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CN111643678A - 基于含巯基的两性离子多肽修饰的阿霉素衍生物、纳米胶束及其制备方法 - Google Patents

基于含巯基的两性离子多肽修饰的阿霉素衍生物、纳米胶束及其制备方法 Download PDF

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CN111643678A
CN111643678A CN202010555917.3A CN202010555917A CN111643678A CN 111643678 A CN111643678 A CN 111643678A CN 202010555917 A CN202010555917 A CN 202010555917A CN 111643678 A CN111643678 A CN 111643678A
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Yanshan University
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Abstract

本发明提供一种基于含巯基的两性离子多肽修饰的阿霉素衍生物、纳米胶束及其制备方法，属于生物医药领域。该阿霉素衍生物具有通式(I)结构，其制备方法包括：在极性溶剂中，将含巯基的两性离子多肽与丙烯酰肼混合反应后，结晶，得到多肽衍生物；再将多肽衍生物与盐酸阿霉素按照摩尔比1:0.2～5溶于极性溶剂中，加入三氟乙酸催化剂，搅拌反应后，得到该阿霉素衍生物。通过该阿霉素衍生物制备的纳米胶束，在体内的血液循环时间长，载药量高，毒副作用小，且具有良好的pH值响应，抑瘤效果佳。

Description

基于含巯基的两性离子多肽修饰的阿霉素衍生物、纳米胶束 及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种基于含巯基的两性离子多肽修饰的阿霉素衍生物、纳米胶束及其制备方法。
背景技术
阿霉素(Doxorubicin，DOX)又称多柔比星、14-羟基柔红霉素、14-羟基正定霉素、14-羟正定霉素、14-羟柔红霉素、多索柔比星、羟基红比霉素、羟基柔红霉素等，它是一种抗肿瘤抗生素，可用于抑制RNA和DNA的合成，尤其对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。主要适用于急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、睾丸癌、胃癌、肝癌等。虽然，阿霉素在抗癌领域具有广泛的应用，但由于阿霉素对机体可产生广泛的生物化学效应，因此使其具有强烈的细胞毒性。阿霉素主要的毒副作用有，约60％～80％的癌症病人注射阿霉素后可发生白细胞和血小板减少，100％的病人有不同程度的毛发脱落，部分病人会出现心律失常、恶心、食欲减退等症状，有些病人甚至出现药物溢出血管外引起组织溃疡及坏死等。
阿霉素由于其优良的抑制癌细胞遗传物质核酸的合成的性质而成为普遍使用的抗癌药物。然而，游离的阿霉素在静脉注射后会被身体很快清除，仅有很少一部分到达肿瘤组织。游离的阿霉素不仅对身体具有很大的毒副作用而且药物的生物利用度也很低。为了克服这一局限性，研究报道已经使用多种方式修饰抗癌药物阿霉素。采用纳米药物载体包裹或者化学键合修饰阿霉素递送阿霉素的方法在一定程度上提高了阿霉素的生物利用度，但是仍存在载药量较低和副作用较大的问题。这主要是由于所制备的纳米药物常用聚乙二醇作为亲水层，聚乙二醇则存在和蛋白质分子存在弱相互作用的缺点，使纳米药物在生物体内的不仅引起一定的免疫反应而且肿瘤靶向性能较低。另外，聚乙二醇修饰的纳米药物的载药量普遍较低。
鉴于此，特提出本申请。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于一端含巯基的两性离子多肽修饰的阿霉素衍生物、纳米胶束及其制备方法，该纳米胶束表面修饰的一层两性离子多肽能够延长阿霉素在体内的血液循环时间，载药量高，毒副作用小，且具有良好的pH值响应，抑瘤效果佳。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种基于含巯基的两性离子多肽修饰的阿霉素衍生物，所述阿霉素衍生物具有通式(I)结构：
Figure BDA0002544234130000021
通式(I)中，
R1和R2选自由侧链含有羧基的氨基酸残基和侧链含有氨基的氨基酸残基组成的群组，且R1和R2中含有的氨基与羧基比例为1:1；
R3选自由氢、取代或未取代的C1～6烷基组成的群组；
R4代表氢或甲基；
m代表0～1；
n代表1～30。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，通式(I)中所述侧链含有羧基的氨基酸残基包括谷氨酸残基、天冬氨酸残基；所述侧链含有氨基的氨基酸残基包括赖氨酸残基、组氨酸残基、精氨酸残基、谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，R3选自由氢、甲基、乙基、丙基和叔丁基组成的群组。
第二方面，本发明提供一种上述阿霉素衍生物的制备方法，其包括：
在极性溶剂中，将含巯基的两性离子多肽与丙烯酰肼混合反应后，结晶，得到多肽衍生物；
再将所述多肽衍生物与盐酸阿霉素按照摩尔比1:0.2～5溶于极性溶剂中，加入三氟乙酸催化剂，搅拌反应后，得到具有通式(I)结构的阿霉素衍生物；
其中，含巯基的两性离子多肽具有通式(II)结构：
Figure BDA0002544234130000031
多肽衍生物具有通式(III)结构：
Figure BDA0002544234130000041
通式(II)和通式(III)中，
R1和R2选自由侧链含有羧基的氨基酸残基和侧链含有氨基的氨基酸残基组成的群组，且R1和R2中含有的氨基与羧基比例为1:1；
R3-选自由氢、取代或未取代的C1～6烷基组成的群组；
R4代表氢或甲基；
m代表0～1；
n代表1～30。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述制备所述多肽衍生物的反应中，所述两性离子多肽与所述丙烯酰肼的摩尔比为1:0.5～4。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，在制备所述多肽衍生物的步骤中，还包括将4-二甲氨基吡啶加入到所述两性离子多肽与所述丙烯酰肼形成的混合溶液中，并用波长为350～380nm的紫外线照射进行反应。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述制备所述多肽衍生物的反应中，反应温度为20～80℃，反应时间为6～24h。
优选地，在本发明较佳的实施例中，上述制备所述多肽衍生物的反应为：按照丙烯酰肼溴化氢盐与含巯基两性离子多肽的摩尔比为1:0.5～4的比例，将丙烯酰肼溴化氢盐和含巯基两性离子多肽溶于甲醇、水、二甲基亚砜等极性溶剂中，并通氮气保护。将反应置于20～80℃水浴搅拌反应6～24h后旋转蒸干，于乙腈和乙醚溶液中结晶，真空干燥后得到丙烯酰肼溴化氢盐修饰两性离子多肽衍生物。
该含酰肼键两性离子多肽两亲性分子的反应方程如下反应通式(I)：
Figure BDA0002544234130000051
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述三氟乙酸催化剂的加入量为1 mL反应溶剂中加入1～100μL。
优选地，在本发明较佳的实施例中，利用上述多肽衍生物与盐酸阿霉素制备所述阿霉素衍生物的反应为：按含酰肼键两性离子多肽衍生物与盐酸阿霉素摩尔比为1:0.2～5的比例，将酰肼键两性离子多肽衍生物与盐酸阿霉素溶于甲醇、水、二甲基亚砜等极性溶剂。按每1mL溶剂中加入1～100μL的三氟乙酸催化剂，20～80℃搅拌反应6～24h，透析袋纯化后，除去溶剂得到两性离子多肽修饰盐酸阿霉素的衍生物。
该两性离子多肽修饰阿霉素的衍生物的反应方程具备如下反应通式：
Figure BDA0002544234130000052
Figure BDA0002544234130000061
其中：n为1～30中的任意整数。R1和R2有两种组合：一种R1为谷氨酸、天冬氨酸等侧链结构含有羧基的氨基酸侧链，R2为赖氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等侧链结构含有氨基的氨基酸侧链；另一种R1为赖氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等侧链结构含有氨基的氨基酸侧链，R2为谷氨酸、天冬氨酸等侧链结构含有羧基的氨基酸侧链，两种组合只需保证R1和R2侧链结构含有氨基与羧基比例为1:1即可，R3为氢原子、甲基、乙基、丙基和叔丁基中的任一种。
第三方面，本发明提供一种基于阿霉素衍生物的纳米胶束，其包括上述阿霉素衍生物和极性溶剂介质。
第四方面，本发明提供一种基于阿霉素衍生物的纳米胶束的制备方法，其包括：将上述阿霉素衍生物溶于极性溶剂介质中，进行自组装后，透析。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，将所述阿霉素衍生物溶于二甲基亚砜中，形成浓度为4-6mg/mL的阿霉素衍生物溶液，再将所述阿霉素衍生物溶液与甲醇按照体积比1:0.3-2充分混合后，透析。
本发明的效果如下：
1、本发明采用的小分子两性离子多肽一端含有巯基，其通过丙烯酰肼为桥梁以化学键的形式连接抗癌药物阿霉素，该化学键对pH敏感，可在肿瘤组织的弱酸环境中断裂，从而使阿霉素被快速的释放，由此制备的纳米胶束具有良好的pH值响应的药物控释能力，而且制备的纳米胶束具有高载药量的优点。
2、本发明采用的小分子两性离子多肽的侧链中含有氨基和羧基，且氨基和羧基的比例为1:1。这种由氨基与羧基比例为1:1组成的两性离子多肽具有优异的抗蛋白质非特异性吸附性能，将其修饰到阿霉素后可以降低阿霉素在正常组织处的毒性，延长阿霉素在体内的血液循环时间，使其具有较好的体内生物相容性。
3、本发明制备的纳米胶束表面修饰有一层两性离子多肽，会形成一层致密的水层，从而使纳米胶束和正常细胞间的亲和力非常低，而纳米胶束借助两性离子多肽的pH敏感性在肿瘤微酸性条件下具有略正的表面电位，从而使纳米胶束对肿瘤细胞的亲和力明显高于对正常细胞的亲和力，从而借助多肽的 pH响应性使纳米胶束在小鼠体内有更好的肿瘤靶向性。
4、本发明制备的纳米胶束的粒径可控制在400nm以下，由此可以利用肿瘤的高通透性和滞留效应来提高阿霉素在肿瘤部位的富集量，从而获得很好的抑瘤效果。
附图说明
图1为本发明实施例1中阿霉素衍生物及纳米胶束的合成步骤；
图2为本发明实施例1获得的2-甲基丙烯酰肼溴化氢盐，(EK)3-C和 (EK)3-C-Methacrylohydrazide的核磁共振氢谱图；
图3为本发明实施例1获得的(EK)3-C-hyd-DOX的核磁共振氢谱图；
图4为本发明实施例1获得的(EK)3-C-hyd-DOX纳米载药胶束的透射电镜图；
图5为本发明实施例1获得的(EK)3-C-hyd-DOX纳米载药胶束的透射电镜粒径分布直方图；
图6为本发明实施例1获得的在pH 5.5～7.4下(EK)3-C-hyd-DOX纳米载药胶束的水动力学粒径分布直方图；
图7为本发明实施例1获得的在pH 5.5～7.4下(EK)3-C-hyd-DOX纳米载药胶束的Zeta电位图；
图8为本发明实验例1中实验小鼠14天的体重变化图；
图9为本发明实验例1中实验小鼠14天的肿瘤体积变化图；
图10为本发明实验例1中实验小鼠在给药14天后，肿瘤以及解剖后肿瘤实物图；
图11为本发明实验例1中(EK)3-C-hyd-DOX纳米载药胶束的小鼠体内血液循环时间曲线图；以及
图12为本发明实验例1中(EK)3-C-hyd-DOX纳米载药胶束在pH 5.5～7.4 下的体外释放曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种两性离子多肽修饰的阿霉素复合物，以及由其自组装形成的纳米胶束，制备步骤如图1所示，具体地包括：
(1)选用含有谷氨酸(E)、赖氨酸(K)组成的两性离子多肽(EK)3-C，按每1mL甲醇中加入3mg(EK)3-C多肽配置3mg/mL(EK)3-C甲醇溶液。按照含巯基两性离子多肽(EK)3-C与2-甲基丙烯酰肼溴化氢盐的摩尔比为1:2的比例，将6mg的2-甲基丙烯酰肼溴化氢盐溶于2mL甲醇溶液中，加入5mL 3 mg/mL(EK)3-C甲醇溶液并通氮气搅拌10min，移除氮气隔绝氧气密封后置于 50℃水浴搅拌反应24h。将反应后的溶液浓缩至原体积的1/10倍，之后加入到15mL的乙腈中重结晶2次，用乙醚洗涤干燥后置于真空干燥机干燥1h，得到2-甲基丙烯酰肼溴化氢盐修饰的(EK)3-C，即(EK)3-C-Methacrylohydrazide。
(EK)3-C-Methacrylohydrazide的核磁谱图如图2所示，图2中 (EK)3-C-Methacrylohydrazide核磁上6.44ppm和6.21ppm所属双键位置处峰的消失以及8.36ppm处峰的出现，表明(EK)3-C-Methacrylohydrazide的合成。
(2)每1mL甲醇中加入0.5mg(EK)3-C-Methacrylohydrazide，将步骤(1) 制得的(EK)3-C-Methacrylohydrazide取7.7mg溶于15.4ml甲醇中，按照 (EK)3-C-Methacrylohydrazide与阿霉素摩尔比例为1:1的比例加入5.2mg的盐酸阿霉素；按照1ml甲醇溶液中加入1μL三氟乙酸的比例加入15μL的三氟乙酸催化剂室温搅拌反应24h。最终的溶液用截留分子量为300的透析袋纯化 24h，旋蒸除去甲醇后得到(EK)3-C-Methacrylohydrazide修饰的DOX，即 (EK)3-C-hyd-DOX。
(EK)3-C-hyd-DOX的核磁谱图如图3所示，其中归属于盐酸阿霉素7.94 ppm、7.67ppm、1.89ppm和1.67ppm处核磁峰以及归属于(EK)3-C多肽1.55 ppm、1.33ppm和1.23ppm处的核磁峰表明(EK)3-C-hyd-DOX的合成。
(3)每1mL二甲基亚砜中加入5mg的(EK)3-C-hyd-DOX，将步骤(2) 制得的(EK)3-C-hyd-DOX溶于二甲基亚砜溶液；取390μL 5mg/mL
(EK)3-C-hyd-DOX的二甲基亚砜溶液，按照二甲基亚砜与甲醇体积比为1:0.5 的比例向溶液中加入195μL的甲醇溶液，溶液充分混合后用截留分子量为300 Da透析袋对pH为7.4的250mL磷酸盐缓冲液透析2次，每次15min后得到(EK)3-C-hyd-DOX自组装的纳米载药胶束，简称为纳米胶束。
对所制备的纳米胶束进行表征，如图4-7所示：
图4为磷钨酸负染的(EK)3-C-hyd-DOX自组装胶束透射电镜图，其表明合成的(EK)3-C-hyd-DOX分子可以自组装形成纳米胶束，由图可以看出该胶束形状为椭球形。
图5是对图4中得到的(EK)3-C-hyd-DOX自组装胶束透射电镜图进行粒径统计。结果表明，该合成的载药胶束粒子直径在241.83±73.79nm，粒径大小分布比较均匀。
图6是(EK)3-C-hyd-DOX自组装胶束置于pH值为7.4、6.5和5.5的磷酸盐缓冲溶液，通过粒径电位仪对其水动力学粒径进行测试。由图可知，pH值为7.4的平均粒径为298nm，pH值为6.5的平均粒径为267nm，pH值为5.5 的平均粒径为252nm。由此表明，制备的(EK)3-C-hyd-DOX胶束在不同pH值下粒径均比较稳定。
图7是(EK)3-C-hyd-DOX自组装胶束置于pH值为7.4、6.5和5.5的磷酸盐缓冲溶液，通过粒径电位仪对其Zeta电位进行测试。纳米胶束在正常组织 pH值为7.4时，平均Zeta电位为-1.74mV，而纳米胶束在肿瘤酸性环境下，在pH值为6.5时的平均Zeta电位为0.87mV，在pH值为5.5时的平均Zeta 电位为1.38mV。这表明纳米胶束能够在肿瘤酸性部位具有更正的Zeta电位。
实施例2
本实施例提供一种两性离子多肽修饰的阿霉素复合物，以及由其自组装形成的纳米胶束，具体地包括：
(1)选用含有谷氨酸(E)、赖氨酸(K)组成的两性离子多肽(EK)1-C，按每1mL甲醇中加入3mg(EK)1-C多肽配置3mg/mL(EK)1-C甲醇溶液。按照含巯基两性离子多肽(EK)1-C与2-甲基丙烯酰肼溴化氢盐的摩尔比为1:1.5 的比例，将9.5mg的2-甲基丙烯酰肼溴化氢盐溶于2mL甲醇溶液中，加入5 mL 3mg/mL(EK)1-C甲醇溶液，加入0.5mg的4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化剂并通氮气搅拌10min，移除氮气隔绝氧气密封后置于25℃室温环境紫外波长365nm下照射搅拌反应6h。将反应后的溶液浓缩至原体积的1/10，之后加入到10mL的乙腈中重结晶2次，用乙醚洗涤干燥后置于真空干燥机干燥1 h，得到2-甲基丙烯酰肼溴化氢盐修饰的(EK)1-C，即 (EK)1-C-Methacrylohydrazide。
(2)每1mL甲醇中加入0.5mg(EK)1-C-Methacrylohydrazide，将步骤(1) 制得的(EK)1-C-Methacrylohydrazide取10mg溶于20ml甲醇中，按照 (EK)1-C-Methacrylohydrazide与阿霉素的摩尔比为1:2的比例加入20.8mg的盐酸阿霉素，按照1ml甲醇溶液加入5μL三氟乙酸的比例加入100μL的三氟乙酸催化剂、10g硫酸钠，25℃室温搅拌反应6h。将反应后的溶液浓缩至原体积的1/10，置于乙腈与乙醚体积比为1:1的混合溶液中结晶2次，乙醚洗涤后，旋蒸除去甲醇后得到(EK)1-C-Methacrylohydrazide修饰的DOX，即(EK)1-C-hyd-DOX。
(3)每1mL二甲基亚砜中加入5mg的(EK)1-C-hyd-DOX，将步骤(2) 制得的(EK)1-C-hyd-DOX溶于二甲基亚砜溶液，取250μL 5mg/mL
(EK)1-C-hyd-DOX的二甲基亚砜溶液，按照二甲基亚砜与甲醇体积比为1:2的比例向溶液中加入500μL的甲醇溶液，溶液充分混合后用截留分子量为300 纤维素的透析袋对pH为7.4的250mL磷酸盐缓冲液中透析2次每次15min 后得到(EK)1-C-hyd-DOX自组装的纳米载药胶束(简称为纳米胶束)。
实施例3
本实施例提供一种两性离子多肽修饰的阿霉素复合物，以及由其自组装形成的纳米胶束，具体地包括：
(1)选用含有谷氨酸(E)、赖氨酸(K)组成的两性离子多肽(EK)14-C，每1mL甲醇中加入3mg(EK)14-C多肽配置3mg/mL(EK)14-C甲醇溶液。按照含巯基两性离子多肽(EK)14-C与2-甲基丙烯酰肼溴化氢盐摩尔比为1:4的比例，将3.3mg的2-甲基丙烯酰肼溴化氢盐溶于2mL甲醇溶液中，加入8.2mL 3mg/mL(EK)14-C甲醇溶液，加入1mg的4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化剂并通氮气搅拌10min，移除氮气隔绝氧气密封后置于室温环境紫外波长365nm 下照射搅拌反应12h。将反应后的溶液浓缩至原体积的1/10，之后加入到10mL 的乙腈中重结晶2次，用乙醚洗涤干燥后置于真空干燥机干燥1h，得到2-甲基丙烯酰肼溴化氢盐修饰的(EK)14-C，即(EK)14-C-Methacrylohydrazide。
(2)每1mL甲醇中加入1mg(EK)14-C-Methacrylohydrazide，将步骤(1) 制得的(EK)14-C-Methacrylohydrazide取10mg溶于10ml甲醇中，按照(EK)14-C-Methacrylohydrazide与阿霉素摩尔比例为1:5的比例加入7.4mg的盐酸阿霉素，按照1ml甲醇溶液加入1μL三氟乙酸的比例加入10μL的三氟乙酸催化剂、10g硫酸钠，室温搅拌反应24h。将反应后的溶液浓缩至原体积的1/10，置于乙腈与乙醚体积比为1:1的混合溶液中结晶2次，乙醚洗涤后，旋转蒸发除去溶剂后得到(EK)14-C-Methacrylohydrazide修饰的DOX，即 (EK)14-C-hyd-DOX。
(3)每1mL二甲基亚砜中加入14mg的(EK)14-C-hyd-DOX，将步骤(2) 制得的(EK)14-C-hyd-DOX溶于二甲基亚砜溶液；按照二甲基亚砜与甲醇体积比为1:2的比例，取250μL5mg/mL(EK)14-C-hyd-DOX的二甲基亚砜溶液，之后向溶液中加入250μL的甲醇溶液，溶液充分混合后用截留分子量为300Da 的透析袋对pH为7.4的250mL磷酸盐缓冲液中透析2次每次15min后得到 (EK)14-C-hyd-DOX自组装的纳米载药胶束，简称为纳米胶束。
实施例4
本实施例提供一种两性离子多肽修饰的阿霉素复合物，以及由其自组装形成的纳米胶束，具体地包括：
(1)选用含有天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)组成的两性离子多肽(DQ)30-C，按每1mL甲醇中加入5mg(DQ)30-C多肽的比例配置5mg/mL(DQ)30-C甲醇溶液。按照含巯基两性离子多肽(DQ)30-C与2-甲基丙烯酰肼溴化氢盐摩尔比为 1:5的比例，将6.7mg的2-甲基丙烯酰肼溴化氢盐溶于2mL甲醇溶液中，加入10.9mL 5mg/mL(DQ)30-C甲醇溶液，加入1mg的4-二甲氨基吡啶(DMAP) 催化剂并通氮气搅拌10min，移除氮气隔绝氧气密封后置于25℃室温环境紫外波长365nm下照射搅拌反应12h。将反应后的溶液浓缩至原体积的1/10，之后加入到10mL的乙腈中重结晶2次，用乙醚洗涤干燥后置于真空干燥机干燥1h，得到2-甲基丙烯酰肼溴化氢盐修饰的(DQ)30-C，即 (DQ)30-C-Methacrylohydrazide。
(2)每1mL甲醇中加入1mg(DQ)30-C-Methacrylohydrazide，将步骤(1) 制得的(DQ)30-C-Methacrylohydrazide取20mg溶于20ml甲醇中，按照(DQ)30-C-Methacrylohydrazide与阿霉素摩尔比例为1:5加入7.6mg的盐酸阿霉素，按照1ml甲醇溶液中加100μL三氟乙酸的比例加入2mL的三氟乙酸催化剂、10g硫酸钠，室温搅拌反应12h。将反应后的溶液浓缩至原体积的 1/10，置于乙腈与乙醚体积比为1:1的混合溶液中结晶2次，乙醚洗涤后，旋转蒸发除去溶剂后得到(DQ)30-C-Methacrylohydrazide修饰的DOX，即(DQ)30-C-hyd-DOX。
(3)每1mL二甲基亚砜中加入5mg的(DQ)30-C-hyd-DOX，将步骤(2) 制得的(DQ)30-C-hyd-DOX溶于二甲基亚砜溶液；按照二甲基亚砜与甲醇体积比为1:0.4的比例，取305μL5mg/mL(DQ)30-C-hyd-DOX的二甲基亚砜溶液，加入122μL的甲醇溶液，溶液充分混合后用截留分子量为300Da的透析袋对 pH为7.4的250mL磷酸盐缓冲液中透析2次每次15min后得到(DQ)30-C-hyd-DOX自组装的纳米载药胶束，简称为纳米胶束。
下面以实施例1制备的纳米胶束(EK)3-C-hyd-DOX纳米胶束为例，进行各项实验，以进一步说明该纳米胶束的性能。
实验例1小鼠体内抑瘤实验
一、实验方法
采用昆明雌鼠(体重18-22g)接种宫颈癌细胞(U14)。将U14细胞接种到健康的昆明雌鼠腹腔内，5-7天后在无菌条件下将腹水取出，并用生理盐水将细胞数稀释到5×106个/mL。皮下注射200μLU14细胞对昆明雌鼠的右后肢进行荷瘤。荷瘤3天后，将种瘤的鼠随机分为3组，每组6只，即(a)生理盐水组；(b)游离盐酸阿霉素组；(c)(EK)3-C-hyd-DOX胶束组。以尾静脉注射的方式每隔2天对小鼠进行给药，给药量为200μL(浓度以DOX计算，5mg/mL)。实验过程中每天记录小鼠的体重和肿瘤尺寸的变化。在第15天将小鼠麻醉并采用断颈法处死，将肿瘤剖出，称重，拍照。
二、实验结果
体内抑瘤实验结果如附图8、9和10所示：
图8是制备的纳米胶束注射小鼠体内14天体重的变化。实验中可以观察到注射游离DOX组小鼠在给药第6天小鼠体重明显下降，然而注射(EK)3-C-hyd-DOX胶束和生理盐水组小鼠体重均未发生明显下降的趋势。从小鼠体重实验可以说明制备的(EK)3-C-hyd-DOX胶束相较游离阿霉素而言具有更低的毒性。
图9是制备的纳米胶束注射小鼠体内14天肿瘤体积的变化。实验中可以观察到注射生理盐水组肿瘤体积从初试时间的113.04mm3持续上升到第14天的2281.88mm3,这表明肿瘤快速增长，注射游离DOX的肿瘤体积从初试时间的115.89mm3快速上升并基本稳定到第14天的556.63mm3，注射 (EK)3-C-hyd-DOX肿瘤体积从初试时间的119.63mm3稳定到第14天的250.41 mm3，这表明(EK)3-C-hyd-DOX具有更好的抑瘤效果。游离DOX组相较生理盐水空白组肿瘤抑制率达到75.6％，(EK)3-C-hyd-DOX胶束组相较生理盐水空白组肿瘤抑制率达到89.1％。从小鼠肿瘤体积抑制情况可以说明制备的 (EK)3-C-hyd-DOX胶束相较游离DOX而言具有较好的肿瘤抑制效果。
图10是制备的纳米胶束注射小鼠体内14天后肿瘤体积的实物图。图中 a1、a2和a3是小鼠注射药物14天后肿瘤部位图片，图b1是小鼠肿瘤解剖的图片。从图10可以证明该载药胶束具有较好的抑制肿瘤效果。
实验例2血浆清除实验
一、实验过程：
血浆清除实验的测定是将制备的pH值为7.4的(EK)3-C-hyd-DOX胶束通过尾静脉注射进入体重为25g左右的昆明小鼠体内，并通过监测小鼠血浆荧光强度计算样品随时间在血浆中的清除情况。
按照5mg(DOX质量)/kg体重的量，经尾静脉分别注射200μL的pH值为7.4的(EK)3-C-hyd-DOX胶束和盐酸阿霉素的磷酸盐缓冲液到小鼠体内。分别在不同时间，眼眶取血50-100μL血样。血样离心后取上清，稀释后测定荧光强度。以注射药物2min为初始含量，分别测量2min、30min、1h、2h、4 h、6h、9h、12h和24h时(EK)3-C-hyd-DOX胶束和游离盐酸阿霉素在血清中的相对百分含量。
二、实验结果：
结果如图11所示，由图可知，修饰两性离子多肽后的载药胶束在小鼠体内相较游离盐酸阿霉素具有更长的血液循环时间。
实验例3体外释放试验
将实施例1中制备的(EK)3-C-hyd-DOX自组装的纳米载药胶束用于体外释放实验。
将制备的(EK)3-C-hyd-DOX胶束装于分子质量为8000～14000Da透析袋中，并置于pH值为5.5、6.5和7.4的磷酸盐缓冲液，测量其在不同pH值下的阿霉素的释放情况。检测激发波长为480nm，发射波长为595nm的荧光值，进而计算出(EK)3-C-hyd-DOX胶束和游离盐酸阿霉素的体外释放量。
结果如图12所示，pH值为7.4时，30小时后药物释放量达到69.1％； pH值为6.5时，30小时后药物释放量达到79.9％；pH值为5.5时，30小时后药物释放量达到87.9％。体外释放实验表明，制备的(EK)3-C-hyd-DOX纳米载药胶束具有很好的pH值响应性，能够在肿瘤的酸性环境内更加有效地释放阿霉素。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种基于含巯基的两性离子多肽修饰的阿霉素衍生物，其特征在于，所述阿霉素衍生物具有通式(I)结构：
Figure FDA0002544234120000011
通式(I)中，
R1和R2选自由侧链含有羧基的氨基酸残基和侧链含有氨基的氨基酸残基组成的群组，且R1和R2中含有的氨基与羧基比例为1:1；
R3选自由氢、取代或未取代的C1～6烷基组成的群组；
R4代表氢或甲基；
m代表0～1；
n代表1～30。
2.根据权利要求1所述的基于含巯基的两性离子多肽修饰的阿霉素衍生物，其特征在于，通式(I)中，所述侧链含有羧基的氨基酸残基包括谷氨酸残基、天冬氨酸残基；所述侧链含有氨基的氨基酸残基包括赖氨酸残基、组氨酸残基、精氨酸残基、谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基。
3.根据权利要求1所述的基于含巯基的两性离子多肽修饰的阿霉素衍生物，其特征在于，R3选自由氢、甲基、乙基、丙基和叔丁基组成的群组。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的阿霉素衍生物的制备方法，其特征在于，其包括：
在极性溶剂中，将含巯基的两性离子多肽与丙烯酰肼混合反应，将反应后的产物结晶，得到多肽衍生物；
再将所述多肽衍生物与盐酸阿霉素按照摩尔比1:0.2～5溶于极性溶剂中，加入三氟乙酸催化剂，搅拌反应后，得到具有通式(I)结构的阿霉素衍生物；
其中，含巯基的两性离子多肽具有通式(II)结构：
Figure FDA0002544234120000021
所述多肽衍生物具有通式(III)结构：
Figure FDA0002544234120000022
通式(II)和通式(III)中，
R1和R2选自由侧链含有羧基的氨基酸残基和侧链含有氨基的氨基酸残基组成的群组，且R1和R2中含有的氨基与羧基比例为1:1；
R3选自由氢、取代或未取代的C1～6烷基组成的群组；
R4代表氢或甲基；
m代表0～1；
n代表1～30。
5.根据权利要求4所述的阿霉素衍生物的制备方法，其特征在于，在制备所述多肽衍生物的反应中，所述两性离子多肽与所述丙烯酰肼的摩尔比为1:0.5～4。
6.根据权利要求4所述的阿霉素衍生物的制备方法，其特征在于，在制备所述多肽衍生物的步骤中，还包括将4-二甲氨基吡啶加入到所述两性离子多肽与所述丙烯酰肼形成的混合溶液中，并用波长为350～380nm的紫外线照射进行反应。
7.根据权利要求4所述的阿霉素衍生物的制备方法，其特征在于，所述三氟乙酸催化剂的加入量为1mL反应溶剂中加入1～100μL。
8.一种基于阿霉素衍生物的纳米胶束，其特征在于，其包括如权利要求1-3任一项所述的阿霉素衍生物和极性溶剂介质。
9.一种基于阿霉素衍生物的纳米胶束的制备方法，其特征在于，其包括：将如权利要求1-3任一项所述的阿霉素衍生物溶于极性溶剂介质中，进行自组装后，透析。
10.根据权利要求9所述的纳米胶束的制备方法，其特征在于，将所述阿霉素衍生物溶于二甲基亚砜中，形成浓度为4-6mg/mL的阿霉素衍生物溶液，再将所述阿霉素衍生物溶液与甲醇按照体积比1:0.3-2充分混合后，透析。
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