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CN111631758A - 取样材料在胃肠道内的保存结构与方法 - Google Patents

取样材料在胃肠道内的保存结构与方法 Download PDF

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CN111631758A CN202010518866.7A CN202010518866A CN111631758A CN 111631758 A CN111631758 A CN 111631758A CN 202010518866 A CN202010518866 A CN 202010518866A CN 111631758 A CN111631758 A CN 111631758A
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Abstract

本发明公开了取样材料在胃肠道内的保存结构与方法，包括取样胶囊，所述取样胶囊内部设置有包裹状结构，且包裹状结构内包裹有药剂，所述取样胶囊内部是指胶囊的内侧壁、用支架结构推送到中央位置等，所述包裹状结构由吸水分解材质、半透膜材质或不透水材质组成。本发明把取样胶囊放入模拟的胃肠道装置中，经实验得出药物保存样本组、冷冻保存样本组与对照组取样的样品的菌群种类和结构与直接取样、冰箱冷藏的样品的菌群种类和结构基本一致，从而证明了其在取样胶囊内的保存效果。

Description

取样材料在胃肠道内的保存结构与方法
技术领域
本发明涉及医疗器械技术领域，具体为取样材料在胃肠道内的保存结构与方法。
背景技术
肠道是人体消化与吸收的主要器官，而人体肠道内寄生数量繁多的微生物，包括细菌、真菌病毒\噬菌体\原虫等，其中细菌占99％，大约有10万亿个，被称为肠道菌群。肠道菌群基因数量大约是人体基因的100倍，因此也被称为人体的“第二基因组”。肠道菌群不仅能影响人体对蛋白质、脂类、碳水化合物等营养物质的消化与吸收，还能合成多种人体生长发育必须的维生素，调节机体免疫力，抵御感染和自体免疫疾病的患病风险。近年来，随着第二代测序技术的发展和生物信息学分析方法的日益完善，已证明肠道微生物与多种疾病的发生发展密切相关。
第二代测序技术的发展和生物信息学分析方法以16SrDNA技术为代表，16SrDNA存在于所有细菌染色体基因中，可以编码16SrRNA相对应的DNA序列，该序列包含9个高变区和10个保守区。保守区反映了生物物种间的亲缘关系，而高变区则能体现物种间的差异。通过设计引物扩增高变区的序列，然后进行二代测序，运用生物信息学分析方法进一步区分菌种。此方法可以应用于肠道微生物的鉴定与分析。
由于人体肠道为微生物提供了最适宜的生长环境，一旦被取样后，微生物就脱离人体肠道环境，大多数微生物的增长与死亡速率会发生很大的改变，不能准确的反映该段胃肠道的微生物种群状况。目前通用的保存方法可以低温冻存和药剂处理，然而此类现存方法在体外可以，而针对在人或其他动物消化道内，就有很大难度。尤其是在肠道内取样后的胶囊，其内部保存的消化道内容物，要保持其活性或菌群数量不变，就是一个现实而急迫的挑战。
鉴于DNA本身具有相对的稳定性，如果用药剂直接破坏细胞，破坏或抑制DNA酶活性后，其内容物的DNA就会被固定且保存下来，浙江大学杨忠丽等的专利(申请号201910101292.0)常温下一种粪便样本的DNA保存液及其制备方法和用途，提出了2个配方，常温下保存DNA的效果都不错。一种用无菌水溶解20-50mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液、10-50mM的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、100-150mM的氯化钠(NaCl)和质量分数为0.1％-0.5％的十二烷基硫酸钠(SDS)，再调制PH至8.0，最后获得DNA保存液。或者是非专利保护的现有配方:25mM三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液、140mM/L的氯化钠(NaCl)、45mM/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、卡松防腐剂0.02％和质量分数为0.5％的十二烷基硫酸钠(SDS)。东莞博奥木华基因科技有限公司(201711370058.5)的专利：一种粪便保存液及其应用，提到的保存粪便DNA的保存液，利用乙醇作为固定剂、柠檬酸钠作为固定辅助剂、EDTA-二钠为抗凝剂、Tris-HCl为缓冲液、NaCl为离子强度维持剂，并配合十二烷基硫酸钠，经过合理组方，能够稳定粪便样品中微生物的数量、组成和丰度，可以保证人肠道菌群测序分析的准确性，实现粪便样本的常温保存。
以上三种粪便保存液的配方和使用方法，除了非常适合常温下的体外的粪便样品保存外，也特别适合于保存由胃肠道内部取样胶囊取出的样品，因为样品自然情况下随胃肠道蠕动而排出，一般需要时间6-48H,甚至更长的时间；如果使用促进胃肠道蠕动的药物，又很难模拟胃肠道真实的微生物生存状态，而在胃肠道保存比较长的时间的条件下，是微生物保持取样时的状态，变得很困难。因此通过药剂保持样品中DNA的稳定，进而对其进行宏基因组学检测，分析变得很重要。以上2个专利给出来一个很好的方法，但是胃肠道内取样，与体外取样有很大不同，要考虑安全性能与可操作性，避免使用对人体可能有害的物质，比如：硫氰酸胍、二甲基亚砜(DMSO)、β-巯基乙醇等。我们基于几个专利的配方，提出本专利的解决的办法。
另外胃肠道内取样得到的材料，不仅仅包括胃肠道微生物，还有局部的蛋白、糖类、脂类等各种生物活性物，包括体内的激素等，而这些物质在取得后，也必须得意保存，方可以用来分析。美国，普罗根尼蒂公司(CN109843182A)，专利中提到很多内容物保持剂，包括使用胶类、表面活性类、抗生素类、蛋白酶类等。但是其并没考虑到具体哪一种保存剂复配效果最好，更没有考虑到在没有电子控制装备的一次性取样胶囊内，哪一种组织方式，哪一种配方会起到更好的效果。
针对消化道取样胶囊取样后，样品中DNA、蛋白质、糖类、脂类及其他生物活性小分子化合物甚至一些活性细胞，我们提出可以在常温(人或动物体温)下保存取样的消化道内容物的结构与方法。
发明内容
本发明的目的在于提供取样材料在胃肠道内的保存结构与方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：取样材料在胃肠道内的保存结构，包括取样胶囊，所述取样胶囊内部设置有包裹状结构，且包裹状结构内包裹有药剂。
优选的，所述取样胶囊内部是指胶囊的内侧壁、用支架结构推送到中央位置等。
优选的，所述包裹状结构由吸水分解材质、半透膜材质或不透水材质组成，且药剂为三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、氯化钠(NaCl)、十二烷基硫酸钠(SDS)、卡松防腐剂、乙醇或柠檬酸钠的一种或多种的混合物。
优选的，所述包裹状结构还由易散热材料做成，且内部还包裹有硝酸铵，或其他吸水或反应能降低温度的物质。
取样材料在胃肠道内的保存方法，其方法包括以下步骤：
A、按几种不同配方，把配方中的固体成分充分混合，用吸水物质材料把其封成一个或多个小包，再用吸附、包裹等方式把它们分散在囊壳内和/或囊壳壁上；
B、囊壳设置成有一定柔软度的材料，在胃肠运动的挤压下，内容物也会被充分搅拌；
C、被取样的材料，其中水分会溶解各种吸附、包裹物质，被溶解的物质作用于取样材料，实现对取样材料的DNA的固定与保存。
优选的，所述步骤A中的配方为三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液、10-50mM的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、100-150mM的氯化钠(NaCl)和质量分数为0.1％-0.5％的十二烷基硫酸钠(SDS)或利用乙醇、柠檬酸钠、EDTA-二钠、Tris-HCl、NaCl和十二烷基硫酸钠或常规实验用配方，且吸水物质材料以多糖类、蛋白质类为主，包括且不限于纤维素类、明胶、琼脂糖、阿拉伯胶、黄原胶、树脂类等，同时小包可以被线状材料串起来，线状材料固定在有一定间隔的囊壁上，且囊壳壁用隔热材料做成，包括泡沫聚氨酯、聚苯乙烯泡沫塑料、聚苯板、酚醛泡沫橡塑海绵、聚乙烯、聚苯乙烯泡沫或玻璃棉等，同时，包裹部分用吸水材料制成，吸水材料控制反应或参与反应。
优选的，所述步骤C中的保存方式为制冷保存，且制冷保存为化学缓慢吸热反应，主要对其他生物活性物质、蛋白质、肿瘤细胞等的保存结构，用吸热的化学反应或物理变化，最好其中一种反应物是水，或者胃肠道、食物中盐类，同时，吸热反应的材料放于囊壳中间的包裹中或放于多个包裹中，挤压下会反应或吸水壁层溶解，然后反应。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
通过实验，得出用DNA保存药物保存的样本或者是用化学反应致冷冻方法保存的样本，在保存8个小时后，与直接取样马上冰箱冷藏8个小时的样品,其菌群种类和结构基本一致，从而证明该保存方法在体内的保存效果是稳定可靠的，可以达到冰箱的保存水平。这对于取样后材料仍然在肠道内不能及时送检，保存其菌群种类和结构的稳定性，对于取样后期的检测检查具有极其重要的意义。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
取样材料在胃肠道内的保存结构，包括取样胶囊，取样胶囊内部设置有包裹状结构，且包裹状结构内包裹有药剂，取样胶囊内部是指胶囊的内侧壁、用支架结构推送到中央位置等，包裹状结构由吸水分解材质、半透膜材质或不透水材质组成，且药剂为三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、氯化钠(NaCl)、十二烷基硫酸钠(SDS)、卡松防腐剂、乙醇或柠檬酸钠的一种或多种的混合物，包裹状结构还由易散热材料做成，且内部还包裹有硝酸铵，或其他吸水或反应能降低温度的物质。
取样材料在胃肠道内的保存方法，其方法包括以下步骤：
A、按几种不同配方，把配方中的固体成分充分混合，用吸水物质材料把其封成一个或多个小包，再用吸附、包裹等方式把它们分散在囊壳内和/或囊壳壁上；
B、囊壳设置成有一定柔软度的材料，在胃肠运动的挤压下，内容物也会被充分搅拌；
C、被取样的材料，其中水分会溶解各种吸附、包裹物质，被溶解的物质作用于取样材料，实现对取样材料的DNA的固定与保存。
步骤A中的配方为三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液、10-50mM的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、100-150mM的氯化钠(NaCl)和质量分数为0.1％-0.5％的十二烷基硫酸钠(SDS)或利用乙醇、柠檬酸钠、EDTA-二钠、Tris-HCl、NaCl和十二烷基硫酸钠或常规实验用配方，且吸水物质材料以多糖类、蛋白质类为主，包括且不限于纤维素类、明胶、琼脂糖、阿拉伯胶、黄原胶、树脂类等，同时，小包可以被线状材料串起来，线状材料固定在有一定间隔的囊壁上，且囊壳壁用隔热材料做成，包括泡沫聚氨酯、聚苯乙烯泡沫塑料、聚苯板、酚醛泡沫橡塑海绵、聚乙烯、聚苯乙烯泡沫或玻璃棉等，同时，包裹部分用吸水材料制成，吸水材料控制反应或参与反应。
步骤C中的保存方式为制冷保存，且制冷保存为化学缓慢吸热反应，主要对其他生物活性物质、蛋白质、肿瘤细胞等的保存结构，用吸热的化学反应或物理变化，最好其中一种反应物是水，或者胃肠道、食物中盐类，同时，吸热反应的材料放于囊壳中间的包裹中或放于多个包裹中，挤压下会反应或吸水壁层溶解，然后反应。
实验验证及具体步骤：把取样胶囊放入模拟的胃肠道装置中，模拟的胃肠道装置选用TIM(TNO Intestinal Model)(TIM是由荷兰瓦赫宁根大学的Minekus和Havenaar研制的用于药物动态测试的多单元的计算机控制的体外消化模拟系统)。该系统分为两部分，胃、小肠模拟器(TIM-1)和大肠模拟器(TIM-2)。本实验采用肠道菌群最复杂的大肠模拟器(TIM-2)作为检测装置。
分为1、2、3组分别对应药物保存样本组、冷冻保存样本组与对照组三部分的取样，每组五个胶囊；对照组为在两类胶囊取样的同时，从模拟器中取样并样本放于无菌Ep管中，储存于-80℃冰箱中冻存备用。药物保存样本组、冷冻保存样本组分别在模拟大肠中停留8个小时后取出。最终我们对三组样品，使用DNA提取试剂盒(QIAamp PowerFecal DNA Kit，德国Qiagen公司)进行总DNA提取。用细菌的16SrRNA基因的通用引物(338F－ACTCCTACGGGAGGCAGGCAGCA，806R－GGACTAC－HVGGGTWTCTAAT)对16SrRNA基因高度可变区V4进行PCR扩增，引物分别加上一段接头序列。构建DNA文库，产物送基因测序，测序结果输入Genbank进行比对。
肠道微生物分布情况，大肠部分菌群丰富度平均值对比指标结果见下表：
Figure BDA0002531165990000081
药物保存样本组、冷冻保存样本组分别与对照组的相对丰度经单因素方差分析，结果均为(P<0.05)，表明两种保存样品的方法，药物保存样本、冷冻保存样本与对照组在肠道菌群种类结构之间的差异不显著。即药物保存样本组、冷冻保存样本组与对照组取样的样品的菌群种类和结构与直接取样、冰箱冷藏的样品的菌群种类和结构基本一致。
综上试验结果表明，药物保存样本与冷冻保存样本的方法具有很好的保存效果。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.取样材料在胃肠道内的保存结构，包括取样胶囊，其特征在于：所述取样胶囊内部设置有包裹状结构，且包裹状结构内包裹有药剂。
2.根据权利要求1所述的取样材料在胃肠道内的保存结构，其特征在于：所述取样胶囊内部是指胶囊的内侧壁、用支架结构推送到中央位置等。
3.根据权利要求1所述的取样材料在胃肠道内的保存结构，其特征在于：所述包裹状结构由吸水分解材质、半透膜材质或不透水材质组成，且药剂为三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、氯化钠(NaCl)、十二烷基硫酸钠(SDS)、卡松防腐剂、乙醇或柠檬酸钠的一种或多种的混合物。
4.根据权利要求1所述的取样材料在胃肠道内的保存结构，其特征在于：所述包裹状结构还由易散热材料做成，且内部还包裹有硝酸铵，或其他吸水或反应能降低温度的物质。
5.取样材料在胃肠道内的保存方法，其特征在于：其方法包括以下步骤：
A、按几种不同配方，把配方中的固体成分充分混合，用吸水物质材料把其封成一个或多个小包，再用吸附、包裹等方式把它们分散在囊壳内和/或囊壳壁上；
B、囊壳设置成有一定柔软度的材料，在胃肠运动的挤压下，内容物也会被充分搅拌；
C、被取样的材料，其中水分会溶解各种吸附、包裹物质，被溶解的物质作用于取样材料，实现对取样材料的DNA的固定与保存。
6.根据权利要求5所述的取样材料在胃肠道内的保存方法，其特征在于：所述步骤A中的配方为三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液、10-50mM的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、100-150mM的氯化钠(NaCl)和质量分数为0.1％-0.5％的十二烷基硫酸钠(SDS)或利用乙醇、柠檬酸钠、EDTA-二钠、Tris-HCl、NaCl和十二烷基硫酸钠或常规实验用DNA保存配方，且吸水物质材料以多糖类、蛋白质类为主，包括且不限于纤维素类、明胶、琼脂糖、阿拉伯胶、黄原胶、树脂类等，同时，小包可以被线状材料串起来，线状材料固定在有一定间隔的囊壁上，且囊壳壁用隔热材料做成，包括泡沫聚氨酯、聚苯乙烯泡沫塑料、聚苯板、酚醛泡沫橡塑海绵、聚乙烯、聚苯乙烯泡沫或玻璃棉等，同时，包裹部分用吸水材料制成，吸水材料控制反应或参与反应。
7.根据权利要求5所述的取样材料在胃肠道内的保存方法，其特征在于：所述步骤C中的保存方式为制冷保存，且制冷保存为化学缓慢吸热反应，主要对其他生物活性物质、蛋白质、肿瘤细胞等的保存结构，用吸热的化学反应或物理变化，最好其中一种反应物是水，或者胃肠道、食物中盐类，同时，吸热反应的材料放于囊壳中间的包裹中或放于多个包裹中，挤压下会反应或吸水壁层溶解，然后反应。
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