CN111617238B - 小鼠ct26结直肠癌治疗性肿瘤多肽疫苗制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小鼠CT26结直肠癌治疗性肿瘤多肽疫苗制剂，包含抗原表位组合物和佐剂，抗原表位组合物包括7条CT26 CD8 T细胞表位的多肽片段(如SEQ ID NO：1‑7所示)与4条CT26 CD4 T细胞表位的多肽片段(如SEQ ID NO：8‑11所示)。为改进其他CT26肿瘤疫苗的治疗效果的新途径，提高了肿瘤生长的抑制效果，适合用于其他类型的抗肿瘤药物的联合治疗进行探索。本发明同时还公开了该多肽疫苗制剂的制备方法，包括：肿瘤新生抗原预测、筛选、鉴定、多肽疫苗制剂开发、多肽疫苗制剂体内药效测试和药效动力学测试。

Description

小鼠CT26结直肠癌治疗性肿瘤多肽疫苗制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于免疫治疗领域，特别涉及一种治疗性肿瘤疫苗，具体涉及小鼠CT26结直肠癌治疗性肿瘤多肽疫苗制剂；此外，本发明还涉及该小鼠CT26结直肠癌治疗性肿瘤多肽疫苗制剂的制备方法。

背景技术

肿瘤一直是人类健康的最大威胁之一，其发病机制复杂，患者人群庞大，已成为我国死亡率最高的疾病。面对严峻的恶性肿瘤挑战，许多制药公司纷纷投身于肿瘤治疗药物的开发，肿瘤治疗药物市场近年来呈规模性快速扩张态势。在迅速扩张的抗肿瘤治疗市场中，肿瘤免疫治疗药物药众人瞩目，其中免疫检查点抑制剂和肿瘤疫苗药物在临床研究中取得了终点进展。目前肿瘤疫苗与其他类型的肿瘤治疗药物特别是免疫检查点抑制剂联合用药是一个主要的趋势。但是目前临床前的肿瘤疫苗和其他类型的肿瘤治疗药物的联合治疗的临床前评估手段非常缺乏，主要是缺乏合适的肿瘤模型和有效的肿瘤抗原制剂，严重阻碍了临床实验的设计和决策。在结直肠癌治疗性肿瘤疫苗临床前研究方面，目前没有开发出一个具有良好疗效的肿瘤疫苗制剂，严重地阻碍了结直肠癌肿瘤疫苗的研发，使得难以进行肿瘤疫苗和其他种类治疗药物联合治疗临床实验的设计和决策，比如化疗药物、小分子靶向治疗药物和抗体等。为了解决这两个问题，我们建立了肿瘤疫苗发现平台，建立肿瘤新生抗原预测、筛选、和鉴定的能力。我们采用一种特别的肿瘤疫苗组合策略，将预测出来的新生抗原制作成一种有效的结肠癌肿瘤CT26多肽疫苗制剂，在CT26肿瘤模型的治疗中取得了巨大的疗效，为临床前的肿瘤疫苗和其他类型的肿瘤治疗药物，特别是疫检查点抑制剂联合治疗提供了一个可靠的评估模型。此外，目前的治疗性肿瘤疫苗多为能够引起CD8T细胞反应MHCI限制性的新生抗原片段，抗肿瘤免疫的效果一般。越来越多研究表明由MHCII限制性的新生抗原产生的CD4 T细胞能够增强CD8 T细胞的抗肿瘤能力。因此在我们筛选到能够引起CD8 T细胞反应MHCI限制性的新生抗原片段之后，我们引入了已知的CT26肿瘤细胞CD4 T细胞表位，做成CT26肿瘤多肽疫苗制剂，用于CT26肿瘤模型的治疗。CT26肿瘤多肽疫苗制剂治疗取得了重大的治疗效果，为临床前的肿瘤疫苗和免疫检查点抑制剂等药物的联合治疗提供了一个可靠的设计和决策手段。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一在于提供小鼠CT26结直肠癌治疗性肿瘤多肽疫苗制剂。

本发明要解决的技术问题之二在于提供该小鼠CT26结直肠癌治疗性肿瘤多肽疫苗制剂的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

在本发明的一方面，提供一种小鼠CT26结直肠癌治疗性肿瘤多肽疫苗制剂，所述多肽疫苗制剂中包含：

a.抗原表位组合物，所述抗原表位组合物包括7条CT26 CD8 T细胞表位的多肽片段与4条CT26 CD4 T细胞表位的多肽片段；所述7条CT26 CD8 T细胞表位的多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-7所示；所述4条CT26 CD4 T细胞表位的多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：8-11所示；

b.佐剂。

作为本发明优选的技术方案，所述佐剂为聚肌苷酸-聚胞嘧啶核苷酸(polyinosine-polycytidylic acid，poly I:C)，或者所述佐剂为完全弗氏佐剂CFA。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽疫苗制剂的制备方法，包含以下步骤：

I、对CT26肿瘤细胞进行全外显子测序和mRNA基因表达量测序；

II、分析测序数据，对突变的多肽序列进行CD8T细胞表位预测，挑选出排名前20的突变序列，并合成多肽片段；

III、将步骤(II)中的20突变多肽片段混合，与佐剂混合，免疫小鼠，筛选出7条具有免疫原性的突变抗原的CD8 T细胞表位的多肽片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1-7所示；

IV、将步骤(III)中选取出的7条CD8 T细胞表位的多肽片段与4条如SEQ ID NO：8-11所示的CT26 CD4 T细胞表位的多肽片段等质量混合形成多肽混合液，添加佐剂，形成多肽疫苗制剂。

作为本发明优选的技术方案，所述佐剂为：聚肌苷酸-聚胞嘧啶核苷酸(polyinosine-polycytidylic acid，poly I:C)。步骤IV中所述多肽疫苗制剂的配制具体方法为：将16mg/mL的多肽混合液与0.5mg/mL的佐剂稀释液以1:1等体积混合，制作成多肽疫苗混悬液制剂。所述多肽混合液的配制方法为：每条多肽片段用DMSO配制成50mg/mL的母液，再将所有多肽的母液等量地混合在一起，用PBS溶解配置成16mg/mL的多肽混合液；所述佐剂稀释液的配制方法为：长度1.5-8kb商品化的Poly I:C的粉末的用无热源的去离子水配制成1mg/mL的母液，65-70℃水浴10分钟溶解，室温放置1小时冷却；Poly I:C母液用PBS稀释成0.5mg/mL的稀释液。

作为本发明优选的技术方案，所述佐剂为：完全弗氏佐剂CFA。步骤IV中所述多肽疫苗制剂的配制具体方法为：将16mg/mL的多肽混合液与完全弗氏佐剂CFA以1:1等体积混合，制作成多肽疫苗混悬液制剂。所述多肽混合液的配制方法为：每条多肽片段用DMSO配制成50mg/mL的母液，再将所有多肽的母液等量地混合在一起，用PBS溶解配置成16mg/mL的多肽混合液。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明利用第二代基因组测序技术，对CT26肿瘤细胞样本进行mRNA测序和外显子测序(WES)，检测肿瘤细胞中的变异位点，再通过两种工具NetMHC和NetMHCpan对WES数据中的变异位点进行肿瘤新生MHCI抗原突变序列的预测，并根据分析工具的算法对新生抗原突变序列的进行打分。然后挑选出得分排名靠前20的条突变序列，用化学合成的方法合成20多肽片段。最后建立验证肿瘤基因突变序列免疫原性的ELISPOT体外实验方法，筛选出7条具有免疫原性的突变抗原的CD8+T细胞表位(图1和图2)。

我们将筛选出来的肿瘤突变抗原CD8+T细胞表位序列进行化学合成，合成出多肽片段，将这些7条CD8+T细胞表位多肽片混合为一组或者与4条已知的CT26肿瘤细胞CD4+T细胞表位混合为一组，然后与佐剂按照不同的比例进行配伍，制作成CT26肿瘤疫苗制剂。然后建立小鼠CT26移殖瘤模型，对药效进行验证，结果表明CT26肿瘤疫苗制剂在荷瘤鼠体内产生了非常有效的T细胞反应，产生的CD4 T细胞和CD8 T细胞都积极的参与抗肿瘤免疫反应。

此前，其他CT26肿瘤疫苗的治疗效果并不是很好，对肿瘤生长的抑制效果并不明显，只是延长了小鼠死亡时间。我们开发出了结肠癌CT26肿瘤多肽疫苗制剂在CT26肿瘤模型中取得了预料不到的治疗效果，TGI达到60.88％(见图4)，尚未在文献和其他专利中找到过疗效更好的案例。我们开发的结肠癌CT26肿瘤多肽疫苗制剂非常适合用于其他类型的抗肿瘤药物的联合治疗进行探索，比如抗体药物、靶向治疗小分子治疗和化疗药物。

附图说明

图1是本发明实施例1中全外显子测序和mRNA基因表达量测序示意图。

图2是本发明实施例2中肿瘤疫苗预测和筛选流程图。

图3是本发明实施例3中ELISOPT筛选出来具有免疫原性的突变抗原肽段示意图。

图4是本发明实施例4中小鼠直肠癌CT26同种移植瘤模型荷瘤鼠在给予CT26肿瘤疫苗制剂后的肿瘤生长曲线。

图5是本发明实施例4中佐剂Poly I:C和CFA对CT26肿瘤疫苗治疗效果的比较示意图。

图6是本发明实施例5中脾脏细胞流式细胞术设门分析策略示意图。

图7是本发明实施例5中肿瘤组织细胞的流式细胞术设门分析策略示意图。

图8是本发明实施例5中荷瘤鼠脾脏中淋巴细胞亚群的比例示意图。

图9是本发明实施例5中荷瘤鼠肿瘤浸润淋巴细胞中免疫细胞亚群的比例示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。

实施例1：全外显子测序和mRNA基因表达量测序。

利用超声波破碎仪将CT26肿瘤细胞DNA随机打断成150-200bp，磁珠纯化后产物经末端修复补平并在3末端加A碱基形成粘性末端。然后，与含有特异性barcode序列的接头连接。磁珠筛选去除连接不完整的产物以及接头自连产物。利用与接头序列互补的通用引物进行PCR扩增，形成测序文库。然后使用Agilent探针在杂交缓冲液中进行杂交，使用磁珠捕获杂交的目的片段并分离纯化。PCR扩增捕获的DNA片段并纯化PCR产物，得到测序文库。Qubit检测文库浓度和Agilent 2100 Bioanalyzer检测文库片段长度。最后用Illumina进行二代测序。全外显子测序和mRNA基因表达量测序的流程如图1所示。

实施例2：肿瘤新生抗原的预测。

对全外显子测序得到的数据进行分析，一共发现CT26细胞中有1259个突变的多肽片段(表1)。我们用两种工具NetMHC和NetMHCpan对这1259个突变的多肽序列进行了CD8T细胞表位预测，根据分析工具的算法对新生抗原突变序列的进行打分，然后挑选出得分排名前20的突变序列，用化学合成的方法合成多肽片段。

如图2所示，对肿瘤细胞的外显子进行测序和分析，结合基因表达量分析，预测出由突变产生的突变多肽，再用软件NetMHC和NetMHCpan对突变多肽进行MHCI限制性结合分析，预测出可被抗原递呈细胞加工和递呈的突变多肽片段。之后根据软件评分和研究者设置的标准，从NetMHC和NetMHCpan的预测结果中挑选出20条多肽进行化学合成，10个一组免疫小鼠。最后用ELISOPT的方法对这些突变多肽片段进行免疫原性鉴定，筛选出来具有免疫原性MHCI限制性突变抗原肽段。

表1.CT26肿瘤细胞中检测到的突变多肽片段数量与用NetMHC和NetMHCpan预测出来的新生抗原T细胞表位数量。

实施例3：ELISOPT筛选具有免疫原性的突变抗原

将20条化学合成的突变多肽片段混合在一起，与佐剂Poly：IC混合，免疫BABL/C小鼠后肢右侧背部，第7天的时候再进行一次加强免疫，免疫14天之后，取小鼠脾脏，制备脾脏单细胞悬液，用ELISPOT技术筛选出突变抗原的T细胞表位。以产生IFN-γ斑点数大于等于10个/5╳10⁵个脾脏细胞为阳性标准，从20条突变多肽片段中，一共筛选出7条具有免疫原性的突变抗原的CD8T细胞表位的多肽片段(见图3和表2)。

表2本发明中的多肽序列

实施例4：CT26多肽疫苗制剂制备

如表3所示，将7条筛选出来的CT26肿瘤突变抗原的CD8 T细胞表位等质量混合在一起为一组，或者将7条筛选出来的CT26肿瘤突变抗原的CD8 T细胞表位和4条已知的CT26CD4 T细胞表位等质量混合在一起为一组。然后与佐剂Poly I:C按照不同的质量比例进行配伍，制作成不同的候选CT26肿瘤疫苗制剂。建立小鼠CT26移植瘤模型，从肿瘤细胞接种后第二天开始用不同的候选CT26肿瘤疫苗制剂对荷瘤鼠进行治疗，剂量均为82.5mg/kg(80mg/kg多肽+2.5mg/kg poly I：C)。每周给药2次，治疗周期是3周。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。CD26肿瘤疫苗制剂的抑瘤疗效用TGI(％)进行评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)＝[(1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积))/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积－溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％。根据药效的结果，筛选出具有最佳抗肿瘤效果的CT26肿瘤疫苗制剂。筛选得到的最有效的CT26肿瘤疫苗制剂成分是CD8 T细胞表位和CD4 T细胞表位等量混合的疫苗制剂。肿瘤抗原多肽片段与的Poly I:C组成的混悬液，其中肿瘤抗原多肽片段的含量是8mg/mL的多肽，Poly；IC的含量是0.25mg/mL(图4和表4)，其在开始治疗之后第21天的时候肿瘤抑制瘤是60.88％，达到了预料不到的技术效果。表4和图4中G1组是由预测、鉴定得到的7条CD8+T细胞表位多肽组成的多肽疫苗制剂，G2组是由4条CD4+T细胞表位多肽组成的多肽疫苗制剂，G3组是由7条CD8+T细胞表位和4条CD4+T细胞表位多肽组成的多肽疫苗制剂。每个数据点用肿瘤平均体积±标准误(SEM)标示，n＝10。此外，用CFA作为佐剂，CD8 T细胞表位和CD4 T细胞表位肿瘤并没有体现出抗肿瘤效果(图5)。图5是小鼠直肠癌CT26同种移植瘤模型荷瘤鼠在给予CT26肿瘤疫苗+PolyI:C佐剂制剂和CT26肿瘤疫苗+CFA佐剂制剂后的肿瘤生长曲线。G3组是由7条CD8+T细胞表位和4条CD4+T细胞表位多肽组成的多肽与PolyI:C的混合制剂。G4组是由7条CD8+T细胞表位和4条CD4+T细胞表位多肽组成的多肽与CFA的混合制剂。G4组的多肽与G3组的成分一样，佐剂的成分不一样，G3组的佐剂是Poly I:C，G4组的佐剂是完全弗氏佐剂CFA。每个数据点用肿瘤平均体积±标准误(SEM)标示，n＝10。

表3.CT26肿瘤疫苗制剂的制备方法

表4.CT26肿瘤疫苗制剂中的多肽成分的性质

实施例5：药效动力学测试

在实验终点，取小鼠的肿瘤组织和脾脏细胞，分别消化成单细胞悬液，并运用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)的方法，检测小鼠肿瘤组织样本中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的成分和脾脏中的免疫细胞成分。用染色缓冲液重悬细胞，使其浓度为1×106个细胞/100μL，铺至96V孔板中，4℃，400×g离心5分钟，去除上清液；用100μL染色缓冲液重悬细胞；每孔加入1μL的Fc Block，4℃避光孵育5分钟。随后加入以下抗体(如表5)，4℃避光孵育30分钟。抗体孵育完成之后，4℃，400×g离心5分钟，去除上清液，用200μL染色缓冲液重悬细胞，4℃，400×g离心5分钟，去上清，并重复一次；然后用100μL固定液重悬细胞，4℃避光孵育30分钟，4℃，400×g离心5分钟，去除上清液。200μL染色缓冲液重悬细胞，4℃，400×g离心5分钟，去上清，并重复一次。最后用200μL染色缓冲液重悬细胞，并转移到流式管中，通过流式细胞仪上机检测。用BD公司的FACS LSR Fortessa X20流式细胞仪对染色好的细胞进行检测。收集10,000个Live/Dead-CD45+CD3+CD4+细胞。运用FlowJo V10，SPSS17.0及Excel对流式数据进行分析，分析CD45+细胞中T细胞、CD4 T细胞、Treg细胞，Central memory CD4 T细胞，Effector Memory CD4 T细胞，CD8 T细胞、Central memory CD8 T细胞，EffectorMemory CD8 T细胞的百分比。采用One-way ANOVA统计方法，利用LSD对两组之间的数据差异进行统计分析。误差条表示均值的标准误差(SEM)。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。流式细胞术圈门策略如图6和图7所示。如图6所示，运用流式细胞仪对脾脏单细胞样本进行分析，分析脾脏中T细胞、CD4 T细胞、Treg细胞，Central memory CD4 T细胞，EffectorMemory CD4 T细胞，CD8 T细胞、Central memory CD8 T细胞，Effector Memory CD8 T细胞的比例。如图7所示，运用流式细胞仪对消化成单细胞的肿瘤组织样本进行分析，分析C脾脏中T细胞、CD4 T细胞、Treg细胞，Central memory CD4 T细胞，Effector Memory CD4 T细胞，CD8 T细胞、Central memory CD8 T细胞，Effector Memory CD8 T细胞的百分比。

小鼠经过CT26肿瘤疫苗制剂治疗之后，脾脏中的T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞和Central memory CD8 T细胞的比例与对照组相比均显著地增加。在肿瘤组织中，T细胞、CD4T细胞、CD8 T细胞的比例与对照组相比也有明显的增加，其中Central memory CD4 T细胞和Central memory CD8 T细胞显著性地增加。这些数据表明CT26肿瘤疫苗制剂在荷瘤鼠体内产生了非常有效的T细胞反应，产生的CD4 T细胞和CD8 T细胞都积极的参与抗肿瘤免疫反应(图8和图9)。如图8所示，运用FlowJo V10和SPSS17.0对荷瘤鼠脾脏细胞流式细胞数据进行分析，采用One-way ANOVA统计方法，利用LSD对两组之间的数据差异进行统计分析。误差条表示均值的标准误差(SEM)。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。如图9所示，运用FlowJoV10和SPSS17.0对荷瘤鼠肿瘤组织中的免疫细胞流式细胞数据进行分析，采用One-wayANOVA统计方法，利用LSD对两组之间的数据差异进行统计分析。误差条表示均值的标准误差(SEM)。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

表5.CT26流式染色方案

#	Channels	panel
			1	BUV395	CD45
2	BUV496	CD4
			3	BUV737	CD8
4	BV421	Live/Dead
			5	BV711	CD25
6	BV786	CD62L
			7	BB700	CD44
8	PE-Cy7	FoxP3+
			9	AF700	CD11b+
10	APC-Cy7	CD3

序列表

<110>苏州药明康德新药开发有限公司

<120>小鼠CT26结直肠癌治疗性肿瘤多肽疫苗制剂及其制备方法

<130> WH-NP-20-100635

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213>人工序列（未知）

<400> 1

KYQGLVVKQS V 11

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213>人工序列（未知）

<400> 1

VKYQGLVVKQ SV 12

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213>人工序列（未知）

<400> 3

KYQGLVVKQS VK 12

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213>人工序列（未知）

<400> 4

DYVTGKMAV 9

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213>人工序列（未知）

<400> 5

SYIETLPKAI K 11

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213>人工序列（未知）

<400> 6

KYVFINVCHR V 11

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213>人工序列（未知）

<400> 7

SSYIETLPKA IK 12

<210> 8

<211> 27

<212> PRT

<213>人工序列（未知）

<400> 8

DKPLRRNNSY TSYIMAICGM PLDSFRA 27

<210> 9

<211> 27

<212> PRT

<213>人工序列（未知）

<400> 9

PLLPFYPPDE ALEIGLELNS SALPPTE 27

<210> 10

<211> 27

<212> PRT

<213>人工序列（未知）

<400> 10

EHIHRAGGLF VADAIQVGFG RIGKHFW 27

<210> 11

<211> 27

<212> PRT

<213>人工序列（未知）

<400> 11

VTSIPSVSNA LNWKEFSFIQ STLGYVA 27

Claims (4)

1.一种小鼠CT26结直肠癌治疗性肿瘤多肽疫苗制剂，其特征在于，所述多肽疫苗制剂中包含：

a.抗原表位组合物，所述抗原表位组合物包括7条CT26 CD8 T细胞表位的多肽片段与4条CT26 CD4 T细胞表位的多肽片段；所述7条CT26 CD8 T细胞表位的多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-7所示；所述4条CT26 CD4 T细胞表位的多肽片段的氨基酸序列如SEQ IDNO：8-11所示；

b.佐剂；所述佐剂为：聚肌苷酸-聚胞嘧啶核苷酸poly I:C。

2.根据权利要求1所述的多肽疫苗制剂的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

I、对CT26肿瘤细胞进行全外显子测序和mRNA基因表达量测序；

II、分析测序数据，对突变的多肽序列进行CD8T细胞表位预测，挑选出排名前20的突变序列，并合成多肽片段；

III、将步骤(II)中的20条突变多肽片段混合，与佐剂混合，免疫小鼠，筛选出7条具有免疫原性的突变抗原的CD8 T细胞表位的多肽片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1-7所示；

IV、将步骤(III)中选取出的7条CD8 T细胞表位的多肽片段与4条如SEQ ID NO：8-11所示的CT26 CD4 T细胞表位的多肽片段等质量混合形成多肽混合液，添加佐剂，形成多肽疫苗制剂；

所述佐剂为：聚肌苷酸-聚胞嘧啶核苷酸poly I:C。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤IV中所述多肽疫苗制剂的配制具体方法为：将16mg/mL的多肽混合液与0.5mg/mL的佐剂稀释液以1:1等体积混合，制作成多肽疫苗混悬液制剂。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述多肽混合液的配制方法为：每条多肽片段用DMSO配制成50mg/mL的母液，再将所有多肽的母液等量地混合在一起，用PBS溶解配置成16mg/mL的多肽混合液；所述佐剂稀释液的配制方法为：长度1.5-8kb商品化的Poly I:C的粉末用无热源的去离子水配制成1mg/mL的母液，65-70℃水浴10分钟溶解，室温放置1小时冷却；Poly I:C母液用PBS稀释成0.5mg/mL的稀释液。

Images