CN111643513A - 阿瑞匹坦和阿糖胞苷的组合及其抗血癌作用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及阿瑞匹坦和阿糖胞苷的组合及其抗血癌作用。具体地，本发明涉及治疗受试者中血癌、缓解受试者中血癌症状或抑制血癌细胞增殖的方法，其包括阿瑞匹坦联合阿糖胞苷至受试者。进一步地，本发明涉及治疗血癌的药物，其包括阿瑞匹坦和阿糖胞苷，以及任选的药学上可接受的载体。

Description

阿瑞匹坦和阿糖胞苷的组合及其抗血癌作用

技术领域

本发明涉及阿瑞匹坦联合阿糖胞苷的抗癌作用。具体地涉及：以联合用药的方式治疗受试者中癌症、缓解受试者中癌症症状或抑制癌细胞增殖的方法；阿瑞匹坦在制备用于降低阿糖胞苷的毒副作用的药物或药剂中的用途；以及治疗癌症的药学产品。

背景技术

癌症作为全世界发病率和死亡率最高的疾病之一，在全球范围内迅速增长，是全球主要的公共卫生问题^[1]。流行病学统计显示，白血病在全球癌症发病率和死亡率中分别占2.4％和3.2％，且呈逐年上升的趋势^[2]。急性髓系细胞白血病(Acute myeloidleukemia，AML)是骨髓的一种恶性疾病，其特征是髓系祖细胞的克隆扩增和分化停滞，且AML是成人中最常见的急性白血病形式，五年生存率只有24％^[3]。

AML的现有标准治疗策略仍然是以化疗为主，包括缓解-诱导、巩固和持续，诱导治疗的目标是达到完全缓解，恢复正常造血^[4]。诱导治疗的通常使用大剂量胞嘧啶阿拉伯糖苷和蒽环类药物^[4]，但化疗毒副作用大，复发率高，预后差，且随着年龄的增长，生存率急剧下降，65岁及以上患者的五年生存率仅为7％^[5]。同种异体造血干细胞移植(HematopoieticStem Cell Transplantation,HSCT)长期以来一直被认为是治疗的标准，也是获得持久反应的最佳机会，但价格昂贵，难以寻找到匹配一致的供者仍然是面临的主要问题。目前AML临床治疗中存在化疗药物种类少、靶向性差、毒副作用高等短板问题，因此，寻找高效低毒的新药物和新靶点，是当前AML临床治疗中迫切需要解决的问题。

NK-1R是G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptor，GPCR)家族的成员^[6]，也是一种速激肽(Tachykinin)受体，参与调节多种生理和病理生理途径。NK-1R存在于神经系统和外周组织，在淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞和小胶质细胞中均有表达^[7]。NK-1R也在骨髓细胞中同样也表达，并被认为是一种造血调节因子^[8]。SP是一种十一肽，是速激肽超家族的成员，与NK-1R亲和力最高^[9]。SP通过NK-1R信号参与许多生理和病理生理功能的调节，如疼痛，心血管系统，情感和成瘾性疾病以及癌症进展^[10-13]。目前发现NK-1R在胶质母细胞瘤^[14]、乳腺癌^[15]、骨肉瘤^[16]和结肠癌^[17]中过表达，阿瑞匹坦作为第一个被FDA批准的NK-1R拮抗剂，临床上用于治疗急性和延迟化疗引起的恶心呕吐(chemotherapyinduced nausea vomiting，CINV)^[18]，目前研究发现有明显的抗肿瘤效果。有研究发现阿瑞匹坦作为一种高选择性的NK1R拮抗剂，可下调cyclinD1、c-Myc和LEF-1相关蛋白的表达，导致结肠癌细胞细胞周期阻滞在G₂期并诱导细胞凋亡^[17]。NK-1R拮抗剂在体外和体内均能有效抑制胶质母细胞瘤的增殖，这种作用是通过β-arrestin复合物的解离从而使MAPK途径失活^[14]。因此NK-1R作为一个新的阻断肿瘤生长的分子靶点，进一步开发有效的NK-1R拮抗剂对癌症的治疗具有重要意义。

阿糖胞苷是一种嘧啶核苷类似物，能够代替脱氧胞苷进入DNA，主要作用在细胞进行DNA合成的S期。通过可以阻止细胞从G1期进入S期，抑制细胞的DNA的合成，从而抑制了细胞的增殖^[19]。对于AML患者来说，最常用的诱导化疗方案包括3天的柔红霉素和7天的阿糖胞苷，这种方案可以在年轻患者中完全缓解(CR)率达到60-80％，在老年患者中CR率达到45-60％^[20,21]。尽管大剂量的阿糖胞苷有明显的治疗效果更好，但毒副作用十分严重，包括对神经系统和器官都有严重影响^[22]。

发明内容

为了向白血病患者提供治疗新途径或提供更广泛的选择，本发明的发明人发现，阿瑞匹坦联合阿糖胞苷具有显著的抗肿瘤作用，且阿糖胞苷与阿瑞匹坦的联合能显著降低大剂量阿糖胞苷应用产生的毒副作用，进而为临床治疗急性髓系白血病患者提供更多的联合化疗方案。

因此，本发明一方面提供了一种治疗受试者中癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的阿瑞匹坦和阿糖胞苷。

本发明的另一方面提供了阿瑞匹坦和阿糖胞苷在制备用于治疗癌症的药物或药剂中的用途。

本发明还提供了一种药物或药物组合物，其包含阿瑞匹坦和阿糖胞苷。

第三方面，本发明提供了一种降低阿糖胞苷的毒副作用的方法，其包括将阿瑞匹坦和阿糖胞苷联合使用。

本发明还提供了阿瑞匹坦在制备用于降低阿糖胞苷的毒副作用的药物或药剂中的用途。

附图说明

图1为阿糖胞苷或阿瑞匹坦单独处理HL60细胞24小时后对细胞增殖活力影响，与0μΜ组相比，阿糖胞苷或阿瑞匹坦本身对HL60细胞增殖活力具有显著性差异(**P<0.01,***P<0.001)。

图2为阿瑞匹坦联合阿糖胞苷处理HL60细胞24小时后对细胞增殖活力影响，与单独加药组相比，联合加药组对HL60细胞活力的抑制具有显著性差异(***P<0.001)。

图3为阿瑞匹坦联合阿糖胞苷处理HL60细胞代表性图片，图中标尺代表50μm。

图4为阿瑞匹坦联合阿糖胞苷对HL60细胞周期的影响，其中：(A)不同加药组处理24小时后，流式细胞仪检测HL60细胞细胞周期分布情况；(B)不同加药组处理下，细胞周期分布的比例统计学分析。与对照组比较，加药组的GO/G1期比例显著性增加；与单独加药组比较，联合加药组的GO/G1期比例显著性增加(*P<0.05,***P<0.001)。

图5为阿瑞匹坦联合阿糖胞苷对HL60细胞凋亡坏死的影响，其中：(A)不同加药组处理24小时后，流式细胞仪检测HL60细胞Annexin V-FITC，PI荧光分布情况；(B)不同加药组处理下，坏死细胞的比例统计。与单独加药组比较，联合加药组的坏死比例的显著性增加(ns P＞0.05，**P<0.01,***P<0.001)。

图6为阿瑞匹坦联合阿糖胞苷对HL60细胞PI吸收的影响，其中：(A)在显微镜下拍摄不同加药组的PI染色情况。图中标尺代表50μm。(B)不同加药组处理24小时和48小时后，不同加药组PI染色的比例统计。与单独加药组相比，联合加药组的细胞PI染色比例显著性增加(**P<0.01,***P<0.001)。

图7为阿瑞匹坦联合阿糖胞苷对HL60细胞LDH释放的影响，不同加药组处理24小时后，联合加药组的细胞LDH相对释放量显著性增加(**P<0.05，***P<0.001)。

图8为Nec-1和Z-VAD-FMK预处理后，阿瑞匹坦联合阿糖胞苷处理HL60细胞24小时后对细胞增殖活力影响。与无Nec-1和Z-VAD-FMK预处理的对照组相比，Nec-1和Z-VAD-FMK能逆转联合加药后对HL60细胞增殖抑制的效果(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

图9为阿瑞匹坦联合阿糖胞苷处理荷瘤裸鼠的肿瘤生长的影响，其中：(A)不同药物处理下，裸鼠肿瘤体积随时间的变化，与单独阿糖胞苷组相比，联合用药组的肿瘤体积显著减少(ns P＞0.05，*P<0.05,**P<0.01)；(B)在第10天从所有小鼠取出的移植瘤肿瘤的照片；(C)统计在第10天从所有小鼠切除的每个肿瘤重量，与对照组相比，各组的肿瘤重量显著减少，与单独阿糖胞苷组相比，联合用药组的肿瘤重量显著减少(ns P＞0.05，*P<0.05,**P<0.01)。

图10为阿瑞匹坦联合阿糖胞苷处理荷瘤裸鼠体重的影响，其中：(A)阿瑞匹坦联合阿糖胞苷处理荷瘤裸鼠的图片。(B)不同药物处理下，裸鼠体重随时间的变化，用药处理后小鼠体重并无显著变化。

图11为阿瑞匹坦联合阿糖胞苷处理荷瘤裸鼠对裸鼠脏器指数的影响。

图12为阿瑞匹坦联合阿糖胞苷处理荷瘤裸鼠对裸鼠白细胞，红细胞，血红蛋白和血小板的影响。

具体实施方式

本发明的发明人经过长期不懈地研究发现，阿瑞匹坦和阿糖胞苷联合使用具有优异的抗肿瘤作用。

因此，本发明一方面提供了一种治疗受试者中癌症或缓解受试者中癌症症状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的阿瑞匹坦和阿糖胞苷联合。本发明也提供了一种抑制癌细胞(血癌细胞)增殖的方法，其包括将所述癌细胞与阿瑞匹坦和阿糖胞苷联合接触的步骤。本发明的再一方面提供了一种药物组合物，其包括阿瑞匹坦和阿糖胞苷；以及包括该涉及该药物组合物的产品的说明书。

对于本发明所述的受试者，其优选为哺乳动物，更优选为人。本发明以血癌细胞进行了举例说明，无特殊说明的情况或明显的上下文的相反启示下，本文中术语“癌症”或“癌”均为血癌及其相关癌细胞。

对于本发明的药物组合物，其可为任何能够治疗受试者中癌症或缓解受试者中癌症症状的阿瑞匹坦和化疗药物阿糖胞苷。如上述“背景技术”中所述，阿瑞匹坦是一种高选择性的NK1R拮抗剂，临床上用于治疗CINV，现发现阿瑞匹坦具有广谱的抗肿瘤效果，通过靶向阻断NK1R抑制癌细胞的生长。阿糖胞苷作为急性髓系白血病最常见的化疗药物。在本发明教导的基础上，阿瑞匹坦联合阿糖胞苷也是能够实现本发明的目的。

本发明的作为活性成分的阿瑞匹坦和阿糖胞苷可以连同药学上可接受的载体一起使用。除活性成分外，本发明的方法、用途和产品还可以包含合适的农学上可接受的载体，包括促进活性化合物加工成制剂的赋形剂和助剂。

例如适于注射或输注的制剂包括水性和非水性无菌注射液和水性和非水性无菌混悬剂，所述无菌注射液可任选地包含抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂和能使制剂与目的接收者的血液等压的溶质，所述无菌混悬剂可包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿，并且可以保存在冻结干燥的(冻干)条件，在立即使用前仅需要加入无菌液体载体，例如注射用水。

本发明的活性成分任选地可与固体赋形剂相组合，且任选地磨碎所得到的混合物，并且需要时，在加入合适的助剂后，加工颗粒的混合物，以获得所需剂型。合适的赋形剂特别是填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素或淀粉制剂、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要时，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。

示例性地，本发明的活性成分可以以阿瑞匹坦1-15mg/kg，阿糖胞苷1-10mg/kg的剂量使用，例如阿瑞匹坦2-12mg/kg，阿糖胞苷2-8mg/kg。优选地，阿瑞匹坦10mg/kg，阿糖胞苷5mg/kg。

根据本发明，本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物可以以任意有效剂量数施用给药受试者。优选地，本发明的药物组合物可以以多次剂量给药，例如从约2至约15次剂量，更优选从约4-10次剂量，最优选约6次剂量。在特别优选的实施方案，在给药过程中，以每三周给药约一次的频率将本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物给药至受试者，例如注射、输注或口服。在特别优选的实施方案，给药为通过注射。

应当理解本发明的药物组合物可以用于通过任意适宜的途径给药的任意适宜的方式配制。

本发明的药物组合物的剂量单位是基于常规进行给药受试者。例如，剂量单位可以给药多于每日一次、每周一次、每月一次等。剂量单位可以是以两次/周为基础给药，即每周两次，例如每三天一次。

如本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。术语“包含”在本文中的任何表述，特别是在描述本发明的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示例性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。

本发明的药学产品中所包含的涉及该药学产品的说明书可以含有如下内容：适应症(例如血癌)、施用剂量(例如上述所示例性说明的)以及可能产生的副作用等等。

本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。

为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。

实施例

1.材料和方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 材料

人急性髓系白血病细胞HL60由浙江大学医学院附属第一医院捐赠。阿瑞匹坦和阿糖胞苷购于北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2 主要试剂

1.1.3 试剂配制

(1)磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline,PBS)：用电子天平准确称量0.2g氯化钾、8g氯化钠、0.24g磷酸二氢钾和3.63g十二水合磷酸氢二钠，加入用二次水洗净的转子，磁力搅拌器溶解于二次水中，调节pH至7.4，定容至1000mL，分装于后，高温高压灭菌，条件为121℃，20分钟，后4℃保存。

(2)阿瑞匹坦：用DMSO配成30mM的母液，-20℃保存。

(3)阿糖胞苷：用PBS配成40mM的储藏液，-80℃冰箱保存，储藏液在稀释成1mM的工作液，-20℃冰箱储藏，使用前拿出常温解冻。

(4)MTT:用电子天平准确称量250mg MTT(Thiazolyl Blue TetrazoliumBromide)粉末，先溶解于内用无菌PBS中于烧杯中，加入转子并用锡箔纸包裹避光，在磁力搅拌器上避光溶解4-6小时，后定容至50mL。在超净台内，用已灭菌的0.22μM的水系针头滤器过滤，分装于1.5mL离心管中，用锡箔纸包裹，-20℃保存。

(5)PI：粉末用无菌PBS溶解至10mg/mL的储藏液，-20℃保存。将储藏液用无菌PBS稀释至1mg/mL，可-20℃保存。

(6)Z-VAD-FMK：粉末用无菌DMSO溶解至50mM的储藏液，-20℃保存。

(7)Necrostatin-1(Nec-1)：粉末用无菌DMSO溶解至10mM的储藏液，-20℃保存。

(8)环磷酰胺：称取适量的环磷酰胺于1.5mL离心管中，加入一定量的无菌PBS溶液，用枪吹匀振荡，配成10mg/mL浓度的环磷酰胺工作液。

1.1.4 主要仪器

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

每天用倒置显微镜观察细胞状态及密度，当细胞密度达到70-90％时，按照稀释比例为1:3至1:6进行传代；吸出细胞培养液，放入15mL离心管中，1000rpm离心5min；除去上清液，向离心管中加入无菌PBS重悬细胞，1000rpm离心5min，洗涤两次；除去PBS，加入适量的新鲜细胞培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的细胞培养皿中，以正常培养条件培养。

1.2.2 MTT实验

(1)收集对数生长期的细胞，使用Count star细胞计数仪进行细胞计数，调整细胞密度以1×10⁴个/100μL接种于96孔板中；

(2)铺板完成后，加入100μL阿瑞匹坦，使阿糖胞苷终浓度为0.4μΜ和0.8μΜ，阿瑞匹坦终浓度为10μΜ，同时设置药物溶剂处理的对照组；

(3)不同的抑制剂提前1h加，其中Nec-1终浓度为50μM，Z-VAD-FMK终浓度10μΜ；

(4)达到指定时间后，每孔加入10μL MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育4h；

(5)1000rpm离心5min后吸去上清，每孔加入150μL DMSO，适当混匀，在细胞培养箱内再继续孵育30min；

(6)用酶标仪测定A490和A570波长的吸光值，导出Excel数值；

(7)对于导出的吸光值，根据公式计算：细胞增殖活力(％)＝(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD-空白组OD)×100％。

1.2.3 细胞周期检测

(1)收集对数生长期的细胞，Count star细胞计数仪进行细胞计数，调整细胞密度以1×10⁶个/孔接种于6孔板中；

(2)铺板完成后，加入两种药物使阿糖胞苷终浓度为0.8μΜ，阿瑞匹坦终浓度为10μΜ，同时设置药物溶剂处理的对照组；

(3)达到指定时间后，收集细胞于15mL离心管，1000rpm离心5mi n，将细胞沉淀用干净的PBS溶液洗涤2次，75％酒精固定过夜；

(4)固定过夜的样品2000rpm离心10mi n，PBS溶液洗涤2次，每管样品加入500μL9:1比例配置的PI/RNase A染色工作液，吹打混匀后，在室温避光环境中孵育30min，流式细胞仪设置完成参数后，上机检测。

1.2.4 凋亡和坏死检测

(1)收集对数生长期的细胞，Count star细胞计数仪进行细胞计数，调整细胞密度以1×10⁶个/孔接种于6孔板中；

(2)铺板完成后，加入两种药物使阿糖胞苷终浓度为0.8μΜ，阿瑞匹坦终浓度为10μΜ，同时设置药物溶剂处理的对照组；

(3)达到指定时间后，收集细胞于15mL离心管，1000rpm离心5mi n，将细胞沉淀用干净的PBS溶液洗涤2次，1000rpm离心5分钟。吸去上清PBS，加入凋亡检测试剂盒中的500μLBinding buffer重悬细胞，细胞悬液通过200目筛网，去除黏连的细胞；

(4)每管样品加入5μL Annexin Ⅴ-FITC和5μL PI溶液，吹打混匀后，在室温避光环境中孵育20min，流式细胞仪设置完成参数后，上机检测。

1.2.5 PI吸收实验

(1)收集对数生长期的细胞，Count star细胞计数仪进行细胞计数，调整细胞密度以1×10⁴个/100μL接种于96孔板中；加药浓度为阿瑞匹坦终浓度为10μΜ，Ara-c终浓度为0.8μΜ。

(2)达到指定时间后，每孔加入10μL PI工作液，在细胞培养箱内继续孵育30min；

(3)使用倒置荧光显微镜，找到合适的视野，视野内细胞100-200个为宜；

(4)调整焦距至细胞形态清晰，先拍摄白光照片，同一位置切换为绿色荧光拍摄照片，拍摄完成后导出照片；

(5)运用Photoshop内将同一视野下的白光和红光两张照片合并为一张照片，使得可以观察到清晰的PI吸收的细胞；运用Photoshop的计数工具，统计出每张照片内的总细胞数和吸收PI的细胞数。根据公式计算：PI吸收比例(％)＝(吸收PI的细胞数)/(总细胞数)×100％。

1.2.6 LDH释放检测实验

(1)收集对数生长期的细胞，Count star细胞计数仪进行细胞计数，调整细胞密度以2×10⁴个/100μL接种于96孔板中；

(2)然后将96孔板放入细胞培养箱常规培养过夜后，吸去培养液，换新鲜含有1％FBS的培养液。并设置如下分组：包括无细胞的培养液孔(背景空白对照孔)，未经药物处理的对照细胞孔(样品对照孔)，未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔(样品最大酶活性对照孔)，以及药物处理的细胞孔(药物处理样品孔)；

(3)对于药物处理样品孔，加药浓度为阿瑞匹坦终浓度为1μΜ，阿糖胞苷终浓度为0.8μΜ。，同时设置药物溶剂处理的对照组；对于样品最大酶活性对照孔，在到预定的检测时间点前1h，加入20μL LDH释放试剂，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育；

(4)达到指定时间后，将96孔板400g离心5min。分别取各孔的上清液120μL，加入到一新的96孔板中；

(5)每孔加入60μL LDH检测工作液，吹打混匀，室温避光置于水平摇床孵育30min

(6)用酶标仪测定A490和A600波长的吸光值，导出Excel数值；

(7)对于导出的吸光值，根据公式计算：LDH释放(％)＝(处理样品吸光度－空白对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度－空白对照孔吸光度)×100％。

1.2.7 阿瑞匹坦联合阿糖胞苷对HL60细胞裸鼠成瘤实验

(1)裸鼠成瘤

将四周龄16只裸鼠随机分4笼，适应性培养两天，两天后每天给每只裸鼠腹腔注射200μL的10mg/mL的环磷酰胺，连续注射2天。收集处于对数生长期的HL60细胞，用无菌PBS洗三遍，1000rpm离心5分钟，最后一遍离心之前取20μL细胞悬液计数，每只小鼠注射1×10⁷个细胞，分别给每只BALB/c裸鼠背部皮下注射200 2L的细胞悬液。

每天观察裸鼠的背部成瘤情况，每三天给裸鼠换垫料和水。当裸鼠的瘤体长到100-150mm³的时候，对裸鼠进行随机分组。

(2)裸鼠给药处理

裸鼠分为四组，分别是对照组、阿瑞匹坦组、阿糖胞苷组、联合组后对裸鼠进行编号。

每两天给药一次，阿瑞匹坦给药为10mg/kg，阿糖胞苷给药为5mg/kg，对照组给腹腔注射PBS，阿糖胞苷组和阿瑞匹坦组分别原位注射100 2L阿糖胞苷稀释液和100 2L阿瑞匹坦稀释液，联合组腹原位注射100 2L阿糖胞苷稀释液和和100μL阿瑞匹坦稀释液。每两天记录裸鼠瘤体体积、同时称量裸鼠体重。

当裸鼠肿瘤体积超过2000mm³即停止实验，全部的裸鼠进行安乐死。剥离裸鼠的瘤体并取出裸鼠的脏器。对剥除的瘤体和脏器称重进行统计。同时收集裸鼠的全血，进行血常规分析。

1.2.8 统计学分析

每个实验至少进行三次重复，统计数值以平均值±平均标准误差(Mean±SEM)展示。根据数据类型使用SPSS进行统计学显著性分析。用t检验比较数据的差异是否显著，记录下检测结果中的显著性差异P值，将P值以*形式标记到统计图中。ns代表P＞0.05，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001。

2 实验结果

2.1 阿瑞匹坦增强HL60细胞对阿糖胞苷的细胞毒性的敏感性

MTT实验结果显示，以对照组的细胞存活率为100％，0.4μM，0.8μM，1.2μM，1.6μM和2.0μM阿糖胞苷处理HL60细胞24小时后，细胞的增殖活力分别为89.17±3.92％,75.84±2.93％,74.16±1.86％,69.16±2.38％和62.18±2.63％。5μM，10μM，15μM，20μM和30μM阿瑞匹坦处理HL60细胞24h后，细胞的增殖活力分别为85.98±2.53％,71.07±2.36％,52.37±0.95％,50.47±0.89％and 23.07±1.58％(图1)。而使用10μM的阿瑞匹坦与0.4μM或0.8μM的阿糖胞苷处理HL60细胞24小时后，细胞的增殖活力分别为41.83±3.96％3和34.90±1.87％，对于HL60细胞对与阿糖胞苷的敏感性，阿瑞匹坦联合0.4μM阿糖胞苷是单独使用0.4μM阿糖胞苷的5.37倍，阿瑞匹坦联合0.8μM阿糖胞苷是单独使用0.8μM阿糖胞苷的2.69倍(图2)。HL60细胞经过10μM的阿瑞匹坦和0.4μM或0.8μM阿糖胞苷单独处理，或者二者联合处理24小时后，从倒置显微镜中直接观察细胞状态。对照组细胞形态正常，透光性好，细胞数量多，而加药组细胞皱缩、破碎，细胞碎片增多，细胞数量少(图3)。

图1、图2和图3直观展示了阿瑞匹坦联合阿糖胞苷对HL60细胞增殖抑制效果。

2.2 阿瑞匹坦增强阿糖胞苷引起HL60细胞G0/G1周期的阻滞

采用细胞周期试剂盒检测细胞的周期。在药物处理24小时后，阿瑞匹和阿糖胞苷均显著阻滞细胞周期在G0/G1期，联合组的细胞周期阻滞效果更明显。统计结果显示，对照组的G0/G1期比例为37.14±2.02％，0.8μM阿糖胞苷组G0/G1期比例为是69.63±1.08％，10μM阿瑞匹坦组的G0/G1期比例为54.96±2.06％，联合组处理的G0/G1期比例为76.02±1.51％(图4)。

图4直观展示了阿瑞匹坦增强阿糖胞苷引起HL60细胞G0/G1的周期阻滞效果。

2.3 阿瑞匹坦联合阿糖胞苷诱导HL60细胞坏死

采用Annexin V-FITC和PI双染法检测细胞的凋亡和坏死。Q4象限为PI和AnnexinV-FITC均阴性的正常细胞群，Q3象限是Annexin V-FITC阳性和PI阴性的早期凋亡细胞群，Q1是PI阳性和Annexin V-FITC阴性的坏死细胞群，Q2是PI和Annexin V-FITC均阳性的晚期凋亡细胞群，在细胞发生凋亡的早期，细胞都会把磷脂酰丝氨酸外翻到细胞膜外侧，因此用带有绿色荧光的荧光探针FITC标记的Annexin V，就可以用流式细胞仪直接地检测到PS的外翻这一细胞凋亡的重要特征。阿瑞匹坦联合阿糖胞苷处理HL60细胞24小时后，我们未观察到Q3区域有明显的细胞群，因此结果提示阿瑞匹坦联合阿糖胞苷是通过增加HL60细胞坏死细胞的比例抑制细胞增殖。

统计结果显示，对照组的坏死比例是5.33±0.24％，0.8μM阿糖胞苷处理的细胞坏死比例是25.11±0.27％，10μM阿瑞匹坦处理的细胞坏死比例是11.83±0.30％，联合组处理的细胞坏死比例是36.35±1.27％(图5)。阿瑞匹坦联合阿糖胞苷处理HL60细胞能诱导坏死，与单独加药组相比，阿瑞匹坦联合阿糖胞苷处理能显著性的增加HL60细胞的坏死比例。

图5直观展示了阿瑞匹坦增强阿糖胞苷诱导的HL60细胞的坏死作用。

2.4 阿瑞匹坦联合阿糖胞苷对HL60细胞PI吸收的影响

对于坏死细胞，由于细胞膜的完整性已经丧失，PI能够进入细胞膜在荧光显微镜下呈现红色荧光，进一步用来判断细胞膜的破损程度。阿瑞匹坦联合阿糖胞苷处理HL60细胞24小时和48小时后，细胞形态发生改变，部分细胞出现明显的破裂，PI染色的细胞数增多。PI染色情况进行统计分析，药物处理24小时后，0.8μM阿糖胞苷单独处理组的PI染色率为11.06±1.90％，而阿瑞匹坦联合阿糖胞苷的PI染色率为27.45±0.88％。药物处理48小时后，0.8μM阿糖胞苷单独处理组的PI染色率为35.59±2.57％，而阿瑞匹坦联合阿糖胞苷的PI染色率为51.79±3.03％(图6)。

图6直观展示了阿瑞匹坦联合阿糖胞苷能显著增加PI染色率，说明阿瑞匹坦联合阿糖胞苷处理能显著性的增加HL60细胞细胞膜的破损程度。

2.5 阿瑞匹坦联合阿糖胞苷促进LDH释放

细胞发生坏死而造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶(l actate dehydrogenase,LDH)，通过乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒对LDH含量进行检测。LDH释放情况进行统计分析，以对照组的LDH相对释放量为1，作为基准，在药物处理24小时后，0.8μM阿糖胞苷单独处理组的LDH相对释放量为7.32±0.09％，而阿瑞匹坦联合阿糖胞苷的LDH相对释放量为10.54±0.58％(图7)。进一步说明阿瑞匹坦联合阿糖胞苷处理能显著性的增加HL60细胞细胞膜的破损程度。

图7直观展示了联合加药组的LDH释放显著高于阿瑞匹坦和阿糖胞苷单独加药组。阿瑞匹坦联合阿糖胞苷增加了HL60细胞细胞膜的破损程度。

2.6 Nec-1和Z-VAD-FMK逆转了阿瑞匹坦联合阿糖胞苷引起的细胞增殖抑制

Nec-1是一种坏死抑制剂，Z-VAD-FMK是特异性的Caspase抑制剂，我们进一步在MTT检测细胞增殖活力实验中加入Nec-1和Z-VAD-FMK预处理，观察Ara-C联合Aprepitant联合引起的细胞坏死能否被一定程度的缓解。统计结果显示在Nec-1预处理组的细胞增殖活力为40.26±2.15％，Z-VAD-FMK处理组的细胞增殖活力为38.06±3.34％，联合两种抑制剂预处理的细胞增殖活力为57.72±2.02％，而联合处理未用抑制剂组的细胞增殖活力为28.97±2.41％(图8)，因此进一步证明阿瑞匹坦联合阿糖胞苷是通过增加HL60细胞坏死细胞的比例抑制细胞增殖。

图8直观展示了Nec-1和Z-VAD-FMK逆转了阿瑞匹坦联合阿糖胞苷引起的细胞增殖抑制

2.7 阿瑞匹坦增强阿糖胞苷在荷瘤裸鼠上异种移植瘤的生长的抑制活性

为了进一步验证阿瑞匹坦联合阿糖胞苷抑制HL60细胞的增殖，我们构建了HL60细胞人源化小鼠移植瘤模型。通过皮下注射HL60细胞，形成实体瘤，不同药物处理组处理后，对照组的裸鼠肿瘤生长最为迅速，肿瘤体积也最大，阿瑞匹坦处理组和阿糖胞苷处理组的肿瘤体积增长比对照组慢，联合组的肿瘤体积增长最慢，肿瘤体积也最小。对第10天肿瘤体积进行数据分析，对照组的肿瘤体积为2175.0±341.9mm³，而联合组的肿瘤体积减少到828.4±232.4mm³。阿糖胞苷组的肿瘤体积为1869.0±153.5mm³，与对照组相比并无显著差异(图9)。对第10天肿瘤重量进行数据分析，对照组的肿瘤重量为1.05±0.11g，阿糖胞苷组的肿瘤重量为0.89±0.11g，阿瑞匹坦组的肿瘤重量为0.50±0.14g，而联合组的肿瘤重量为0.34±0.10g，联合组和阿糖胞苷单独处理组之间有显著性差异(图9)。

各组之间体重增长并无显著差异(图10)。对脏器指数统计分析发现，个、各组之间的各种脏器指数均无显著差异(图11)。对收集的小鼠全血进行血常规分析，统计结果发现各组之间的白细胞，数红细胞数，血红蛋白数和血小板数均无显著差异(图12)，说明阿瑞匹坦联合阿糖胞苷对裸鼠没有产生明显的毒副作用。

图9直观展示了在动物实验中，阿瑞匹坦联合阿糖胞苷能显著抑制小鼠肿瘤生长。图10，图11和图12直观展示了在动物实验中，阿瑞匹坦联合阿糖胞苷对小鼠无明显的毒副作用。

综上可见，阿瑞匹坦联合阿糖胞苷在体内和体外对HL60细胞都具有的增加阿糖胞苷的毒性作用。在细胞实验上，阿瑞匹坦联合阿糖胞苷能显著抑制HL60细胞的增殖，诱导HL60细胞的坏死，阿瑞匹坦联合阿糖胞苷破坏HL60细胞膜，PI吸收和LDH释放显著增加。在动物实验上，阿瑞匹坦联合阿糖胞苷处理裸鼠能显著抑制移植瘤的增长，且同时无显著的毒副作用。

本领域普通技术人员应当理解，可以在本发明的实践中采用除具体例示那些外的方法和原材料等而无需过度实验。任何此类方法和原材料等的所有的本领域已知的功能等价物都预期包括在本发明中。本领域技术人员还应当理解，可对本说明书及权利要求书中描述的本发明进行各种变动和修饰，且本发明包括所有此类变动和修饰。本发明还包括本说明书中单独或同时提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何2个或更多个的任何和所有组合。

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Claims (10)

1.阿瑞匹坦联合阿糖胞苷在制备用于治疗受试者中癌症、缓解受试者中癌症症状或抑制癌细胞增殖的药物中的用途，其中所述癌症为血癌或血细胞癌。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述的癌症为原发性癌症或继发性癌症。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述的癌症为急性白血病。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述的癌细胞是急性白血病癌细胞。

5.根据权利要求1中所述的用途，其中所述的受试者为哺乳动物。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述的哺乳动物为人。

7.治疗癌症的药物组合物或药盒，其包括阿瑞匹坦和阿糖胞苷。

8.根据权利要求7所述的药物组合物或药盒，其中所述癌症为白血病。

9.阿瑞匹坦在制备用于降低阿糖胞苷的毒副作用的药物或药剂中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述药物或药剂是用于治疗血癌的药物或药剂。

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