的流速为30μl.h^-1至1500μl.h^-1。在一个实施方案中，所述流速周期性地在30μl.h^-1至1500μl.h^-1之间变化，频率最高为0.2Hz。在另一个实施方案中，在所述微通道中以1500μl.h^-1的猝发(burst)施加所述液体的脉动流(pulsatile flow)，每分钟持续5秒。

在一个具体的实施方案中，引起水凝胶层的拉伸至多为25％，尤其是10％，这特别是通过如下过程引起的：在10秒内将微通道中的流速从30μl.h^-1周期性地增加到1500μl.h^-1，然后在30μl.h-1进行10到50秒的弛豫时间。水凝胶层的这种驱动可以历时几天，例如7天。

在一个具体的实施方案中，所述微通道中的所述液体和所述腔体中的所述液体相同或不同。

本发明的特定特征将在以下附图和实施例中说明。本文公开的特征也定义了如上的本发明的实施方式。

附图说明

图1：(A-B)基于液压驱动的水凝胶层(HAHL，Hydraulically Actuated HydrogelLayer)的微流控装置的概念；水凝胶薄层通过上通道和下通道之间的压差随时间被驱动。由于水凝胶与第一元件的共价结合，因此，驱动是可能的。通过随时间变化的液压，驱动曲线直接受HAHL装置用户的控制。(C)作为概念的早期证明，HAHL装置在上部通道(P1)中接种了Caco2/E-Cad::GFP上皮细胞，在下部通道(P2)中接种了野生型HUVEC。标尺200微米。虚线矩形：插入位置。虚线：上部微流控通道的极限。(D)早期HAHL微流控装置的初步结果。闭路用于几天内的HAHLs灌注和水凝胶层变形的评估，使用2D显微镜观察放置在驱动的水凝胶顶部的细胞。(E)基于周期性细胞位移的微观分析，评估PEG-纤连蛋白(PEG-Fn)机械传感器的变形。误差棒＝超过3个特征的标准偏差。可视化在PEG-Fn水凝胶层上二维生长的C2C12细胞。(F)在薄的PEG机械传感器上接枝的透明质酸-明胶水凝胶的两个区域中的差异变形。星形表示圆形变形非常大的点，以至于导致通道中心上方的珠子离开焦平面，因此强制使用不再具有小角度近似的点。R2＝线性回归的确定系数。误差棒＝基于对5个特征(成对的珠子)的分析得出的标准偏差。

图2：定量评估流速与平均细胞面积变形之间的关系。图A和图B显示了在不同流速下在HAHL装置上机械刺激的细胞的两张照片。由于材料中发生拉伸的方式，趋势线被计算为对数。

图3：HAHL-微流控装置上的上皮分化。早在接种后2天，接种的CaCo2细胞就显示出清晰的3D组织(organization)形成绒毛状结构的迹象(拉伸条件：在连续流动下)。相同的细胞仍会经历24小时延迟的3D组织。

图4A：根据穿过微通道和腔体的平面的本发明的微流控装置的三维剖视图。

图4B：图4A所示的装置的组成元件的分解图。

图5：本发明的微流控装置的第一元件的示例性实施方式的截面图。

图6：本发明的各种装置构造(剖视图)。

具体实施方式

实施例1：液压驱动的水凝胶层：概念验证

早期的概念验证是通过研究驱动来证明的，例如通过液压使水凝胶薄层膨胀和收缩。实际上，结合了液压驱动的水凝胶层(HAHL)的微流控装置是由硅橡胶(PDMS)和PEG水凝胶制成的。使用微细加工和软光刻技术在PDMS中产生微流控通道。在第二步中，产生具有不同弹性模量的PEG水凝胶薄层，并通过表面官能化(巯基丙基硅烷基)共价结合到PDMS主体。此关键步骤依赖于将硫醇基团接枝到PDMS的表面，然后将其用于共价结合PEG水凝胶的乙烯基砜基团，以形成微流控通道，该微流控通道的一侧衬有由相当于细胞外基质(Extracellular Matrix)的软合成材料制成。该组装使接种的细胞暴露于模拟其天然微环境的生物力学和生物化学信号(cues)。最后，将PDMS/水凝胶组件安装在定制固定器中的玻璃盖玻片上。这样，组装好的装置形成了水凝胶界面，该水凝胶界面可以在上面和下面都灌注并接种细胞。

对基于HAHL的微流控装置的初步表征表明，该概念足够稳健可以在装备合理的生物医学实验室中获得相当可观的设备产量。初步研究始于验证PEG水凝胶薄层的液压驱动。通过在两个微流控通道之间插入水凝胶层来调节压力，可以有效地驱动细胞培养的PEG水凝胶层。此外，验证了将上部通道中的流量/压力与水凝胶层的机械变形程度联系起来的数学函数(图1A-B，D-F)。利用当前通道的几何形状和水凝胶力学性能，已证实获得的细胞拉伸非常接近地模拟了肠道微环境的体内物理环境(10％的拉伸率，在5kPa弹性模量下为0.2Hz频率)。

在第二步骤中，可通过在底部微流控通道中施加液压，来堆叠并有效地驱动多达三层的水凝胶。在最大500μm时，仅损失了20％的拉伸幅度(耗散)。该实验清楚地表明，基于HAHL的微流控装置可以有效地用于机械刺激3D细胞封装的水凝胶层。

最后，证明了PEG水凝胶可以用纤连蛋白和其他ECM蛋白功能化。共价偶联依赖于蛋白质胺或硫醇的迈克尔型加成到PEG水凝胶的乙烯基砜基团上。发现该策略对于促进细胞粘附到其它惰性PEG材料是有效的。例如，多种细胞类型有效地接种在HAHL设备上，包括原代细胞(HUVEC)或衍生细胞系(成纤维细胞，C2C12，Caco2…)(图1C和E)。这些初步实验还表明，接种的细胞可以很好地粘附，经过机械刺激长达17天，并且可以存活。

实施例2：确定最佳的水凝胶机械性能：凝胶浓度和厚度。

测试了范围从2.5％到10％的各种PEG水凝胶浓度。在所有条件下，我们保留了1.2mM的游离SH基团，以便在需要时进一步固定蛋白质或肽。还生产了170μm和340μm厚的凝胶，以便确定与PDMS结合的凝胶拉伸但在液压载荷下不会破裂的最佳条件。最成功的HAHL装置设置基于5％、170μm厚的PEG凝胶。在这些条件下，已证明所有生产的装置中有50％或更多没有泄漏，并且可以承受液压驱动。此外，已证明，可以用PEG浓度变化的以及因此的弹性模量变化的水凝胶生产HAHL装置。通常，可用含有5至10％(w/v)PEG的水凝胶(分别对应于10至30kPa的剪切模量(G'))生产HAHL装置。

实施例3：驱动基于HAHL的微流控装置。

在为HAHL装置确保可靠的组装方案后，研究了应用于装置的不同流速与PEG水凝胶层的拉伸程度之间的关系。可以在上部通道中灌注多达10,000μl.h^-1，而不会使水凝胶破裂。此条件对应于约20％的单轴拉伸。

为了确认所获得的水凝胶变形影响接种在水凝胶层两面上的细胞，将水凝胶层用纤连蛋白片段官能化并接种Caco2。细胞粘附后，将HAHL装置置于一定的流速范围内，并测量细胞变形(图2A-B)。30μl.h^-1的连续流速不会产生可观察到的变形，而将流速增加到1500μl.h^-1会立即使平均细胞面积增加10％(图2C)。最引人注目的是，可以通过在30和1500μl.h^-1之间以高达0.2Hz的频率交替改变流速，来周期性地进行该驱动。

实施例4：在HAHL系统中使肠道芯片(Gut-on-Chip)成熟

在完成HAHL装置的机械表征后，发明人决定研究在这些装置上培养的内皮和上皮衬里(分别为HUVEC和CaCo-2)的成熟。分别在上部通道和下部通道以30μl.h-1的恒定流速连续接种和灌注这两种细胞类型。几天后，观察到内皮细胞和上皮细胞呈扁平且坚固的单层，并开始脉动流(1500μl.h^-1的猝发，每分钟持续5秒)，以诱导水凝胶和细胞拉伸。在装置的上皮和内皮侧均观察到清楚且明显的分化迹象。图3显示，早在液压驱动开始两天后，CaCo-2单层便开始以3D形式组织。观察到让人联想到大肠的绒毛的结构。在内皮侧，HUVEC组织从连续的单层变为分支/管状网络(图3)。当比较静态和驱动的HAHL装置时，发现循环应变可以使3D结构的出现加快24至48小时。

全局地，这些实验表明：

·水凝胶薄层的液压驱动可以成功维持超过7天。

·如本文所述，液压驱动不会引起细胞或水凝胶分层。

·接种的细胞的液压驱动可实现更快更好的分化。

·接种的细胞可以在HAHL装置上存活并分化，有效地重现了健康肠道组织的结构。

·如果显微镜配备了实时成像功能，则HAHL系统与延时显微镜连续观察完全兼容。

实施例5：光刻控制生产(Photolithography masters production)。

HAHL装置的设计是在CleWin物理布局编辑器软件(美国，Phoenix软件)中生成的。简而言之，设计的第一层由两个7.5毫米长和1毫米宽的通道组成。这些笔直的通道连接到入口和出口(直径2mm)。第二层被设计成提供直径为18mm的凹口，该凹口可以容纳水凝胶薄层，在本文中被称为“池”。从Selba S.A(瑞士)订购了相应的光刻掩模，以50000DPI打印在透明塑料板上。在两个掩膜上引入了微米级对准标记，以确保两个微流控通道都在池中心产生。接下来，将直径为4”的硅晶片(法国，Neyco S.A.)用作光刻的基底。旋涂SU8-2100树脂(Microchem，MA，美国)，调节前烘(soft bake)、曝光(exposure)和后烘(post exposurebake)参数，以获得500μm厚的第一层。在MJB4掩模对准器(Süss)上进行光刻。然后用针对厚度为250μm的微加工参数，生产包括微流控通道的第二层。最终，在丙二醇单甲醚乙酸酯(PGMEA，美国密歇根州西格玛奥德里奇)中开发了微加工的掩模，并在200℃下坚膜(hardbake)2小时。然后，在Dektak XT台阶仪(Bruker，美国)上测量所产生结构的高度。

实施例6：软光刻(PDMS主体生产)

首先，将30g聚二甲基硅氧烷(PDMS，Sylgard 184Dow Corning)基料与固化剂按1:10的比例混合。然后，将得到的溶液剧烈搅拌3分钟，并通过在真空下再保持30分钟将其脱气。将获得的混合物倒入含有微加工模具的培养皿中，不引入新的气泡。最后，将铸塑的PDMS在80℃下烘烤2小时，以获得完全交联的微加工掩模的模型。

PDMS固化后，用手术刀和小刮铲将PDMS从其模具中取出。然后用魔术透明胶带(3M)覆盖含有微流控通道的PDMS表面。然后，将获得的PDMS用直径为35mm的打孔机打孔，以便在将芯片放入定制固定器中时使微流控通道居中。接着，使用内径为0.75mm的打孔机打孔入口和出口。这些连接在中心通道的延长线上成45度角，以减少灌注时水凝胶上的负荷。

实施例7：PDMS主体的表面功能化

每个PDMS主体均装有四个金属连接器，以确保更轻松地连接到流体主管线。为了防止液体泄漏，将一滴氰基丙烯酸酯胶涂抹在突出的连接器的底部周围。接下来，除去透明胶带，将PDMS主体正面朝上放置在等离子清洁器中。然后将PDMS主体在35mbars、50mW的氧等离子体中暴露1分钟。活化表面后，将PDMS主体浸入1％(v/v)3-巯基丙基-(三甲氧基)-硅烷(MPS)的无水乙醇(300ml)和10滴乙酸的溶液中一小时(所有化学药品均购自SigmaAldrich)。随后进行两次70％的乙醇洗涤，将PDMS主体在非纤维组织上空气干燥10分钟，然后将其放入110℃的烘箱中一小时。然后将PDMS主体保存在4℃下。

实施例8：水凝胶浇铸并结合到PDMS主体的表面

在制备水凝胶之前，首先将PDMS主体在10mM二硫苏糖醇(DTT)溶液中孵育至少10分钟，以还原PDMS主体表面的二硫键。通过混合两种不同的10kDa官能化聚乙二醇(PEG)大分子单体(日本NOF公司)的储备溶液，来制备水凝胶。采用确保乙烯基砜过量1.2mM的化学计量比，混合四臂硫醇官能化的PEG大分子和八臂乙烯基砜官能化的PEG大分子。通常，通过将10.1μl的PEG-VS(12％w/v)、21.2μl的PEG-SH(12％w/v)和18.7μl的三乙醇胺(TEA)缓冲液(0.3M，pH 7.5)混合，获得50μl的7.5％(w/v)PEG水凝胶。在仍为液体的同时，将40μl的胶凝混合物吸移到含单个孔(直径18mm，深260μm)的Teflon圆柱体上，并用疏水性载玻片(SL2，Sigma Aldrich)覆盖。水凝胶的聚合是通过乙烯基砜官能团在巯基上的迈克尔型加成反应实现的。交联的持续时间在所有测试的PEG浓度上都不同；通常，将7.5％PEG凝胶在室温下放置30分钟以进行固化。在胶凝化或交联完成前三分钟，将残留在DTT中的PDMS主体用Milli-Q水彻底冲洗，并用过滤的压缩空气干燥。然后，将疏水性载玻片小心地从装有凝胶的Teflon模具中取出。然后，将活化的PDMS主体轻轻地压在水凝胶的表面上，以使水凝胶完全覆盖PDMS主体的两个通道。覆盖水凝胶时，轻轻按压PDMS主体的侧面，以使内部中心均匀地接触水凝胶，从而排除气泡。在此步骤中，重要的是要确保水凝胶平坦，以使通道被水凝胶均匀覆盖，并且通道内的PDMS表面不会接触水凝胶。然后，将组件在室温下放置一小时，以使水凝胶中过量的乙烯基砜基团与PDMS表面的硫醇发生共价反应。结合后，将两块小心地分离，使水凝胶转移到PDMS主体的表面。

实施例9：重组蛋白的产生和聚乙二醇化(PEGilation)

为了将细胞接种在HAHL装置上，需要使原本惰性的PEG水凝胶变成细胞粘附性的。重组纤连蛋白结构域9和结构域10用于促进细胞粘附。相应的合成基因是从Eurofins^TM(法国)订购的。在pGEX-4T-1表达载体(GE Lifesciences)中克隆，在Institut Pasteur的重组蛋白平台上进行表达和纯化。FN9-10片段在4L培养物中的大肠杆菌BL21 Star^TM(DE3)中表达。重组蛋白的纯化在GST柱上进行，然后凝血酶裂解纯化标签。将纯化的FN9-10片段在PBS中浓缩为3.5mg.ml^-1。然后，以1:4的化学计量比将所得的FN9-10片段通过其游离仲胺偶联至3.5kDa异官能团NHS-PEG-马来酰亚胺连接子(NOF Corporation)。将500μl的FN9-10(浓度为3.5mg.ml^-1)与29μl的PEG连接子(浓度为50mg.ml^-1)在室温下孵育1小时。然后，在微流控通道中和水凝胶的自由表面上，灌注聚乙二醇化的FN9-10溶液。然后将经处理的HAHL装置在37℃下孵育2小时。最后，用PBS洗涤将过量的FN9-10洗掉。

实施例10：细胞接种

HAHL装置可以接种各种不同的粘附细胞。在此实施例中，使用了TC7 CaCo2上皮细胞和HUVEC(人脐静脉内皮细胞)。在接种到HAHL装置上之前，将细胞在常规T75烧瓶中培养。然后通过胰蛋白酶消化收获细胞。将3ml胰蛋白酶(对于HUVEC为0.05％，对于CaCo细胞为0.25％)吸移到细胞上。在37℃下5分钟后，在显微镜下检查烧瓶以检查细胞脱离情况。加入6ml培养基，并将脱离的细胞收集在50ml管中。然后将细胞以300g离心5分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于300μl培养基中。通过将20μl移至Malassez血细胞计数器上来评估细胞浓度。对于HUVEC，将浓度调整为1百万个细胞.ml^-1；对于Caco2，将浓度调整为6-8百万个细胞.ml^-1。通过将100μl的HUVEC悬浮液输送到倒置HAHL装置的水凝胶部分，开始接种程序。孵育(在37℃下30分钟)后，HUVEC很好地粘附在纤连蛋白包被的水凝胶上。进行PBS洗涤以去除非粘附细胞。然后将接种的HAHL装置翻转，并将Caco2细胞悬浮液注入微流控通道。同样，将HAHL-芯片置于37℃过夜，以确保Caco2细胞的良好粘附。然后通过在微流控通道中轻轻灌注培养基，来去除多余的非粘附Caco2细胞。为了获得HUVEC和Caco2细胞的汇合(confluent)单层，在这些静态条件下的细胞培养(无灌注)继续进行了另外的24小时。

实施例11：HAHL装置组装

在接种细胞之前，将HAHL装置组装在定制的固定器中。首先，将直径约30mm的盖玻片放入固定器中。其次，将PDMS环(外径35毫米，内径20毫米，厚度1毫米)放置在盖玻片的顶部，形成一个小的贮液池。在放置HAHL装置之前，向贮液池中注满EGM2培养基(Lonza)，同时要确保没有气泡混入。然后放置HAHL装置，使水凝胶面对贮液池。最后，通过拧紧紧固环，将组件密封关闭。Tygon^TM管(预先填充有PBS)插入芯片的流体连接器可确保适当的微流控界面。

实施例12：HAHL设备灌注

一旦获得单层，则通过Tygon管将HAHL装置的上部微流控通道连接至包括Caco2培养基的Hamilton玻璃注射器。通过将注射器连接到neMESYS泵系统(Cetoni GmbH)，开始以30μl.h^-1的速度连续灌注。为了研究不同的拉伸方式，改变了HAHL装置的驱动方案。通常，通过在10秒内将流速从30循环升高到1500μl.h^-1，然后进行张弛周期(在30μl.h^-1下10到50秒)，可将水凝胶层拉伸10％。调节流速和周期以改变水凝胶层的应变。每个实验通常进行7天。通过在Qmix软件(Cetoni GmbH)中开发相应的脚本，可以自动控制流速随时间变化曲线。

实施例13：HAHL设备实时和固定成像

图像采集方案进行了大量的修改，以适应每个实验的需要。在配备了落射荧光(Collibri^TM2)、温育室和Orcaflash V4.0 CMOS相机的Axio Observer Z1倒置电动显微镜(德国卡尔蔡司)上，获取快照、定时拍摄、马赛克和z堆栈。大多数图像是使用10倍，0.45NA，Phase1物镜采集的。

在细胞培养不同时间后，将HAHL装置固定以用于后续的染色和成像。首先，将分解后的设备浸入磷酸盐缓冲液(PBS)溶液(ThermoFischer scientific)中5分钟，进行两次洗涤。然后，将设备浸入4％(w/v)、pH 7.4的多聚甲醛(Sigma Aldrich，MI，美国)溶液中15分钟。进行最后的两次PBS洗涤，然后将装置密封在培养皿中并保持在4℃。

实施例14：细胞拉伸定量

在实验开始之前，选择了一种装置(接种后一天)进行细胞拉伸定量。用20mbar至70mbar的压力(增量为10mbar)对设备进行灌注。在每个压力增量下对CaCo-2细胞成像，并使用图像分析软件“Fiji”对拉伸进行定量。从成像部分中选择五个细胞，并在每个压力增量处在它们周围绘制感兴趣的区域。在每个压力增量下，测量并比较细胞的面积。计算面积差，并在每个压力增量处记录拉伸百分比，为5个细胞的平均值。然后使用特定于HAHL装置的已建立关系，将细胞的拉伸转换为流速。需要多次重复意味着必须从每个实验中选择一个器件，以缩小误差范围并提高准确性。

微流控装置的3D构造的示例性实施方式

现在我们同时参考图4A和图4B，其代表根据本发明的实施方式的微流控装置10。微流控装置10由组装在一起以形成微流控装置10的几个部分形成。然后，其包括第一元件11、水凝胶层14和第二元件16。这三个部分11、14、16安装在固定器18的内部。第一元件11由单独的一个第一部件12和一个第二部件13形成。

在附图中公开的实施方案中，微流控装置10具有大体圆柱形的形状。然而，应当理解，装置10可以具有任何其他形状。

更具体地，第一部件12可以由可以接枝硫醇基团的任何透明材料制成。第一部件12的厚度为2至25mm。第一元件11具有沿方向40彼此相对的第一表面3和第二表面5，方向40基本上垂直于第一元件11。第一表面3和第二表面5通过外围表面15连接在一起，外围表面15可以是圆柱形。如图4A所示，当组装微流控装置时，在第一元件11上形成凹口20，以便在第二表面5上敞开。特别地，凹口20部分地在第一部件12内并且由第二部件13形成。凹口20包括底面22和形成外边界的圆柱形侧壁23。至少一个凹槽24形成在凹口的底部，例如两个，如图5所示。在示例性实施方案中，凹槽24是直的，并且可以具有0.1mm至5mm的宽度和0.1mm至5mm的深度，长度在0.2mm至20mm之间。可以使用诸如光刻的任何种类的技术来形成凹槽24或多个凹槽。在一个实施方案中，应当理解，由于第一元件11的大体圆柱形形状，第二表面5可以是基本环形的。

凹口可以具有与图中描述的形状不同的形状。例如，凹口可以是正方形或矩形。因此，凹口可以包括多个侧壁，这些侧壁结合在一起以勾画出所述凹口的外部边界或周界。

在附图所示的示例性实施方案中，第二元件16由透明材料的扁平薄片形成，即盖玻片或盖片，其可以具有在0.1mm和0.17mm之间的恒定厚度。

如图4A和4B所示，由第一部件12和第二部件13形成的所述第一元件11，所述第二元件16和所述水凝胶层14被安装在固定器18内，固定器18包括圆柱形壁26，圆柱形壁26具有第一端26a和第二端26b，第二端26b连接到环形径向壁28，环形径向壁28形成用于安装第二元件16的桥台墙(abutment wall)。如图所示，环形径向壁28的径向内端勾画出开口30。第二元件16覆盖凹口20的出口，并因此与水凝胶层14和凹口20的圆柱形侧壁23勾画出腔体32。

水凝胶层14包括朝向凹口20的底面22的第一面7和与第一面7相对并朝向第二元件16的第二面9。水凝胶层14的第一面7被施加到凹口20的底面22上，从而封闭所述凹槽，以形成微通道34或多个微通道。

按照以下方式组装微流控装置10。水凝胶层14安装在凹口20的内部，凹口20的尺寸和形状完全在其中容纳水凝胶层14。更具体地，在此实施方案中，凹口的尺寸和形状被配置为允许水凝胶完全装进凹口内而不必使水凝胶层变形(例如，起皱或折叠)。凹口的侧壁接触或不接触地围绕水凝胶层的外围或边缘。

水凝胶层14覆盖所述凹槽24或在凹口20的底面22上形成的凹槽，以形成微通道34。第二元件16或盖玻片安装在固定器18内并与径向壁28邻接，并且由第一元件11和水凝胶层14形成的组件被安装在固定器18的内部，使得第二环形表面5被压在第二元件16或盖玻片上。我们注意到，第一元件11的第二部件13具有环形形状，以及例如矩形截面。第二部件13介于第二元件16和第一元件11之间，以完美地密封第一元件11的第一部件12与第二元件16的接合处。夹持元件38安装在固定器18上并允许通过将第一元件11和第二元件16拧紧到固定器18的径向壁28上来组装设备。这里的夹持元件38由拧在固定器18的圆柱形壁26的螺纹内表面上的螺母形成。

如图4A清楚所示，水凝胶层14在给定轴线40上插入第一元件11和第二元件16之间，给定轴线40基本垂直于水凝胶层14。而且，确定第一元件11、第二元件16和水凝胶层14的形状和尺寸以勾画出至少一个微通道34和至少一个腔体32，所述至少一个微通道34在第一元件11和水凝胶层14的第一面7之间；所述至少一个腔体32在第二元件16和水凝胶层14的第二面9之间，所述至少一个微通道34和所述至少一个腔体32相对于彼此布置，使得给定轴线40截断所述至少一个微通道34和所述至少一个腔体32。

为了允许将液体引入腔体32内，导管42穿过第一元件11，更准确地，导管42穿过第一元件11的第一部件12和水凝胶层14，至少一个导管42用于引入液体，并且至少另一个导管42用于排出液体。同样，图4B展示了一个导管43，用于在由凹槽24和水凝胶层定义的微通道34内引入液体或气体。显然，微流控装置还包括用于排出流体的导管(未示出)。

还应注意，第一元件11可仅包括第一部件12，即，不包括第二部件13。

微通道34连接至流体回路44(图5)，回路44包括用于改变所述至少一个微通道34与所述至少一个腔体32之间的流体压力差的器件46(图5)。至少一个微通道34与所述用于改变压差的器件46的连接以及如上所述的腔体32和微通道34在给定轴线上的布置，使水凝胶层14通过交替地在垂直于水凝胶层的平面的两个相反方向上朝向所述至少一个微通道34或所述至少一个空腔32折曲或弯曲而膨胀或收缩。

在最有效的实施方案中，微通道34的长度为8mm。它的宽度为1mm，深度为0.250mm。腔体32的直径为20mm，深为2mm。

应当认为，用于指代“第一元件”或“第二元件”的术语“元件”可以表示是单件构造的元件，即被制造为单件。如在图6的以下描述中将描述的，它也可以指定包含几个独立部件的元件，并且在图4A的实施方案中就是这种情况。

应当清楚地理解，第一元件和第二元件是单独的部件，其组装在一起以定义壳体，水凝胶层安装在该壳体中。根据该解释，凹口、腔体和至少一个凹槽中的每一个都被包含在壳体内。第一元件和第二元件相互接触，以在第一元件和第二元件之间的接合处限定封闭的密封轮廓。

同样，在所有实施方案中，水凝胶层不经受由第一元件或第二元件中的任何一个以及由于第一元件和第二元件的任何一个子部件而施加的任何压力。

实际上，我们将参考图6，其表示本发明的微流控装置的不同构造，其中第一元件和第二元件具有不同的形状。即使没有描述，在下文中描述的每个微流控装置也包括流体回路，该流体回路可以包括参考图5描述的流体差压器件。

在下文描述的图6的不同实施方案中：

-第一列对应于图6A至6H，其表示一个微流控装置的示意图，该微流控装置包括：具有一个凹槽24A、24B、24C、24D、24E、24F、24G、24H的第一元件11A、11B、11C、11D、11E、11F、11G、11H，一个水凝胶层14A、14B、14C、14D、14E、14F、14G、14H以及第二元件16A、16B、16C、16D、16E、16F、16G、16H，水凝胶层与第二元件限定了腔体32A、32B、32C、32D、32E、32F、32G、32H；

-第二列对应于图6A'至6H'，其表示分别与图6A至6H所示的布置相同的一个示意图，不同之处是水凝胶层14A'、14B'、14C'、14D'、14E'、14F'、14G'、14H'同时覆盖在相同第一元件11A'、11B'、11C'、11D'、11E'、11F'、11G'、11H'内形成的多个凹槽24A'、24B'、24C'、24D'、24E'、24F'、24G'、24H'，并且水凝胶层与第二元件16A'、16B'、16C'、16D'、16E'、16F'、16G'、16H'限定了一个单独的腔体32A'、32B'、32C'、32D'、32E'、32F'、32G'、32H'；和

-第三列对应于图6A”至6H”，其表示分别与图6A至6H所示的布置相同的一个示意图，不同之处是具有多个水凝胶层14A”、14B”、14C”、14D”、14E”、14F”、14G”、14H”，每个水凝胶层覆盖在相同第一元件11A”、11B”、11C”、11D”、11E”、11F”、11G”、11H”内形成的一个凹槽24A”、24B”、24C”、24D”、24E”、24F”、24G”、24H，各个水凝胶层14A”、14B”、14C”、14D”、14E”、14F”、14G”、14H”与第二元件形成腔体32A”、32B”、32C”、32D”、32E”、32F”、32G”、32H”。

在图6A、6A'和6A”表示的一个实施方案中，微流控装置包括没有任何凹口的一个第一元件11A、11A'、11A”，凹槽24A、24A'、24A”被水凝胶层14A、14A'、14A”覆盖。第二元件16A、16A'、16A”包括凹口，水凝胶层容纳在该凹口中。第一元件与第二元件环形接触。第一元件11A、11A'、11A”和第二元件16A、16A'、16A”由单件制成。

包含在第二元件16A、16A'、16A”的所述侧面的凹口的宽度宽于包含在第一元件11A、11A'、11A”的一侧的凹槽24A、24A'、24A”的宽度。特别地，确定第二元件16A、16A'、16A”的侧面包含的凹口的宽度，以允许水凝胶层14A、14A'、14A”被布置在凹口内(即，水凝胶层的表面积不超出第二元件16A、16A'、16A'的所述侧面包含的凹口的宽度)，从而水凝胶层14A、14A′、14A′在第一元件11A、11A′、11A′与第二元件16A、16A′、16A′之间不被挤压(或不承受压力)。

包括在第二元件的所述侧面中的凹口的深度或高度大于水凝胶层的总厚度，以便在水凝胶层的第二面和第二元件之间形成腔体。

在图6B、6B'和6B”表示的实施方案中，第一元件11B、11B'、11B”没有任何凹口。第二元件16B、16B'、16B”包括第一部件13B、13B'、13B”，第二部件17B、17B′、17B′用于加深或增加在水凝胶层14B、14B’、14B””的第二面和第二元件16B、16B’、16B”之间的腔体32B、32B′、32B′的深度或高度。如这些附图所示，在其中安装有水凝胶层的凹口限定了第一部件13B和第二部件17B。

在图6C、6C'和6C”表示的与前述实施方案相似的另一个实施方案中，第二元件16B、16B'、16B”的第二部件17C、17C'、17C”不包含凹口。水凝胶层14C、14C'、14C”设置在第二元件16C、16C'、16C”的第二部件13C、13C'、13C”的内边界内。

在图6D、6D'和6D”所示的特定实施方案中，单件制造的第一元件11D、11D'、11D”包括具有底部的凹口，该底部包括至少一个凹槽24D、24D'、24D”，水凝胶层14D、14D'、14D”被施加到所述底部上并覆盖所述至少一个凹槽24D、24D'、24D”，从而形成所述至少一个微通道。在一个实施方案中，凹口在环形表面上敞开，该环形表面被施加到所述第二元件16D、16D'、16D”上，以形成与所述至少一个微通道相对的所述至少一个腔体。

水凝胶层14D、14D'、14D”的尺寸被配置为使其适合在凹口的外边界内。施加到凹口的底部并与其共价结合的水凝胶层14D、14D'、14D”保持平坦，并且不会侵入微通道的空间或接触微通道的内壁。

根据图6D、6D'和6D”表示的本发明的一个实施方案，凹口形成在第一元件11D、11D'、11D”内，并且其深度有利地大于一个或多个水凝胶层的总厚度，这允许在水凝胶的第二面和平面的第二元件之间形成腔体。

根据图6E、6E'和6E”表示的本发明的另一个实施方案，第一元件11E、11E'、11E”的凹口的深度被配置为：水凝胶层14E、14E'、14E”的厚度在凹口的所述深度之内(即，水凝胶层的厚度几乎等于或略小于凹口的深度)。第二元件还可以包括面对水凝胶层14E、14E'、14E”的第二面的凹口。

在图6F、6F'、6F”表示的一个实施方案中，水凝胶层14F、14F'、14F”被部分地安装在第一元件11F、11F'、11F”的凹口内和第二元件16F、16F'、16F”的凹口内。在这种情况下，水凝胶层的第二面可以接触第一元件11F、11F'、11F”的凹口的所述底部和第二元件16F、16F'、16F”的底部。水凝胶层的第一面与第一元件的凹口的底部接触(并共价结合)。水凝胶层的第二面可以共价结合或可以不共价结合到第二元件的凹口的底部。如图清楚所示，第一元件的凹口的底部包括凹槽，并且凹口的底部包括中空空间，中空空间与水凝胶层14F、14F'、14F”的第二面限定了腔体32F、32F'、32F”。

在图6G、6G'和6G”所示的另一个实施方案中，第一元件11G、11G'、11G”不包括凹口(仅包括至少一个凹槽)，第二元件包括凹口，凹口的底部包括至少一个中空空间。水凝胶层的尺寸被配置为使其适合在第二元件中包括的所述凹口的外边界内。水凝胶层可以共价结合至第二元件或共价结合至第一元件和第二元件两者。

本发明的微流控装置包括至少一对微通道(在水凝胶层的第一面上)/腔体(在水凝胶层的第二面上，沿着所述微通道的同一轴线)。本发明的微流控装置还可以包括多对微通道/腔体。在一个实施方案中，装置包括几对微通道/腔体(例如，参见图A”)。在另一个实施方案中，装置包括针对一个腔体的几个微通道(例如，参见图A')。多对微通道/腔体的存在使得可以对各种测定进行高通量筛选。水凝胶层的弹性模量(或剪切模量)必须足够，以使一对中的压力变化不会影响相邻的一对。

图6H对应于先前关于图4A和4B描述的类似实施方案，但是也表示图6H'和图6H”的实施方案。

最后，应当理解的是，凹口可以形成在第一元件或第二元件中的一个内，或者部分地形成在第一元件和第二元件内。此外，第一元件可包括一个单件或组装在一起的多个件，第二元件也是如此。

Claims

1.微流控装置（10），包括：

a）第一元件（11），所述第一元件（11）包括在其表面上的一种以上化学官能团，其中所述一种以上化学官能团包括在与所述表面共价结合的分子中；

b）水凝胶层（14），所述水凝胶层（14）具有彼此相对的第一面（7）和第二面（9），所述水凝胶层（14）包括一种以上化学官能团，至少一种所述化学官能团有效地与共价结合于所述第一元件（11）表面的分子中包括的至少一种化学官能团反应；和

c）第二元件（16），

其中所述水凝胶层（14）在给定轴线（40）上介于所述第一元件（11）和所述第二元件（16）之间，所述给定轴线（40）基本垂直于所述水凝胶层（14），并且所述第一元件（11）、所述第二元件（16）和所述水凝胶层（14）具有确定的形状和尺寸，以在所述第一元件（11）和所述水凝胶层（14）的所述第一面（7）之间勾画出至少一个微通道（34），以及在所述第二元件（16）和所述水凝胶层（14）的所述第二面（9）之间勾画出至少一个腔体（32），所述至少一个微通道（34）和所述至少一个腔体（32）相对于彼此布置，使得所述给定轴线（40）截断所述至少一个微通道（34）和所述至少一个腔体（32），

其中，分子中包括的至少一种所述化学官能团和所述水凝胶层（14）的至少一种所述化学官能团彼此共价结合，所述分子共价结合到所述第一元件（11）的表面。

2.根据权利要求1所述的微流控装置（10），其中，所述第二元件（16）面对所述水凝胶层（14）的表面包括一种以上化学官能团，并且至少一种所述化学官能团与所述水凝胶层（14）的至少一种化学官能团共价结合。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的微流控装置（10），其中，所述第一元件（11）和所述第二元件（16）中的至少一个包括凹口（20），所述水凝胶层（14）安装于所述凹口（20）中。

4.根据权利要求1至2中任一项所述的微流控装置（10），其中，所述水凝胶层（14）覆盖形成在所述第一元件（11）的所述表面上的至少一个凹槽，从而形成至少一个微通道（34）。

5.根据权利要求4所述的微流控装置（10），其中，所述第一元件（11）和所述第二元件（16）中的至少一个具有凹口（20），所述水凝胶层（14）安装于所述凹口（20）中，所述凹口（20）形成在所述第一元件（11）上并且包括具有所述至少一个凹槽的底部（22）。

6.根据权利要求1至2中任一项所述的微流控装置（10），其中，所述微流控装置（10）包括用于在所述至少一个微通道（34）和所述至少一个腔体（32）之间产生压力差的器件（46）。

7.根据权利要求1至2中任一项所述的微流控装置（10），其中，所述第一元件、所述第二元件或这两种元件都包括透明或半透明的材料。

8.根据权利要求1至2中任一项所述的微流控装置（10），其中，所述第一元件、所述第二元件或这两种元件都包括聚二甲基硅氧烷（PDMS）。

9.根据权利要求1至2中任一项所述的微流控装置（10），其中，共价结合至所述第一元件（11）或所述第二元件（16）的至少一部分表面的分子中包含的化学官能团包括：硫醇基团，所述水凝胶层（14）中包含的化学官能团包括乙烯基砜基团。

10.根据权利要求1至2中任一项所述的微流控装置（10），其中，所述水凝胶层（14）的弹性模量在1 kPa至50 kPa的范围内。

11.根据权利要求1至2中任一项所述的微流控装置（10），其中，所述水凝胶层（14）的厚度在30 μm至500 μm的范围内。

12.根据权利要求1至2中任一项所述的微流控装置（10），其中，所述装置包括两层或更多层水凝胶。

13.根据权利要求1至2中任一项所述的微流控装置（10），其中，所述水凝胶层（14）包括聚合物基材，所述聚合物基材包含或由一种以上大分子单体或一种以上亲水性大分子单体组成，所述大分子单体具有连接至所述一种以上大分子单体的聚合物主链的亲水性官能团。

14.根据权利要求13所述的微流控装置（10），其中，所述聚合物基材包括聚乙二醇（PEG）。

15.根据权利要求13所述的微流控装置（10），其中，所述一种以上大分子单体的聚合物基材包含乙烯基砜基团或硫醇基团或这两种基团，相对于乙烯基砜基团，硫醇基团的摩尔过量为0至10%。

16.根据权利要求1至2中任一项所述的微流控装置，其中，所述水凝胶层包括微结构或微图案。

17.根据权利要求1至2中任一项所述的微流控装置（10），其中，至少一种细胞粘附分子存在于所述水凝胶层（14）的所述第一面（7）、所述水凝胶层（14）的所述第二面（9）、所述水凝胶层（14）的主体，或它们的任意组合。

18.根据权利要求17所述的微流控装置，其中，所述细胞粘附分子共价连接至所述水凝胶层的至少一种化学官能团。

19.根据权利要求18所述的微流控装置，其中，所述细胞粘附分子为细胞粘附蛋白。

20.根据权利要求18所述的微流控装置，其中，所述细胞粘附分子用fc抗体片段标记或用异生物功能蛋白交联剂修饰。

21.根据权利要求20所述的微流控装置，其中，所述异生物功能蛋白交联剂为异双功能NHS-PEG-马来酰亚胺连接子。

22.根据权利要求17所述的微流控装置，其中，所述细胞粘附分子包括纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白中的任一种或其任意组合。

23.根据权利要求17所述的微流控装置（10），其中，细胞沉积在所述水凝胶层（14）的所述第一面（7）、所述水凝胶层（14）的所述第二面（9）、所述水凝胶层（14）的主体或其任意组合的细胞粘附分子上。

24.根据权利要求23所述的微流控装置，其中，所述水凝胶层（14）的所述第一面（7）、所述水凝胶层（14）的所述第二面（9），所述水凝胶层（14）的主体或其任意组合包括相同或不同类型的细胞。

25.根据权利要求23所述的微流控装置，其中，所述细胞形成一层或多层。

26.根据权利要求23所述的微流控装置，其中，所述细胞包括哺乳动物细胞。

27.根据权利要求26所述的微流控装置，其中，所述哺乳动物细胞是人类细胞。

28.用于生产权利要求1至27中任一项所述的微流控装置（10）的方法，包括以下步骤：

a）生产或提供第一元件（11）和第二元件（16）；

b）用包括一种以上化学官能团的分子将所述第一元件（11）的表面官能化；

d）生产或提供包括一种以上化学官能团的水凝胶层（14），所述水凝胶层（14）有效地与所述第一元件（11）或所述第二元件（16）或这两种元件的表面上的分子的至少一种化学官能团反应；

e）将所述水凝胶层（14）置于所述第一元件（11）和所述第二元件（16）之间；

f）允许所述第一元件（11），所述第二元件（16）或这两种元件的表面上的分子的至少一种化学官能团与所述水凝胶层（14）中的至少一种化学官能团共价反应。

29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述方法还包括在步骤b）与步骤d）之间的步骤c）：用包括一种以上化学官能团的分子将所述第二元件（16）的表面官能化。

30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述水凝胶层（14）通过使乙烯基砜官能化的聚乙二醇（PEG-VS）大分子单体和硫醇官能化的聚乙二醇（PEG-SH）大分子单体交联而产生。

31.驱动权利要求1至27中任一项所述的微流控装置（10）的水凝胶层（14）的方法，包括以下步骤：

a）将液体或气体引入第一元件（11）与水凝胶层（14）的第一面（7）之间的至少一个微通道（34）；

b）将液体或气体引入第二元件（16）与水凝胶层（14）的第二面（9）之间的至少一个腔体（32）；

c）使所述液体或气体流过第一元件（11）与水凝胶层（14）的第一面（7）之间的所述至少一个微通道（34）；

d）使所述液体或气体流过第二元件（16）与水凝胶层（14）的第二面（9）之间的所述至少一个腔体（32）；以及

e）调节或改变所述至少一个微通道（34）或所述至少一个腔体（32）中的所述液体的流速或所述气体的压力，在所述至少一个微通道（34）和所述至少一个腔体（32）之间产生压差，通过交替地在垂直于水凝胶层的平面的两个相反方向上朝向所述至少一个微通道（34）或所述至少一个腔体（32）的折曲或弯曲，使所述水凝胶层（14）膨胀或收缩。