CN111658629A - Fusarielin M及其衍生物、药学上可接受的盐的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药学领域，具体涉及Fusarielin M及其衍生物、药学上可接受的盐的应用，化合物Fusarielin M对结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶B具有很强的抑制活性，其IC₅₀为1.05±0.08μM。所述化合物Fusarielin M能够有效地抑制结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶B的去磷酸化活性，并且细胞毒性很低，对巨噬细胞内分枝杆菌的增殖有明显抑制作用，具有结核病治疗的临床应用潜力。另外，化合物Fusarielin M是从微生物分离的天然代谢活性小分子产物，其结构已被解析，可通过大规模发酵分离生产，来源丰富，生产成本低，成药可能性高。

Description

Fusarielin M及其衍生物、药学上可接受的盐的应用

技术领域

本发明涉及药学领域，具体涉及Fusarielin M及其衍生物、药学上可接受的盐的应用。

技术背景

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的慢性传染病，是全世界最主要的致命传染病之一。根据世界卫生组织2019全球结核病控制报告，在2018年，共有1000万新发患者，约120万人死于结核病(TB)。我国是结核病与耐药结核病高负担国家，加上耐药菌的不断出现，抗结核药物的研发迫在眉睫！

结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶B(Mycobacterium tuberculosis protein tyrosinephosphatase，MptpB)，是结核分枝杆菌侵染宿主细胞所必须的分泌型毒力因子，具有酪氨酸磷酸酶活性。MptpB也是Mtb体外生长的非必需基因，MptpB的缺失不影响Mtb在培养基中的生长，但是严重抑制Mtb在IFN-y激活巨噬细胞中的增殖，并且削弱Mtb感染豚鼠的能力。MptpB与人PTP1B的同源性仅为6％，较低的同源相似性会提高以MptpB为靶点的抗结核药物特异性。因此，以MptpB为靶点进行抗结核药物的筛选，是研制新的强力低毒抗结核药物的重要策略。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中问题，提供Fusarielin M及其衍生物、药学上可接受的盐的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

Fusarielin M及其衍生物或其药学上可接受的盐在作为酪氨酸磷酸酶抑制剂的应用。

Fusarielin M及其衍生物或其药学上可接受的盐在制备抑制酪氨酸磷酸酶的药物上的应用。

优选地，所述酪氨酸磷酸酶为结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶B。

Fusarielin M及其衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗结核病的药物中的应用。

上述Fusarielin M的分子结构式如式(I)所示：

优选地，所述Fusarielin M或其衍生物或其药学上可接受的盐的浓度为0.95～1.12μM。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

本发明提供了化合物Fusarielin M或其衍生物或其药学上可接受的盐的应用，化合物Fusarielin M对结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶B具有很强的抑制活性，其IC₅₀为1.05±0.08μM。所述化合物Fusarielin M能够有效地抑制结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶B的去磷酸化活性，并且细胞毒性很低，对巨噬细胞内分枝杆菌的增殖有明显抑制作用，具有结核病治疗的临床应用潜力。另外，化合物Fusarielin M是从微生物分离的天然代谢活性小分子产物，其结构已被解析，可通过大规模发酵分离生产，来源丰富，生产成本低，成药可能性高。

附图说明

图1结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶B蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳结果；其中M泳道为蛋白质分子量标准(Thermo 26616)，1、2泳道为纯化后的MptpB(每孔上样量为1μg纯化蛋白)；

图2化合物Fusarielin M对结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶B酶活性抑制的IC₅₀曲线；

图3化合物Fusarielin M对结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶B的抑制类型鉴定；

图4化合物Fusarielin M对细胞内MptpB介导的MAPK通路激活的western blot检测结果；

图5不同浓度化合物Fusarielin M处理时细胞内结核杆菌数；

图6化合物Fusarielin M分子结构式图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

除特殊说明，本实施例中所用的设备均为常规实验设备，所用的材料、试剂无特殊说明均为市售得到，无特殊说明的实验方法也为常规实验方法。

实施例1

一、结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶B(MptpB)的表达与纯化

将表达MptpB的大肠杆菌BL21(DE3)T程菌接种于含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养液，37℃震荡培养过夜获得培养物。将2mL上述培养物接种于100mL含卡那霉素的LB培养液中，37℃震荡培养至OD₆₀₀＝0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG，于20℃，180rpm震荡培养过夜，诱导工程菌表达蛋白MptpB。将诱导过夜的表达结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶B的工程菌离心(5000×g，4℃，离心5min)，收集菌体，并将菌体重悬于20mL预冷的裂解缓冲液(25mMTris，20mM咪唑，500mM NaCl，pH 7.8)，再次离心。重复上述步骤一次，以洗去培养基。后面的步骤都在冰上进行，所用缓冲液、离心机均需提前预冷至4℃。使用10mL裂解缓冲液重悬菌体，并加入终浓度为1％TritonX-100，5mM DTT，1×蛋白酶抑制剂，冰水浴超声15min破碎菌体，破碎后的菌液进行离心(11000rpm，20min，4℃)，收集上清液进行纯化。利用NiSepharose 6 Fast Flow琼脂糖凝胶亲和层析纯化，将上清液加入此镍层析柱，使目标蛋白与填料充分结合，然后加入10mL的洗涤缓冲液(25mM Tris，50mM咪唑，500mM NaCl，pH 7.8)洗去非特异结合的杂蛋白。最后，用10mL洗脱缓冲液(25mM Tris，350mM咪唑，500mM NaCl，pH 7.8)将目的蛋白洗脱下来。将蛋白洗脱液转移至10kDa孔径的超滤管，5000×g，4℃离心15min进行浓缩，弃去外层收集管中液体。加入5-10mL的保存缓冲液(25mM Tris，100mMNaCl，pH 7.8)5000×g，4℃离心15min，如此反复几次，直到将洗脱蛋白中的咪唑置换出来。离心直到超滤浓缩的液体体积为2mL，并分装保存于4℃，按照BCA蛋白定量试剂盒(Pierce)测定纯化后MptpB蛋白的浓度。纯化蛋白经SDS-PAGE电泳分析，证明实验获得了大小正确、纯度在90％以上的MptpB酶(见图1)。结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶A(MptpA)、人酪氨酸磷酸酶1B的大肠杆菌表达和纯化步骤与MptpB相同。

二、Fusarielin M对结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶B(MptpB)的酶抑制活性分析

采用对硝基苯磷酸二钠(pNPP)为底物，在反应缓冲液(50mM Tris，100mM NaCl，pH7.0)中进行化合物抑制结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶B的抑制实验，所用的结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶B是上述纯化得到的重组结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶B蛋白。

(1)半抑制浓度IC₅₀值的测定

反应总体积为200μL，3个平行孔，在96孔板中依次加入1.5μg的MptpB，梯度的化合物(终浓度：0μM，0.05μM，0.1μM，0.5μM，1μM，5μM，10μM)，化合物和MptpB在室温预混合5min。孵育结束后，加入终浓度为1.3mM的pNPP，37℃反应5min，读取405nm下各孔的吸收值。同时，设立空白对照(只加DMSO或化合物)，用于扣除背景。根据吸光值按照以下计算方法算出化合物对MptpB酶的抑制活性：抑制率(％)＝[1-(实验组-空白组)/(阴性对照-空白组)]×100％。以化合物浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标作图，由Origin Pro 8软件拟合计算IC₅₀，结果用平均值±标准差表示。

(2)抑制类型分析

如上所述，测定不同化合物浓度(0μM，0.5μM，1μM，2.5μM)下，浓度梯度的pNPP底物(0.1mM，0.2mM，0.4mM，0.8mM，1.6mM，3.2mM)对应的吸光值，然后以底物浓度的倒数为横坐标，反应速率的倒数为纵坐标，进行双倒数作图，判定抑制类型和计算抑制常数K_i。每个样品重复测定三次。

(3)化合物的酶抑制特异性分析

测定化合物对同源蛋白结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶A(MptpA)、人酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的酶抑制活性，反应体系同MptpB。不同地，反应中加入0.75μg的MptpA，化合物浓度为0μM、1.5625μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM，化合物与MptpA预孵育5min后加入终浓度1.2mM底物；反应中加入1μg的PTP1B，化合物浓度为0μM、1.5625μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM，化合物与PTP1B预孵育5min后加入终浓度2mM底物。每个样品测定3个平行孔，计算出化合物对MptpA和PTP1B的半抑制浓度IC₅₀。

(4)实验结果

实验测得化合物Fusarielin M对结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶B半抑制浓度IC₅₀为1.05±0.08μM(见表1，图2)；化合物对MptpB酶抑制的特异性较好，与结核分枝杆菌MptpA、人PTP1B这些同源蛋白相比，选择性在15倍以上(见表1)。进一步鉴定化合物Fusarielin M对MptpB的抑制作用类型，不同浓度抑制剂的四条直线相交于纵轴(见图3)，说明化合物Fusarielin M是竞争性抑制剂，同时求得化合物Fusarielin M的抑制常数K_i为1.03±0.39μM(表2)。

表1化合物Fusarielin M的体外酶抑制活性结果(IC₅₀，μM)^a

SI＝selectivity index.SI^*＝IC₅₀ ^MptpA/IC₅₀ ^MptpB；SI^**＝IC₅₀ ^PTP1B/IC₅₀ ^MptpB.

^a实验重复三次，结果用平均值±标准差表示。

表2化合物Fusarielin M对MptpB酶抑制常数测定结果(K_i，μM)^a

化合物	MptpB(K<sub>i</sub>，μM)
		Fusarielin M	1.03±0.39

^a实验重复三次，结果用平均值±标准差表示

三、化合物Fusarielin M的细胞增殖毒性实验

(1)细胞培养

人肺癌细胞株A549在含10％FBS和双抗(青霉素和链霉素)的RPMI 1640培养基中培养，小鼠肺泡巨噬细胞J774A.1与人肝癌细胞HepG2在含10％FBS和双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养基中培养。

(2)细胞铺板

当小鼠肺泡巨噬细胞J774A.1贴壁汇聚度达到80％～90％时，弃培养基，用PBS洗细胞两次后，加入胰酶消化，培养基终止消化，转移至离心管，1000rpm离心3min。弃上清，用培养基重悬细胞，取少量细胞悬液进行计数。用培养基将细胞重悬液的密度调节至5×10⁴个/mL，按0.1mL/孔将稀释后的细胞接种至96孔板。将细胞培养板置于37℃的CO₂培养箱，过夜培养。

(3)化合物处理

向接种细胞的96孔板中加入合有不同浓度化合物的培养液(25，50，100，120，150，180，200μM)，同时设立阴性对照组(合1％DMSO)和空白对照组(只加培养基)，三个平行孔。将细胞培养板置于37℃的CO₂培养箱，培养72h。

(4)MTS处理

弃去原孔内培养基，每孔加入0.1mL培养基和20μL MTS(promega)，继续培养0.5-1h。取出培养板，测量490nM下各孔的吸光值。根据吸光值按照以下计算方法算出不同浓度化合物处理对细胞增殖的抑制活性：抑制率(％)＝[1-(实验组-空白组)/(阴性对照-空白组)]×100％。以化合物浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标作图，由Origin Pro 8软件拟合计算iC₅₀结果用平均值±标准差表示。

(5)实验结果

实验结果显示，化合物Fusarielin M对人肺癌细胞株A549，人肝癌细胞株HepG2，小鼠巨噬细胞株J774A.1没有很强的细胞毒性，iC₅₀值均大于100μM(见表3)。

表3化合物Fusarielin M的细胞增殖毒性实验结果(IC₅₀，μM)

细胞株	化合物的IC<sub>50</sub>值(μM)
		人肺癌细胞A549	120.16±3.12
人肝癌细胞HepG2	169.84±6.29
		小鼠巨噬细胞J774A.1	127.03±2.06

实施例2

一、化合物Fusarielin M的体外抗结核菌生长活性测定

本实验采用刃天青作为细菌生长的指示试剂，测定化合物Fusarielin M对4株分枝杆菌菌株(M.smegmatis，M.marinum，M.bovis，M.tuberculosis)、1株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和1株大肠杆菌菌株(Escherichia coli)的体外抑菌活性，以最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)为指标评价化合物的抗菌活性。

(1)菌株

分枝杆菌：M.tuberculosis H₃₇Ra，M.bovis BCG，M.smegmatis mc²155，M.marinumBAA-535，于7H9(含0.2％甘油，0.05％Tween-80，10％OADC)液体培养基(BD)中培养。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC6538)、大肠杆菌(Escherichiacoli ATCC25922)在LB培养基中培养。

(2)采用刃天青(aladdin)作为细菌生长的指示剂，检测化合物的体外抑菌活性。在96孔板上，将梯度稀释的化合物(100μL)与细菌(100μL)共培养一段时间，然后每孔加入30μL的0.01％刃天青溶液，继续培养过夜，测定每孔荧光值(激发波长530nm，发射波长590nm)，计算得到化合物对各个细菌的最低抑菌浓度(MIC)。

(3)实验结果：化合物Fusarielin M对结核分枝杆菌H₃₇Ra菌株具有较好的体外抑菌活性，MIC值为12.3mg/L，对金黄色葡萄球菌具有较弱的抑菌活性(MIC＝19mg/L)，但对耻垢分枝杆菌、海分枝杆菌、牛分枝杆菌及大肠杆菌没有明显体外生长抑制活性(见表4)。

表4化合物Fusarielin M的体外抗菌活性(MIC,mg/L)

二、化合物Fusarielin M对细胞内MptpB抑制活性分析

在结核菌感染细胞时，毒力蛋白MptpB能通过激活细胞Akt信号、抑制ERK1/2和p38活化，从而抑制细胞凋亡与下调免疫反应。如果化合物Fusarielin M能够抑制细胞内MptpB，就能反转MptpB对细胞通路的调节作用，引起上述指标的相反变化，即Akt通路激活减少，ERK1/2和p38激活增多。据此，在巨噬细胞Raw264.7中瞬时转染过表达MptpB(野生型)、MptpB/C160S(酶活缺失型)，用干扰素IFN-γ刺激细胞免疫，并加入化合物处理，收集并提取细胞总蛋白，进行Western blot检测细胞中pERK1/2、ERK1/2、pp38、p38的蛋白表达量。

(1)小鼠巨噬细胞Raw264.7培养

小鼠巨噬细胞Raw264.7培养在含10％FBS和双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养基，置于37℃的CO₂培养箱中培养。当细胞贴壁生长的汇聚度达到80％时，进行传代与铺板。在细胞转染前一天，按3×10⁶个/孔，将细胞铺板至6孔细胞培养板中。将细胞培养板置于37℃的CO₂培养箱过夜，使细胞充分贴壁。

(2)细胞瞬时转染表达MptpB

准备含3ug表达质粒(MptpB、MptpB/C160S、Vector)的150μL Opti-MEM，加入9μLFu

HD Transfection Reagent(Promega)并轻轻混匀，室温孵育15min以形成质粒-转染试剂混合物。将转染复合物缓慢滴加至细胞中，轻轻晃动混合均匀，置于培养箱培养24h，表达目的蛋白。

(3)化合物处理

转染24h后，更换含有不同浓度化合物的新鲜培养基(0,10,20μM)，37℃培养1h。每孔加入终浓度为40ng/mL IFN-γ，继续培养2h后收集细胞进行蛋白提取。

(4)细胞总蛋白提取

弃去培养上清液，用PBS清洗细胞两次(2mL/孔)。按200μL/孔，加入IP Lysis/washbuffer(含1×蛋白酶抑制剂，Pierce)，混匀，置于冰上裂解15min。13000×g，4℃离心10min，取上清进行蛋白浓度测定及Western blot实验。

检测抗体：兔抗p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)，兔抗ERK1/2，兔抗p-p38(Thr180/Tyr182)，兔抗p38购自CST公司；鼠抗α-tubulin，辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠IgG二抗，HRP标记山羊抗兔二抗购自Proteintech公司。

(5)实验结果：

MptpB能抑制IFN-γ刺激下细胞内MAPK通路的激活，减少p38与ERK1/2的磷酸化水平；MptpB对MAPK通路抑制是依赖于其磷酸酶活性，故点突变缺失酶活MptpB/C160S失去了对MAPK的抑制作用，与转染空载一致(图4)。因此，本实验中，MptpB对细胞内MAPK通路的抑制作用与文献报道一致。化合物Fusarielin M对细胞内MptpB产生抑制后，p-p38与p-ERK1/2增多且呈浓度依赖；在转染空载与点突变酶活缺失MptpB/C160S的细胞内，化合物Fusarielin M不影响-pp38与p-ERK1/2的表达量(图4)。因此，Fusarielin M能够阻断MptpB对细胞内MAPK通路的抑制作用。

三、化合物Fusarielin M对巨噬细胞内分枝杆菌的生长抑制活性

鉴于化合物Fusarielin M具备良好的体内外抑制MptpB活性，进一步研究化合物在细胞水平上的抗结核活性。以小鼠肺泡巨噬细胞J774A.1为宿主细胞，用牛分枝杆菌(M.bovis BCG)菌株感染细胞，测定Fusarielin M抑制胞内结核菌增殖的活性。

(1)牛分枝杆菌M.bovis BCG菌株培养

7H9(含0.2％甘油，0.05％Tween-80，10％OADC)液体培养基，7H10(含0.2％甘油，10％OADC)固体培养基(BD)。

将-80℃冻存的牛分枝杆菌BCG菌株接种于7H10固体培养基，37℃倒置培养2-3周，直至平板上长出一层菌苔，即可用于细胞感染或传代。

(2)J774A.1细胞培养与铺板

小鼠肺泡巨噬细胞J774A.1培养在含10％FBS和双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养基，置于37℃的CO₂培养箱中培养。当细胞贴壁生长的汇聚度达到80％时，进行传代与铺板。在细胞感染前一天，按2×10⁵个/孔，将细胞铺板至24孔细胞培养板中。将细胞培养板置于37℃的CO₂培养箱过夜，使细胞充分贴壁。

(3)细胞感染

刮取2-3周菌龄的BCG菌苔至50mL离心管，并用20mL预热的PBS缓冲液重悬，加入5mL玻璃珠涡旋震荡10min。600rpm离心10min，吸取上清液，用含10％牛血清的DMEM培养基将菌液稀释至1×10⁶CFU/mL，按200μL/孔将稀释后的菌液加入24孔细胞培养板(MOI＝1)，培养4h。感染4h后，弃培养液，按1mL/孔用预热的PBS洗细胞2次，洗去没有吞入细胞的细菌。分别加入2mL含有不同浓度化合物或0.8％DMSO的细胞培养基，继续培养72h。每实验组设3个平行孔。

三天后，小心弃掉细胞培养上清，按1mL/孔用预热的PBS洗细胞2次。每孔加入0.2mL 0.05％SDS，37℃静置5min，裂解细胞释放胞内活菌。将细胞裂解液转移至1.5mL离心管，涡旋震荡5min，充分裂解细胞和重悬菌体。用7H9培养基对裂解液进行100倍稀释，取200μL稀释液涂布于7H10平板，37℃倒置培养3-4周后，对平板上的生长菌落计数，计算抑菌率。

(4)实验结果

化合物Fusarielin M对巨噬细胞J774A.1内BCG的增殖具有抑制作用，且呈化合物浓度依赖，如图5，在化合物浓度分别为5μM，10μM，20μM时，细胞内活菌数分别减少了42％，58％，62％。之前的实验证明了40μM化合物Fusarielin M对J774A.1无明显细胞毒性作用，所以此处观察到的胞内抑菌效果是由化合物抗菌活性导致，而不是化合物的毒性引起细胞凋亡，破坏了细菌生存环境导致的活菌数降低。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.Fusarielin M及其衍生物或其药学上可接受的盐在作为酪氨酸磷酸酶抑制剂的应用。

2.Fusarielin M及其衍生物或其药学上可接受的盐在制备抑制酪氨酸磷酸酶的药物上的应用。

3.根据权利要求1或2所述应用，所述酪氨酸磷酸酶为结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶B。

4.Fusarielin M及其衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗结核病的药物中的应用。

5.根据权利要求1、2或4任一项所述应用，其特征在于，所述Fusarielin M或其衍生物或其药学上可接受的盐的浓度为0.95～1.12μM。

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