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CN111647082B - 抗人il-4ra的抗体及其用途 - Google Patents

抗人il-4ra的抗体及其用途 Download PDF

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CN111647082B CN201911390315.0A CN201911390315A CN111647082B CN 111647082 B CN111647082 B CN 111647082B CN 201911390315 A CN201911390315 A CN 201911390315A CN 111647082 B CN111647082 B CN 111647082B
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Abstract

本发明涉及一种抗人白介素4‑受体A的抗体、包括其的药物组合物或试剂盒，及其用途。

Description

抗人IL-4RA的抗体及其用途
技术领域
本发明属于过敏性疾病治疗和分子免疫学领域，涉及一种抗人白介素4-受体A的抗体、包含其的药物组合物或试剂盒，及其用途。
背景技术
白介素-4受体(interleukin-4 Recptor，IL-4R)是一种跨膜受体，存在两种不同的形式：一种为I型IL-4R，为高亲和力IL-4R d亚基(即本发明中的IL-4RA)，和中度亲和力γC亚基组成，它结合白介素-4(interleukin-4，IL-4)并介导IL-4诱导的细胞增殖、活化等生物学功能作用；另一种为II型IL-4R，由高亲和力IL-4Rα亚基(IL-4RA)和白介素-13受体α亚基(IL-13Rα)组成，II型IL-4R同时电是白介素-13(interleukin-13，IL-13)的同源功能受体，可以结合IL-13(Wang及Secombes，Cytokine.2015.75卷，1期，8-13页(2015))。IL-4R在T、B、造血干细胞及内皮细胞、上皮细胞、肌肉、纤维母细胞、肝细胞和脑组织中均有表达，IL-4与受体结合后IL-4RA与γC亚基或IL-13Rα亚基共同作用激活胞质内多种非受体型蛋白质酪氨酸激酶，进一步启动下游信号转导途径(Nelms等人，Annu Rev Immunol，17卷，701-738页(1999)；LaPorte等人，Cell，132卷，2期，259-272页(2008))。
IL-4RA可高亲和力的与IL-4及IL-13结合，是以上提及的I型及II型IL4R的主要功能性亚基，抑制IL-4RA可有效阻断IL-4及IL-13所介导的相关生物学功能(Gessner等人，Immunobiology，201卷，285页(2000))。
IL-4是由CD4+T细胞亚群、B细胞、肥大细胞等免疫细胞分泌的多效性细胞因子；IL-13在人体主要由活化的T细胞(小鼠为Th2)产生，IL-13对单核(巨噬细胞)、B淋巴细胞、NK细胞和血管内皮细胞等具有多种生物学作用。体外研究表明，IL-4和IL-13可在多种细胞类型中发挥相应的效应功能，例如T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、气道平滑肌细胞、呼吸道上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞，这些细胞是导致过敏性疾病，如变应性鼻炎、食物过敏等，和哮喘的发生的主要效应细胞(May等人，Cytokine，75卷，1期，89-116页(2015))；此外，气道平滑肌细胞、呼吸道上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞等还参与慢性阻塞性肺疾病的疾病发生、进展和维持(有关综述参见Steinke等人，RespRes，2卷，：66期，66-70页(2001)和Willis-Karp等人，Immunol Rev，202卷，175-190页，(2004))；T、B细胞功能异常是自身免疫性疾病的发生主要机制，而IL-4通过与免疫细胞表面IL-4R结合激活下游信号通路参与自身免疫性疾病的发生(May等人，Cytokine，75卷，1期，89-116页(2015))。
IL-4/IL-13途径在哮喘病理学(Chatila等人，Trendsin Molecular Med，10卷，10期，493-499页，(2004))以及罗列于本文它处的其它病症中起着重要作用。气道高反应性、粘液分泌过多以及气道重塑等为哮喘的关键病理特征，研究证实IL-4和IL-13参与以上病理过程的发生及维持(May等人，Cytokine，75卷，1期，89-116页(2015))，IL-13被认为是触发气道高反应性(AHR)关键细胞因子，IL-4是Th2免疫细胞极化和IgE产生的主要诱发因素(Wynn等人，AnnuRev Immunol，21卷，425-456页，(2003))。
特应性皮炎(atopic dermatitis)，尤其是中重度特应性皮炎，是一种严重的慢性炎症性皮肤病，主要表现为剧烈的瘙痒、明显的湿疹样变和皮肤干燥。特应性皮炎常常自婴幼儿发病，部分患者延续终生，可因慢性复发性湿疹样皮疹、严重瘙痒、睡眠缺失、饮食限制以及心理社会影响而严重影响患者的生活质量。IL-4/IL-13被认为是特异性皮炎持续内在炎症的关键驱动因素(Malajian等人，Cytokine，73卷，2期，311-318页(2015))。临床研究证实抗人IL-4RA单抗Dupilumab可有效治疗中重度特异性皮炎(Beck等人，N.Engl.J.Med.，371卷，2期，130-139页(2014))，目前已被美国食品药品监督管理局FDA批准用于治疗中、重度特应性皮炎。
此外，基础医学研究及临床研究还证实IL-4、IL-13和IL-4R通路参与慢性阻塞性肺疾病、鼻窦炎、肿瘤发生和发展，抑制IL-4RA具有治疗慢性阻塞性肺疾病(金林等人，实用医学杂志，30卷，22期，3543-3544页(2014年))、鼻窦炎、肺纤维化、肿瘤(May等人，Cytokine，75卷，1期，89-116页(2015)；国畅廓等人，生命的化学，37卷，3期，413-418页(2017))的潜力。抗人IL-4RA单克隆抗体Dupilumab在应用于鼻内糖皮质激素治疗无效的有症状的慢性鼻窦炎和鼻息肉患者的成年人中，Dupilumab联合糖皮质激素可显著缓解患者症状，减少鼻息肉(Bachert等人，JAMA，315卷，5期，469-79页(2016))。
抗人IL-4RA抗体药物具有广泛的应用前景，可用于治疗过敏性疾病，如变应性鼻炎、哮喘、过敏、特应性皮炎等疾病的治疗，还可用于鼻窦炎、鼻息肉、慢性阻塞性肺疾病、组织纤维化、肿瘤和自身免疫性疾病等。因此，开发与人IL-4RA具有高亲和力的抗体药物，用于过敏性疾病的治疗，使其具有更好的治疗效果、更低的毒副作用，具有非常重要的意义。然而，目前现有的抗人IL-4RA抗体药物的亲和力较低，尚缺少一种具有高亲和力的抗人IL-4RA抗体。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，利用哺乳动物细胞表达系统表达出重组的人IL-4RA，作为抗原免疫小鼠，经小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。发明人通过进行对大量样本的筛选，得到了如下的杂交瘤细胞株：
本发明人发现：
杂交瘤细胞株13E5能够分泌产生与人IL-4RA特异性结合的特异性抗体(命名为13E5)，并且该抗体能够十分有效地阻断人IL-4RA和IL-4的结合。
进一步地，本发明人创造性地制得了抗人IL-4RA的人源化抗体(分别命名为13E5H1L1、13E5 H2L2、13E5 H3L3、13E5 H4L4、13E5 H4L2)。
杂交瘤细胞株18H7能够分泌产生与人IL-4RA特异性结合的特异性抗体(命名为18H7)，并且该抗体能够十分有效地阻断人IL-4RA和IL-4的结合。
进一步地，本发明人创造性地制得了抗人IL-4RA的人源化抗体(分别命名为18H7H1L1、18H7 H2L2、18H7 H2L3、18H7 H3L2)。
杂交瘤细胞株20G10能够分泌产生与人IL-4RA特异性结合的特异性抗体(命名为20G10)，并且该抗体能够十分有效地阻断人IL-4RA和IL-4的结合。
进一步地，本发明人创造性地制得了抗人IL-4RA的人源化抗体(命名为20G10H3L3)。
前述抗体能有效地结合人IL-4RA，阻断人IL-4RA与其配体IL-4或IL-13的结合，抑制人IL-4RA下游信号通路的激活；具有用于制备防治变应性鼻炎、哮喘、过敏、特应性皮炎、鼻窦炎、鼻息肉、慢性阻塞性肺疾病、组织纤维化、自身免疫性疾病的药物的潜力。
由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及抗体或其抗原结合片段，其中：所述抗体包含：
HCDR1，其包含SEQ ID NO：9所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
HCDR2，其包含SEQ ID NO：10所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，和
HCDR3，其包含SEQ ID NO：11所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，并且所述抗体还包含：
LCDR1，其包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸，或与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
LCDR2，其包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，和
LCDR3，其包含SEQ ID NO：14所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
或者，
所述抗体包含：
HCDR1，其包含SEQ ID NO：15所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
HCDR2，其包含SEQ ID NO：16所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，和
HCDR3，其包含SEQ ID NO：17所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
并且，所述抗体还包含：
LCDR1，其包含SEQ ID NO：18所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
LCDR2，其包含SEQ ID NO：19所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，和
LCDR3，其包含SEQ ID NO：20所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。
或者，
所述抗体包含：
HCDR1，其包含SEQ ID NO：130所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
HCDR2，其包含SEQ ID NO：131所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，和
HCDR3，其包含SEQ ID NO：132所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
并且，所述抗体还包含：
LCDR1，其包含SEQ ID NO：133所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
LCDR2，其包含SEQ ID NO：134所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，和
LCDR3，其包含SEQ ID NO：135所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。
在本发明的实施方案中，所述抗体包括：
(1)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：2所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：4所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；
(2)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：6所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：8所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；
(3)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：22所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：24所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；
(4)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：26所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：28所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；
(5)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：30所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：32所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；
(6)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：34所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：36所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；
(7)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：38所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：40所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；
(8)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：42所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：44所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；
(9)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：46所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：48所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；
(10)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：42所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：48所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；或
(11)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：46所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
与SEQ ID NO：44所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；或
(12)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：34所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：28所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。
(13)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：127所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：127所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：127所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：129所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。
通过本领域技术人员所熟知的技术手段，例如通过VBASE2数据库分析上面的(1)-(13)中的抗体序列的CDR区的氨基酸序列：
本发明的抗体13E5，13E5 H1L1，13E5 H2L2，13E5 H3L3，13E5 H4L4和13E5 H4L2具有相同的HCDR1-3和LCDR1-3：
根据IMGT编号系统，其重链可变区的3个HCDR区的氨基酸序列如下：
Figure BDA0002341318650000141
其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
Figure BDA0002341318650000142
本发明的抗体18H7，18H7H1L1、18H7H2L2、18H7H2L3以及18H7H3L2具有相同的HCDR1-3和LCDR1-3：
根据IMGT编号系统，其重链可变区的3个HCDR区的氨基酸序列如下：
Figure BDA0002341318650000151
其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
Figure BDA0002341318650000152
本发明的抗体20G10H3L3具有的HCDR1-3和LCDR1-3：
根据IMGT编号系统，其重链可变区的3个HCDR区的氨基酸序列如下：
Figure BDA0002341318650000153
其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
Figure BDA0002341318650000154
在本发明的实施方案中，所述抗体还包含重链可变区的框架区FR，优选地，所述框架区FR包含FR-H1，FR-H2，FR-H3和FR-H4，其中FR-H1包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：49所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其列组成；FR-H2包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列或与SEQ ID NO：50所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；FR-H3包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列或与SEQ ID NO：51所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；FR-H4包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：54所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的实施方案中，所述抗体还包含轻链可变区的框架区FR，优选地，所述框架区FR包含FR-L1，FR-L2，FR-L3和FR-L4，其中FR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列或与SEQ ID NO：55所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；FR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列或与SEQ ID NO：54所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；FR-L3包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列或与SEQ ID NO：55所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；FR-L4包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列或与SEQ ID NO：56所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。
在本发明的实施方案中，所述抗体还包含重链可变区的框架区FR，优选地，所述框架区FR包含FR-H1，FR-H2，FR-H3和FR-H4，其中FR-H1包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列或与SEQ ID NO：57所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；FR-H2包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列或与SEQ ID NO：58所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；FR-H3包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列或与SEQ ID NO：59所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；FR-H4包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列或与SEQ ID NO：60所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。
在本发明的实施方案中，所述抗体还包含轻链可变区的框架区FR，优选地，所述框架区FR包含FR-L1，FR-L2，FR-L3和FR-L4，其中FR-L1包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列或与SEQ ID NO：61所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；FR-L2包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列或与SEQ ID NO：62所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；FR-L3包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或与SEQ ID NO：63所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；FR-L4包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列或与SEQ ID NO：64所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。
在本发明的实施方案中，所述抗体还包含重链可变区的框架区FR，优选地，所述框架区FR包含FR-H1，FR-H2，FR-H3和FR-H4，其中FR-H1包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列或与SEQ ID NO：65所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；FR-H2包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列或与SEQ ID NO：66所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；FR-H3包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列或与SEQ ID NO：67所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；FR-H4包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或与SEQ ID NO：68所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。
在本发明的实施方案中，所述抗体还包含轻链可变区的框架区FR，优选地，所述框架区FR包含FR-L1，FR-L2，FR-L3和FR-L4，其中FR-L1包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：69所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L2包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：70所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L3包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：71所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L4包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：72所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的实施方案中，所述抗体还包含重链可变区的框架区FR，优选地，所述框架区FR包含FR-H1，FR-H2，FR-H3和FR-H4，其中FR-H1包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：73所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-H2包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：74所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：74所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-H3包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：75所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-H4包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：76所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：76所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的实施方案中，所述抗体还包含轻链可变区的框架区FR，优选地，所述框架区FR包含FR-L1，FR-L2，FR-L3和FR-L4，其中FR-L1包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：77所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L2包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：78所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L3包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：79所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L4包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：80所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的实施方案中，所述抗体还包含重链可变区的框架区FR，优选地，所述框架区FR包含FR-H1，FR-H2，FR-H3和FR-H4，其中FR-H1包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：81所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-H2包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：82所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-H3包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：83所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-H4包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：84所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的实施方案中，所述抗体还包含轻链可变区的框架区FR，优选地，所述框架区FR包含FR-L1，FR-L2，FR-L3和FR-L4，其中FR-L1包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：85所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：85所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L2包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：86所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：86所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L3包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：87所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：87所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L4包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：88所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：88所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的实施方案中，所述抗体还包含重链可变区的框架区FR，优选地，所述框架区FR包含FR-H1，FR-H2，FR-H3和FR-H4，其中FR-H1包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：89所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：89所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-H2包含SEQ ID NO：90的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：90所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：90所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-H3包含SEQ ID NO：91的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：91所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：91所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-H4包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：92所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的实施方案中，所述抗体还包含轻链可变区的框架区FR，优选地，所述框架区FR包含FR-L1，FR-L2，FR-L3和FR-L4，其中FR-L1包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：93所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：93所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L2包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：94所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：94所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：95所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：95所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L4包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：96所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：96所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的实施方案中，所述抗体还包含重链可变区的框架区FR，优选地，所述框架区FR包含FR-H1，FR-H2，FR-H3和FR-H4，其中FR-H1包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：97所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：97所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-H2包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：98所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：98所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成，FR-H3包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：99所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：99所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-H4包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：100所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：100所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的实施方案中，所述抗体还包含轻链可变区的框架区FR，优选地，所述框架区FR包含FR-L1，FR-L2，FR-L3和FR-L4，其中FR-L1包含SEQ ID NO：101的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：101所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：101所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L2包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：102所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：102所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L3包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：103所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：103所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L4包含SEQID NO：104的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：104所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ IDNO：104所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的实施方案中，所述抗体还包含重链可变区的框架区FR，优选地，所述框架区FR包含FR-H1，FR-H2，FR-H3和FR-H4，其中FR-H1包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：105所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成，FR-H2包含SEQ ID NO：106的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：106所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-H3包含SEQ ID NO：107的氨基酸序列或，或与SEQ ID NO：107所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列由其组成；FR-H4包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：108所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的实施方案中，所述抗体还包含轻链可变区的框架区FR，优选地，所述框架区FR包含FR-L1，FR-L2，FR-L3和FR-L4，其中FR-L1包含SEQ ID NO：109的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：109所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L2包含SEQ ID NO：110的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：110所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L3包含SEQ ID NO：111的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：113所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L4包含SEQ ID NO：112的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：112所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：112所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的实施方案中，所述抗体还包含重链可变区的框架区FR，优选地，所述框架区FR包含FR-H1，FR-H2，FR-H3和FR-H4，其中FR-H1包含SEQ ID NO：113的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：113所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-H2包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：114所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-H3包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：115所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：115所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-H4包含SEQ ID NO：116的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：116所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：116所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的实施方案中，所述抗体还包含轻链可变区的框架区FR，优选地，所述框架区FR包含FR-L1，FR-L2，FR-L3和FR-L4，其中FR-L1包含SEQ ID NO：117的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：117所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：117所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L2包含SEQ ID NO：118的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：118所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：118所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L3包含SEQ ID NO：119的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：119所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：119所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L4包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：120所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：120所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的实施方案中，所述抗体还包含重链可变区的框架区FR，优选地，所述框架区FR包含FR-H1，FR-H2，FR-H3和FR-H4，其中FR-H1包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：136所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-H2包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：137所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：137所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-H3包含SEQ ID NO：138的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：138所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：138所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-H4包含SEQ ID NO：139的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：139所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：139所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的实施方案中，所述抗体还包含轻链可变区的框架区FR，优选地，所述框架区FR包含FR-L1，FR-L2，FR-L3和FR-L4，其中FR-L1包含SEQ ID NO：140的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：140所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：140所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L2包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：141所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：141所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L3包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：142所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：142所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；FR-L4包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：143所示的序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：143所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的一个方面，涉及分离的多肽，其包含SEQ ID NO：9，10和11所示的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还包含SEQID NO：12，13和14所示的序列。
在本发明的一个方面，涉及分离的多肽，其包含SEQ ID NO：15，16和17所示的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还包含SEQ ID NO：18，19和20所示的序列。
在本发明的一个方面，涉及分离的多肽，其包含SEQ ID NO：12，13和14所示的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还包含SEQ ID NO：9，10和11所示的序列。
在本发明的一个方面，涉及分离的多肽，其包含SEQ ID NO：18，19和20所示的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还包含SEQ ID NO：15，16和17所示的序列。
在本发明的一个方面，涉及分离的多肽，其包含SEQ ID NO：130，131和132所示的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还包含SEQ ID NO：133，134和135所示的序列。
在本发明的一个方面，涉及分离的多肽，其包含SEQ ID NO：133，134和135所示的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还包含SEQ ID NO：130，131和132所示的序列。
在本发明的一个方面，涉及分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：2，6，22，26，30，34，或38所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还分别对应包含选自SEQ ID NO：4，8，24，28，32，36，或40所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；或者
涉及分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：42所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ ID NO：44所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；或者
涉及分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：42所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ ID NO：48所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；或者
涉及分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：46所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ ID NO：48所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；或者
涉及分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：34所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ ID NO：28所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。
在本发明的一个方面，涉及分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：4，8，24，28，32，36或40所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述单克隆抗体还对应包含选自SEQ ID NO：2，6，22，26，30，34，或38所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；或
涉及分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：44所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ ID NO：42所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；或
涉及分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：48所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ ID NO：42所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；或
涉及涉及分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：48所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ ID NO：46所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；或
涉及分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：28所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ ID NO：34所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。
涉及分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：127所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ ID NO：129所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。
涉及分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：129所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ ID NO：127所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。
在本发明的实施方案中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb、Fab/c、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、双价抗体、结构域抗体。
在本发明的实施方案中，所述抗体是人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)。
在本发明的实施方案中，所述抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的KD结合人IL-4RA蛋白。优选地，所述KD通过Fortebio分子相互作用仪测得。
在本发明的实施方案中，所述抗体以小于大约100nM，例如小于大约10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM或更小的EC50结合人IL-4RA蛋白。具体地，所述EC50通过间接ELISA方法测得。
在本发明的实施方案中，所述抗体包括恒定区，且所述恒定区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体，优选来自人IgG，更优选IgG4。
在本发明的实施方案中，所述抗体的恒定区是人源化的，例如，重链恒定区均采用Ig gamma-4链C区，更优选GenBank登记号为ACCESSION：P01861.1的Ig gamma-4链C区；轻链恒定区均采用Ig kappa链C区，更优选GenBank登记号为ACCESSION：P01834的Ig kappa链C区。
本发明的另一方面涉及编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含SEQ ID NO：9，10和11所示的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还包含SEQ ID NO：12，13和14所示的序列。
在本发明的一个方面，涉及编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含SEQ IDNO：15，16和17所示的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还包含SEQ ID NO：18，19和20所示的序列。
在本发明的一个方面，涉及编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含SEQ IDNO：12，13和14所示的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还包含SEQ ID NO：9，10和11所示的序列。
在本发明的一个方面，涉及编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含SEQ IDNO：18，19和20所示的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还包含15，16和17所示的序列。
在本发明的一个方面，涉及编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含SEQ IDNO：130，131和132所示的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还包含133，134和135所示的序列。
在本发明的一个方面，涉及编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含SEQ IDNO：133，134和135所示的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还包含130，131和132所示的序列。
在本发明的一个方面，涉及编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含选自SEQID NO：2，6，22，26，30，34或38所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还分别对应包含选自SEQ ID NO：4，8，24，28，32，36或40所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；或
涉及编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含选自SEQ ID NO：42所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ ID NO：44所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；或
涉及编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含选自SEQ ID NO：42所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ ID NO：48所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；或
涉及编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含选自SEQ ID NO：46所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ ID NO：48所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；或
涉及编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含选自SEQ ID NO：34所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ ID NO：28所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。
在本发明的一个方面，涉及编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含选自SEQID NO：4，8，24，28，32，36或40所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还分别对应包含选自SEQ ID NO：2，6，22，26，30，34或38所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；或
涉及编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含选自SEQ ID NO：44所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ ID NO：42所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；或
涉及编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含选自SEQ ID NO：48所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ ID NO：42所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；或者
涉及编码多肽分离的的多核苷酸，所述多肽包含选自SEQ ID NO：48所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ ID NO：46所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；或
涉及编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含选自SEQ ID NO：28所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ ID NO：34所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。
涉及编码多肽分离的的多核苷酸，所述多肽包含选自SEQ ID NO：127所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ IDNO：129所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；或
涉及编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含选自SEQ ID NO：129所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ IDNO：127所示的序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。
具体地，所述多核苷酸分子包含下述序列或由下述序列组成：SEQ ID NO：1，SEQID NO：5，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：37，SEQID NO：41，SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：126所示的核苷酸序列，或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
具体地，所述多核苷酸分子包含下述序列或由下述序列组成：SEQ ID NO：3，SEQID NO：7，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：39，SEQID NO：43，SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：128所示的核苷酸序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
本发明的再一方面涉及一种载体，其包含本发明中如上所述任一个的多核苷酸分子。
本发明的再一方面涉及一种宿主细胞，其包含本发明中如上所述任一个的多核苷酸分子，或者本发明的载体。
本发明的再一方面涉及一种制备本发明中如上所述任一个的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段的步骤。
在本发明的一个方面，还提供了抗体偶联物，其包括所述抗人IL-4RA的抗体或其抗原结合片段，以及与其偶联的偶联部分，所述偶联部分为纯化标签(如His标签)、细胞毒性剂，或可检测的标记。优选地，所述偶联部分为放射性同位素、发光物质、有色物质、酶或聚乙二醇。
在本发明的一个方面，还提供了多特异性抗体，优选双特异性抗体，其包括所述抗人IL-4RA的抗体或其抗原结合片段，以及针对其他抗原和/或其他抗原表位的抗体或抗原结合片段。
在本发明的一个方面，还提供了融合蛋白，其包括如上文任一个所述的抗人IL-4RA的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的一个方面，还提供了试剂盒，其包括本发明中如上所述任一个的抗体或其抗原结合片段，或者包括本发明的抗体偶联物或多特异性抗体。
优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述抗体或其抗原结合片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、发光物质、有色物质、酶或聚乙二醇。
本发明的再一方面，涉及本发明如上所述任一个所述的抗体或其抗原结合片段或者本发明的抗体偶联物或多特异性抗体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测人IL-4RA在样品中的存在或其水平或用于预防和/或治疗和/或辅助治疗和/或诊断过敏性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病、皮肤感染、组织纤维化、鼻窦炎、鼻息肉、慢性阻塞性肺疾病，优选地，所述过敏性疾病选自特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘或过敏，更优选地，所述特应性皮炎包括中、重度特应性皮炎。
本发明的再一方面，涉及一种药物组合物，其包含本发明中如上所述任一个的抗体或其抗原结合片段或者本发明所述的抗体偶联物，多特异性抗体或融合蛋白；可选地，其还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。优选地，所述药物组合物为单独使用或与一种或多种药物联合使用。当所述药物组合物与联合使用的药物不能直接混合使用时，所述药物组合物和联合使用的药物独立存在于试剂盒中。
本发明的再一方面，涉及如上所述任一个的抗体或其抗原结合片段或者本发明的抗体偶联物或多特异性抗体或融合蛋白在制备如下药物中的用途：
阻断人IL-4RA与人IL-4或人IL-13结合的药物，
阻断人IL-4RA活性或下调其水平的药物，或者
阻断人IL-4或人IL-13与IL-4RA结合所介导的细胞学生物学反应的药物；
优选地，所述人IL-4RA的配体为人IL-4或人IL-13，更优选为人IL-4。
在本发明的一个方面，涉及如上所述任一个的抗体或其抗原结合片段或者本发明的抗体偶联物或多特异性抗体或融合蛋白在制备治疗选自如下疾病的药物中的用途：特应性皮炎包括中、重度特应性皮炎；鼻息肉症；哮喘；皮肤感染；和自身免疫性疾病等。
本发明的再一方面涉及一种在体内或体外方法，包括施加含有本发明所述的抗体或其抗原结合片段、本发明的抗体偶联物、多特异性抗体或融合蛋白的细胞的步骤，或给予有需求的受试者以有效量的本发明中如上所述任一个的抗体或其抗原结合片段或者本发明的抗体偶联物或多特异性抗体或融合蛋白的步骤，所述方法选自如下各项：
阻断IL-4RA与配体IL-4或IL-13的结合的方法，
下调IL-4RA活性或水平的方法，或者
阻断人IL-4或人IL-13与IL-4RA结合所介导的细胞学生物学反应的方法；
优选地，所述IL-4RA的配体为IL-4或IL-13，更优选为IL-4。
在本发明的实施方案中，所述体外方法是非治疗目的的或诊断目的的。
本发明的再一方面涉及本发明中如上所述任一个的抗体或其抗原结合片段或者本发明的抗体偶联物或多特异性抗体在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗和/或诊断过敏性疾病、肿瘤、皮肤感染、自身免疫性疾病、组织纤维化、鼻窦炎、鼻息肉、慢性阻塞性肺疾病的药物中的用途；具体地，所述过敏性疾病选自特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘或过敏。
在本发明的实施方案中，所述药物为适合于口服施用于胃肠道(GI)的剂型。优选地，所述剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。
在本发明的实施方案中，所述药物为适于通过皮下注射、皮内注射、静脉内注射、肌内注射或病灶内注射施用的形式。
本发明的再一方面涉及预防和/或治疗和/或辅助治疗和/或诊断过敏性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病、组织纤维化、皮肤感染、鼻窦炎、鼻息肉、慢性阻塞性肺疾病的方法，包括给需要的受试者施用本发明中如上所述任一个的抗体或其抗原结合片段或者本发明的抗体偶联物或多特异性抗体；具体地，所述过敏性疾病选自特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘或过敏。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本发明中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本发明中所使用的，术语“抗原结合区”意指特异性结合指定抗原的蛋白或蛋白的部分。例如，含有与抗原相互作用并对抗体赋予其对于抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的抗体的该部分被称为“抗原结合区”。抗原结合区通常包括一或多个“互补决定区”(complementarity-determining region，“CDR”)。某些抗原结合区还包括一个或多个“框架”区(fragment region，“FR”)。CDR是促成抗原结合特异性和亲和力的氨基酸序列。
如本发明中所使用的，术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白或可与完整抗体竞争对靶抗原的特异性结合的其抗原结合片段，并且包括，例如嵌合抗体、人源化抗体、全人源化抗体和双特异性抗体或其抗原结合片段。这样的“抗体”是抗原结合蛋白的种类。完整抗体通常包含至少两个全长重链和两个全长轻链，但在一些情况下，可包括更少的链，诸如可只包含重链的天然存在于骆驼科动物中的抗体。抗体或其抗原结合片段可只来源于单个来源，或可以是“嵌合的”，即，抗体的不同部分可来源于如下文中进一步描述的两个不同来源。抗体或其抗原结合片段可通过重组DNA技术在杂交瘤中产生，或通过完整抗体的酶促或化学切割来产生。除非另外指出，否则术语“抗体”，除了包含两个全长重链和两个全长轻链的抗体外，还包括其衍生物、变体和片段。
如本发明中所使用的，术语“抗体”或“免疫球蛋白链(重链或轻链)”的“抗原结合片段”(或简称“片段”)，包含缺乏至少一些存在于抗体全长链中的氨基酸但能够特异性结合抗原的抗体的部分(无论如何获得或合成该部分)。此类片段具有生物活性，因为它们特异性结合靶抗原并且可与其它抗体或其抗原结合片段竞争对给定的表位的特异性结合。在一个方面，此类片段将保留至少一个存在于抗体全长轻链或重链中的CDR，并且在一些实施方案中将包含单个重链和/或轻链或其部分。这些生物活性片段可通过重组DNA技术产生，或可以例如通过完整抗体的酶促或化学切割产生。免疫功能性免疫球蛋白片段包括，但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、结构域抗体和单链抗体，并且可来源于任何哺乳动物来源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、骆驼科动物或兔。还设想本文中公开的抗体的功能性部分例如一个或多个CDR可被共价地结合于第二蛋白或小分子以生成导向身体中的特定靶的治疗剂，从而具有双功能治疗性质或具有延长的血清半衰期，例如融合蛋白。
如本发明中所使用的，术语“抗体全长链”、“全长抗体”、“完整抗体(intactantibody)”和“全抗体(whole antibody)”在本文中可互换地用来指这样的抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有如本文定义的Fc区的重链。
术语“轻链”包括全长轻链和其具有充足的可变区序列来赋予结合特异性的片段。全长轻链包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域在多肽的氨基末端。轻链包括κ链和λ链。
术语“重链”包括全长重链和其具有充足的可变区序列来赋予结合特异性的片段。全长重链包括可变区结构域VH和3个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域在多肽的氨基末端，并且CH结构域在羧基末端，CH3最靠近多肽的羧基末端。重链可具有任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。
如本发明中所使用的，术语“Fab片段”由一条轻链和CH1以及一条重链的可变区组成。Fab分子的重链不能与另一条重链分子形成二硫键。
如本发明中所使用的，术语“Fc”区含有两个包含抗体的CH1和CH2结构域的重链片段。两个重链片段通过两个或更多个二硫键以及通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
如本发明中所使用的，术语“Fab’片段”含有一条轻链和一条重链的部分(其含有VH结构域和CH1结构域以及还有CH1与CH2结构域之间的区域的部分)，以便可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。
如本发明中所使用的，术语“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条含有CH1与CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，以便在两条重链之间形成链间二硫键。F(ab’)2片段从而由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。
如本发明中所使用的，术语“Fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但缺乏恒定区。
如本发明中所使用的，术语“Fd”片段意指由VH和CH 1结构域组成的抗体片段(Ward等人，Nature 341：544-546(1989))。
如本发明中所使用的，术语“dAb”片段(Ward等人，Nature 341：544-546(1989))由VH结构域组成。
如本发明中所使用的，术语“Fab’-SH”是本文对Fab’的命名，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基携带游离硫醇基团。
如本发明中所使用的，术语“Fab/c”片段是免疫球蛋白经胃蛋白酶消化形成的抗体裂解中间产物，其兼有Fab和Fc区的优点，即具有扩散能力强，体内代谢清除慢的特点，并能保持高度亲和力(刘建军，《细胞与分子免疫学杂志》，1989(4)：29-29)。
如本发明中所使用的，术语“单链抗体”是其中重链与轻链可变区通过柔性接头连接来形成单条多肽链(其形成抗原结合区)的Fv分子(参见，例如，Bird等人，Science.242：423-426(1988)和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90：5879-5883(1988))。单链抗体在国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利U.S.P 4,946,778和U.S.P 5,260,203(所述国际专利申请公开号和美国专利号的公开内容通过引用并入)中进行了详细描述。
如本发明中所使用的，术语“结构域抗体”是只含有重链的可变区或轻链的可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个VH区通过肽接头共价地连接，以生成多价结构域抗体(特别是双价结构域抗体)。双价结构域抗体的两个VH区可靶向相同或不同的抗原。
如本发明中所使用的，术语“双价抗原结合蛋白”或“双价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同抗原特异性。双价抗体可以是双特异性的。
如本发明中所使用的，术语“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”是靶向不止一种抗原或表位的抗原结合蛋白或抗体。
如本发明中所使用的，术语“双特异性”、“双重特异性”或“双功能性”抗原结合蛋白或抗体是分别具有两个不同的抗原结合位点的杂交抗原结合蛋白或抗体。双特异性抗体是一种多特异性抗原结合蛋白或多特异性抗体，并且可通过多种方法产生，包括，但不限于杂交瘤的融合或Fab’片段的连接。参见，例如，Songsivilai和Lachmann，1990，Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，1992，J.Immunol.148：1547-1553。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将结合两个不同的表位，所述表位存在于相同或不同的蛋白质靶标上。
如本发明中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature，256：495，1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P 4,816,567)。
如本发明中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的框架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al.，Nature，321：522 525(1986)；Reichmann etal.，Nature，332：323 329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593 596(1992)；和Clark，Immunol.Today 21：397 402(2000)。
如本发明中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换地用于指氨基酸残基的聚合物。术语还用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物，以及用于天然存在的氨基酸聚合物。术语还可包括已例如通过添加糖类残基以形成糖蛋白而被修饰的或磷酸化的氨基酸聚合物。多肽和蛋白质可由天然存在的细胞和非重组细胞产生；或其由基因工程或重组细胞产生，并且包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子，或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。
术语“多肽”和“蛋白质”具体地包括抗体，例如抗人IL-4RA抗体(也称为IL-4RA抗体)、IL-4RA结合蛋白、具有抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的抗体或序列。
术语“多肽片段”是指相较于全长蛋白质具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。此类片段还可相较于全长蛋白质含有经修饰的氨基酸。在某些实施方案中，片段的长度为约5至500个氨基酸。例如，片段的长度可为至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸。有用的多肽片段包括抗体的免疫功能片段，包括结合结构域。在人IL-4RA抗体的情况下，有用的片段包括但不限于CDR区、重链或轻链的可变结构域、抗体链的部分或正好其包括2个CDR的可变结构域等。
术语“人IL-4RA”、“hIL-4RA”、“人IL-4受体A”、“人IL-4受体a亚基”可互换使用并指人白介素4受体d亚基。人IL-4RA是指其成熟肽(GenbankID：NP_001244336.1)。IL-4和IL-13是IL-4RA的主要内源激动剂。除非另外指定或根据其中使用术语的上下文清楚地了解，否则“IL-4RA”是指人IL-4RA。
多肽的“衍生物”是以与插入、缺失或取代变体不同的方式，例如通过另一种化学部分的缀合而化学修饰的多肽(例如，抗原结合蛋白或抗体)，例如缀合PEG的多肽。
如本发明中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本发明中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本发明中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本发明中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本发明中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。在分子结合动力学测定的几个参数中，KD值为解离平衡常数，在抗体药物研究中，是表征被测抗体与靶抗原分子亲和作用的强弱的参数，计算方法为KD＝kdis/kon，平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。kon，结合速率常数＝抗原抗体复合物形成的速率，kon愈小提示抗体与抗原结合的速度愈快；kdis，解离速率常数＝抗体从抗原-抗体复合物中解离的速率，kdis愈小即抗体从抗原上脱离的速度愈慢，抗体与抗原结合越稳固。通常，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如，L1蛋白)，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪或Fortebio分子相互作用仪中测定的。
如本发明中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本发明中所使用的，术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”可互换使用，并且当提及术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。
如本文中使用的，术语″百分比序列同一性″与″百分比序列同源性″可互换使用。
如本文中使用的，术语“相似性”或“序列相似性”、“同一性”是指两个或更多个蛋白质或多肽分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列测定的。“百分比同一性”意指被比较的分子中的氨基酸之间的相同残基的百分比，并且可基于待比较的最小的分子的大小来计算。为了进行这些计算，必须通过特定的数学模型或计算机程序(即，“算法”)来解决比对中的缺口(如果有的话)。当用于多肽时，术语″大体上的同一性″，是指两个肽序列，当例如使用程序GAP或BESTFIT，利用程序提供的缺省缺口权重，进行最佳对齐时，共有至少70％、75％或80％的序列同一性，至少90％或95％的序列同一性，和至少97％、98％或99％的序列同一性。在某些情况下，不相同的残基位点相异在于保守氨基酸置换。″保守氨基酸置换″是这样的置换，即其中氨基酸残基被具有拥有相似化学性质(例如，电荷或正在水性)的侧链R基团的另一个氨基酸残基置换。一般地，保守氨基酸置换将基本上不改变蛋白质的功能性质。在其中两个或更多个氨基酸序列彼此相异在于保守置换的情况下，可上调百分比序列同一性以就置换的保守性质进行修正。用于进行该调整的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。参见例如Pearson，Methods Mol.Biol.243：307-31(1994)。具有拥有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括1)脂肪族羟基侧链：甘氨酸、丙氨酸、缅氨酸、亮氨酸和异亮氨酸：2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸：3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺：4)芳香族侧链：苯丙氨酸、醋氨酸和色氨酸：5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸：6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸置换组是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺
可选择地，保守置换是在Gonnet等人，Science 256：1443-45(1992)(通过引用合并入本文)中公开的PAM250对数似然矩阵(PAM250 log-likelihood matrix)中具有正值的任何变化。“中度保守的”置换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
通常使用序列分析软件测量多肽的序列同一性。蛋白质分析软件使用分配给不同置换、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸置换)的相似性的量度来匹配序列。例如，GCG包括程序例如″Gap″和″Bestfit″，所述程序(使用由程序指定的缺省参数)可用于测定密切相关的多肽(例如来自不同生物物种的同源多肽)之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如，GCG Version 6.1(University of Wisconsin，WI)。还可使用缺省或推荐的参数利用FASTA比较多肽序列，参见GCG Version 6.10 FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供质询序列与搜索序列之间最佳重叠的区域的比对和百分比序列同一性(Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)：Pearson，Methods Mo l.Biol.132：185-219(2000))。当将序列与含有大量来自不同生物的序列的数据库相比较时，另一个优选算法是计算机程序BLAST，特别地blastp或tblastn(使用程序提供的缺省参数)。参见，例如，Altschul等人，Mo l.Biol.215：403-410(1990)：Al tschul等人，Nucleic AcidsRes.25：3389-402(1997)
相对于现有技术，本发明具有例如如下优点：
本发明抗人IL-4RA抗体能够以高亲和力与人IL-4RA结合，并通过阻断人IL-4和人IL-13与人IL-4RA结合来抑制人IL-4和人IL-13介导的相关细胞生物学效应，如细胞增殖、IL-4和IL-13诱导的CD23表达水平的上调等。具有活性高、排除种属差异性等优点，可用于制备阻断人IL-4和IL-13与人IL-4RA结合的药物、制备治疗或预防例如过敏性疾病包括治疗变应性鼻炎、哮喘、过敏、特应性皮炎(包括中、重度特应性皮炎)，以及鼻窦炎、鼻息肉、慢性阻塞性肺疾病、组织纤维化、自身免疫性疾病的药物，具有良好的应用前景和市场价值。
附图说明
图1：13E5和Dupilumab与抗原IL4RA-mFc的结合活性。
图2：13E5 H1L1、13E5 H2L2、13E5 H3L3和Dupilumab与抗原IL4RA-mFc的结合活性。
图3：13E5 H4L2、13E5 H4L4、和Dupilumab与抗原IL4RA-mFc的结合活性。
图4：13E5和Dupilumab与人IL4-N-His竞争结合人IL4RA-mFc的活性。
图5：13E5 H1L1、13E5 H2L2、13E5 H3L3和Dupilumab与人IL4-N-His竞争结合人IL4RA-mFc的活性。
图6：13E5 H4L2、13E5 H4L4、和Dupilumab与人IL4-N-His竞争结合人IL4RA-mFc的活性。
图7：18H7和Dupilumab与抗原IL4RA-mFc的结合活性。
图8：18H7 H1L1、18H7 H2L2、18H7 H2L3、18H7 H3L2、18H7 H3L3和Dupilumab与抗原IL4RA-mFc的结合活性。
图9：18H7和Dupilumab与人IL4-N-His竞争结合人IL4RA-mFc的活性检测结果。
图10：18H7 H1L1、18H7 H2L2、18H7 H2L3、18H7 H3L2和Dupilumab与人IL4-N-His竞争结合人IL4RA-mFc的活性检测结果。
图11：20G10H3L3和13E5 H4L4和Dupilumab与人IL4-N-His竞争结合人IL4RA-mFc的活性检测结果。
图12：13E5 H4L4与人IL4RA亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为25nM，6.25nM，3.13nM，1.56nM，0.78nM，0.39nM。
图13：18H7 H1L1与人IL4RA亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为25nM，6.25nM，3.13nM，1.56nM，0.78nM，0.39nM。
图14：Dupilumab与人IL4RA亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为12.5nM，6.25nM，3.13nM，1.56nM，0.78nM，0.39nM。
图15：13E5H1L1与人IL4RA亲和力常数检测结果。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为25nM，12.5nM，6.25nM，3.13nM，1.56nM，0.78nM，0.39nM。
图16：13E5H2L2与人IL4RA亲和力常数检测结果。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为25nM，12.5nM，6.25nM，3.13nM，1.56nM，0.78nM，0.39nM。
图17：13E5H3L3与人IL4RA亲和力常数检测结果。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为25nM，12.5nM，6.25nM，3.13nM，1.56nM，0.39nM。
图18：13E5H4L2与人IL4RA亲和力常数检测结果。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为12.5nM，6.25nM，3.13nM，1.56nM，0.78nM，0.39nM。
图19：18H7H2L2与人IL4RA亲和力常数检测结果。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为6.25nM，3.13nM，1.56nM，0.78nM，0.39nM。
图20：18H7H3L2与人IL4RA亲和力常数检测结果。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为25nM，12.5nM，6.25nM，3.13nM，1.56nM，0.78nM，0.39nM。
图21：Dupilumab与人IL4RA亲和力常数检测结果。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为6.25nM，3.13nM，1.56nM，0.78nM，0.39nM。
图22：13E5H1L1、13E5H2L2和Dupilumab抑制IL-4诱导的TF-1细胞的增殖。
图23.：13E5H1L1、13E5H2L2和Dupilumab抑制IL-13诱导的TF-1细胞的增殖。
图24.：13E5H4L2、13E5H4L4和Dupilumab抑制IL-4诱导的TF-1细胞的增殖。
图25.：13E5H4L2、13E5H4L4和Dupilumab抑制IL-13诱导的TF-1细胞的增殖。
图26.：18H7H1L1、18H7H2L2和Dupilumab抑制IL-4诱导的TF-1细胞的增殖。
图27：18H7H1L1、18H7H2L2和Dupilumab抑制IL-13诱导的TF-1细胞的增殖。
图28.：18H7H1L1、13E5H4L4和Dupilumab抑制IL-4诱导的单核细胞CD23表达水平上调。
图29.：18H7H1L1、13E5H4L4和Dupilumab抑制IL-13诱导的单核细胞CD23表达水平上调。
图30：13E5H4L4抑制B-hIL4Ra小鼠皮肤炎症模型的表皮厚度。
图31：各实验组小鼠的表皮厚度情况的病理切片(HE染色，400倍显微镜视野)。a.正常组(生理盐水)；b.Dupilumab(80mg/kg)；c.Dupilumab(20mg/kg)；d.hIgG4(80mg/kg)；e.13E5H4L4(80mg/kg)；f.13E5H4L4(20mg/kg)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，为可以通过市场购买获得的常规产品。
在本发明的下述实施例中，使用的BALB/C小鼠购自广东省医学实验动物中心。
在本发明的下述实施例中，所用的阳性对照抗体Dupilumab VAB 16F3-1(以下简称Dupilumab)，生产自中山康方生物医药有限公司，其序列参考RegeneronPharmaceuticals，Inc的专利，申请号：PCT/US2007/021210中所述的抗体VAB 16F3-1重链可变区(序列如SEQ ID NO：124所示；恒定区为Ig gamma-1 chain C region，ACCESSION：P01857)以及与抗体VAB 16F3-1轻链可变区(编码序列如SEQ ID NO：125所示；恒定区为Igkappa chain Cregion；ACCESSION：P01834)。
实施例1抗人IL-4RA的抗体20G10、13E5和18H7的制备
1杂交瘤细胞株20G10、13E5和18H7的制备
制备抗IL-4RA抗体所用的抗原IL-4RA-mFc是人IL-4RA成熟肽(GenbankID：NP_001244336.1)与mFc标签(SEQ ID NO：121)的融合蛋白(中山康方生物医药有限公司合成)并用于免疫BALB/C小鼠(购自广东医学实验动物中心)。参考目前已存在的技术方法(例如，Stewart，S.J.，“Monoclonal Antibody Production”，in Basic Methods in antibodyProduction and Characterization，Eds.G.C.Howard and D.R.Bethell，Boca Raton：CRCPress，2000)取经抗原免疫的BALB/C小鼠(购自广东医学实验动物中心)的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞通过细胞融合技术形成杂交瘤细胞。用IL4RA-hFc蛋白(其中IL-4RA同上，hFc为人IgG Fc纯化标签，具体为Ig gamma-1chain C region，Genbank编号：P01857，位置114-330)作为抗原包被酶标板，进行间接ELISA法筛选，得到分泌与IL 4RA-hFc特异性结合的抗体的杂交瘤细胞。对间接ELISA筛选得到的杂交瘤细胞，通过竞争ELISA筛选出能够分泌与配体IL4-N-his(IL4的NCBI Gene ID：AAH70123.1)竞争结合IL 4RA-hFc的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并经过有限稀释法得到两株稳定分泌抗人IL-4RA抗体的杂交瘤细胞株。将以上杂交瘤细胞株分别命名为杂交瘤细胞株LT018、LT008和LT009，其分泌的单克隆抗体分别命名为20G10、13E5和18H7。
杂交瘤细胞株LT018(IL4RA-20G10)，其于2019年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C202010，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。
杂交瘤细胞株LT008(IL4RA-13E5)，其于2018年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2018131，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。
杂交瘤细胞株LT009(IL4RA-18H7)，其于2018年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2018132，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。
2.抗人IL-4RA的抗体20G10、13E5和18H7的制备
用CD培养基(Chemical Defined Medium)对上面制得的LT018、LT008和LT009细胞株分别进行培养(CD培养基，内含1％青链霉素，于5％CO2，37℃细胞培养箱中进行培养)，7天后收集细胞培养上清，通过高速离心、微孔滤膜抽真空过滤以及HiTrap protein A HP柱进行纯化，制得抗体20G10、13E5和18H7。
实施例2：抗人IL-4RA的抗体13E5的序列分析
按照培养细胞细菌总RNA提取试剂盒(Tiangen，货号DP430)的方法，从实施例1中培养的LT008细胞株中提取mRNA。
按照Invitrogen
Figure BDA0002341318650000571
III First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，并进行PCR扩增。
PCR扩增产物直接进行TA克隆，具体操作参考pEASY-T1 Cloning Kit(TransgenCT101)试剂盒说明书进行。
将TA克隆的产物直接进行测序，测序结果如下：
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，片段长348bp。其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示，长度为116个氨基酸，其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO：9所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO：10所示，重链CDR3的序列如SEQ ID NO：11所示。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：3所示，长度为321bp。其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示，长度为107个氨基酸，其中轻链CDR1的序列如SEQ ID NO：12所示，轻链CDR2的序列如SEQ ID NO：13所示，轻链CDR3的序列如SEQ ID NO：14所示。
实施例3：抗人IL-4RA的人源化抗体13E5 H1L1、13E5 H2L2、13E5 H3L3、13E5 H4L2和13E5 H4L4的设计和制备
1.抗IL4RA人源化抗体13E5 H1L1、13E5 H2L2、13E5 H3L3、13E5 H4L2和13E5 H4L4的轻链和重链序列的设计
根据人IL-4RA蛋白的三维晶体结构(Hage T，Reinemer P，Sebald W.Crystals ofa 1：1 complex between human interleukin-4 and the extracellular domain of itsreceptor alpha chain.Eur J Biochem.1998；258(2)：831-6.)以及实施例2获得的抗体13E5的序列，通过计算机模拟抗体模型，根据模型设计突变，得到抗体13E5 H1L1、13E5H2L2、13E5 H3L3、13E5 H4L2和13E5 H4L4的可变区序列(抗体恒定区序列，来自NCBI的数据库，Ig gamma-4 chain C region，ACCESSION：P01861.1；轻链恒定区为Ig kappa chain Cregion，ACCESSION：P01834)。
设计的可变区序列如下：
(1)人源化单克隆抗体13E5 H1L1的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：21所示，长度为348bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示，长度为116aa，其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO：9所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO：10所示，重链CDR3的序列如SEQ ID NO：11所示。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：23所示，长度为321bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示，长度为107aa，其中轻链CDR1的序列如SEQ ID NO：12所示，轻链CDR2的序列如SEQ ID NO：13所示，轻链CDR3的序列如SEQ ID NO：14所示。
(2)人源化单克隆抗体13E5 H2L2的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：25所示，长度为348bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示，长度为116aa，其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO：9所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO：10所示，重链CDR3的序列如SEQ ID NO：11所示。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：27所示，长度为321bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示，长度为107aa，其中轻链CDR1的序列如SEQ ID NO：12所示，轻链CDR2的序列如SEQ ID NO：13所示，轻链CDR3的序列如SEQ ID NO：14所示。
(3)人源化单克隆抗体13E5 H3L3的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：29所示，长度为348bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示，长度为116aa，其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO：9所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO：10所示，重链CDR3的序列如SEQ ID NO：11所示。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：31所示，长度为321bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示，长度为107aa，其中轻链CDR1的序列如SEQ ID NO：12所示，轻链CDR2的序列如SEQ ID NO：13所示，轻链CDR3的序列如SEQ ID NO：14所示。
(4)人源化单克隆抗体13E5 H4L4的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：33所示，其长度为348bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示，长度为116aa，其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO：9所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO：10所示，重链CDR3的序列如SEQ ID NO：11所示。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：35所示，长度为321bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：36所示，长度为107aa，其中轻链CDR1的序列如SEQ ID NO：12所示，轻链CDR2的序列如SEQ ID NO：13所示，轻链CDR3的序列如SEQ ID NO：14所示。
(5)人源化单克隆抗体13E5 H4L2的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO 33；
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 34；
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO 27所示；
其编码的氨基酸序列SEQ ID NO 28所示。
2.人源化抗体13E5 H1L1、13E5 H2L2、13E5 H3L3、13E5 H4L2和13E5 H4L4的制备
重链恒定区均采用Ig gamma-4 chain C region，ACCESSION：P01861.1；轻链恒定区均采用Ig kappa chain C region，ACCESSION：P01834。
将13E5 H1L1重链可变区cDNA和轻链可变区的cDNA、13E5 H2L2的重链可变区cDNA和轻链可变区的cDNA、13E5 H3L3的重链可变区cDNA和轻链可变区的cDNA、13E5 H4L2的重链可变区cDNA和轻链可变区的cDNA和13E5 H4L4的重链可变区cDNA和轻链可变区的cDNA，分别克隆到pUC57 simple(金斯瑞生物科技有限公司提供)载体中，分别获得pUC57simple-13E5H1，pUC57simple-13E5L1，pUC57simple-13E5H2，pUC57simple-13E5L2，pUC57simple-13E5H3，pUC57simple-13E5L3，pUC57simple-13E5H4和pUC57simple-13E5L4。参照《分子克隆实验指南(第二版)》介绍的标准技术，酶切得到可变区片段，亚克隆到含有相应重链恒定区片段和含有相应轻链恒定区片段的pcDNA3.1载体(对于重链恒定区片段，通过限制酶(HindIII&EcoRI)的酶切克隆入载体pcDNA3.1中；对于轻链恒定区片段，通过限制酶(HindIII&EcoRI)的酶切克隆入载体pcDNA3.1中)中获得pcDNA3.1-13E5H1，pcDNA3.1-13E5L1，pcDNA3.1-13E5H2pcDNA3.1-13E5L2，pcDNA3.1-13E5H3，pcDNA3.1-13E5L3，pcDNA3.1-13E5H4和pcDNA3.1-13E5L4。随后将含有相应的轻、重链重组质粒一起(pcDNA3.1-13E5H1和pcDNA3.1-13E5L1，pcDNA3.1-13E5H2和pcDNA3.1-13E5L2，pcDNA3.1-13E5H3和pcDNA3.1-13E5L3，pcDNA3.1-13E5H4和pcDNA3.1-13E5L4，以及pcDNA3.1-13E5H4和pcDNA3.1-13E5L2)分别转染293F细胞后收集培养液进行纯化。测序验证正确后，制备去内毒素级别的表达质粒并将质粒瞬时转染HEK293细胞进行抗体表达，培养7天后收集细胞培养液，采用Protein A柱进行亲和纯化获得人源化抗体13E5 H1L1、13E5 H2L2、13E5H3L3、13E5 H4L2和13E5 H4L4。
实施例4：抗人IL-4RA的抗体18H7的序列分析
按照培养细胞细菌总RNA提取试剂盒(Tiangen，货号DP430)的方法，从实施例1中培养的LT009细胞株中提取mRNA。
按照Invitrogen
Figure BDA0002341318650000601
III First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，并进行PCR扩增。
PCR扩增产物直接进行TA克隆，具体操作参考pEASY-T1 Cloning Kit(TransgenCT101)试剂盒说明书进行。
将TA克隆的产物直接进行测序，测序结果如下：
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：5所示，长度为360bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，长度为120aa，其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO：15所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO：16所示，重链CDR3的序列如SE Q ID NO：17所示。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：7所示，长度为333bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，长度为111aa，其中轻链CDR1的序列如SEQ ID NO：18所示，轻链CDR2的序列如SEQ ID NO：19所示，轻链CDR3的序列如SEQ ID NO：20所示。
实施例5：抗人IL-4RA的人源化抗体18H7 H1L1、18H7 H2L2、18H7 H2L3、18H7 H3L2和18H7 H3L3的设计和制备
1.抗人IL-4RA人源化抗体18H7 H1L1、18H7 H2L2、18H7 H2L3、18H7 H3L3和18H7H3L2的轻链和重链序列的设计
根据人IL-4RA蛋白的三维晶体结构(Nat Hage T，Reinemer P，SebaldW.Crystals of a 1：1 complex between human interleukin-4 and the extracellulardomain of its receptor alpha chain.Eur J Biochem.1998；258(2)：831-6.)以及实施例4获得的抗体18H7的序列，通过计算机模拟抗体模型，根据模型设计突变，得到抗体18H7H1L1、18H7 H2L2、18H7 H2L3、18H7 H3L3和18H7 H3L2的可变区序列(抗体恒定区序列，来自NCBI的数据库，重链恒定区为Ig gamma-4 chain C region，ACCESSION：P01861.1；轻链恒定区为Ig kappa chain C region，ACCESSION：P01834)。
设计的可变区序列如下：
(1)人源化单克隆抗体18H7 H1L1的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：37所示，长度为360bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：38所示，长度为120aa，其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO：15所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO：16所示，重链CDR3的序列如SEQ ID NO：17所示。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：39所示，长度为333bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：40所示，长度为111aa，其中轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示，轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。
(2)人源化单克隆抗体18H7 H2L2的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：41所示，长度为360bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：42所示，长度为120aa，其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO：15所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO：16所示，重链CDR3的序列如SEQ ID NO；17所示。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：43所示，长度为333bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：44所示，长度为111aa，其中轻链CDR1的序列如SEQ ID NO：18所示，轻链CDR2的序列如SEQ ID NO：19所示，轻链CDR3的序列如SEQ ID NO；20所示。
(3)人源化单克隆抗体18H7 H3L3的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：45所示，长度为360bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：46所示，长度为120aa，其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO：15所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO：16所示，重链CDR3的序列如SEQ ID NO：17所示。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：47所示，长度为333bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：48所示，长度为111aa，其中轻链CDR1的序列如18所示，轻链CDR2的序列如SEQID NO：19所示，轻链CDR3的序列如SEQ ID NO：20所示。
(4)人源化单克隆抗体、18H7 H2L3的重链和轻链序列重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：41所示；
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：42所示；
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：47所示；
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：48所示。
(5)人源化单克隆抗体18H7 H3L2的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：45所示；
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：46所示；
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：43所示；
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：44所示。
2.人源化抗体18H7 H1L1、18H7 H2L2、18H7 H2L3、18H7 H3L3和18H7 H3L2的制备
重链恒定区均采用Ig gamma-4 chain C region，ACCESSION：P01861.1；轻链恒定区均采用Ig kappa chain C region，ACCESSION：P01834。
将18H7 H1L1重链可变区cDNA和轻链可变区的cDNA、18H7 H2L2的重链可变区cDNA和轻链可变区的cDNA、18H7 H2L3的重链可变区cDNA和轻链可变区的cDNA、18H7 H3L3的重链可变区cDNA和轻链可变区的cDNA以及18H7 H3L2的重链可变区cDNA和轻链可变区的cDNA，分别克隆到pUC57simple(金斯瑞生物科技有限公司提供)载体中，分别获得pUC57simple-18H7 H1、pUC57simple-18H7L1；pUC57simple-18H7H2、pUC57simple-18H7L2；pUC57simple-18H7H3、pUC57simple-18H7L3。参照《分子克隆实验指南(第二版)》介绍的标准技术，酶切得到可变区片段，亚克隆到含有相应重链恒定区片段和含有相应轻链恒定区片段的pcDNA3，1载体中获得pcDNA3.1-18H7 H1 pcDNA3.1-18H7L1，pcDNA3.1-18H 7H2，pcDNA3.1-18H7 L2，pcDNA3.1-18H7 H3，pcDNA3.1-18H7 L3。随后将相应的轻、重链重组质粒一起(pcDNA3.1-18H7 H1和pcDNA3.1-18H7 L1，pcDNA3.1-18H7 H2和pcDNA3.1-18H7 L2，pcDNA3.1-18H7 H3和pcDNA3.1-18H7 L3，pcDNA3.1-18H7 H2和pcDNA3.1-18H7 L3，以及pcDNA3.1-18H7 H3和pcDNA3.1-18H7 L2)分别转染至293F细胞后收集培养液进行纯化，测序验证正确后，制备去内毒素级别的表达质粒并将质粒瞬时转染HEK293细胞进行抗体表达，培养7天后收集细胞培养液，采用ProteinA柱(GE)进行亲和纯化获得人源化抗体18H7H1L1、18H7 H2L2、18H7 H2L3、18H7 H3L2和18H7 H3L3。
实施例6：抗人IL-4RA的人源化抗体20G10 H3L3的设计和制备
1.抗人IL-4RA人源化抗体20G10 H3L3的轻链和重链序列的设计
根据人IL-4RA蛋白的三维晶体结构(Nat Hage T，Reinemer P，SebaldW.Crystals of a 1：1 complex between human interleukin-4 and the extracellulardomain of its receptor alpha chain.Eur J Biochem.1998；258(2)：831-6.)，通过计算机模拟抗体模型，根据模型设计突变，得到抗体20G10 H3L3的可变区序列(抗体恒定区序列，来自NCBI的数据库，重链恒定区为Ig gamma-4chain C region，ACCESSION：P01861.1；轻链恒定区为Ig kappa chain Cregion，ACCESSION：P01834)。
设计的可变区序列如下：
(1)人源化单克隆抗体20G10 H3L3的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：126所示，长度为360bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：127所示，长度为120aa，其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO：130所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO：131所示，重链CDR3的序列如SEQ ID NO：132所示。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：128所示，长度为321bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：129所示，长度为107aa，其中轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：133所示，轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：134所示，轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：135所示。
2.人源化抗体20G10 H3L3的制备
重链恒定区均采用Ig gamma-4 chain C region，ACCESSION：P01861.1；轻链恒定区均采用Ig kappa chain C region，ACCESSION：P01834。
将20G10 H3L3重链可变区cDNA和轻链可变区的cDNA克隆到pUC57simple(金斯瑞生物科技有限公司提供)载体中获得pUC57simple-20G10 H3、pUC57simple-20G10 L3。参照《分子克隆实验指南(第二版)》介绍的标准技术，酶切得到可变区片段，亚克隆到含有相应重链恒定区片段和含有相应轻链恒定区片段的pcDNA3.1载体中获得pcDNA3.1-20G10 H3pcDNA3.1-20G10 L3。随后将相应的轻、重链重组质粒一起(pcDNA3.1-20G10 H3和pcDNA3.1-20G10 L3)转染至293F细胞后收集培养液进行纯化，测序验证正确后，制备去内毒素级别的表达质粒并将质粒瞬时转染HEK293细胞进行抗体表达，培养7天后收集细胞培养液，采用Protein A柱(GE)进行亲和纯化获得人源化抗体20G10 H3L3。
实施例7.ELISA方法检测抗体与抗原的结合活性
1.鼠源抗体13E5和人源化抗体13E5 H1L1、13E5 H2L2、13E5 H3L3、13E5 H4L2和13E5 H4L4与抗原人IL4RA-hFc或人IL-4RA-mFc的结合活性
1.1采用间接ELISA方法检测抗体13E5、13E5 H1L1、13E5 H2L2、13E5 H3L3、13E5H4L2和13E5 H4L4与抗原人IL4RA-hFc或人IL4RA-mFc的结合活性。
实验步骤：酶标板中包被人IL4RA-hFc或人IL4RA-mFc并进行孵育，封闭后分别加入待测抗体，经孵育洗板后，加入山羊抗鼠IgG(H+L)，HRP(购自Jackson ImmunoResearchInc.，货号：109-035-062)或山羊抗人IgG(H+L)，HRP(购自Jackson ImmunoResearch Inc.，货号：109-035-088)，孵育洗板后用TMB(Neogen，308177)进行显色反应，显色终止后在酶标仪中检测450nm波长吸光度。用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理。
450nm读数结果显示：抗体13E5、13E5 H1L1、13E5 H2L2、13E5 H3L3、13E5 H4L2和13E5 H4L4均能有效地结合抗原人IL4RA-hFc或人IL4RA-mFc，其结合效率呈剂量依赖关系。以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行4-parameter拟合曲线作图分析，结果表明如表1、表2、表3所示，13E5、13E5 H1L1、13E5 H2L2、13E5 H3L3、13E5 H4L2和13E5 H4L4均可与抗原人IL4RA-hFc或人IL4RA-mFc有效结合，结合活性与同靶点阳性对照抗体Dupilumab相当(图1、图2、图3)。
表1：13E5和Dupilumab与抗原人IL4RA-hFc或人IL4RA-mFc的结合活性。
Figure BDA0002341318650000651
Figure BDA0002341318650000661
表2：13E5 H1L1、13E5 H2L2、13E5 H3L3和Dupilumab与抗原IL4RA-mFc的结合活性。
Figure BDA0002341318650000662
表3：13E5 H4L2、13E5 H4L4、和Dupilumab与抗原IL4RA-mFc的结合活性。
Figure BDA0002341318650000663
Figure BDA0002341318650000671
1.2采用竞争ELISA方法检测抗体13E5、13E5 H1L1、13E5 H2L2、13E5 H3L3、13E5H4L2和13E5 H4L4阻断IL4-N-his与抗原IL4RA-hFc结合的活性
采用ELISA的方法测定13E5、13E5 H1L1、13E5 H2L2、13E5 H3L3、13E5 H4L2和13E5H4L4与靶抗原的配体人IL4-N-His竞争结合人IL4RA-hFc的EC50(半数效应浓度)，以考察13E5、13E5 H1L1、13E5 H2L2、13E5 H3L3、13E5 H4L2和13E5 H4L4阻断靶抗原的配体与人IL4RA-hFc结合的活性。
酶标板中包被人IL4RA-hFc并进行封闭后，分别加入待测抗体，然后加入等体积的人IL4-N-His(中山康方生物医药有限公司合成)进行混匀并孵育，洗板后加入小鼠抗-his，HRP(购自康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0285A)并孵育，洗板后用TMB(Neogen，308177)进行显色并终止。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值，用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理。具体检测结果列在表4、表5表6中。
以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行4-parameter拟合曲线作图得到所检测抗体相应的阻断EC50。由图4、图5、图6可见，13E5、13E5 H1L1、13E5 H2L2、13E5 H4L2和13E5 H4L4均能有效地阻断配体人IL4-N-His与抗原人IL4RA-hFc的结合，阻断效率呈现剂量依赖关系，其中13E5 H1L1、13E5 H2L2、13E5 H4L2和13E5 H4L4与人IL4-N-His竞争结合人IL4RA-hFc的活性均优于同靶点阳性对照抗体Dupilumab。
表4：13E5和Dupilumab与人IL4-N-His竞争结合人IL4RA-hFc的活性检测结果
Figure BDA0002341318650000681
表5：13E5 H1L1、13E5 H2L2、13E5 H3L3和Dupilumab与人IL4-N-His竞争结合人IL4RA-hFc的活性检测结果
Figure BDA0002341318650000682
Figure BDA0002341318650000691
表6：13E5 H4L2、13E5 H4L4、和Dupilumab与人IL4-N-His竞争结合人IL4RA-hFc的活性检测结果
Figure BDA0002341318650000692
2.鼠源抗体18H7、人源化抗体18H7 H1L1、18H7 H2L2、18H7 H2L3、18H7 H3L2和18H7 H3L3与抗原IL-4RA-hFc的结合活性
2.1采用间接ELISA方法检测抗体18H7、18H7 H1L1、18H7 H2L2、18H7 H2L3、18H7H3L2和18H7 H3L3与抗原人IL4RA-hFc或人IL4RA-mFc的结合活性。
实验步骤：酶标板中包被人IL4RA-hFc或人IL4RA-mFc并进行孵育，封闭后分别加入待测抗体，经孵育洗板后，加入山羊抗鼠IgG(H+L)，HRP(购自Jackson ImmunoResearchInc.，货号：109-035-062)或山羊抗人IgG(H+L)，HRP(购自Jackson ImmunoResearch Inc.，货号：109-035-088)，孵育洗板后用TMB(Neogen，308177)进行显色反应，显色终止后在酶标仪中检测450nm波长吸光度。用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理。
450nm读数结果显示：抗体18H7、18H7 H1L1、18H7 H2L2、18H7 H2L3、18H7 H3L2和18H7 H3L3均能有效地结合抗原人IL4RA-hFc或人IL4RA-mFc，其结合效率呈剂量依赖关系。以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行4-parameter拟合曲线作图分析，结果表明如表7和表8所示18H7、18H7 H1L1、18H7 H2L2、18H7 H2L3、18H7 H3L2和18H7 H3L3均可与抗原人IL4RA-hFc或人IL4RA-mFc有效结合，其中18H7 H1L1、18H7 H2L2及18H7 H2L3与人IL4RA-hFc或人IL4RA-mFc的结合活性与同靶点阳性对照抗体Dupilumab相当(图7和图8)。
表7：18H7和Dupilumab与抗原人IL4RA-hFc或人IL-4RA-mFc的结合活性。
Figure BDA0002341318650000701
Figure BDA0002341318650000711
2.2采用竞争ELISA方法检测抗体18H7、18H7 H1L1、18H7 H2L2、18H7 H2L3和18H7H3L2阻断IL4-N-his与抗原IL4RA-hFc结合的活性。
采用ELISA的方法测定18H7、18H7 H1L1、18H7 H2L2、18H7 H2L3和18H7 H3L2与靶抗原的配体人IL4-N-His竞争结合人IL4RA-hFc的EC50(半数效应浓度)，以考察18H7、18H7H1L1、18H7 H2L2、18H7 H2L3和18H7 H3L2阻断靶抗原的配体与人IL4RA-hFc结合的活性。
酶标板中包被人IL4RA-hFc并进行封闭后，分别加入待测抗体，然后加入等体积的人IL4-N-His(中山康方生物医药有限公司合成，IL4的N段连接6个His标签)进行混匀并孵育，洗板后加入小鼠抗-his，HR(购自康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0285M)并孵育，洗板后用TMB(Neogen，308177)进行显色并终止。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值，用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理。具体检测结果列在表9和表10中。
以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行4-parameter拟合曲线作图得到所检测抗体相应的阻断EC50。由图9及图10可见，18H7、18H7H1L1、18H7 H2L2和18H7 H3L2能有效地阻断配体人IL4-N-His与抗原人IL4RA-hFc的结合，阻断效率呈现剂量依赖关系，其中18H7 H1L1、18H7 H2L2以及18H7 H3L2与人IL4-N-His竞争结合人IL4RA-hFc的活性均优于同靶点阳性对照抗体Dupilumab。
表9：18H7和Dupilumab与人IL4-N-His竞争结合人IL4RA-hFc的活性检测结果
Figure BDA0002341318650000721
Figure BDA0002341318650000731
表10：18H7 H1L1、18H7 H2L2、18H7 H2L3、18H7 H3L2和Dupilumab与人IL4-N-His竞争结合人IL4RA-hFc的活性检测结果
Figure BDA0002341318650000732
3.人源化抗体20G10H3L3和13E5 H4L4与抗原IL-4RA-hFc的结合活性
3.1采用竞争ELISA方法检测抗体20G10H3L3和13E5 H4L4阻断IL4-N-his与抗原IL4RA-hFc结合的活性。
采用ELISA的方法测定20G10H3L3和13E5 H4L4与靶抗原的配体人IL4-N-His竞争结合人IL4RA-hFc的EC50(半数效应浓度)，以考察20G10H3L3和13E5 H4L4阻断靶抗原的配体与人IL4RA-hFc结合的活性。
酶标板中包被人IL4RA-hFc并进行封闭后，分别加入待测抗体，然后加入等体积的人IL4-N-His(中山康方生物医药有限公司合成)进行混匀并孵育，洗板后加入小鼠抗-his，HRP(购自康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0285A)并孵育，洗板后用TMB(Neogen，308177)进行显色并终止。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值，用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理。具体检测结果列在表11中。
以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行4-parameter拟合曲线作图得到所检测抗体相应的阻断EC50。由图11可见，20G10H3L3和13E5 H4L4能有效地阻断配体人IL4-N-His与抗原人IL4RA-hFc的结合，阻断效率呈现剂量依赖关系，其中20G10H3L3和13E5H4L4与人IL4-N-His竞争结合人IL4RA-hFc的活性均优于同靶点阳性对照抗体Dupilumab。
表11：20G10H3L3、13E5 H4L4和Dupilumab与人IL4-N-His竞争结合人IL4RA-hFc的活性检测结果
Figure BDA0002341318650000741
实施例8.人源化抗体13E5 H1L1、13E5 H2L2、13E5 H3L3、13E5 H4L2、13E5 H4L4、18H7 H1L1、18H7 H2L2、18H7 H3L2与人IL-4RA的亲和力常数测定
使用Fortebio分子相互作用仪测定人源化抗体13E5 H1L1、13E5 H2L2、13E5H3L3、13E5 H4L2、13E5 H4L4、18H7 H1L1、18H7 H2L2、18H7 H3L2以及Dupilumab与人IL-4RA的亲和力常数。
5μg/ml抗原固定在AMC传感器上，时间60s，传感器在PBST中平衡300s，固定在传感器上的抗原与抗体结合，抗体浓度为0.39-25nM(两倍梯度稀释)，时间120s，抗原抗体在PBST中解离，时间600s。传感器使用10mM甘氨酸，pH1.7再生。数据以1∶1模型拟合分析，得到亲和力常数。
人源化抗体13E5 H4L4、18H7 H1L1、以及Dupilumab(作为阳性对照)与人IL4RA的亲和力常数测定结果见表12，检测结果如图12～14所不。
表12：13E5 H4L4、18H7 H1L1和Dupilumab与人IL4RA亲和力常数检测结果
抗体名称 K<sub>D</sub>(M) kon(l/Ms) kon Error kdis(l/s) kdis Error Rmax(nm)
13E5 H4L4 2.63E-11 5.56E+06 1.60E+05 1.46E-04 9.74E-06 0.1370-0.1667
18H7 H1L1 3.09E-11 4.97E+06 1.94E+05 1.54E-04 1.33E-05 0.1026-0.1445
Dupilumab 1.14E-11 7.08E+06 2.15E+05 8.10E-05 1.13E-05 0.1325-0.2184
KD为亲和力常数；KD＝kdis/kon。
结果表明，人源化抗体13E5 H4L4、18H7 H1L1与人IL4RA均有较强的结合能力，与同靶点阳性对照抗体Dupilumab相当。
人源化抗体13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3、13E5H4L2、18H7H2L2、18H7H3L2以及Dupilumab(作为阳性对照)与人IL-4RA的亲和力常数测定结果见表13，检测结果如图15～21所示。
表13：13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3、13E5H4L2、18H7H2L2、18H7H3L2和Dupilumab与人IL4RA亲和力常数检测结果
抗体 K<sub>D</sub>(M) kon(l/Ms) kon Error kdis(l/s) kdis Error Rmax(nm)
13E5 H1L1 1.00E-11 5.78E+06 1.94E+05 5.79E-05 1.12E-05 0.1347-0.2008
13E5 H2L2 2.83E-11 2.44E+06 9.77E+04 6.90E-05 1.44E-05 0.1377-0.1944
13E5 H3L3 1.82E-11 2.79E+06 1.46E+05 5.09E-05 1.90E-05 0.0824-0.1332
13E5 H4L2 1.79E-11 1.78E+07 1.16E+06 3.18E-04 2.15E-05 0.0521-0.1012
18H7 H2L2 2.39E-11 6.47E+06 2.63E+05 1.54E-04 1.60E-05 0.0913-0.117
18H7 H3L2 1.71E-11 1.27E+06 5.38E+04 2.16E-05 1.44E-05 0.1731-0.3601
Dupilumab 1.17E-11 2.35E+06 1.68E+05 2.75E-05 1.73E-05 0.2131-0.3131
KD为亲和力常数；KD＝kdis/kon。
结果表明，人源化抗体13E5 H1L1与抗原亲和力优于同靶点阳性对照抗体Dupilumab；13E5 H1L1、13E5 H2L2、18H7 H2L2、18H7 H3L2与人IL-4RA的解离速率常数kdis小于同靶点阳性对照抗体Dupilumab，提示13E5 H2L2、18H7 H2L2、18H7 H3L2与人IL-4RA的结合更为稳固。13E5 H1L1、13E5 H4L2与抗原人IL-4RA的结合速率常数大于同靶点阳性对照抗体Dupilumab，提示13E5 H1L1、13E5 H4L2与抗原人IL-4RA结合速率较Dupilumab更快。
实施例9.细胞生物学活性分析
通过细胞增殖法检测13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H4L2、13E5 H4L4、18H7H1L1、18H7H2L2阻断人IL-4和人IL-13促TF-1细胞增殖的细胞生物学活性。具体如下：
TF-1细胞(购自美国模式培养物集存库，American type culture collection，货号：CRL-2003)正常培养(完全培养液：RPMI 1640+10％FBS+2.5g/L葡萄糖+2ng/mL GM-CSF)；实验当天，离心收集TF-1细胞，不含GM-CSF的培养液重悬细胞沉淀，计数，每孔2万个细胞接种至96孔板中；按实验设计进行给药处理：抗体终浓度为0.05、0.5、5nM；IL-4设三个浓度：0.041、0.41、4.1nM，抗体组中IL-4采用0.41nM；IL-13设三个浓度：1.58、15.8、79nM，抗体组中IL-13采用15.8nM；给药后将96孔板置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养72h；72h后，参照CCK8试剂盒(购自日本同仁，货号：CK04)说明书，加入CCK8试剂，混匀，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育3-4h后读取OD(450nm)值。同时，绘制细胞数-OD曲线，即接种梯度稀释的TF-1细胞于96孔板，加入CCK8试剂，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育3-4h后读取OD(450nm)值。根据OD值计算实验各组细胞数，GraphPad Prism 5做图。
本研究的同型对照抗体为人抗鸡蛋溶酶体(human anti-Hen Egg Lysozyme IgG，anti-HEL，即human IgG，简称hIgG)，其序列来自于Acierno等人发表的Affinitymaturation increases the stability and plasticity of the Fv domain of anti-protein antibodies中Fab F10.6.6序列的可变区序列(Acierno等人.J Mol Biol.2007；374(1)：130-46.)，设计为本研究的同型对照抗体，在中山康方生物医药有限公司实验室制备而成。
human IgG委托南京金斯瑞生物对抗体的重轻链(全序列或可变区)基因进行氨基酸的密码子优化和基因合成，参照《分子克隆实验指南(第二版)》介绍的标准技术，采用酶切、DNA胶回收、连接转化、菌落PCR或酶切鉴定等标准的分子克隆技术将重轻链基因分别亚克隆到哺乳动物表达系统的抗体重链表达载体和抗体轻链表达载体(都是pcDNA3.1载体)，并进一步对重组表达载体的重轻链基因进行测序分析(重链序列为SEQ ID NO：122，轻链序列为SEQ ID NO：123)。测序验证正确后，大量制备去内毒素级别的表达质粒并将重轻链表达质粒瞬时共转染HEK293细胞进行重组抗体的表达。培养7天后收集细胞培养液，进行rProteinA柱(GE)亲和纯化，收获的抗体样品用SDS-PAGE和SEC-HPLC标准分析技术对其进行质量鉴定。
检测结果如图22～27所示。由图22～27可知，人IL-4和人IL-13均能有效促进TF-1细胞的增殖，且呈剂量依赖关系；相比同型对照抗体(Human IgG)，Dupilumab、13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H4L2、13E5H4L4、18H7H1L1、18H7H2L2均可特异性抑制由IL-4和IL-13诱导的TF-1细胞的增殖，且呈剂量依赖关系。
结果表明，13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H4L2、13E5 H4L4、18H7H1L1、18H7H2L2可特异性抑制人IL-4和人IL-13诱导的TF-1细胞的增殖，其中13E5H1L1、13E5H4L4和18H7H1L1活性与阳性对照药Dupilumab相当。
实施例10. 13E5H4L4、18H7H1L1抑制PBMC细胞CD23表达水平的上调
本实施例的目的旨在通过流式细胞术检测13E5H4L4、18H7H1L1对人IL-4和人IL-13引起的人PBMC细胞表面CD23表达水平上调的中和生物活性。具体如下：
正常人外周血(肝素抗凝)，采用ficoll密度梯度离心法分离得到人新鲜PBMC，3次离心洗涤后，计数并调整细胞密度至2.5×106/mL；接种至低吸附96孔板中，每孔加入200μLPBMC(即50万/孔)；每孔对应加入25μL抗体Dupilumab、13E5H4L4和18H7H1L1(终浓度分别为30，3，0.3nM)，并设计空白对照及同型对照Human IgG(终浓度为30nM)，室温孵育30min。30min后，加入25μL人IL-4(终浓度为100pM)或25μL人IL-13(终浓度为300ng/mL)，培养箱孵育2.5天；2.5天后，收集各组PBMC至1.5mL EP管中，每管加入500μL1％PBSA，1000xg，离心5min，去上清；加入50μLCD23-PE抗体(用1％PBSA稀释50倍)，冰上孵育40min。40min后，加入1mL 1％PBSA，1000xg，离心5min，去上清。加入200μL 1％PBSA重悬细胞，转移到流式管中，上机检测。
检测结果如图28、29所示。
结果表明，人IL-4和人IL-13可上调人PBMC中单核细胞表面CD23的表达水平，13E5H4L4、18H7H1L1可特异性结合人IL-4RA，从而有效阻断IL-4和IL-13对CD23表达水平的上调。
实施例11. 13E5H4L4对HDM诱导B-hIL4Ra小鼠皮肤炎症模型的影响
实验步骤：
采用HDM(尘螨过敏原，Greer Laborct，lot：348717)诱导B-hIL4Ra小鼠(C57BL/6背景)建立小鼠皮肤炎症模型。实验小鼠分6组，每组7只。并设同型对照组(anti-HEL)、高剂量Dupilumab组(80mg/kg)(商用Dupilumab购自Sanofi and RegeneronPharmaceuticals)、低剂量Dupilumab组(20mg/kg)(商用Dupilumab购自Sanofi andRegeneron Pharmaceuticals)、高剂量13E5H4L4组(80mg/kg)和低剂量13E5H4L4组(20mg/kg)。给药方式为皮下注射，且在D-1，D2，D5，D8四天给药。在正常组中，动物模型以每天皮内注射生理盐水建立；在同型对照组中，动物模型以连续7天每天皮内注射HDM(37.5μg×2/25μl/天)加上连续3天每天皮内注射HDM(25μg×2/25μl/天)建立；在加抗体的实验组中，动物模型以连续7天每天皮内注射HDM(37.5μg×2/25μl/天)加上连续3天每天皮内注射HDM(25μg×2/25μl/天)建立。
实验测量各组小鼠的表皮厚度，考察13E5H4L4抑制B-hIL4Ra小鼠皮肤炎症模型的表皮厚度的影响。
表14给药剂量和给药方案
Figure BDA0002341318650000781
Figure BDA0002341318650000791
注：D0为建模第一天。背部右上右下各注射生理盐水或者HDM。实验结果，结果如图30所示，相比同型对照抗体hIgG4，不同剂量13E5H4L4均能有效抑制小鼠表皮的增厚，80mg/kg同等剂量下，13E5H4L4的血药浓度高于Dupilumab，与药效结果相对应。
病理切片结果如图31所示：在HDM 37.5μg+25μg皮内注射建立的B-hIL4Ra小鼠皮肤炎症模型中，模型组小鼠皮肤表皮厚度与正常组相比有明显的增厚，Dupilumab 80mg/kg、13E5H4L4 80mg/kg皮下给药均能明显的抑制小鼠表皮的增厚，并有较好的量效关系，其中13E5H4L4 80mg/kg略优于Dupilumab 80mg/kg。
以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可做出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
13E5重链可变区：
Figure BDA0002341318650000801
13E5轻链可变区
Figure BDA0002341318650000802
18H7重链可变区
Figure BDA0002341318650000811
18H7轻链可变区
Figure BDA0002341318650000812
13E5 CDR
Figure BDA0002341318650000813
18H7 CDR
Figure BDA0002341318650000814
13E5H1重链可变区
Figure BDA0002341318650000815
Figure BDA0002341318650000821
13E5L1轻链可变区
Figure BDA0002341318650000822
13E5H2重链可变区
Figure BDA0002341318650000823
13E5L2轻链可变区
Figure BDA0002341318650000824
13E5H3重链可变区
Figure BDA0002341318650000825
Figure BDA0002341318650000831
13E5L3轻链可变区
Figure BDA0002341318650000832
13E5H4重链可变区
Figure BDA0002341318650000833
13E5L4：轻链可变区
Figure BDA0002341318650000834
18H7H1：重链可变区
Figure BDA0002341318650000841
18H7L1：轻链可变区
Figure BDA0002341318650000842
18H7H2：重链可变区
Figure BDA0002341318650000843
18H7L2：轻链可变区
Figure BDA0002341318650000844
18H7H3：重链可变区
Figure BDA0002341318650000851
18H7L3：轻链可变区
Figure BDA0002341318650000852
13E5重链骨架区
Figure BDA0002341318650000853
13E5轻链骨架区
Figure BDA0002341318650000854
18H7重链骨架区：
Figure BDA0002341318650000855
18H7轻链骨架区：
Figure BDA0002341318650000856
13E5H1骨架区：
Figure BDA0002341318650000861
13E5L1骨架区：
Figure BDA0002341318650000862
13E5H2骨架区：
Figure BDA0002341318650000863
13E5L2骨架区：
Figure BDA0002341318650000864
13E5H3骨架区：
Figure BDA0002341318650000865
13E5L3骨架区：
Figure BDA0002341318650000866
13E5H4：骨架区：
Figure BDA0002341318650000867
13E5L4骨架区：
Figure BDA0002341318650000868
Figure BDA0002341318650000871
18H7H1骨架区：
Figure BDA0002341318650000872
18H7L1骨架区：
Figure BDA0002341318650000873
18H7H2骨架区：
Figure BDA0002341318650000874
18H7L2骨架区：
Figure BDA0002341318650000875
18H7H3骨架区：
Figure BDA0002341318650000876
18H7L3骨架区：
Figure BDA0002341318650000877
mFc标签的序列：
Figure BDA0002341318650000878
Figure BDA0002341318650000881
hIgG的重链序列
Figure BDA0002341318650000882
hIgG的轻链序列
Figure BDA0002341318650000883
VAB 16F3-1 VH-2
Figure BDA0002341318650000884
16F3-1 VL
Figure BDA0002341318650000885
20G10H3重链可变区：
Figure BDA0002341318650000886
20G10L3轻链可变区：
Figure BDA0002341318650000887
Figure BDA0002341318650000891
20G10 CDR
Figure BDA0002341318650000892
20G10H3骨架区：
Figure BDA0002341318650000893
20G10L3骨架区：
Figure BDA0002341318650000894

Claims (64)

1.抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合IL4RA，其中：所述抗体包含：
HCDR1，其由SEQ ID NO: 9所示的序列组成，
HCDR2，其由SEQ ID NO:10所示的序列组成，和
HCDR3，其由SEQ ID NO:11所示的序列组成，
并且所述抗体还包含：
LCDR1，其由SEQ ID NO: 12所示的氨基酸组成，
LCDR2，其由SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列组成，和
LCDR3，其由SEQ ID NO:14所示的序列组成，
其中所述抗原结合片段选自Fab，Fab'，F(ab')2，Fd，Fv，dAb，Fab/c，互补决定区片段，单链抗体，双价抗体或结构域抗体。
2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合人IL4RA。
3.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括：
(1) (i) 重链可变区，其由下述序列组成：
SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:2所示的序列具有至少80%序列同一性的序列，和
(ii) 轻链可变区，其由下述序列组成：
SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:4所示的序列具有至少80%序列同一性的序列，
(2) (i) 重链可变区，其由下述序列组成：
SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:22所示的序列具有至少85%序列同一性的序列，和
(ii) 轻链可变区，其由下述序列组成：
SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:24所示的序列具有至少90％序列同一性的序列，
(3) (i) 重链可变区，其由下述序列组成：
SEQ ID NO: 26所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:26所示的序列具有至少85%序列同一性的序列，和
(ii) 轻链可变区，其由下述序列组成：
SEQ ID NO: 28所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:28所示的序列具有至少85%序列同一性的序列，
(4) (i) 重链可变区，其由下述序列组成：
SEQ ID NO: 30所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:30所示的序列具有至少80%序列同一性的序列，和
(ii) 轻链可变区，其由下述序列组成：
SEQ ID NO: 32所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:32所示的序列具有至少80%序列同一性的序列，
(5) (i) 重链可变区，其由下述序列组成：
SEQ ID NO: 34所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:34所示的序列具有至少85%序列同一性的序列，和
(ii) 轻链可变区，其由下述序列组成：
SEQ ID NO: 36所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:36所示的序列具有至少85%序列同一性的序列，
(6) (i) 重链可变区，其由下述序列组成：
SEQ ID NO: 34所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:34所示的序列具有至少85%序列同一性的序列，和
(ii) 轻链可变区，其由下述序列组成：
SEQ ID NO: 28所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:28所示的序列具有至少85%序列同一性的序列。
4.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变区，其序列与SEQ ID NO:2或30所示的序列具有至少85%的序列同一性。
5.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变区，其序列与SEQ ID NO:2、22、26、30或34所示的序列具有至少90%的序列同一性。
6.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变区，其序列与SEQ ID NO:2、22、26、30或34所示的序列具有至少91%的序列同一性。
7.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变区，其序列与SEQ ID NO:2、22、26、30或34所示的序列具有至少92%的序列同一性。
8.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变区，其序列与SEQ ID NO:2、22、26、30或34所示的序列具有至少93%的序列同一性。
9.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变区，其序列与SEQ ID NO:2、22、26、30或34所示的序列具有至少94%的序列同一性。
10.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变区，其序列与SEQ ID NO:2、22、26、30或34所示的序列具有至少95%的序列同一性。
11.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变区，其序列与SEQ ID NO:2、22、26、30或34所示的序列具有至少96%的序列同一性。
12.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变区，其序列与SEQ ID NO:2、22、26、30或34所示的序列具有至少97%的序列同一性。
13.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变区，其序列与SEQ ID NO:2、22、26、30或34所示的序列具有至少98%的序列同一性。
14.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变区，其序列与SEQ ID NO:2、22、26、30或34所示的序列具有至少99%的序列同一性。
15.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链可变区，其序列与SEQ ID NO:4或32所示的序列具有至少85%的序列同一性。
16.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链可变区，其序列与SEQ ID NO:4、28、32或36所示的序列具有至少90%的序列同一性。
17.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链可变区，其序列与SEQ ID NO:4、24、28、32或36所示的序列具有至少91%的序列同一性。
18.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链可变区，其序列与SEQ ID NO:4、24、28、32或36所示的序列具有至少92%的序列同一性。
19.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链可变区，其序列与SEQ ID NO:4、24、28、32或36所示的序列具有至少93%的序列同一性。
20.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链可变区，其序列与SEQ ID NO:4、24、28、32或36所示的序列具有至少94%的序列同一性。
21.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链可变区，其序列与SEQ ID NO:4、24、28、32或36所示的序列具有至少95%的序列同一性。
22.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链可变区，其序列与SEQ ID NO:4、24、28、32或36所示的序列具有至少96%的序列同一性。
23.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链可变区，其序列与SEQ ID NO:4、24、28、32或36所示的序列具有至少97%的序列同一性。
24.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链可变区，其序列与SEQ ID NO:4、24、28、32或36所示的序列具有至少98%的序列同一性。
25.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链可变区，其序列与SEQ ID NO:4、24、28、32或36所示的序列具有至少99%的序列同一性。
26.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体还包含重链可变区的框架区FR-H1，FR-H2，FR-H3和FR-H4，和轻链可变区的框架区FR-L1，FR-L2，FR-L3和FR-L4，其中
(1) FR-H1由SEQ ID NO:49的氨基酸序列组成；
FR-H2由SEQ ID NO:50的氨基酸序列组成；
FR-H3由SEQ ID NO:51的氨基酸序列组成；
FR-H4由SEQ ID NO:52的氨基酸序列组成；和
FR-L1由SEQ ID NO:53的氨基酸序列组成；
FR-L2由SEQ ID NO:54的氨基酸序列组成；
FR-L3由SEQ ID NO:55的氨基酸序列组成；
FR-L4由SEQ ID NO:56的氨基酸序列组成；
(2) FR-H1由SEQ ID NO:65的氨基酸序列组成；
FR-H2由SEQ ID NO:66的氨基酸序列组成；
FR-H3由SEQ ID NO:67的氨基酸序列组成；
FR-H4由SEQ ID NO:68的氨基酸序列组成；和
FR-L1由SEQ ID NO:69的氨基酸序列组成；
FR-L2由SEQ ID NO:70的氨基酸序列组成；
FR-L3由SEQ ID NO:71的氨基酸序列组成；
FR-L4由SEQ ID NO:72的氨基酸序列组成；
(3) FR-H1由SEQ ID NO:73的氨基酸序列组成；
FR-H2由SEQ ID NO:74的氨基酸序列组成；
FR-H3由SEQ ID NO:75的氨基酸序列组成；
FR-H4由SEQ ID NO:76的氨基酸序列组成，和
FR-L1由SEQ ID NO:77的氨基酸序列组成；
FR-L2由SEQ ID NO:78的氨基酸序列组成；
FR-L3由SEQ ID NO:79的氨基酸序列组成；
FR-L4由SEQ ID NO:80的氨基酸序列组成；
(4) FR-H1由SEQ ID NO:81的氨基酸序列组成；
FR-H2由SEQ ID NO:82的氨基酸序列组成；
FR-H3由SEQ ID NO:83的氨基酸序列组成；
FR-H4由SEQ ID NO:84的氨基酸序列组成，和
FR-L1由SEQ ID NO:85的氨基酸序列组成；
FR-L2由SEQ ID NO:86的氨基酸序列组成；
FR-L3由SEQ ID NO:87的氨基酸序列组成；
FR-L4由SEQ ID NO:88的氨基酸序列组成；
(5) FR-H1由SEQ ID NO:89的氨基酸序列组成；
FR-H2由SEQ ID NO:90的氨基酸序列组成；
FR-H3由SEQ ID NO:91的氨基酸序列组成；
FR-H4由SEQ ID NO:92的氨基酸序列组成，和
FR-L1由SEQ ID NO:93的氨基酸序列组成；
FR-L2由SEQ ID NO:94的氨基酸序列组成；
FR-L3由SEQ ID NO:95的氨基酸序列组成；
FR-L4由SEQ ID NO:96的氨基酸序列组成。
27.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人源化抗体、嵌合抗体或多特异性抗体。
28.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是双特异性抗体。
29.权利要求27所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的恒定区是人源化的。
30.权利要求29所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的恒定区来自人IgG。
31.权利要求30所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的恒定区来自人IgG4。
32.权利要求29所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的重链恒定区采用Iggamma-4 链C区；轻链恒定区采用Ig kappa 链C区。
33.权利要求32所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的重链恒定区采用GenBank登记号为ACCESSION：P01861.1的Ig gamma-4 链C区。
34.权利要求32所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的轻链恒定区采用GenBank登记号为ACCESSION: P01834的Ig kappa 链C区。
35.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是scFv。
36.分离的多肽，其选自以下各项组成的组：
(1) 分离的多肽，其包含SEQ ID NO:9，10和11所示的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还包含SEQ ID NO:12，13和14所示的序列；
(2) 分离的多肽，其包含SEQ ID NO:12，13和14所示的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还包含SEQ ID NO:9，10和11所示的序列；
(3) 分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO:2所示的序列或与所述序列具有至少80%序列同一性且包含SEQ ID NO:9，10和11所示的序列的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还分别对应包含选自SEQ ID NO:4所示的序列或与所述序列具有至少80%序列同一性且包含SEQ ID NO:12，13和14所示的序列的序列；
(4) 分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO:4所示的序列或与所述序列具有至少80%序列同一性且包含SEQ ID NO:12，13和14所示的序列的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还分别对应包含选自SEQ ID NO:2所示的序列或与所述序列具有至少80%序列同一性且包含SEQ ID NO:9，10和11所示的序列的序列；
(5) 分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO:22所示的序列或与所述序列具有至少85%序列同一性且包含SEQ ID NO:9，10和11所示的序列的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还分别对应包含选自SEQ ID NO:24所示的序列或与所述序列具有至少90%序列同一性且包含SEQ ID NO:12，13和14所示的序列的序列；
(6) 分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO:26所示的序列或与所述序列具有至少85%序列同一性且包含SEQ ID NO:9，10和11所示的序列的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还分别对应包含选自SEQ ID NO:28所示的序列或与所述序列具有至少85%序列同一性且包含SEQ ID NO:12，13和14所示的序列的序列；
(7) 分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO:30所示的序列或与所述序列具有至少80%序列同一性且包含SEQ ID NO:9，10和11所示的序列的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还分别对应包含选自SEQ ID NO:32所示的序列或与所述序列具有至少80%序列同一性且包含SEQ ID NO:12，13和14所示的序列的序列；
(8) 分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO:34所示的序列或与所述序列具有至少85%序列同一性且包含SEQ ID NO:12，13和14所示的序列的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还分别对应包含选自SEQ ID NO:36所示的序列或与所述序列具有至少85%序列同一性且包含SEQ ID NO:12，13和14所示的序列的序列；
(9) 分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO:34所示的序列或与所述序列具有至少85%序列同一性且包含SEQ ID NO:9，10和11所示的序列的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ ID NO: 28所示的序列或与所述序列具有至少85%序列同一性且包含SEQ ID NO:12，13和14所示的序列的序列;
(10) 分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO:24所示的序列或与所述序列具有至少90％序列同一性且包含SEQ ID NO:12，13和14所示的序列的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述单克隆抗体还对应包含选自SEQ ID NO:22所示的序列或与所述序列具有至少85%序列同一性且包含SEQ ID NO:9，10和11所示的序列的序列；
(11) 分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO:28所示的序列或与所述序列具有至少85%序列同一性且包含SEQ ID NO:12，13和14所示的序列的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述单克隆抗体还对应包含选自SEQ ID NO:26所示的序列或与所述序列具有至少85％序列同一性且包含SEQ ID NO:9，10和11所示的序列的序列；
(12) 分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO:32所示的序列或与所述序列具有至少80%序列同一性且包含SEQ ID NO:12，13和14所示的序列的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还分别对应包含选自SEQ ID NO:30所示的序列或与所述序列具有至少80%序列同一性且包含SEQ ID NO:9，10和11所示的序列的序列；
(13) 分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO:36所示的序列或与所述序列具有至少85%序列同一性且包含SEQ ID NO:12，13和14所示的序列的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还分别对应包含选自SEQ ID NO:34所示的序列或与所述序列具有至少85%序列同一性且包含SEQ ID NO:9，10和11所示的序列的序列；
(14) 分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO:28所示的序列或与所述序列具有至少85%序列同一性且包含SEQ ID NO:12，13和14所示的序列的序列，其中所述多肽作为抗人IL-4RA的抗体的一部分，特异性结合人IL-4RA，所述抗体还对应包含选自SEQ ID NO: 34所示的序列或与所述序列具有至少85%序列同一性且包含SEQ ID NO:9，10和11所示的序列的序列。
37.权利要求36所述的分离的多肽，其中：所述分离的多肽包含如权利要求4-25任一项中所定义的重链可变区或轻链可变区。
38.分离的多核苷酸，其编码权利要求36-37任一项中所述的分离的多肽。
39.载体，其包含权利要求38所述的分离的多核苷酸。
40.宿主细胞，其包含权利要求38所述的分离的多核苷酸或权利要求39所述的载体。
41.制备权利要求1-35任一项所述抗体或其抗原结合片段的方法，包括培养权利要求40所述的宿主细胞。
42.抗体偶联物，其包含权利要求1-35任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及与其偶联的偶联部分。
43.权利要求42所述的抗体偶联物，其中所述偶联部分选自纯化标签、细胞毒性剂、可检测的标记、放射性同位素、发光物质、有色物质、酶或聚乙二醇。
44.权利要求43所述的抗体偶联物，其中所述纯化标签是His标签。
45.多特异性抗体，其包括权利要求1-35任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及针对其他抗原和/或其他抗原表位的抗体或抗原结合片段。
46.权利要求45所述的多特异性抗体，其为双特异性抗体。
47.融合蛋白，其包含权利要求1-35任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
48.药物组合物，包含权利要求1-35任一项所述的抗体或其抗原结合片段， 权利要求42-44任一项所述的抗体偶联物，权利要求45-46任一项所述的多特异性抗体或权利要求47所述的融合蛋白。
49.权利要求48所述的药物组合物，还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
50.权利要求48所述的药物组合物，所述药物组合物为单独使用或者与一种或多种药物联用。
51.权利要求48-50任一项所述的药物组合物，所述药物组合物为适合于口服施用于胃肠道（GI）的剂型；或所述药物为适合于通过皮下注射、皮内注射、静脉内注射、肌内注射、病灶内注射的剂型。
52.权利要求48-50任一项所述的药物组合物，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂或酏剂。
53.试剂盒，其包括权利要求1-35任一项所述的抗体或其抗原结合片段，权利要求42-44任一项所述的抗体偶联物，权利要求45-46所述的多特异性抗体或权利要求47所述的融合蛋白。
54.权利要求53所述的试剂盒，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别权利要求1-35任一项所述的抗体或其抗原结合片段，权利要求42-44任一项所述的抗体偶联物，权利要求45-46所述的多特异性抗体或权利要求47所述的融合蛋白。
55.权利要求54所述的试剂盒，所述第二抗体还包括可检测的标记。
56.权利要求55所述的试剂盒，其中所述可检测的标记选自放射性同位素、发光物质、有色物质、酶。
57.权利要求1-35任一项所述的抗体或其抗原结合片段，权利要求42-44任一项所述的抗体偶联物，权利要求45-46所述的多特异性抗体或权利要求47所述的融合蛋白在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测人IL-4RA在样品中的存在或其水平或用于预防和/或治疗和/或辅助治疗和/或诊断过敏性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病、皮肤感染、组织纤维化、鼻窦炎、鼻息肉、慢性阻塞性肺疾病。
58.权利要求57所述的应用，其中所述过敏性疾病选自特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘或过敏。
59.权利要求58所述的应用，其中所述特应性皮炎包括中、重度特应性皮炎。
60.权利要求1-35任一项所述的抗体或其抗原结合片段，权利要求42-44任一项所述的抗体偶联物，权利要求45-46所述的多特异性抗体或权利要求47所述的融合蛋白在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗和/或诊断过敏性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病、皮肤感染、组织纤维化、鼻窦炎、鼻息肉、慢性阻塞性肺疾病的药物中的用途。
61.权利要求60所述的用途，其中所述过敏性疾病选自特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘或过敏。
62.权利要求61所述的用途，其中所述特应性皮炎包括中、重度特应性皮炎。
63.杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NO: C2018131。
64.单克隆抗体，其由权利要求63所述的杂交瘤细胞株分泌。
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