[go: up one dir, main page]

CN111647640A - 一种快速精准实现慢性心力衰竭心功能病程分级的方法 - Google Patents

一种快速精准实现慢性心力衰竭心功能病程分级的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111647640A
CN111647640A CN202010442068.0A CN202010442068A CN111647640A CN 111647640 A CN111647640 A CN 111647640A CN 202010442068 A CN202010442068 A CN 202010442068A CN 111647640 A CN111647640 A CN 111647640A
Authority
CN
China
Prior art keywords
heart failure
chronic heart
group
mice
stage
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010442068.0A
Other languages
English (en)
Inventor
余伯阳
李芳�
赖琼
柴程芝
张鹿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Pharmaceutical University
Original Assignee
China Pharmaceutical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Pharmaceutical University filed Critical China Pharmaceutical University
Priority to CN202010442068.0A priority Critical patent/CN111647640A/zh
Publication of CN111647640A publication Critical patent/CN111647640A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
    • A61D1/00—Surgical instruments for veterinary use
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/30—Animals modified by surgical methods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0375—Animal model for cardiovascular diseases
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90203—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90245—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • G01N2333/90248—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one of the donors, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
    • G01N2333/90251—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one of the donors, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13 with a definite EC number (1.14.13.-)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/325—Heart failure or cardiac arrest, e.g. cardiomyopathy, congestive heart failure

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Abstract

本发明公开了一种与慢性心力衰竭病程诊断或监测相关的代谢标志物及其应用，所述代谢标志物为黄尿酸和/或苯乙酰甘氨酸。本发明证明了黄尿酸和苯乙酰甘氨酸可分别作为慢性心力衰竭心功能B和C级的代谢标志物，以实现慢性心力衰竭心功能的精准分级，且犬尿氨酸3‑单加氧酶（KMO）和醛脱氢酶家族1成员A3（ALDH1A3）可以作为筛选预防、缓解和/或治疗不同心功能分级的心肌缺血损伤药物靶标。

Description

一种快速精准实现慢性心力衰竭心功能病程分级的方法
技术领域
本发明属于心脏病领域，具体涉及一种快速精准实现慢性心力衰竭心功能病程分级的方法。
背景技术
随着对疾病的不断认识与发展，美国心脏病学会(ACC)与美国心脏协会(AHC)发展了新的分级，强调了疾病发展与演变过程。具体分级情况：阶段A为心衰高危、易患人群，无心衰症状，左室功能正常；阶段B无症状，但已发展成器质性、结构性心脏病，左室功能不正常；阶段C为病人以前或目前有气促、运动耐受量下降及液体潴留等心衰症状及体征，有基础的结构性心脏病；阶段D为顽固性心衰，可能需要心脏移植等治疗或临终关怀。其中B和C阶段是慢性心衰中重要的两个病程阶段。
目前临床上主要通过测定心肌损伤标志物，如hsCRP,BNP,hs-cTn的含量和评估心功能来对慢性心衰进行诊断。但生化指标的测定会受其他生理状况的影响从而产生错误的诊断结果，况且目前可用于心衰阶段分级的生物标志物非常少。基于以上现实问题，急需一种更好的心功能评价方法，达到对慢性心衰的精准诊断。高分辨率和高通量的代谢组学技术能够为不同的慢性心衰阶段提供相关的代谢表征，进而遴选出不同慢性心衰阶段特异性生物标志物，从而有助于提升临床对心衰不同阶段的诊断和治疗。
发明内容
针对现有问题的不足，本发明的第一个目的是提供一种代谢标志物制备慢性心力衰竭病程诊断或监测制剂中的应用；本发明的第二个目的是提供一种心力衰竭病程诊断或监测制剂盒；本发明的第三个目的是提供一种代谢标志物在制备或筛选治疗慢性心力衰竭的药物中的应用；第四个目的是提供犬尿氨酸-3-单加氧酶(KMO)和/或醛脱氢酶家族1成员A3 (ALDH1A3)作为检测靶点在制备慢性心力衰竭病程诊断或监测制剂中的应用；第五个目的是提供KMO和/或ALDH1A3作为治疗靶点在制备或筛选治疗慢性心力衰竭的药物中的应用。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
一种代谢标志物在制备慢性心力衰竭B和C阶段病程诊断或监测制剂中的应用，所述代谢标志物为黄尿酸和/或苯乙酰甘氨酸。
一种慢性心力衰竭B和C阶段病程诊断或监测制剂盒，该试剂盒中含有检测黄尿酸和/ 或苯乙酰甘氨酸的试剂。
黄尿酸和/或苯乙酰甘氨酸作为代谢标志物在制备或筛选治疗慢性心力衰竭的药物中的应用。
优选的，所述慢性心力衰竭处于B或C阶段
KMO和/或ALDH1A3作为检测靶点在慢性心力衰竭B和C阶段病程诊断或监测制剂中的应用。
检测KMO和/或ALDH1A3的试剂在制备慢性心力衰竭B和C阶段病程诊断或监测制剂中的应用。
慢性心力衰竭B和C阶段病程诊断或监测制剂盒，该试剂盒含有检测KMO和/或ALDH1A3的试剂。
KMO和/或ALDH1A3作为治疗靶点在制备或筛选治疗慢性心力衰竭的药物中的应用。
优选的，所述慢性心力衰竭处于B或C阶段。
抑制KMO和/或ALDH1A3表达的物质在治疗慢性心力衰竭的药物中的应用。
优选的，所述慢性心力衰竭处于B或C阶段。
优选的，所述的抑制KMO表达的物质为UPF-648。
更优选的，所述UPF-648的添加量为1～2mg/kg。
优选的，所述抑制ALDH1A3表达的物质为CM10。
更优选的，所述CM10的添加量为0.32～1.28μM。
本发现证明了黄尿酸和苯乙酰甘氨酸可作为慢性心力衰竭心功能B和C级的代谢标志物，以实现慢性心力衰竭心功能的精准分级，且KMO和ALDH1A3可以作为筛选预防、缓解和/或治疗不同心功能分级的心肌缺血损伤药物靶标。
本发明还公开了一种模拟慢性心力衰竭病程的小鼠模型的方法，包括以下步骤：采用 1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，取仰卧位，左胸除毛，涂碘伏消毒，连接人工呼吸机；纵行切开皮层后，逐层钝性分离胸前肌肉直至肋骨显露，在肋间隙用弯钳扎破胸腔，撕开心包，暴露心脏，轻压胸廓即可将心脏挤出胸腔外；快速用6-0号丝线，在冠状动脉左前降支起源出下方3mm处连同线穿过的心肌一并结扎，结扎完成迅速放回胸腔，挤出气体并缝合，其中，所述小鼠模型在2-3周符合临床慢性心力衰竭的心功能B阶段，所述小鼠模型在4-5 周符合临床慢性心力衰竭的心功能C阶段。
优选的，所述连接人工呼吸机的参数为：潮气量3mL，呼吸比2:1，心率110。
本发明还保护上述方法得到的小鼠模型在慢性心力衰竭病程诊断或监测制剂中的应用。
本发明还保护上述方法得到的小鼠模型在制备或筛选治疗慢性心力衰竭的药物中的应用。
有益效果
(1)本发明首次利用冠状动脉结扎诱导的慢性心衰模型小鼠在模型后的第2-3周主要模拟临床慢性心衰的心功能B阶段，在第4-5周主要模拟临床慢性心衰的心功能C阶段；
(2)本发明还发现了黄尿酸和苯乙酰甘氨酸分别在B和C阶段慢性心衰临床患者和小鼠尿液中特异性升高，且KMO和ALDH1A3可分别作为黄尿酸和苯乙酰甘氨酸的关键调控酶；
(3)本发明还发现了分别抑制KMO和ALDH1A3可以有效缓解心肌缺血损伤。
附图说明
图1:慢性心衰模型小鼠心功能的时程变化；#p<0.05 and##p<0.01vs.假手术组(Sham group)。
图2:慢性心衰模型小鼠心脏维度的时程变化；#p<0.05 and##p<0.01vs.Shamgroup。
图3:慢性心衰模型小鼠心脏脏器指数的时程变化；#p<0.05and##p<0.01vs.Shamgroup。
图4:慢性心衰模型小鼠血清中脑钠肽(BNP)和超敏C-反应蛋白(hs-CRP)含量的时程变化；其中，A)BNP.B)hs-CRP.#p<0.05 and##p<0.01vs.Sham group。
图5:慢性心衰模型小鼠心肌组织病理和纤维化程度的变化。
图6:慢性心衰模型小鼠各脏器水肿程度的变化；#p<0.05 and##p<0.01vs.Shamgroup。
图7:慢性心衰模型小鼠运动耐受量的变化；#p<0.05 and##p<0.01vs.Sham group。
图8:小鼠血浆样本中代谢物含量测定结果；#p<0.05 and##p<0.01vs.Sham group。
图9:小鼠血清样本中代谢物含量测定结果；其中，A)2-花生四烯酰甘油磷酸胆碱(2-Arachidonoylglycerophosphocholine).B)烟酸(Nicotinic acid).C)吡啶甲酸(Picolinic acid).#p<0.05 and##p<0.01vs.Sham group。
图10:小鼠尿液样本中代谢物含量测定结果；其中，A)黄尿酸(Xanthurenicacid).B) 苯乙酰甘氨酸(Phenylacetylglycine).C)1-甲基鸟苷(1-Methylguanosine).D)N-甲基-4-吡啶酮-3-羧酰胺(4PY).E)果糖赖氨酸(Fructoselysine).F)7-甲基鸟嘌呤(7-Methylguanine). #p<0.05 and##p<0.01vs.Sham group。
图11:临床血浆样本中代谢物含量测定结果；#p<0.05 and##p<0.01vs.正常人组(normal group).*p<0.05,**p<0.01。
图12:临床血清样本中代谢物含量测定结果；其中，A)2-花生四烯酰甘油磷酸胆碱.B)烟酸.C)吡啶甲酸.#p<0.05 and##p<0.01vs.normal group.*p<0.05,**p<0.01。
图13:临床尿液样本中代谢物含量测定结果；其中，A)黄尿酸.B)苯乙酰甘氨酸.C)1- 甲基鸟苷.D)7-甲基鸟嘌呤.E)4PY.F)果糖赖氨酸.#p<0.05 and##p<0.01vs.normalgroup. *p<0.05,**p<0.01。
图14:慢性心衰模型小鼠B阶段各脏器组织中黄尿酸含量的变化；#p<0.05,##p<0.01, 假手术组vs模型组(Sham vs Model)。
图15:利用转录组学遴选慢性心衰模型小鼠B阶段心脏组织中黄尿酸相关代谢通路中的差异基因。
图16：B和C阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织中黄尿酸相关代谢通路中关键调控酶蛋白表达情况；#p<0.05 and##p<0.01vs.Sham group。
图17：B阶段慢性心衰模型小鼠各脏器组织中KMO表达情况；#p<0.05,##p<0.01,Sham vs Model。
图18 ：KMO抑制剂对B阶段慢性心衰模型小鼠尿液中黄尿酸和苯乙酰甘氨酸含量的影响；#p<0.05 and##p<0.01vs.Sham group.*p<0.05 and**p<0.01vs.Model group。
图19：KMO抑制剂对B阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织病理和纤维化程度的影响。
图20：KMO抑制剂对B阶段慢性心衰模型小鼠血清中心衰相关生化指标的影响；其中， A)BNP.B)hs-CRP.C)肿瘤坏死因子α(TNF-α).D)丙二醛(MDA).E)一氧化氮(NO). #p<0.05 and##p<0.01vs.Sham group.*p<0.05 and**p<0.01vs.Model group。
图21 ：KMO抑制剂对B阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织超微结构的影响。
图22： KMO抑制剂对B阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织中KMO表达的影响；#p<0.05and##p<0.01vs.Sham group.*p<0.05and**p<0.01vs.Model group。
图23：KMO抑制剂对氧糖剥夺(OGD)诱导损伤的H9c2细胞活力的影响；#p<0.05 and##p<0.01vs.Control group.*p<0.05 and**p<0.01vs.OGD group。
图24：KMO抑制剂对OGD诱导损伤的H9c2细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出率的影响；#p<0.05 and##p<0.01vs.Control group.*p<0.05,**p<0.01vs.OGD group。
图25：慢性心衰模型小鼠C阶段各脏器组织中苯乙酰甘氨酸含量的变化。#p<0.05,##p <0.01,Sham vs Model。
图26：利用转录组学遴选慢性心衰模型小鼠C阶段心脏组织中苯乙酰甘氨酸相关代谢通路中的差异基因。
图27：B和C阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织中苯乙酰甘氨酸相关代谢通路中关键调控酶蛋白表达情况；#p<0.05 and##p<0.01vs.Sham group。
图28：C阶段慢性心衰模型小鼠各脏器组织中ALDH1A3表达情况；#p<0.05,##p<0.01, Sham vs Model。
图29：ALDH1A3抑制剂对C阶段慢性心衰模型小鼠尿液中苯乙酰甘氨酸和黄尿酸含量的影响；#p<0.05 and##p<0.01vs.Sham group.*p<0.05 and**p<0.01vs.Model group。
图30 ：ALDH1A3抑制剂对C阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织病理和纤维化程度的影响。
图31： ALDH1A3抑制剂对C阶段慢性心衰模型小鼠血清中心衰相关生化指标的影响；其中，A)BNP.B)hs-CRP.C)MDA.D)TNF-α.#p<0.05 and##p<0.01vs.Sham group.*p<0.05and**p<0.01vs.Model group。
图32： ALDH1A3抑制剂对C阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织超微结构的影响。
图33 ：ALDH1A3抑制剂对C阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织中ALDH1A3表达的影响；#p<0.05 and##p<0.01vs.Sham group.*p<0.05 and**p<0.01vs.Model group。
图34 ：ALDH1A3抑制剂对OGD诱导损伤的H9c2细胞活力的影响；#p<0.05 and##p<0.01 vs.Control group.*p<0.05 and**p<0.01vs.OGD group。
图35： ALDH1A3抑制剂对OGD诱导损伤的H9c2细胞LDH漏出率的影响；#p<0.05 and##p<0.01vs.Control group.*p<0.05,**p<0.01vs.OGD group。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
实施例1.慢性心衰模型小鼠中B阶段和C阶段的时程
实验方法
1实验动物
实验动物为雄性ICR小鼠，体重20-22g，清洁级，由扬州大学比较医学中心提供，符合普通实验动物质量标准。许可证号为SCXK(苏)2017-0007。小鼠分笼饲养，每笼5只，饲养室温为24℃，相对湿度为40-80％，每只小鼠均可自由饮水和摄食，适应性饲养7天后开始实验。将100只小鼠随机分为2组：1)假手术组(Sham，n＝10只)；2)模型组(Model， n＝90只)。
2小鼠心衰模型的制备
采用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，取仰卧位，左胸除毛，涂碘伏消毒，连接人工呼吸机(潮气量3mL，呼吸比2:1，心率110)。纵行切开皮层后，逐层钝性分离胸前肌肉直至肋骨显露，在肋间隙用弯钳扎破胸腔，撕开心包，暴露心脏，轻压胸廓即可将心脏挤出胸腔外。快速用6-0号丝线，在冠状动脉左前降支起源出下方3mm处连同线穿过的心肌一并结扎(假手术组只进线不结扎)，结扎完成迅速放回胸腔，挤出气体并缝合。造模完成后，进行心电图测试，检验造模是否成功。
3小动物高频彩色超声(US)测定
分别于造模后第1、7、14、21、28、35、42、49、56天送至南京医科大学动物实验中心进行超声心动图检测。异氟烷吸入式麻醉小鼠，仰位，利用Visual Sonics Vevo2100小动物专用高频彩色超声仪，测定各组小鼠心脏射血分数(EF)、缩短分数(FS)、左室间隔厚度(IVS；d)、左室内径(LVID；d)、左室后壁厚度(LVPW；d)、校正后左室质量(LV Masscorrected)、左室体积(LV Vol；d)、射血前期(PEP)和每搏输出量(SV＝LV Vold-LV Vols)。
4血清中BNP和hs-CRP含量测定
造模后第1、7、14、21、28、35、42、49、56天以摘眼球法取血，血样先室温静置60min后3500rpm离心10min，取上清液，用ELISA试剂盒(双抗体夹心酶联免疫吸附法)测血清中BNP和hs-CRP的含量，具体操作步骤参照试剂盒使用说明书。
5心脏脏器指数的检测
造模后第1、7、14、21、28、35、42、49、56天称取并记录实验小鼠的体重，将心脏组织完整取出后用滤纸拭去表面血迹并以电子天平称重并记录各脏器湿重，由此得到各脏器指数＝脏器质量/体重。
6 HE染色
HE染色的操作步骤：将石蜡切片置于烘箱中60℃烤1～2h；石蜡切片常规二甲苯，乙醇脱蜡至水，苏木素染10分钟，流水冲洗，去余色，0.7％盐酸乙醇分化数秒钟，流水冲洗，切片变蓝约15分钟，7.95％乙醇30秒钟，8.酒精性伊红染30秒，I 95％乙醇30秒钟，II 95％乙醇30秒钟，I 100％乙醇30秒钟，II100％乙醇30秒钟，石碳酸二甲苯30秒钟，(1：4 石碳酸1-二甲苯4)I二甲苯30秒钟，II二甲苯30秒钟，中性树胶封片。
7 Masson染色
石蜡切片脱蜡至水；铬化处理或去汞盐沉淀；依次自来水和蒸馏水洗；用Harris氏苏木素染液或Weigert苏木素液染核1-2min；流水稍洗；0.5％盐酸酒精分化15s；流水冲洗3min；丽春红酸性品红液染8min；蒸馏水稍冲洗；1％磷钼酸水溶液处理约5min；不用水洗，直接用苯胺蓝液或亮绿液复染5min；1％冰醋酸处理1min；95％乙醇脱水5min×2次，用吸水纸吸干液体；100％乙醇5min×2次，用吸水纸吸干液体；二甲苯中透明5min×2次，用吸水纸吸干液体；中性树胶封片。
8脏器湿干质量比
造模后第1、7、14、21、28、35、42、49、56天将各脏器完整取出后用滤纸拭去表面血迹并以电子天平称重并记录各脏器湿重，置于烤箱90℃烘烤72h，称取各脏器干质量，由此得到湿/干质量比。
9力竭游泳试验
造模后第1、7、14、21、28、35、42、49、56天进行力竭游泳试验，在小鼠尾根部系 5％体质量的铅块(使小鼠负重游泳并快速至力竭状态)，把负重小鼠放入水深30cm，内壁光滑，水温(25±2℃)的游泳箱内游泳，记录小鼠的力竭游泳时间(从游泳开始到小鼠头部全部沉入水中8s不能再浮出水面的时间)。每次游泳运动结束后均擦除水分，并使用吹风机吹干皮毛。每次游泳至力竭标准。
实验结果
1慢性心衰模型小鼠心功能的时程变化
利用高频彩色超声对慢性心衰模型小鼠56天内心功能的变化进行了评估，各组小鼠代表性M型超声心动图如图1显示，慢性心衰模型小鼠整体波峰与波谷之间的距离较对照组缩短。与假手术组比较，模型组小鼠射血分数在冠状动脉结扎造模之后的第14天出现显著下降的现象；缩短分数在第7天后持续显著下降；射血前期在第28天开始显著延长，而在造模后前14天射血前期较假手术组呈下降趋势；每搏输出量在第1天后出现下降的现象。
2慢性心衰模型小鼠心脏维度的时程变化
进一步采用超声心动仪对慢性心衰模型小鼠56天内心脏维度的变化进行了考察，与假手术组比较，模型组小鼠左室间隔厚度(图2A)、左室内径(图2B)以及校正后左室质量(图2C)在冠状动脉结扎造模后的第14-56天均显著增加，而左室后壁厚度在第7天开始显著增加(图2D)。
3慢性心衰模型小鼠心脏脏器指数的时程变化
通过考察各组小鼠心脏脏器指数，评估了慢性心衰模型小鼠56天内心肌肥大的情况。结果如图3所示，与假手术组比较，模型组小鼠在冠状动脉结扎造模第1天之后心脏脏器指数整体呈逐渐升高趋势，且在第35天达到最高点。
4慢性心衰模型小鼠血清中BNP和hs-CRP含量的时程变化
各组小鼠血清中BNP含量的检测结果如图4A所示，与假手术组比较，模型组小鼠在冠状动脉结扎造模第7天之后BNP含量呈逐渐升高趋势，而hs-CRP较BNP更为灵敏，在造模后第1天即显著升高，并逐渐升高至第56天(图4B)。
5慢性心衰模型小鼠心肌组织病理和纤维化程度的变化
进一步采用HE和Masson染色分别评估了慢性心衰模型小鼠56天内心肌组织病理和纤维化程度的变化。结果如图5所示，冠状动脉结扎诱导的慢性心衰模型组小鼠随时间的推移，心肌纤维化，充血、水肿炎细胞浸润的程度逐渐加重，在第14-21天心脏组织病理损伤程度较轻，而在第28-35天损伤程度显著升高。
6慢性心衰模型小鼠各脏器水肿程度的变化
液体潴留是慢性心衰患者较为典型的临床表征，通过考察慢性心衰模型小鼠56天内5 个主要脏器组织(心、肝、脾、肺、肾)湿干质量比变化，评估慢性心衰模型小鼠水肿程度。与假手术组比较，模型组小鼠在冠状动脉结扎造模第35天心脏，肺和肾脏组织均出现显著的水肿现象，而肝脏和脾脏组织在第28和35天也出现明显水肿现象。
7慢性心衰模型小鼠运动耐受量的变化
慢性心衰患者往往易出现不同程度的运动耐受量下降等临床表征，通过力竭游泳试验，进一步考察了慢性心衰模型小鼠56天内运动耐受量的变化情况。结果如图7所示，与假手术组比较，模型组小鼠在冠状动脉结扎造模第28天之后出现明显的力竭游泳时间下降的现象。
上述实验结果表明：冠状动脉结扎诱导的慢性心衰模型小鼠在模型后的第2-3周已发展成器质性、结构性心脏病，并且左室功能不正常，符合临床慢性心衰的心功能B阶段；而慢性心衰模型小鼠在第4-5周发生器质性以及功能性病变的基础上，出现较为明显的运动耐受量降低以及液体潴留等心衰体征和症状，符合临床慢性心衰的心功能C阶段。
实施例2.黄嘌呤酸和苯乙酰甘氨酸分别可作为慢性心力衰竭B和C阶段的代谢标志物
实验方法
1实验动物
参见实施例1。
2临床样本
本实验经江苏省中医院共纳入100例研究对象，分别收集其血浆、血清和尿液。三种样品收集后立即分装至150μL/管，置-80℃冷冻保存。所有患者均经临床诊断分为正常健康组 (Normal group)、慢性心衰心功能B阶段组(B stage)和心功能C阶段组(C stage)。
3小鼠心衰模型的制备
参见实施例1。
4动物样品采集
尿液：采集时禁食不禁水，小鼠置于代谢笼中收集24h尿液，尿液置于冰中保持低温， 4000r/min，4℃低温离心5min后，取上清液，分装保存于-80℃。
血清：采集前24h禁食不禁水，以摘眼球法取血，血样先室温静置60min后3500rpm离心10min，取上清液，分装保存于-80℃。
血浆：采集前24h禁食不禁水，以摘眼球法取血，以柠檬酸三钠为抗凝剂，血样先室温静置10min后2500rpm离心10min，取上清液，分装保存于-80℃。
5样品的前处理
将冻存样本(血清、血浆和尿液)常温解冻，取生物样本50μL，内标工作溶液10μL，甲醇140μL，涡旋混匀1min。4℃13000rpm低温离心30min沉淀蛋白，取160μL上清液，再次4℃13000r/min离心30min，取130ul上清，使用0.22μm有机滤膜进行过滤，置入进样瓶4℃冷藏备用，等待上机检测。
6色谱条件
血浆样品使用色谱柱为SynergiTM Fusion-RP C18色谱柱(50×2mm i.d.,2.5μm)，血清和尿液样品使用色谱柱为TSK-GEL Amide-80(Part No.0019696)(150×2.0mmi.d.,5μm)，柱温均为25℃，自动进样器温度为4℃，进样量均为5μL。流动相组成：A相为含0.1％甲酸的水溶液，B相为含0.1％甲酸的乙腈。血浆样品的梯度洗脱条件：0-5min为5-10％B，5-10min 为10-50％B，10-15min为50-70％B，之后回到初始状态，平衡5min；流速0.4mL/min。血清样品的梯度洗脱条件：0-3min为80-75％B，3-8min为75-60％B，8-10min为60-50％B，10-12min保持为50％B，之后回到初始状态，平衡5min；流速0.2mL/min。尿液样品的梯度洗脱条件：0-3min为70-65％B，3-8min为65-60％B，8-10min为60-50％B， 10-22min保持为50％B，之后回到初始状态，平衡5min；流速0.2mL/min。
7质谱条件
选择电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测，信号采集技术选择多反应监测模式 (MRM)。毛细管电压和喷嘴电压(The capillary and Nozzle voltages)分别为3500V和1500V。辅助气温度为350℃，辅助气流量为10L/min，鞘气温度为350℃，鞘气流量为 12L/min，喷雾器压力为50psi。
实验结果
1小鼠和临床血浆样本中代谢物含量测定结果
利用LC-MS测定假手术和慢性心衰模型小鼠在冠状动脉结扎后的第1、7、14、21、28、 35、42、49、56天血浆中C18-二氢鞘氨醇(C18-Dihydrosphingosine)含量的变化；利用LC-MS 测定正常健康组，慢性心衰B和C阶段临床血浆样本中C18-二氢鞘氨醇含量的变化。
结果表明，血浆中C18-二氢鞘氨醇含量呈逐渐降低趋势，结果分别见于图8和图11。
2小鼠和临床血清样本中代谢物含量测定结果
利用LC-MS测定假手术和慢性心衰模型小鼠在冠状动脉结扎后的第1、7、14、21、28、 35、42、49、56天血清中2-花生四烯酰甘油磷酸胆碱，烟酸和吡啶甲酸含量的变化。结果表明，与假手术组比较，血清中2-花生四烯酰甘油磷酸胆碱含量在冠状动脉结扎后第1天至第3周呈上升趋势，但在第4-5周呈现下降趋势，且4-5周较2-3周显著性降低(图9A)；血清中烟酸含量在冠状动脉结扎后一直呈逐渐降低趋势，且2-3周较4-5周降低程度更高(图 9B)；血清中吡啶甲酸含量在冠状动脉结扎后一直呈逐渐降低趋势(图9C)。
利用LC-MS测定正常健康组，慢性心衰B和C阶段临床血清样本中2-花生四烯酰甘油磷酸胆碱，烟酸和吡啶甲酸含量的变化。结果表明，与正常健康组比较，仅慢性心衰B阶段血清样本中2-花生四烯酰甘油磷酸胆碱含量显著升高，而在慢性心衰C阶段又趋于正常；临床血清样本中烟酸和吡啶甲酸含量在慢性心衰B和C阶段均显著降低。
3小鼠尿液样本中代谢物含量测定结果
利用LC-MS测定假手术和慢性心衰模型小鼠在冠状动脉结扎后的第1、7、14、21、28、 35、42、49、56天尿液中苯乙酰甘氨酸，N-甲基-4-吡啶酮-3-羧酰胺，果糖赖氨酸，1-甲基鸟苷，7-甲基鸟嘌呤和黄尿酸含量的变化。结果表明，与假手术组比较，尿液中黄尿酸(图10A)含量在冠状动脉结扎后2-3周显著升高，而4-5周又逐渐趋于假手术含量水平；尿液中苯乙酰甘氨酸(图10B)和1-甲基鸟苷(图10C)含量均在冠状动脉结扎后2-3周无显著变化，但4-5周开始显著升高；尿液中N-甲基-4-吡啶酮-3-羧酰胺(图10D)含量在冠状动脉结扎后第1周前显著升高，但在2-5周均显著降低；尿液中果糖赖氨酸(图10E)含量在冠状动脉结扎后一直呈降低趋势；尿液中7-甲基鸟嘌呤(图10F)含量在冠状动脉结扎后 2-5周均显著增加。
4临床尿液样本中代谢物含量测定结果
利用LC-MS测定正常健康组、慢性心衰B和C阶段临床尿液样本中苯乙酰甘氨酸，N-甲基-4-吡啶酮-3-羧酰胺，果糖赖氨酸，1-甲基鸟苷，7-甲基鸟嘌呤和黄尿酸含量的变化。结果表明，与正常健康组比较，仅慢性心衰B阶段尿液样本中黄尿酸含量显著升高，而在慢性心衰C阶段又趋于正常；临床尿液样本中苯乙酰甘氨酸，1-甲基鸟苷和7-甲基鸟嘌呤含量在慢性心衰B阶段均无显著变化，但在C阶段尿液样本中却显著升高；临床尿液样本中N-甲基-4-吡啶酮-3-羧酰胺和果糖赖氨酸含量在慢性心衰B和C阶段中均显著降低，且两组间无显著差异。
上述实验结果表明：黄尿酸和苯乙酰甘氨酸分别在B和C阶段慢性心衰临床患者和小鼠尿液中特异性升高，可以用于慢性心力衰竭心功能B和C级的诊断。
实施例3 KMO可调节黄尿酸的升高，可作为慢性心力衰竭B阶段治疗的新靶点
实验方法
1实验动物
其他参见实施例1，不同点在于，将60只小鼠随机分为6组：
1)假手术组(Sham，n＝10只)：手术后腹腔注射(ip)等容积量的氯化钠注射液，造模后第1d开始，连续14天，1次/日；
2)模型组(Model-2w，n＝10只)：手术后腹腔注射(ip)等容积量的氯化钠注射液，造模后第1d开始，连续14天，1次/日；
3)模型组(Model-5w，n＝10只)：手术后腹腔注射(ip)等容积量的氯化钠注射液，造模后第1d开始，连续35天，1次/日；
4)KMO抑制剂高剂量组(UPF-648-H，n＝10只)：手术后腹腔注射(ip)UPF-648溶液2mg/kg，造模后第1d开始，连续14天，1次/日；
5)KMO抑制剂低剂量组(UPF-648-L，n＝10只)：手术后腹腔注射(ip)UPF-648溶液1mg/kg，造模后第1d开始，1次/3日，共14天；
6)美托洛尔组(Met，n＝10只)：手术后灌胃(ig)美托洛尔5.14mg/kg，造模后第1d开始，连续14天。
2细胞
H9c2(2-1)心肌细胞系，购自上海中科院细胞库。
3小鼠心衰模型的制备
参加实施例1。
4 LC-MS组织样品采集
将小鼠处死后迅速解剖取出心、肝、脾、肺、肾和脑等组织，用生理盐水将各组织表面的血渍漂洗干净，并用滤纸将残留水渍吸干，称重，加入定量的生理盐水(1g组织加2mL生理盐水)用玻璃匀浆器将各组织制成匀浆液，分装保存于-80℃。
5 LC-MS样品的前处理
将冻存组织样本(心、肝、脾、肺、肾和脑)常温解冻，取组织样本50μL，内标工作溶液10μL，甲醇140μL，涡旋混匀1min。4℃13000rpm低温离心30min沉淀蛋白，取160μL 上清液，再次4℃13000r/min离心30min，取130ul上清，使用0.22μm有机滤膜进行过滤，置入进样瓶4℃冷藏备用，等待上机检测。
6 LC-MS色谱条件
组织样品使用色谱柱为TSK-GEL Amide-80(Part No.0019696)(150×2.0mmi.d.,5μm)，柱温均为25℃，自动进样器温度为4℃，进样量均为5μL。流动相组成：A相为含0.1％甲酸的水溶液，B相为含0.1％甲酸的乙腈。样品的梯度洗脱条件：0-3min为70-65％B，3-8min 为65-60％B，8-10min为60-50％B，10-22min保持为50％B，之后回到初始状态，平衡5min；流速0.2mL/min。
7 LC-MS质谱条件
选择电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测，信号采集技术选择多反应监测模式 (MRM)。毛细管电压和喷嘴电压(The capillary and Nozzle voltages)分别为3500V和1500V。辅助气温度为350℃，辅助气流量为10L/min，鞘气温度为350℃，鞘气流量为 12L/min，喷雾器压力为50psi。
8 Western Blotting法检测蛋白表达
假手术组(Sham)、模型组(Model-2w)和模型组(Model-5w)小鼠心脏经生理盐水灌注后取出，去掉除心脏左室外其余部分，用含1mM PMSF的匀浆液匀浆，BCA试剂盒定量。每组样品分别上样于10％SDS-PAGE凝胶，转膜后的条带用对应一抗于4℃孵育过夜。洗涤后，PVDF膜上的蛋白条带孵育对应2抗，ECL试剂盒显色，经凝胶成像仪曝光后分析条带，蛋白含量表示为对应内参条带的相对值。主要利用Western blotting考察各组小鼠心脏组织中调控酶A-E蛋白表达情况。
9免疫组化染色
取各脏器组织，利用免疫组化分析调控酶表达情况。心脏取出后置于4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成4μm的切片。切片用PBS水合，置于3％过氧化氢溶液中封闭过氧化物酶。切片取出后置于37℃封闭液进封闭1小时，4℃下孵育一抗(1：100)过夜。PBS洗涤后，切片37℃下孵育1小时的HRP-Conjugated Secondary抗体(1：200)。在DAB染色，苏木精复染和分段脱水后封片，于200X显微镜下观察。
10血清中生化指标含量测定
摘眼球法取血，血样先室温静置60min后3500rpm离心10min，取上清液，用ELISA试剂盒(双抗体夹心酶联免疫吸附法)测血清中BNP、hs-CRP、TNF-α、MDA和NO的含量，具体操作步骤参照试剂盒使用说明书。
11 HE染色
参见实施例1。
12 Masson染色
参见实施例1。
13透射电镜检测
1)固定：收集处理后的小鼠心脏组织，分别加入1mL2.5％戊二醛，充分摇晃约2min，隔15min再摇晃1次，而后放置4℃冰箱内固定2h以上待用；
2)漂洗：用0.1M PBS缓冲液(PH 7.2)冲洗3次，每次15min。以除去残留的戊二醛；
3)后固定：将组织标本移入装有1％锇酸固定液的离心管内充分摇晃约5min，使饿酸充分浸透心脏组织，固定1h；
4)漂洗：用0.1M PBS缓冲液(PH 7.2)冲洗3次，每次15min。用双蒸水漂洗一次，约10min充分摇晃，去除PBS；
5)块染：1％醋酸铀染色液处理2h，待有沉淀物出现，吸掉染色液，双蒸水续洗；
6)梯度脱水：将标本分别浸入50％、70％、80％、90％丙酮各脱水15min，纯丙酮浸泡 2次，共20min；
7)渗透：丙酮/包埋剂＝1：1，37℃烘箱1h；丙酮/包埋剂＝1：4，37℃烘箱过夜；在纯包埋液内45℃烘箱1h；
8)包埋聚合：烘箱烘干；
9)超薄切片；
10)透射电镜观察并拍照。
14细胞培养及分组
14.1H9c2心肌细胞的培养
大鼠心肌细胞系(H9c2(2-1))培养于含10％FBS的DMEM培养基中，置37℃、5％CO2培养箱中培养。细胞呈贴壁生长，待长满80％以上时传代，弃去培养液，加入2mL PBS轻轻荡洗，弃去荡洗液，加入2mL 0.25％胰酶溶液，37℃消化至细胞形态皱缩变圆，弃去消化液并加入含有10％FBS的培养基终止消化，反复吹打，将细胞悬液转移至离心管， 1000rpm离心5min，弃上清，将细胞重悬于含10％FBS的培养基中，以1×105细胞/mL接种于新的培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。
14.2 H9c2心肌细胞的冻存
取对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化细胞后，加入含10％FBS的DMEM培养基终止消化，收集细胞悬液，1000rpm离心5min，弃上清，将细胞重悬于冻存液中，冻存液中细胞最终为2×106个细胞数/mL，分装于冻存管中。将冻存管无菌密封后，立即放置于4℃冰箱30min，再转移至-20℃，放置2h，再置于-70℃低温冰箱中过夜(16～18h)，于次日转入液氮中保存。
14.3 H9c2心肌细胞复苏
从液氮罐中取出细胞冻存管，立即放入37℃水浴中快速摇晃，使冻存管内细胞在1min 之内完全融化。室温下1000rpm离心5min，弃去上层液，加入1mL DMEM完全培养基重悬，吹匀，将细胞悬液转移至培养瓶中，加入充足的培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养。
14.4实验分组
取对数生长期H9c2大鼠心肌细胞，消化后，用含10％FBS的DMEM培养基重悬，接种于96孔板，接种密度为6×104个细胞/mL，每孔加入100μL含10％FBS的培养基，置37℃、 5％CO2培养箱中正常培养，待细胞进入对数生长期，按照下述方法建立N2缺氧箱的氧糖剥夺(Oxygen and glucose deprivation，OGD)模型，具体分组情况如下：
1)正常培养组(Control)：采用正常培养基于37℃、5％CO2培养箱中正常培养；
2)正常培养组+UPF-648高剂量组(Control+UPF-648-H)：加入UPF-648 2μM后，采用正常培养基于37℃、5％CO2培养箱中正常培养；
3)正常培养组+UPF-648中剂量组(Control+UPF-648-M)：加入UPF-648 1μM后，采用正常培养基于37℃、5％CO2培养箱中正常培养；
4)正常培养组+UPF-648低剂量组(Control+UPF-648-L)：加入UPF-648 0.5μM后，采用正常培养基于37℃、5％CO2培养箱中正常培养；
5)OGD模型组(OGD)：将进入对数生长期用于实验的细胞用预先经94％ N2+5％CO2+1％O2的混合气饱和1h的无糖培养基置换正常培养液，后放入通有94％N2+5％ CO2+1％O2的37℃恒温培养箱，缺氧培养6h。
6)OGD模型组+UPF-648高剂量组(OGD+UPF-648-H)：加入UPF-648 2μM后，同时以94％N2+5％CO2+1％O2混合气饱和1h的无糖培养基置换正常培养基，缺氧培养6h。
7)OGD模型组+UPF-648中剂量组(OGD+UPF-648-M)：加入UPF-648 1μM后，同时以94％N2+5％CO2+1％O2混合气饱和1h的无糖培养基置换正常培养基，缺氧培养6h。
8)OGD模型组+UPF-648低剂量组(OGD+UPF-648-L)：加入UPF-648 0.5μM后，同时以94％N2+5％CO2+1％O2混合气饱和1h的无糖培养基置换正常培养基，缺氧培养6h。
15细胞活力检测
取对数生长期H9c2大鼠心肌细胞，消化后，接种于96孔培养板，37℃，5％CO2饱和湿度下培养。各实验组细胞经处理后，加入已配制好的MTT孵育。用酶联免疫检测仪测定每孔的OD值(测定波长570nm，参比波长650nm)。并计算细胞活性。
16细胞上清液中LDH释放检测
取对数生长期H9c2大鼠心肌细胞，消化后，接种于96孔培养板，每孔接种100μL细胞浓度为1×105个/mL的细胞，然后37℃、5％CO2饱和湿度下培养24h。各实验组细胞经给药或者氧糖剥夺处理后，取培养液上清，按照LDH试剂盒说明进行测定，采用2,4-二硝基苯肼显色法测定LDH释放量。
实验结果
1慢性心衰模型小鼠B阶段各脏器组织中黄尿酸含量的变化
利用LC-MS对假手术和慢性心衰B阶段的模型小鼠的心、肝、脾、肺、肾和脑组织中黄尿酸的含量进行定量检测。具体结果如图14所示，与假手术组比较，慢性心衰B阶段的模型小鼠中心脏组织中黄尿酸含量显著升高，而在肝、肾和脾组织中黄尿酸含量显著低于假手术，在肺和脑组织中B阶段模型小鼠和假手术组无显著差异。
2利用转录组学遴选慢性心衰模型小鼠B阶段心脏组织中黄尿酸相关代谢通路中的差异基因
黄尿酸主要参与色氨酸代谢途径，具体如图15A所示。基于前期转录组学结果，其中参与黄尿酸相关代谢通路的关键调控酶基因有HemK甲基转移酶家族成员1(HEMK1)、犬尿氨酸氨基转移酶1(KAT1)和KMO，所遴选的差异基因在假手术组和B阶段的慢性心衰模型小鼠心脏组织中的RNA水平如图15B-D所示，与假手术组比较，HEMK1和KAT1 在B阶段的慢性心衰模型小鼠心脏组织中RNA水平均显著降低，而KMO显著升高。
3 B和C阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织中Xanthurenic acid相关代谢通路中关键调控酶蛋白表达情况
利用Western Blotting法分别检测假手术组、B和C阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织中 Xanthurenic acid相关代谢通路中关键调控酶蛋白KAT1、犬尿氨酸氨基转移酶3(KAT3)、 KMO、犬尿氨酸酶(KYNU)和HEMK1的表达情况。具体结果如图16所示，与假手术比较，B阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织中KAT3、KMO和KYNU的表达显著上升，至C阶段表达与假手术组无显著差异。其中HEMK1的表达显著降低，但其在C阶段也存在降低趋势。此外，KAT1在B阶段无显著变化，直至C阶段显著升高。
4 B阶段慢性心衰模型小鼠各脏器组织中KMO表达情况
利用免疫组化技术考察假手术组和B阶段慢性心衰模型组小鼠心、肝、脾、肺、肾和脑组织中KMO表达情况，结果如图17所示，与假手术比较，B阶段慢性心衰模型组小鼠心脏组织中KMO的表达显著升高，其余组织中KMO的表达水平与假手术组无明显差异。
5 KMO抑制剂对B阶段慢性心衰模型小鼠尿液中黄尿酸和苯乙酰甘氨酸含量的影响
利用LC-MS考察KMO抑制剂UPF-648是否可有效抑制B阶段慢性心衰模型小鼠尿液中黄尿酸含量的升高，结果如图18A所示，剂量为2mg/kg和1mg/kg的UPF-648均可有效抑制B阶段慢性心衰模型小鼠尿液中黄尿酸含量的升高，并且阳性药美托洛尔对其含量的升高无抑制作用。此外还考察了KMO抑制剂UPF-648对各组小鼠尿液中苯乙酰甘氨酸含量的影响，结果如图18B所示，剂量为2mg/kg和1mg/kg的UPF-648对各组小鼠尿液中苯乙酰甘氨酸含量均无影响。.
6 KMO抑制剂对B阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织病理和纤维化程度的影响
借助HE和Masson染色分别评估了给予KMO抑制剂UPF-648后对B阶段慢性心衰模型小鼠心肌组织病理和纤维化程度的变化。结果如图19所示，B阶段慢性心衰小鼠出现明显心肌纤维化，充血、水肿炎细胞浸润等现象。剂量为2mg/kg和1mg/kg的UPF-648均可有效改善模型小鼠的病理和纤维化程度，且高剂量的UPF-648改善效果最佳。
7 KMO抑制剂对B阶段慢性心衰模型小鼠血清中心衰相关生化指标的影响
利用ELISA试剂盒法考察了给予KMO抑制剂UPF-648后对B阶段慢性心衰模型小鼠血清中心衰相关生化指标的影响和变化，主要包括BNP、hs-CRP、TNF-α、MDA和NO。结果如图20所示，与假手术组比较，B阶段慢性心衰小鼠血清中心衰生化指标均显著上升，表明造模成功。与模型组比较，发现剂量为2mg/kg的UPF-648对B阶段慢性心衰小鼠血清中BNP、hs-CRP、TNF-α、MDA和NO等心衰生化指标均有较好的调控作用，而剂量为1mg/kg 的UPF-648除了BNP，其余生化指标hs-CRP、TNF-α、MDA和NO也均表现出较好的改善作用。
8 KMO抑制剂对B阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织超微结构的影响
透射电镜结果如图21所示，假手术组小鼠心肌细胞排列比较整齐，肌纤维排列比较规则，细胞间连接清楚、不间断且结构较为完整；胞质有整齐排列的肌原纤维；胞质中含大量线粒体且结构完整；细胞核位于中央且结构完整。与假手术组比较，B阶段慢性心衰模型组小鼠心肌细胞肌原纤维排列杂乱、并发生分离、断裂溶解等现象，细胞间连接模糊，线粒体数量增多、堆积，其形态肿胀，溶解，出现许多空泡，表明造模成功。高低剂量(1mg/kg和2mg/kg)KMO抑制剂UPF-648和美托洛尔阳性药组小鼠心肌细胞心肌纤维溶解现象较模型组减轻，心肌细胞的肌原纤维排列恢复正常，细胞核形态也趋于正常。
9 KMO抑制剂对B阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织中KMO表达的影响
利用免疫组化技术考察了给予KMO抑制剂UPF-648后对B阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织中KMO表达的影响，结果如图22所示，与假手术比较，B阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织中KMO表达水平显著上升，这与与前期研究结果相一致，而给予UPF-648后，高低剂量组均体现了较好的KMO表达抑制作用。
10 KMO抑制剂对OGD诱导损伤的H9c2细胞活力的影响
H9c2心肌细胞采用氧糖剥夺的造模方式模拟体内缺血环境培养，用MTT法考察KMO抑制剂UPF-648对OGD诱导损伤的H9c2细胞活力的影响。结果如图23所示，与空白组比较，OGD组H9c2心肌细胞缺氧6h使细胞活力明显下降，表明造模成功。与OGD组比较，给予KMO抑制剂UPF-648(1μM和2μM)均显著的提升模型细胞活力，且对空白组细胞无细胞活力影响。
11 KMO抑制剂对OGD诱导损伤的H9c2细胞LDH漏出率的影响
利用LDH试剂盒考察KMO抑制剂UPF-648对OGD诱导损伤的H9c2细胞LDH漏出率的影响，结果如图24所示，OGD刺激使H9c2细胞LDH漏出率显著增加，2μM的UPF-648 对OGD引起的H9c2细胞LDH释放均有明显的抑制作用，说明UPF-648可减轻OGD引起的细胞膜损伤，且对正常组细胞LDH漏出率也无显著影响。
上述实验结果表明：犬尿氨酸3-单加氧酶(KMO)在慢性心衰B阶段小鼠心脏组织中表达特异性升高，是引起黄尿酸在B阶段慢性心衰小鼠尿液中特异性升高的关键调控酶。此外，通过抑制KMO可以有效缓解心肌缺血损伤。
实施例4.ALDH1A3可调节苯乙酰甘氨酸的升高，可作为慢性心力衰竭C阶段治疗的新靶点
实验方法
1实验动物
其他参见实施例1，不同点在于，将60只小鼠随机分为6组：
1)假手术组(Sham，n＝10只)：手术后腹腔注射(ip)等容积量的氯化钠注射液，造模后第1d开始，连续35天，1次/日；
2)模型组(Model-2w，n＝10只)：手术后腹腔注射(ip)等容积量的氯化钠注射液，造模后第1d开始，连续14天，1次/日；
3)模型组(Model-5w，n＝10只)：手术后腹腔注射(ip)等容积量的氯化钠注射液，造模后第1d开始，连续35天，1次/日；
4)ALDH1A3抑制剂高剂量组(CM 10-H，n＝10只)：手术后腹腔注射(ip)CM 10 溶液2mg/kg，造模后第1d开始，1次/3日，共35天；
5)ALDH1A3抑制剂低剂量组(CM 10-L，n＝10只)：手术后腹腔注射(ip)CM 10 溶液1mg/kg，造模后第1d开始，1次/3日，共35天；
6)美托洛尔组(Met，n＝10只)：手术后灌胃(ig)美托洛尔5.14mg/kg，造模后第1d开始，连续35天，1次/日。
2小鼠心衰模型的制备
参见实施例1。
3 LC-MS组织样品采集
参见实施例3。
4 LC-MS样品的前处理
参见实施例3。
5 LC-MS色谱条件
参见实施例3。
6 LC-MS质谱条件
参见实施例3。
7 Western Blotting法检测蛋白表达
取假手术组(Sham)、模型组(Model-2w)和模型组(Model-5w)小鼠心脏匀浆用于Western blotting检测，主要考察各组小鼠心脏组织中ALDH1A3、ALDH3B1和ALDH3B2 蛋白表达情况。其余步骤参见3.1.8。
8免疫组化染色
取各脏器组织，利用免疫组化分析ALDH1A3表达情况。其余步骤参见3.1.9。
9血清中生化指标含量测定
摘眼球法取血，血样先室温静置60min后3500rpm离心10min，取上清液，用ELISA试剂盒(双抗体夹心酶联免疫吸附法)测血清中BNP、hs-CRP、TNF-α和MDA的含量，具体操作步骤参照试剂盒使用说明书。
10 HE染色
参见实施例1。
11 Masson染色
参见实施例1。
12透射电镜检测
参见实施例3。
13细胞培养及分组
13.1 H9c2心肌细胞的培养
参见实施例3。
13.2 H9c2心肌细胞的冻存
参见实施例3。
13.3 H9c2心肌细胞复苏
参见实施例3。
13.4实验分组
取对数生长期H9c2大鼠心肌细胞，消化后，用含10％FBS的DMEM培养基重悬，接种于96孔板，接种密度为6×104个细胞/mL，每孔加入100μL含10％FBS的培养基，置 37℃、5％CO2培养箱中正常培养，待细胞进入对数生长期，按照下述方法建立N2缺氧箱 OGD模型，具体分组情况如下：
1)正常培养组(Control)：采用正常培养基于37℃、5％CO2培养箱中正常培养；
2)正常培养组+CM 10高剂量组(Control+UPF-648-H)：加入CM 10 1.28μM后，采用正常培养基于37℃、5％CO2培养箱中正常培养；
3)正常培养组+CM 10中剂量组(Control+UPF-648-M)：加入CM 10 0.64μM后，采用正常培养基于37℃、5％CO2培养箱中正常培养；
4)正常培养组+CM 10低剂量组(Control+UPF-648-L)：加入CM 10 0.32μM后，采用正常培养基于37℃、5％CO2培养箱中正常培养；
5)OGD模型组(OGD)：将进入对数生长期用于实验的细胞用预先经94％ N2+5％CO2+1％O2的混合气饱和1h的无糖培养基置换正常培养液，后放入通有94％ N2+5％CO2+1％O2的37℃恒温培养箱，缺氧培养6h。
6)OGD模型组+CM 10高剂量组(OGD+UPF-648-H)：加入CM 10 1.28μM后，同时以94％N2+5％CO2+1％O2混合气饱和1h的无糖培养基置换正常培养基，缺氧培养6h。
7)OGD模型组+CM 10中剂量组(OGD+UPF-648-M)：加入CM 10 0.64μM后，同时以94％N2+5％CO2+1％O2混合气饱和1h的无糖培养基置换正常培养基，缺氧培养6h。
8)OGD模型组+CM 10低剂量组(OGD+UPF-648-L)：加入CM 10 0.32μM后，同时以94％N2+5％CO2+1％O2混合气饱和1h的无糖培养基置换正常培养基，缺氧培养6h。
14细胞活力检测
参见实施例3。
15细胞上清液中LDH释放检测
参见实施例3。
实验结果
1慢性心衰模型小鼠C阶段各脏器组织中苯乙酰甘氨酸含量的变化
利用LC-MS对假手术和慢性心衰C阶段的模型小鼠的心、肝、脾、肺、肾和脑组织中苯乙酰甘氨酸的含量进行定量检测。具体结果如图25所示，与假手术组比较，慢性心衰C 证阶段的模型小鼠中心和肺组织中苯乙酰甘氨酸含量显著升高，而在肝和脾组织中苯乙酰甘氨酸含量显著低于假手术，在肾和脑组织中C阶段模型小鼠和假手术组无显著差异。
2利用转录组学遴选慢性心衰模型小鼠C阶段心脏组织中苯乙酰甘氨酸相关代谢通路中的差异基因
苯乙酰甘氨酸主要参与苯丙氨酸代谢途径，具体如图26A所示。基于前期转录组学结果，其中参与苯乙酰甘氨酸相关代谢通路的关键调控酶基因有ALDH1A3、乙醛脱氢酶家族3成员B1(ALDH3B1)和乙醛脱氢酶家族3成员B2(ALDH3B2)，所遴选的差异基因在假手术组和C阶段的慢性心衰模型小鼠心脏组织中的RNA水平如图26B-D所示，与假手术组比较，ALDH1A3、ALDH3B1和ALDH3B2在C阶段的慢性心衰模型小鼠心脏组织中RNA 水平均显著降低。
3 B和C阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织中苯乙酰甘氨酸相关代谢通路中关键调控酶蛋白表达情况
利用Western Blotting法分别检测假手术组、B和C阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织中苯乙酰甘氨酸相关代谢通路中关键调控酶蛋白ALDH1A3、ALDH3B1和ALDH3B2的表达情况。具体结果如图27所示，与假手术比较，C阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织中仅 ALDH1A3的表达显著上升，而B阶段表达与假手术组无显著差异。B和C阶段慢性心衰模型小鼠心脏中ALDH3B1和ALDH3B2的表达与假手术无差异。
4 C阶段慢性心衰模型小鼠各脏器组织中ALDH1A3表达情况
利用免疫组化技术考察假手术组和C阶段慢性心衰模型组小鼠心、肝、脾、肺、肾和脑组织中ALDH1A3表达情况，结果如图28所示，与假手术比较，C阶段慢性心衰模型组小鼠心脏组织中ALDH1A3的表达显著升高，其余组织中ALDH1A3的表达水平与假手术组无明显差异。
5 ALDH1A3抑制剂对C阶段慢性心衰模型小鼠尿液中苯乙酰甘氨酸和黄尿酸含量的影响
利用LC-MS考察ALDH1A3抑制剂CM 10是否可有效抑制C阶段慢性心衰模型小鼠尿液中苯乙酰甘氨酸含量的升高，结果如图29A所示，剂量为2mg/kg和1mg/kg的CM 10均可有效抑制C阶段慢性心衰模型小鼠尿液中苯乙酰甘氨酸含量的升高，且阳性药美托洛尔对其含量的升高也表现出明显的抑制作用。此外还考察了ALDH1A3抑制剂CM 10对各组小鼠尿液中黄尿酸含量的影响，结果如图29B所示，各组间小鼠尿液中黄尿酸含量均无明显差异。
6 ALDH1A3抑制剂对C阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织病理和纤维化程度的影响
借助HE和Masson染色分别评估了给予ALDH1A3抑制剂CM 10后对C阶段慢性心衰模型小鼠心肌组织病理和纤维化程度的变化。结果如图30所示，C阶段慢性心衰模型组小鼠出现明显心肌纤维化，充血、水肿炎细胞浸润等现象。剂量为2mg/kg和1mg/kg的CM 10 均可有效改善模型小鼠的病理和纤维化程度，且高剂量的CM 10改善效果最佳。
7 ALDH1A3抑制剂对C阶段慢性心衰模型小鼠血清中心衰相关生化指标的影响
利用ELISA试剂盒法考察了给予ALDH1A3抑制剂CM 10后对C阶段慢性心衰模型小鼠血清中心衰相关生化指标的影响和变化，主要包括BNP、hs-CRP、TNF-α和MDA。结果如图31所示，与假手术组比较，C阶段慢性心衰小鼠血清中心衰生化指标均显著上升，表明造模成功。与模型组比较，发现剂量为2mg/kg和1mg/kg的CM 10对C阶段慢性心衰小鼠血清中BNP、hs-CRP、TNF-α和MDA等心衰生化指标均有较好的调控作用。
8 ALDH1A3抑制剂对C阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织超微结构的影响
透射电镜结果如图32所示，假手术组小鼠心肌细胞排列比较整齐，肌纤维排列比较规则，细胞间连接清楚、不间断且结构较为完整；胞质有整齐排列的肌原纤维；胞质中含大量线粒体且结构完整；细胞核位于中央且结构完整。与假手术组比较，C阶段慢性心衰模型组小鼠心肌细胞肌原纤维排列杂乱、并发生分离、断裂溶解等现象，细胞间连接模糊，线粒体数量增多、堆积，其形态肿胀，溶解，出现许多空泡，表明造模成功。高低剂量(1mg/kg和2mg/kg)ALDH1A3抑制剂CM 10和美托洛尔阳性药组小鼠心肌细胞心肌纤维溶解现象较模型组减轻，心肌细胞的肌原纤维排列恢复正常，细胞核形态也趋于正常。
9 ALDH1A3抑制剂对C阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织中ALDH1A3表达的影响
利用免疫组化技术考察了给予ALDH1A3抑制剂CM 10后对C阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织中ALDH1A3表达的影响，结果如图33所示，与假手术比较，C阶段慢性心衰模型小鼠心脏组织中ALDH1A3表达水平显著上升。而给予CM 10后，高低剂量组均体现了较好的ALDH1A3表达抑制作用。
10 ALDH1A3抑制剂对OGD诱导损伤的H9c2细胞活力的影响
H9c2心肌细胞采用氧糖剥夺的造模方式模拟体内缺血环境培养，用MTT法考察ALDH1A3抑制剂CM 10对OGD诱导损伤的H9c2细胞活力的影响。结果如图34所示，与空白组比较，OGD组H9c2心肌细胞缺氧6h使细胞活力明显下降，表明造模成功。与OGD 组比较，给予ALDH1A3抑制剂CM 10(1μM和2μM)均显著的提升模型细胞活力，且对空白组细胞无细胞活力影响。
11 ALDH1A3抑制剂对OGD诱导损伤的H9c2细胞LDH漏出率的影响
利用LDH试剂盒考察ALDH1A3抑制剂CM 10对OGD诱导损伤的H9c2细胞LDH漏出率的影响，结果如图35所示，OGD刺激使H9c2细胞LDH漏出率显著增加，剂量为 0.32μM、0.64μM和1.28μM的CM 10对OGD引起的H9c2细胞LDH释放均有明显的抑制作用，说明UPF-648可减轻OGD引起的细胞膜损伤，且1.28μM的CM 10对正常组细胞 LDH漏出率也有明显抑制作用。
上述实验结果表明：醛脱氢酶家族1成员A3(ALDH1A3)在慢性心衰C阶段小鼠心脏组织中表达特异性升高，是引起苯乙酰甘氨酸在C阶段慢性心衰小鼠尿液中特异性升高的关键调控酶。此外，通过抑制ALDH1A3可以有效缓解心肌缺血损伤。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims (10)

1.一种代谢标志物在制备慢性心力衰竭B和C阶段病程诊断或监测制剂中的应用，其特征在于，所述代谢标志物为黄尿酸和/或苯乙酰甘氨酸。
2.一种慢性心力衰竭B和C阶段病程诊断或监测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有检测权利要求1所述的代谢标志物的试剂。
3.权利要求1所述的代谢标志物在制备或筛选治疗慢性心力衰竭B和C阶段的药物中的应用。
4.KMO和/或ALDH1A3作为检测靶点在慢性心力衰竭B和C阶段病程诊断或监测制剂中的应用。
5.检测KMO和/或ALDH1A3的试剂在制备慢性心力衰竭Ｂ和Ｃ阶段病程诊断或监测制剂中的应用。
6.一种慢性心力衰竭Ｂ和Ｃ阶段病程诊断或监测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有检测KMO和/或ALDH1A3的试剂。
7.KMO和/或ALDH1A3作为治疗靶点在制备或筛选治疗慢性心力衰竭的药物中的应用。
8.抑制KMO和/或ALDH1A3表达的物质在治疗慢性心力衰竭的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的抑制KMO表达的物质为UPF-648。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑制ALDH1A3表达的物质为CM10。
CN202010442068.0A 2020-05-22 2020-05-22 一种快速精准实现慢性心力衰竭心功能病程分级的方法 Pending CN111647640A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010442068.0A CN111647640A (zh) 2020-05-22 2020-05-22 一种快速精准实现慢性心力衰竭心功能病程分级的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010442068.0A CN111647640A (zh) 2020-05-22 2020-05-22 一种快速精准实现慢性心力衰竭心功能病程分级的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111647640A true CN111647640A (zh) 2020-09-11

Family

ID=72349572

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010442068.0A Pending CN111647640A (zh) 2020-05-22 2020-05-22 一种快速精准实现慢性心力衰竭心功能病程分级的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111647640A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024007778A1 (zh) * 2022-07-05 2024-01-11 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 一种血浆分子标志物犬尿氨酸在早期心力衰竭检测中的应用
WO2024109767A1 (zh) * 2022-11-25 2024-05-30 中国科学院深圳先进技术研究院 基于粪便代谢物的阿尔兹海默症标志物及其应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060019890A1 (en) * 2004-01-15 2006-01-26 Kapoun Ann M Method for treating cardiac remodeling following myocardial injury
CN101443823A (zh) * 2004-12-29 2009-05-27 纳图龙公司 黄尿酸衍生物药物组合物及其相关方法
KR20120131368A (ko) * 2011-05-25 2012-12-05 연세대학교 산학협력단 대사물질을 이용한 심부전 바이오마커
CN103237901A (zh) * 2010-03-01 2013-08-07 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 用于治疗诊断的生物标志物
CN106526156A (zh) * 2016-10-26 2017-03-22 王喜军 一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法
CN109952102A (zh) * 2016-09-05 2019-06-28 代谢研究所 使用色氨酸代谢物治疗肌肉萎缩
CN110161242A (zh) * 2019-05-23 2019-08-23 华中科技大学同济医学院附属同济医院 EETs、sEH、sEH抑制剂在慢性心力衰竭中的应用
CN110268048A (zh) * 2016-12-04 2019-09-20 大学健康网络 从人多能干细胞生成心房心肌细胞和心室心肌细胞谱系
CN110794074A (zh) * 2019-11-18 2020-02-14 广西医科大学 当归四逆汤抗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060019890A1 (en) * 2004-01-15 2006-01-26 Kapoun Ann M Method for treating cardiac remodeling following myocardial injury
CN101443823A (zh) * 2004-12-29 2009-05-27 纳图龙公司 黄尿酸衍生物药物组合物及其相关方法
CN104069123A (zh) * 2004-12-29 2014-10-01 纳图龙公司 黄尿酸衍生物药物组合物及其相关方法
CN103237901A (zh) * 2010-03-01 2013-08-07 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 用于治疗诊断的生物标志物
KR20120131368A (ko) * 2011-05-25 2012-12-05 연세대학교 산학협력단 대사물질을 이용한 심부전 바이오마커
CN109952102A (zh) * 2016-09-05 2019-06-28 代谢研究所 使用色氨酸代谢物治疗肌肉萎缩
CN106526156A (zh) * 2016-10-26 2017-03-22 王喜军 一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法
CN110268048A (zh) * 2016-12-04 2019-09-20 大学健康网络 从人多能干细胞生成心房心肌细胞和心室心肌细胞谱系
CN110161242A (zh) * 2019-05-23 2019-08-23 华中科技大学同济医学院附属同济医院 EETs、sEH、sEH抑制剂在慢性心力衰竭中的应用
CN110794074A (zh) * 2019-11-18 2020-02-14 广西医科大学 当归四逆汤抗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDERS LUND: "3rd World Heart Congress-Kynurenine pathway metabolites are associated with mortality in patients with heart failure", 《J CLIN EXP CARDIOLOGY》 *
FRANCESCO FAZIO等: "Vasorelaxing Action of the Kynurenine Metabolite, Xanthuren Acid: The Missing Link in Endotoxin-Induced Hypotension?", 《FRONTIERS IN PHARMACOLOGY》 *
HOWARD A. LEVY等: "Pyridoxine Deficiency in Congestive Heart Failure", 《P.S.E.B.M.》 *
XIUJIE XIE等: "ALDH1A3 Regulations of Matricellular Proteins Promote Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation", 《ISCIENCE》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024007778A1 (zh) * 2022-07-05 2024-01-11 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 一种血浆分子标志物犬尿氨酸在早期心力衰竭检测中的应用
WO2024109767A1 (zh) * 2022-11-25 2024-05-30 中国科学院深圳先进技术研究院 基于粪便代谢物的阿尔兹海默症标志物及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Edwards et al. Identification of atrial natriuretic factor within ventricular tissue in hamsters and humans with congestive heart failure.
Cassling et al. Quantitative evaluation of inflammation in biopsy specimens from idiopathically failing or irritable hearts: experience in 80 pediatric and adult patients
CN111647640A (zh) 一种快速精准实现慢性心力衰竭心功能病程分级的方法
Fayyaz et al. Pathophysiological insights into HFpEF from studies of human cardiac tissue
Jung et al. Cardiac-specific overexpression of oxytocin receptor leads to cardiomyopathy in mice
Nakayama et al. Dilated cardiomyopathy with eosinophilic granulomatosis with polyangiitis in which active myocardial inflammation was only detected by endomyocardial biopsy
CN112753655A (zh) Sirt5蛋白作为标志物在诊断或辅助诊断急性心肌梗死中的应用
Zhang et al. Type I epithelial cells are the main target of whole-body hypoxic preconditioning in the lung
Zhai et al. Sevoflurane prevents pulmonary vascular remodeling and right ventricular dysfunction in pulmonary arterial hypertension in rats
WO2022033163A1 (zh) 一种衰老以及健康衰老相关的分子标志物及其在改善健康衰老中的应用
CN108535492A (zh) Aim作为生物标志物在诊断、预后或监测脓毒症中的用途
CN114984218B (zh) 肝脏sirt5蛋白在制备预防和治疗急性心肌梗死的产品中的应用
Fang et al. REDD1 gene knockout alleviates vascular smooth muscle cell remodeling in pulmonary hypertension
Fastrès et al. Assessment of lung microbiota in healthy dogs: impact of breed and living conditions.
Zhang et al. Osteopontin protects against hyperoxia-induced lung injury by inhibiting nitric oxide synthases
Spada et al. Evaluation of feline packed red blood cell units obtained by blood sedimentation and stored for 42 days for transfusion purposes
CN108888652A (zh) 一种肾叶山蚂蝗醇提取液及其应用
Carotenuto et al. Fractional excretion of electrolytes in dogs with primary hypoadrenocorticism before and after treatment
CN114917220A (zh) 鸢尾苷元在制备防治心肌重构药物中的应用
Golinelli et al. Comparison of different monitoring methods in dogs with hypercortisolism treated with trilostane
Prasinou et al. The paradigm of erythrocyte membrane lipidome in healthy dogs: first evaluation of the optimal interval values of a fatty acid cluster
Mihajlović et al. Changes in risk factors trends in coronary surgery over the past decade-a single center validation
JP2024545975A (ja) 好酸球を検出するための試薬、好酸球及びその細胞質内容物並びヒドロキシドコサヘキサエン酸の応用
He et al. Inflammation induced PFKFB3-mediated glycolysis promoting myometrium contraction through the PI3K-Akt-mTOR pathway in preterm birth mice
Abe et al. 6015 Profile of pro-inflammatory cytokines in epicardial adipose tissue in patients with atrial fibrillation: association with atrial myocardial fibrosis

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200911

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication