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CN111565760B - 体液渗漏检测水性组合物 - Google Patents

体液渗漏检测水性组合物 Download PDF

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CN111565760B CN201880082122.6A CN201880082122A CN111565760B CN 111565760 B CN111565760 B CN 111565760B CN 201880082122 A CN201880082122 A CN 201880082122A CN 111565760 B CN111565760 B CN 111565760B
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Abstract

公开了体液渗漏检测水性组合物，例如用于术中胰液渗漏的检测。所述组合物包含增加所述组合物的粘度的胶凝剂，和缓冲物质，从而缓冲所述组合物。所述胶凝剂是交联的α‑葡聚糖微球。此外，所述组合物包含pH指示剂。所述组合物的pH比所述pH指示剂的pKa低或高至少0.1个pH单位。

Description

体液渗漏检测水性组合物
技术领域
本发明涉及一种体液渗漏检测组合物及其在结合胰腺手术例如部分胰腺切除术来检测胰液渗漏中的用途。
背景技术
胰腺癌是世界上与癌症有关的死亡的第四大主要原因，胰腺切除术是唯一的潜在治疗方法。这些操作每年在全球范围内执行数以万计。常见、严重且昂贵的并发症是胰液渗漏引起的术后胰瘘，是胰腺手术中最重要的未解决问题。胰液的渗漏不仅引起细菌感染的风险，而且还会由于胰液的自我消化作用而引起消化附近器官(如肠或血管)的风险，这可能导致严重的出血甚至死亡。
因此，胰液渗漏是胰腺切除术中最重要的发病问题。尽管已经研究了胰腺解剖和闭合的各种胰腺切除术技术以及术后管理技术，但是胰液渗漏的发生频率仍为30％至50％。由于术后胰瘘的每例病例都可能危及生命，因此早期检测至关重要。胰液渗漏的困难在于，渗漏从宏观上是无法察觉的，目前，外科医生无法看到在胰腺手术期间胰腺剩余部分是否渗漏以及在哪里渗漏。因此，现有的预防或关闭胰液渗漏的术中方法是不精确的，因为在临床上没有允许可视化胰液渗漏的可靠且可行的方法。
在部分胰腺切除术中，由于胰腺组织切割表面的胰导管系统的开口很小且几乎不可见，因此难以进行有靶向闭合，因此难以完全防止胰液渗漏。此外，胰腺组织非常柔软，因此渗漏的手术闭合术必须非常轻柔，以避免破裂。
腹膜内引流液中淀粉酶(一种糖酵解酶)浓度的测量目前被用作一种检测部分胰腺切除术后胰液渗漏的间接方法。然而，该技术是间接性的，并且不允许在胰腺手术期间直接检测和定位胰液渗漏。因此，期望提供一种能够在手术期间就能可视化和定位无色透明胰液的渗漏的技术。
EP 2857830以及Mori等人在《Gastroenterology》中的相关出版物(参见2015；149:第1334-1336页)公开了一种荧光探针，据称能够在手术期间或手术后快速检测和成像胰液渗漏的存在。尽管据称能够以高灵敏度提供快速检测和成像，但该探针仍然需要紫外光照射并使用遮光玻璃以成像渗漏。此外，最终导致渗漏可视化的化学反应要花几分钟才能可视化渗漏，从而显著干扰“外科手术进程”。此外，众所周知，荧光探针倾向于具有潜在的毒副作用，并且紫外线辐射会导致DNA损伤。因此，所提供的可视化方法相当复杂、低效且不安全，无法在医院实施。此外，所使用的剂型有点不精确，即确切的渗漏点可能难以定位。
CN105334209和CN105203541公开了一种胰液显影剂。胰液显影剂包含酸碱指示化合物，例如百里酚蓝和溴百里酚蓝。所述胰液显影剂以各种剂型提供，所述剂型选自洗剂、喷雾剂、试纸、指示纱布、棉花和棉签。类似于EP 2857830的荧光探针，这些胰液显影剂存在不精确的问题，即确切的渗漏点可能难以识别，并且一旦使用就需要去除剂型。
考虑到在胰腺组织上进行靶向治疗的困难，非常需要对确切的渗漏点进行快速而精确的定位。此外，期望提供一种可降解的可视化手段，其能够重复应用以重新检查充分的闭合并且在操作结束时不需要将其移除。此外，还期望提供用于在腹腔镜手术中检测胰液渗漏的可视化手段。
发明内容
因此，根据本发明的第一方面，本发明通过提供一种体液渗漏检测水性组合物来寻求减轻、缓解、消除或避免本领域中上述一个或更多个缺陷和单独地或任意组合的缺点，该组合物包含增加该组合物粘度的胶凝剂，和缓冲物质，从而该组合物被缓冲。胶凝剂是交联的α-葡聚糖微球。该组合物还包含pH指示剂。该组合物的pH比该pH指示剂的pKa低或高至少0.1个pH单位。
根据一个实施方案，该胶凝剂是交联的淀粉微球。因此，该组合物可包含5至25重量％的交联淀粉微球，优选10至20重量％的交联淀粉微球，更优选13至17重量％的交联淀粉微球。以交联剂：淀粉的重量比表示的交联度可以在12至20重量％的范围内，例如在13.5至18.5重量％，或15.0至17.0重量％的范围内。根据一个备选实施方案，该胶凝剂是交联的葡聚糖微球。
该pH指示剂的pKa可以在5至9的范围内；优选在6至8的范围内；更优选在6.5至7.5的范围内。因此，该pH指示剂可以是溴百里酚蓝，并且该组合物可以包含0.001至0.5重量％，例如0.005至0.25重量％或0.01至0.1重量％的溴百里酚蓝。此外，该组合物的pH可以在4至7之间；优选在5和6之间。存在于该组合物中以提供缓冲的组合物的缓冲物质可以以0.1至30mM，优选0.5至10mM，更优选1.0至5mM的量存在。
根据本发明的优选方面，该体液渗漏检测水性组合物是胰液渗漏检测水性组合物。这种胰液渗漏检测水性组合物的pH在4至6的范围内，pH该指示剂的pKa在6至8的范围内，优选在6.5至7.5的范围内。
根据本发明的另一个方面，提供了这样的一种胰液渗漏检测水性组合物，其用于结合胰腺外科手术例如部分胰腺切除术来检测胰液渗漏。
根据本发明的另一方面，提供了一种结合胰腺手术来检测胰液渗漏的方法。该方法包括：
-施用该胰液渗漏检测水性组合物；和
-通过该胰液渗漏检测水性组合物的颜色变化来检测和定位胰液在胰腺组织表面上的任何渗漏。
本发明的其他有利特征在从属权利要求中定义。另外，在本文公开的实施方案中阐述了本发明的有利特征。
具体实施方式
为了提供胰液渗漏检测手段，解决本领域中的需求，考虑了各种构思。发现基于粉末的手段，例如浸渍指示剂的交联淀粉微球，难以操作和施用。此外，所施加的粉末很容易被胰液冲掉，因此，如果有的话，提供了不精确的检测。此外，通过将干粉放在胶带上或用浸有指示剂的擦拭纸或纱布代替干粉以克服其缺点的尝试均未成功，无法提供精确的检测。
为了克服这些缺点并提供解决本领域需要的胰液渗漏检测手段，考虑使用流体而不是干燥的，固体的或固定的胰液渗漏检测手段。因此，提供了包含渗漏指示剂的体液渗漏检测水性组合物。
公认的是，使用pH指示剂作为渗漏指示剂可以快速响应由胰液渗漏引起的pH变化，只要该组合物的pH不同于该pH指示剂的pKa，从而pH的变化导致该pH指示剂改变颜色。胰液的pH值(约8.3至8.5)高于正常间隙液的pH值(约7.4)。通过使用合适的pH指示剂，例如溴百里酚蓝，可检测到胰液渗漏。此外，组合物的pH应不仅不同于pH指示剂的pKa。还可以看出，该组合物应包含缓冲物质以提供缓冲的组合物。缓冲液将允许改善阳性和阴性检测之间的对比度。
另外，为了提供具有提高的精度的体液渗漏检测水性组合物，需要提高该水性组合物的粘度。例如，使用溶解在水中的pH指示剂，例如通过喷雾，未提供任何精确的检测。然而，发现添加胶凝剂以期望的方式增加了粘度，以在阳性和阴性检测之间提供清晰的边界。增加组合物的粘度将减少以凝胶或半固体形式存在的组合物中的扩散。组合物中扩散的减少意味着由于渗漏的胰液导致组合物颜色变化(溴百里酚蓝在6.0至7.6的pH范围从黄色变为蓝色)引起的pH变化将更加局部化，因此精度得到了提高。因此，可以通过添加提高组合物粘度的胶凝剂来提高体液渗漏检测水性组合物的精度。
因此，根据一个实施方案，提供了一种体液渗漏检测水性组合物，其包含交联的α-葡聚糖微球形式的胶凝剂。该组合物还包含pH指示剂。为了提供响应于pH变化的可见颜色变化，该组合物的pH比pH指示剂的pKa低或高至少0.1个pH单位。
例如，对于pKa为7.0的溴百里酚蓝，该组合物的pH应为6.9或更低，或7.1或更高。为了提供更清晰的颜色变化，该组合物的pH可以比pH指示剂的pKa低或高至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0个pH单位。根据一个实施方案，该组合物的pH比pH指示剂的pKa低或高至少1.0个pH单位。
为了检测胰液的渗漏，该组合物的pH优选低于pH指示剂的pKa，因为间隙液的pH低于胰液的pH。因此，该组合物的pH可以比pH指示剂的pKa低至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0个pH单位。根据一个实施方案，该组合物的pH比pH指示剂的pKa低至少1.0个pH单位。
此外，发现该组合物必须包含缓冲物质，即该组合物应被缓冲。根据一个实施方案，该组合物因此被缓冲。缓冲物质可以以0.1至30mM，例如0.5至10mM或1.0至5mM的总量存在。浓度过高的缓冲物质可能导致无颜色变化或延迟的颜色变化。延迟的颜色变化不仅会延迟显示，还会降低精度。此外，浓度过低的缓冲物质可能导致渗漏检测不精确，甚至可能导致假阳性。
缓冲组合物提供了更稳健的体液渗漏检测水性组合物。另外，间隙液和胰液不仅pH不同，而且缓冲强度也不同。尽管间隙液不会显著改变缓冲组合物的pH值，但由于胰液中碳酸氢盐的浓度较高，因此具有较高缓冲强度的胰液也能够提高缓冲的体液渗漏检测水性组合物的pH，从而使体液渗漏检测水性组合物变色。胰液包含高浓度的碳酸氢盐，以便能够中和酸性胃酸。因此，缓冲体液渗漏检测水性组合物对于进一步提高组合物的精度可能是有利的。
如本领域技术人员所公认的，各种缓冲系统可用于提供缓冲的组合物。如已经概述的，缓冲的组合物可以具有4至7的pH，例如5至7、5至6或6至7。因此，该组合物可以包含磷酸缓冲盐水(PBS)。根据一个实施方案，该组合物被磷酸盐和/或柠檬酸盐缓冲。该组合物可以包含0.1至30mM的磷酸盐，例如0.5至10mM或1.0至5mM的磷酸盐。在本文中，磷酸盐浓度是指各种磷酸盐种类(例如HPO4 2-和H2PO4 -)的总浓度。
此外，缓冲物质可以基于选自由磷酸、柠檬酸、乙酸、乳酸、PIPES(哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸))、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)组成的组中的化合物或这些化合物中一种或几种的混合物。然而，优选的是，缓冲物质是基于内源性化合物，例如磷酸、柠檬酸、乙酸和/或乳酸。
取决于pH指示剂，本发明的组合物可用于检测各种体液的渗漏，例如弱碱性的类似于胰液的胆汁，或酸性的胃液。胆汁由胆囊分泌。因此，本发明的体液渗漏检测水性组合物还可用于检测胆汁的渗漏，例如创伤后或结合胆囊手术。尽管不限于此，pH指示剂的pKa可以在5至9的范围内；优选在6至8的范围内；更优选在6.5至7.5的范围。为了检测胰液的渗漏，发现pKa在6至8的范围内，优选在6.5至7.5的范围内是合适的。对于检测胆汁的渗漏，该范围也是优选的。根据一个实施方案，pH指示剂是溴百里酚蓝。溴百里酚蓝不仅具有适当的pKa，而且在低(黄色)和高(深蓝色)pH之间也表现出鲜明的颜色对比。此外，指示(深蓝色)与组织和血液之间的对比度也很明显。此外，pH指示剂可以是酚红(3-氨基-7-二甲基氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐)或中性红(也称为酚磺酞或3,3-双(对羟基苯基)-2,1-3H-苯并氧硫杂戊环1,1-二氧化物(3,3-Bis(p-hydroxyphenyl)-2,1-3H-benzoxathiole 1,1-dioxide))。
为了检测胃液渗漏，pH指示剂的pKa可以在4到6的范围内。如本领域技术人员所公认的，已知许多pH指示剂的pKa在此范围内，并因此具有相应的颜色变化。例如，可以提及pH指示剂溴甲酚绿(2,6-二溴-4-[7-(3,5-二溴-4-羟基-2-甲基-苯基)-9,9-二氧代-8-氧杂-9λ6-硫代双环[4.3.0]壬-1,3,5-三烯-7-基]-3-甲基-苯酚(2,6-Dibromo-4-[7-(3,5-dibromo-4-hydroxy-2-methyl-phenyl)-9,9-dioxo-8-oxa-9λ6-thiabicyclo[4.3.0]nona-1,3,5-trien-7-yl]-3-methyl-phenol))、甲基红(2-{[4-(二甲基氨基)苯基]二氮烯基}苯甲酸(2-{[4-(Dimethylamino)phenyl]diazenyl}benzoic acid))、甲基紫(CAS注册号：1340-02-9)。
如上所述，该组合物的pH应不同于pH指示剂的pKa。该组合物的pH可以在4至7之间，优选在5至6之间。发现弱酸性的pH有利于检测胰液的渗漏。
如已经讨论的，体液渗漏检测水性组合物包含交联的α-葡聚糖微球形式的胶凝剂，以增加组合物的粘度。具有增加的粘度的组合物具有改善的精度，即，当应用于例如胰腺切除术后的胰腺剩余部分时，颜色变化仅在靠近渗漏的位置出现。但是要注意，虽然增加组合物的粘度可以提高精度，但是也可以减慢颜色变化。虽然粘性更大的组合物可以提供更精确的渗漏定位，但是粘性太大的组合物可能缓慢地响应于渗漏而改变颜色。此外，太稀或太粘的组合物可能更难以施用。
优选该组合物是明显的剪切稀化和/或Bingham(假)塑性的。剪切稀化和/或Bingham(假)塑性的组合物一经施用将保持在原位，并且不会铺展。另外，鉴于其剪切稀化特性(参见“番茄酱效应”)，该组合物可以容易地通过例如注射器施用。
根据一个实施方案，该体液渗漏检测水性组合物包含5至25重量％，例如10至20重量％，13至17重量％或14至16重量％的胶凝剂。如下所述，交联的淀粉微球代表优选的胶凝剂。
不仅胶凝剂的浓度，而且盐的浓度，即离子强度，都影响组合物的粘度。增加溶液强度对粘度具有降低效果。浓度高于1M会对粘度产生重大影响。降低是由于基质中带电离子与大分子之间的离子配对引起的。由于盐溶效应(in-salting effect)，在较低浓度引入离子导致大分子(生物聚合物)之间的相互吸引作用降低。
根据一个实施方案，该体液渗漏检测水性组合物中的离子强度为50至500mM，例如100至250mM或125至175mM。如果胶凝剂是交联的淀粉微球，则离子强度优选在100至250mM的范围内，例如125-175mM。
发现胶凝剂优选是交联的多糖微球，例如交联的α-D-葡萄糖-聚合物(即α-葡聚糖)微球，例如交联的淀粉微球或交联的葡聚糖微球。交联的多糖微球，例如交联的淀粉微球提供了一种剪切稀化和/或Bingham(假)塑性的组合物。如已经概述的，剪切稀化和/或Bingham(假)塑性的组合物一经施用将保持在原位，并且不会铺展。另外，鉴于其剪切稀化特性(参见“番茄酱效应”)，该组合物可以容易地通过例如注射器施用
此外，通过使用交联的多糖微球例如交联淀粉微球作为胶凝剂，发现更容易建立体液渗漏检测水性组合物的组成以获得适合于体液渗漏检测的粘度。溶胀的微球改善了体液渗漏检测水性组合物的内部摩擦。这导致了体液渗漏检测水性组合物的稠度使得其变得更易于处理和施用。此外，在颜色指示在定位变得更加精确的意义上，它还促进了指示剂的作用。
此外，淀粉和交联的淀粉微球是可生物降解的。这意味着包含淀粉或交联的淀粉微球或相关胶凝剂的体液渗漏检测水性组合物，因为不需要除去胶凝而将在原位降解。然而，交联意味着交联的淀粉微球比天然淀粉降解得更慢。考虑到胰液中淀粉酶的高浓度，如果胶凝剂是未交联的淀粉，则胶凝剂的降解可能太快。
作为交联的淀粉微球的替代物，可以将交联的葡聚糖微球用作胶凝剂。葡聚糖与淀粉的主要区别在于它被α-1,3连接支化。由于葡聚糖显示高度分支的结构和糖苷键的不同分布，因此它不能被α-淀粉酶降解，或者只能被α-淀粉酶部分降解。因此，大多数肠胃外施用给人体的葡聚糖都经肾脏排泄，而不是被α-淀粉酶降解为葡萄糖。但是，人体中的某些细胞能够将葡聚糖降解为葡萄糖。
根据一个备选实施方案，胶凝剂是交联的葡聚糖微球。考虑到对α-淀粉酶降解的抵抗力，交联的葡聚糖微球可能比交联的淀粉微球提供更持久的渗漏检测。由于葡聚糖已经临床用于例如作为体积膨胀剂和肠胃外营养手段的静脉内溶液，有限的α-淀粉酶降解对于本发明的体液渗漏检测水性组合物中作为的胶凝剂的用途不被认为是不可接受的。对于某些应用，甚至可以优选使用交联的葡聚糖微球作为胶凝剂。
根据一个实施方案，胶凝剂是交联的淀粉微球。交联的淀粉微球由植物来源(例如土豆)的淀粉组成，所述淀粉被交联以提供微球。如本领域技术人员所公认的，淀粉是天然聚合物，其由两条聚合物链的混合物构成，是一种支链葡萄糖聚合物(具有α6分支的α-4-葡萄糖链)。它是在动植物中发现的天然物质，作为能量储备。该聚合物由直链淀粉(长链和低分支)和支链淀粉(高分支和短链)组成。这两种聚合物之间的比例根据来源而不同。如本领域中已知的，可降解的交联淀粉微球(DSM)通过乳化工艺形成，其中聚合物链被交联成球形。淀粉或改性淀粉的微粒已在现有技术中显示(例如D.R.Lu et al“Starch-basedcompletely biodegradable polymer materials”eXPRESS polymer Letters Vol.3No.6(2009)p.366-375；P.B.Malafaya et al.”Starch-based microspheres produced byemulsion crosslinking with a potential media dependent responsive behavior tobe used as drug delivery carriers”J.Mater.Sci:Mater Med(2006),17:371-377)。在本领域中，交联的淀粉微球众所周知形成可降解药物递送系统的一部分。交联淀粉微球中的淀粉可以是水解淀粉。水解度可用于调节所得交联淀粉微球的性质。
在使淀粉交联以提供交联的淀粉微球时，使用交联剂，例如表氯醇。根据一个实施方案，胶凝剂是已经通过使用表氯醇交联的交联淀粉微球。
交联的葡聚糖微球可以以相应的方式获得。
由于胰液中的淀粉酶水平明显高于体内的正常水平，因此淀粉基微球的降解时间也将分别缩短。
交联度影响对淀粉酶降解的抗性。较高的交联度提供较高的降解抗性。交联度应优选使得当暴露于待检测的体液时交联的淀粉微球保持完整至少5分钟，以便允许以足够的精度来检测任何渗漏。但是，太高的交联度会对性能产生负面影响，例如组合物的粘度和检测时间。
根据一个实施方案，以交联剂:淀粉的重量比表示的交联度应在12至20重量％的范围内，例如13.5至18.5重量％或15.0至17.0重量％。为了检测胰液，认为约25重量％的交联度是优选的。相同范围适用于交联的葡聚糖微球。
交联的淀粉微球在体内被血浆淀粉酶降解为寡糖，麦芽糖，最终降解为葡萄糖，进入正常代谢。
由于体液渗漏检测水性组合物在用作胰液渗漏检测水性组合物时将用于腹腔，因此胶凝剂应优选为可生物降解的。使用可生物降解的胶凝剂意味着在闭合腹腔之前不一定必须完全除去胶凝剂。特别是当用于腹腔镜手术时，胶凝剂是可生物降解的是有利的，甚至几乎是必需的。交联的淀粉微球代表了可生物降解的胶凝剂的优选实例。
交联的淀粉微球以及交联的葡聚糖微球可以以各种尺寸提供并且可以具有各种尺寸分布。以下提供的附图涉及在体液渗漏检测水性组合物中存在的处于溶胀状态的交联淀粉微球。相同范围适用于交联的葡聚糖微球。已经发现，交联的淀粉微球或交联的葡聚糖微球不应太小，以表现出明显的剪切稀化和/或Bingham(假)塑性特征。根据一个实施方案，根据ISO13320:2009使用激光衍射确定的基于体积的平均直径(D[4,3])因此为100至1000μm，例如250至750μm。此外，根据ISO 13320:2009确定的基于体积的中位直径D[v,0.5]通常将略低于基于体积的平均直径。此外，根据ISO 13320:2009确定的体积中位直径D[v,0.5]也可以在100至1000μm的范围内，例如在250至750μm的范围内，尽管低于基于体积的中位直径。此外，尺寸分布可以使得根据ISO 13320:2009确定的90％的颗粒具有小于300至2000μm的基于体积的直径(D[v,0.9])，例如小于500至1500μm。此外，尺寸分布可以使得按照ISO13320:2009确定的10％的颗粒具有小于50至600μm的基于体积的直径(D[v,0.1])，例如小于100至500μm，即90％的颗粒的直径至少为50至600μm，例如至少100至500μm。
根据一个实施方案，存在于体液渗漏检测水性组合物中的交联淀粉微球的尺寸分布使得：
-根据ISO 13320:2009使用激光衍射确定的基于体积的平均直径D[4,3]为100至1000μm，例如250至750μm；和/或
-根据ISO 13320:2009使用激光衍射确定的基于体积的直径D[v,0.9]为300至2000μm，例如500至1500μm；和/或
-根据ISO 13320:2009使用激光衍射确定的基于体积的直径D[v,0.1]为50至600μm，例如100至500μm。
体液渗漏检测水性组合物中胶凝剂的类型和量将影响组合物的粘度。根据一个实施方案，所述体液渗漏检测水性组合物包含：
-5至25重量％，例如10至20重量％，13至17重量％，或14至16重量％的胶凝剂，例如交联的淀粉微球；
-0.001-0.5重量％，例如0.005-0.25重量％或0.01-0.1重量％的pH指示剂，例如溴百里酚蓝；和
-至少75重量％，例如至少80重量％的水。
优选地，在这样的实施方案中，交联的淀粉微球的交联度为12至20重量％，例如13.5至18.5重量％，或15.0至17.0重量％。此外，缓冲液的浓度可以为0.1至30mM，例如0.5至10mM或1.0至5mM。该缓冲液可以是磷酸盐缓冲液。此外，体液渗漏检测水性组合物可以基于盐水。优选地，水性组合物包含磷酸缓冲盐水，以提供缓冲的等渗组合物。根据该实施方案，体液渗漏检测水性组合物的离子强度可以为100至200mM，优选为125至175mM。
上文提供的关于交联的淀粉微球的优选方面(交联，大小等)同样适用于交联的葡聚糖微球。因此，根据一个实施方案，根据ISO 13320:2009使用激光衍射测定的交联的葡聚糖微球的基于体积的平均直径(D[4,3])为100至1000μm，例如250至750μm。此外，根据ISO13320:2009确定的基于体积的中位直径D[v,0.5]通常将略低于基于体积的平均直径。此外，根据ISO 13320:2009确定的体积中位直径D[v,0.5]也可以在100至1000μm的范围内，例如在250至750μm的范围内，尽管低于基于体积的中位直径。此外，尺寸分布可以使得按照ISO 13320:2009确定的90％的颗粒具有小于300至2000μm的基于体积的直径(D[v,0.9])，例如小于500至1500μm。此外，尺寸分布可以使得按照ISO 13320:2009确定的10％的颗粒具有小于50至600μm的基于体积的直径(D[v,0.1])，例如小于100至500μm，即90％的颗粒的直径为至少50至600μm，例如至少100至500μm。此外，根据一个实施方案，以交联剂:葡聚糖的重量比表示的交联葡聚糖微球的交联度应在12至20重量％的范围内，例如13.5至18.5重量％，或15.0至17.0重量％。为了检测胰液，认为约25重量％的交联度是优选的。
根据一个实施方案，存在于体液渗漏检测水性组合物中的交联的葡聚糖微球的尺寸分布使得：
-根据ISO 13320:2009使用激光衍射确定的基于体积的平均直径D[4,3]为100至1000μm，例如250至750μm；和/或
-根据ISO 13320:2009使用激光衍射确定的基于体积的直径D[v,0.9]为300至2000μm，例如500至1500μm；和/或
根据ISO 13320:2009使用激光衍射确定的基于体积的直径D[v,0.1]为50至600μm，例如100至500μm。
pH指示剂应以足以提供有色组合物的量存在，至少在其pKa以上或以下。因此，pH指示剂的浓度可以为至少0.001重量％，例如至少0.005重量％或0.01重量％。此外，从安全角度来看，pH指示剂的浓度不应太高。因此，pH指示剂的浓度可以为0.5重量％或更低，例如0.25重量％或0.1重量％或更低。
为了提高体液渗漏检测水性组合物的保质期，它可以进一步包含防腐剂。防腐剂的实例是技术人员已知的，并且其中包括乳酸和苯甲酸。考虑到该组合物通常是弱酸性的，甚至可以省去添加防腐剂。
此外，该体液渗漏检测水性组合物可包含氯化钠(NaCl)以调节渗透压并提供等渗组合物。为了提供缓冲的等渗的体液渗漏检测水性组合物，可以使用磷酸缓冲盐水(PBS)来溶解胶凝剂。
根据一个优选的实施方案，该体液渗漏检测水性组合物是胰液渗漏检测水性组合物。这种胰液渗漏检测水性组合物的pH在4至6的范围内。此外，pH指示剂的pKa在6至8的范围内，例如在6.5至7.5的范围内。胰液渗漏检测水性组合物中的pH值指示剂可以选自由溴百里酚蓝、酚红和中性红组成的组。pH指示剂优选是溴百里酚蓝。
这样的胰液渗漏检测水性组合物可以结合胰腺手术例如部分胰腺切除术来检测胰液渗漏。因此，一个实施方案的确涉及用于结合胰腺手术例如部分胰腺切除术来检测胰液渗漏的胰液渗漏检测水性组合物。在这样的用途中，在胰腺手术期间将胰液渗漏检测水性组合物施用于胰腺。该胰液渗漏检测水性组合物可以通过注射器施用。优选地，将胰液渗漏检测水性组合物作为连续层施加在胰腺上。可以通过以迂回方式将来自注射器的线形组合物施加到胰腺上来提供连续层。施加的层的厚度应尽可能均匀。太厚的层可能会妨碍任何渗漏的可视化。
基于其性质，除非存在胰液渗漏，否则该组合物将保持其初始颜色(如果使用溴百里酚蓝则为黄色)。胰液的渗漏将局部升高组合物的pH，并导致局部颜色变化(如果使用溴百里酚蓝，则从蓝色变为蓝绿色)，不仅表示渗漏量，而且还定位了精确的渗漏点。因此，使外科医生意识到胰腺剩余部分的闭合或吻合是不充分的，并且在闭合腹腔之前需要进行额外的处理或必须改变围手术期管理，例如，引流放置、药物治疗或重症监护病房治疗。此外，还向外科医生提供有关组织表面上渗漏的精确定位的指导。后者是针对闭合治疗(例如额外的结扎)的重要指导。
本发明的另一个实施方案涉及一种结合胰腺手术来检测胰液渗漏的方法。在这种方法中，在胰腺手术期间，例如利用结扎治疗(如横向不可吸收的单针缝合线)或使用吻合器的远端胰腺切除术中的胰腺剩余部分的常规闭合后，将胰液渗漏检测水性组合物施用于胰腺。如已经解释的，通过施加在该表面上的胰液渗漏检测水性组合物的颜色变化，将检测到胰液渗漏并将其在组织表面上定位。所述方法可以包括阻止检测到的渗漏的进一步的步骤，例如通过靶向结扎治疗，例如通过不可吸收的单/x针缝合线或使用吻合器。当通过腹腔内注射将胰液渗漏检测水性组合物施用于组织表面时，其可用于开放式以及腹腔镜或机器人辅助手术中。
根据另一个实施方案，该体液渗漏检测水性组合物是胆汁渗漏检测水性组合物。这种胆汁渗漏检测水性组合物的pH在4至6的范围内。此外，pH指示剂的pKa在6至8的范围内，例如在6.5至7.5的范围内。胆汁渗漏检测水性组合物中的pH值指示剂可以选自由溴百里酚蓝、酚红和中性红组成的组，并且优选为pH指示剂溴百里酚蓝。
这种胆汁渗漏检测水性组合物可结合例如因良性或恶性疾病的部分肝脏切除、肝脏创伤或肝移植后的腹部手术用于检测胆汁渗漏。因此，一个实施方案确实涉及胆汁渗漏检测水性组合物，其结合横切肝表面、创伤性肝损伤或胆消化性吻合术用于检测胆汁渗漏。在这样的用途中，将胆汁渗漏检测水性组合物施用于组织表面，意指肝囊(livercapsula)、实质切开表面或胆消化道吻合术表面。基于其性质，除非存在胆汁渗漏，否则该组合物将保持其初始颜色(如果使用溴百里酚蓝则为黄色)。胆汁的渗漏将局部升高组合物的pH，并导致局部颜色变化(如果使用溴百里酚蓝，则从蓝色变为蓝绿色)，不仅表示胆汁渗漏，而且还定位了胆汁渗漏的确切位点。因此，使外科医生意识到肝脏剩余部分或胆消化道吻合术的闭合是不充分，并且在闭合腹腔之前需要进行额外的处理或必须改变围手术期管理，例如，引流放置、药物治疗或重症监护病房治疗。此外，还向外科医生提供有关胆汁渗漏的量和精确定位的指导。后者是有针对性地闭合渗漏的肝组织表面或胆汁消化性吻合术(例如结扎、吻合处理或生物或人工封闭贴片的应用)的重要指导。当通过腹腔内注射将胆汁渗漏检测水性组合物施用于组织表面时，它既可用于开放式也可用于腹腔镜或机器人辅助手术。无需进一步阐述，相信本领域技术人员可以使用前面的描述来最大程度地利用本发明。因此，前述优选的具体实施方案应被解释为仅是示例性的，而不以任何方式限制本公开。
尽管上面已经参考特定实施方案描述了本发明，但是本发明并不旨在限于这里阐述的特定形式。而是，本发明仅由所附权利要求限制，并且除了以上具体实施方案之外的其他实施方案(例如与上述不同的实施方案)也同样可能在这些所附权利要求的范围内。
在权利要求中，术语“包含/包括”不排除其他成分或步骤的存在。另外，尽管各个特征可以被包括在不同的权利要求或不同的实施方案中，但是这些特征可以被有利地组合，并且包含在不同的权利要求或实施方案中并不意味着特征的组合是不可行和/或不利的。
另外，单数引用不排除复数。术语“一”，“一个”，“第一”，“第二”等不排除多个。
附图说明
参考附图，从下面对本发明示例性实施方案的描述中，本发明能够实现的这些和其他方面、特征和优点将变得显而易见并得到阐明。
图1是在胰腺手术(远端胰腺切除术)期间拍摄的照片序列。图1a描绘了远端胰腺切除术后剩余胰腺的闭合部分。裸眼没有看到明显的渗漏。然而，如图1b所示，借助本发明的体液渗漏检测水性组合物，渗漏仍然可见(参见箭头)。图1c描绘了靶向闭合局部渗漏后的胰腺。最后，如图1d所示，本发明的体液渗漏检测水性组合物的重新施用证实了局部渗漏的靶向闭合(参见图1b)是成功的。
图2显示了直接在胰腺手术(D0)后直至D7(在检测到胰液渗漏后有和没有额外的缝合)的p-淀粉酶水平；和
图3显示了在胰腺手术之后和直到第7天(在检测到胰液渗漏后有和没有额外的缝合)不同动物组中的脂肪酶水平。
实验
以下实施例仅是实施例，决不应解释为限制本发明的范围。而是，本发明仅由所附权利要求限定。
材料
在所使用的三种不同类型(交联的大小和程度)的交联淀粉微球中，其中两种是在Magle AB(Kristianstad,Sweden)内部生产的，如下所述，第三种是从DavolInc.获得的。除非另有说明，否则用于制造交联的淀粉微球以及后续制备水凝胶的所有其他化学制品和试剂都是分析级并从VWR International AB获得。天然马铃薯淀粉从Lyckeby Starch(Kristianstad,Sweden)获得。
概述
简而言之，前两种类型的交联淀粉微球通过以下方式提供：
-水解天然淀粉以提供较短的聚合物链；
-还原末端醛基，以减少变色；
-形成包含球形淀粉小滴的乳液；
-使液滴中的淀粉交联以提供交联的淀粉微球；和
-洗涤交联的淀粉微球。
如本领域所公认的，所得交联淀粉微球的性质取决于许多因素，包括：
-水解度，即聚合物链的长度(受pH、反应时间和温度影响)；
-微球的尺寸(受乳化剂类型、聚合物链的长度和搅拌速度的影响)；和
-交联度(受表氯醇:淀粉的重量比影响)。
水解淀粉(HST)溶液的制备
在室温在搅拌下向第一反应器中加入纯净水。然后向第一反应器中加入浓盐酸。现在在搅拌下将天然马铃薯淀粉分份加入到稀释的酸中。升高夹套温度。将混合物在高温下搅拌直至达到所需的水解度。反应时间完成后，将夹套温度降至室温。通过控制氢氧化钠的加入将酸性反应混合物淬灭。内部温度不应超过在加入碱期间的反应温度。在室温下搅拌和受控条件下，向混合物中加入硼氢化钠。一旦硼氢化物完全溶解，就搅拌混合物以进行完全反应。
微球的制备
在受控条件下，向第二反应器中加入甲苯和Rhodafac PA17(乳化剂)，并在高温下搅拌直至Rhodafac完全溶解。现在在高搅拌速率下将包含水解的和还原的天然淀粉的第一反应器的内容物加入第二反应器中，直到获得稳定的悬浮液。根据要生产的微球的范围来调节搅拌速率，从而调节悬浮液的组成。在受控条件下向该悬浮液中加入表氯醇。加入的交联剂的量取决于要生产的微球的范围。反应在高温下保持过夜。加入乙醇，并将夹套温度降低到室温，粗产物沉淀。虹吸掉清澈的顶相。
精制(Work-up)
在搅拌下将乙醇加入到粗产物中。一旦均匀，然后让混合物沉淀。虹吸掉顶相。此顺序重复三次。
在搅拌下向产物混合物中加入纯净水。现在在搅拌下向该浆料中加入乙酸以使pH为4-5。加入乙醇。一旦均匀，使混合物沉淀，然后虹吸掉顶相。
向反应器中加入预制的乙醇水溶液(20重量％)，搅拌混合物。一旦均匀，使混合物沉淀，然后虹吸掉顶相。此顺序重复四次。
重复除沉淀以外的上述过程，但是，从底阀收集混合物并过滤。
将产物用无水乙醇冲洗并过滤。冲洗过程重复五次。
将该产品在60℃的不锈钢托盘中真空干燥，并通过400微米的筛子(第一类型)进行筛分，以提供尺寸范围(湿态；分散在纯净水中)为32至900μm的微球，或通过600微米的筛子(第二类型)以提供尺寸范围(湿态；分散在纯净水中)为50至1200μm的微球。
微球的类型
通过使用这种方法，制备了两种类型的交联淀粉微球。第一类型的基于体积的平均直径(D[4,3])为约450μm(湿态；分散在纯净水中)，交联度为约14％。生产的第二类型的基于体积的平均直径(D[4,3])为约620μm(湿态；分散在纯净水中)，交联度为约15％。
如前所述，第三类微球是Davol Inc.提供的这些微球的基于体积的平均直径(D[4,3])为约138μm(湿态；分散在纯净水中)，交联度为约11％。
提供胰液渗漏检测组合物
为了提供胰液渗漏检测组合物，将第一、第二或第三类的天然马铃薯淀粉(参见实施例21和22)，微球(15g)加入到含有溴百里酚蓝(0.2％w/w)的25ml乙醇溶液中。将所得混合物在室温搅拌30分钟，然后将混合物在60℃真空干燥过夜。
将干燥的产物——主干混合物(stem mixture)(15g)溶解在100ml的纯净水中或包含盐水和磷酸盐缓冲液的预制溶液中，并且任选地通过添加盐酸来酸化。搅拌混合物直到在室温下获得均匀的溶液，然后将均匀的干凝胶填充到注射器上。
使用该方案，获得了25种胰液渗漏检测组合物。下面列出了对该方案的修改和微球的类型以提供每个实施例。
实施例1：将包含第三类型的微球的主干混合物加入到100ml的纯净水中，并用盐酸(0.1M)酸化。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
实施例2：将包含第二类型的微球的主干混合物加入到100ml的纯净水中，而没有任何酸化。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
实施例3：将包含第三类型的微球的主干混合物加入到100ml纯净水中，并用5ml盐酸(0.1M)酸化。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
实施例4：将包含第二类型的微球的主干混合物加入到预制的溶液中，该溶液包含盐水83ml和pH 6.4的磷酸盐缓冲液1ml。使用0.1M盐酸将所得凝胶的pH调节至4.5。搅拌混合物直到获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
实施例5：将包含第二类型的微球的主干混合物(20.5g)加入到含有100ml盐水的预制溶液中。使用0.1M盐酸将溶液酸化。搅拌混合物直到获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
实施例6：将包含第二类型的微球的主干混合物(29.5g)加入到含有150ml盐水的预制溶液中。使用1M盐酸将溶液的pH调节至4.5。搅拌混合物直至获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
实施例7：将包含第二类型的微球的主干混合物加入到预制的溶液中，该溶液包含盐水85ml和pH 5.8的1M磷酸盐缓冲液1.13ml。使用1M盐酸将溶液的pH调节至4.6。搅拌混合物直至获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
实施例8：将包含第二类型的微球的主干混合物加入到预制的溶液中，该溶液包含盐水85ml和pH 5.8的1M磷酸盐缓冲液1.13ml。使用1M盐酸将溶液的pH调节至5.0。搅拌混合物直至获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
实施例9：将包含第二类型的微球的主干混合物加入到预制的溶液中，该溶液包含盐水85ml和pH 5.8的1M磷酸盐缓冲液1.13ml。使用1M盐酸将溶液的pH调节至4.3。搅拌混合物直至获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
实施例10：将包含第二类型的微球的主干混合物加入到预制的溶液中，该溶液包含盐水85ml和pH 5.8的1M磷酸盐缓冲液0.565ml。使用1M盐酸将溶液的pH调节至4.5。搅拌混合物直至获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
实施例11：将包含第二类型的微球的主干混合物加入到预制的溶液中，该溶液包含盐水85ml和pH 5.8的1M磷酸盐缓冲液0.565ml。使用1M盐酸将溶液的pH调节至4.8。搅拌混合物直至获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
实施例12：将包含第二类型的微球的主干混合物加入到预制的溶液中，该溶液包含盐水85ml和pH 5.8的1M磷酸盐缓冲液2.26ml。使用1M盐酸将溶液的pH调节至4.1。搅拌混合物直至获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
实施例13：将包含第二类型的微球的主干混合物加入到预制的溶液中，该溶液包含盐水85ml和pH 5.8的1M磷酸盐缓冲液2.26ml。使用1M盐酸将溶液的pH调节至4.7。搅拌混合物直至获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
实施例14：将包含第二类型的微球的主干混合物加入到预制的溶液中，该溶液包含盐水83ml和pH 5.8的1M磷酸盐缓冲液0.1ml。使用1M盐酸将凝胶的pH调节至5.8。搅拌混合物直到获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上，并在高压釜中灭菌。
实施例15：将包含第二类型的微球的主干混合物加入到预制的溶液中，该溶液包含盐水83ml和pH 5.8的1M磷酸盐缓冲液0.457ml。使用1M盐酸将凝胶的pH调节至4.7。搅拌混合物直到获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上，并在高压釜中灭菌。
实施例16：将包含第二类型的微球的主干混合物加入到预制的溶液中，该溶液包含盐水83ml和pH 5.8的1M磷酸盐缓冲液0.125ml。使用0.1M盐酸将凝胶的pH调节至4.5。搅拌混合物直到获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上，并在高压釜中进行蒸汽灭菌。
实施例17：将包含第二类型的微球的48g主干混合物加入到预制的溶液中，该溶液包含盐水230ml和pH 5.8的1M磷酸盐缓冲液0.345ml。使用1M盐酸将凝胶的pH调节至4.6。搅拌混合物直到获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
实施例18：将包含第二类型的微球的48g主干混合物加入到预制的溶液中，该溶液包含盐水230ml和pH 5.8的1M磷酸盐缓冲液0.345ml。使用1M盐酸将凝胶的pH调节至4.6。搅拌混合物直到获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上，并在高压釜中进行蒸汽灭菌。
实施例19：将包含第二种类型的微球的31g主干混合物(除了微球的尺寸范围(湿态；分散在纯净水中)为150至2000μm之外)加入到预制的溶液中，该溶液包含盐水140ml和pH 5.8的1M磷酸盐缓冲液0.21ml。使用1M盐酸将凝胶的pH调节至4.6。搅拌混合物直到获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
实施例20：将包含第二种类型的微球的28g主干混合物(除了微球的尺寸范围(湿态；分散在纯净水中)为150至1600μm之外)加入到预制的溶液中，该溶液包含盐水130ml和pH 5.8的1M磷酸盐缓冲液0.195ml。使用1M盐酸将凝胶的pH调节至4.5。搅拌混合物直到获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
实施例21：将包含天然马铃薯淀粉的10g主干混合物加入到预制的溶液中，该溶液包含盐水120ml、甘油4.4g和pH 5.8的1M磷酸盐缓冲液0.075ml。将该混合物加热至70℃并搅拌30分钟。使用0.1M盐酸将凝胶的pH调节至4.5。搅拌混合物直到获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
实施例22：将包含天然马铃薯淀粉的10g主干混合物加入到预制的溶液中，该溶液包含盐水120ml、甘油4.4g和pH 5.8的1M磷酸盐缓冲液0.05ml。将该混合物加热至70℃并搅拌30分钟。使用0.1M盐酸将凝胶的pH调节至4.5。搅拌混合物直到获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
实施例23：将包含第一类型的微球的主干混合物加入到预制的溶液中，该溶液包含盐水87ml和pH 5.8的1M磷酸盐缓冲液0.124ml。将该混合物加热至70℃并搅拌30分钟。使用0.1M盐酸将凝胶的pH调节至4.4。搅拌混合物直到获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
实施例24：将包含第一类型的微球的主干混合物加入到预制的溶液中，该溶液包含盐水87ml和pH 5.8的1M磷酸盐缓冲液0.124ml。将该混合物加热至70℃并搅拌30分钟。使用0.1M盐酸将凝胶的pH调节至4.4。搅拌混合物直到获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
实施例25：将包含第一类型的微球的主干混合物加入到预制的溶液中，该溶液包含盐水83ml和pH 5.8的1M磷酸盐缓冲液0.124ml。将该混合物加热至70℃并搅拌30分钟。使用0.1M盐酸将凝胶的pH调节至4.6。搅拌混合物直到获得均匀的浆料。然后将均匀的凝胶填充到注射器上。
体外评估
使用唾液润湿的滤纸、新鲜的猪胰腺组织和新鲜的人胰液在体外评估获得的体液渗漏检测水性组合物(即实施例1至25)。猪胰腺组织由地方屠宰场捐赠(Fleischversorgungszentrum Mannheim)，并在2℃的温度下保存，直到死后12小时内用于实验用途。在根据赫尔辛基宣言知情同意后(经海德堡大学伦理委员会批准；票数301/2001，159/2002)，从患者的新鲜手术样本中抽吸出人胰液。体外方法提供了高度受控的测试，且复杂性有限。因此，可以在a)使用的实用性、b)反应时间、c)清晰度和d)指示的准确性方面进行快速评估样品并即时反馈给开发人员，从而可以快速优化指示剂。
在体外测试中，可以得出一些结论：
-发现约12.5重量％的交联度(参见实施例3)太低而不能提供最佳性能，因为该组合物似乎相当快地降解。增加交联度至约16重量％(参见实施例2、11、14、16和17)，使该组合物对胰液的淀粉酶降解具有适当的抵抗力(即稳定至少5分钟)；
-组合物中微球的量影响组合物的粘度。结论是少于10重量％的微球(参见实施例21和22)提供的组合物过于液态化而不能提供最佳性能，而20重量％或以上的微球(参见实施例5)提供太稠的组合物而不能提供最佳性能。浓度为13至18重量％的微球(参见实施例1、2、6-20、23和24)提供的组合物易于处理并提供快速(即5分钟内)和精确的渗漏检测。
-优选保持pH指示剂的浓度尽可能低。但是，它应该足够高以提供清晰可见的渗漏检测。低于0.04重量％的BTB浓度(参见实施例1和2)提供了有些微弱的颜色，尽管仍然可见；和
-不被缓冲的组合物提供不太精确的渗漏检测。另外，具有高缓冲强度的组合物(参见实施例5-9、12和13)提供了较慢的检测，而1至10mM的缓冲强度(参见实施例10、11和14至24)提供了快速而精确的渗漏检测。
体内验证
基于体外评估，还在动物模型中评估了选择的体液渗漏检测水性组合物(即实施例1-25)。动物试验项目已由地方行政管理部门(Karlsruhe根据Deutsches TierSchG(德国动物法)§8Abs.1,参考号35-9835.81/G-184/16批准在接受胰腺手术的家猪(sus scrofa domestica)上进行指示剂开发和测试。手术是在如在人类中使用的全身麻醉下进行的。
在第一个概念验证实验(n＝10只动物)中，测试了初步体液渗漏检测水性组合物(实施例1-5)在最终胰腺手术中的技术适用性和性能(远端胰切除术，DP，请参见下文)。与体外实验平行地评估了以下特征：a)使用的实用性、b)反应时间、c)清晰度和d)指示的准确性，然后使用胰腺残余部分的术后组织学分析评估由指示剂引起的初始组织损伤。
第二个实验(n＝8只动物)由最初的远端胰腺切除术(参见下文)、随后的48小时的观察体液渗漏检测水性组合物的局部细胞毒性和全身性副作用(实施例5-25)和评估腹腔内病理的终末再手术并取回组织样本进行组织学分析组成。经过三臂研究(three-armedstudy)设计，将动物分为未检测到渗漏的指示剂阴性组，如果指示剂检测到渗漏，随机细分为无额外闭合的指示剂阳性组和有靶向额外闭合的指示剂阳性组。因此，可以研究敏感性和特异性以及术后胰瘘改良闭合的影响。在观察期间，通过临床评估辅以对血液和腹膜液样本的实验室分析，观察体液渗漏检测水性组合物的使用对生物体的短期影响。临床参数包括感染或术后胰瘘的体征，血液分析包括血液中炎症、贫血或胰腺炎的标志物以及腹膜液中的胰腺渗漏。
与第二个实验类似地进行第三个实验(n＝16只动物)，但是观察时间延长至8天，以使得可以评估体液渗漏检测水性组合物的使用对生物体的中长期影响。基于临床知识，已知在这段时间内几乎所有的术后胰瘘都在临床上显而易见。相反，如果在手术后一周没有并发症发生，可以看作是出院的平均时间点，这设置了临床治疗的主要时间窗。
远端胰腺切除术(DP)
通过正中剖腹术打开腹腔，并打开网膜囊暴露胰腺。一旦暴露，就通过手术从周围的腹膜组织中释放出胰腺的最后2-3厘米(猪脾叶)，并用手术刀切除胰腺的远端2厘米。用单针/x针不可吸收缝线阻止出血(每只动物最多3根)。用横向不可吸收的单针缝合线(1x/cm表面)闭合残余胰腺。之后，将闭合的胰腺残余部分冲洗并用盐水清洗。
冲洗后，将根据上述的体液渗漏检测水性组合物施用于胰腺残余部分的整个表面。当施用时，该组合物显示为黄色，但是如果由于在某些局部的闭合不充分而导致胰液漏出，则该组合物将局部变为蓝绿色。该指示剂反应立即发生，即在几秒钟内。在给定组合物的粘度的情况下，颜色变化仅在渗漏的附近出现。
如果发生胰液渗漏，可以在可见的渗漏部位使用不可吸收的单针/x针缝线对残余部分进行精细的缝合。此后，可以通过无限制地重复施加组合物来控制闭合。最终，用纱布和盐水冲洗除去组合物凝胶。胰腺残余部分旁放置腹部硅胶引流管，用于术后排空和液体分析；闭合腹壁。
毒理学和细胞毒性
通过分析48小时内降解产物的体内药代动力学来评估PAN毒理学。另外，评估了在几分钟内由指示剂引起的急性局部组织损伤，以及在8天之内的宏观腹部内副作用和装置的局部组织学。最后，分析了其降解产物对胰腺靶细胞的细胞毒性。
为了对PAN指示剂进行毒理学评估，进行了水凝胶药代动力学研究，以测量该装置在体液成分中降解产物随时间的浓度，从而在胰腺手术中腹部应用。采样门静脉血和术中位置或术后引流的腹膜液。与指示剂施用有关的采样时间点是：0分钟(指示剂施用之前的基线)、1、5、30、60和120分钟、术后第一天和第二天。由于其具有水和可降解成分的淀粉微球的组成，因此仅需要评估其他成分溴百里酚蓝(BTB)。在胰腺手术现场施用后，应评估BTB是否以及有多少BTB残留在生物体内，被重新吸收至门静脉循环并通过肝脏代谢达到中心静脉循环。因此，如上所述，随着时间的推移，在不同的身体隔室中收集身体的样本。由于预期要测量的BTB量极小，因此使用了非常灵敏的检测方法高压液相色谱-质谱(HPLC-MS)。
在所有猪中，施用指示剂后，引流液中BTB浓度立即而强烈地增加，随后逐渐下降，在术后第1天可检测到少量的BTB(<20ng/ml)，直到术后第2天在任何一种猪的引流液中未检测到残留的BTB。在施用后5分钟和30分钟仅在一头猪的门静脉血中发现了少量的BTB。在其余的猪和时间点，未检测到BTB(表1)。
表1-分别在引流液和门静脉血中的BTB浓度
为了检查由指示剂引起的胰腺的局部组织病理学短期变化，从六头猪中总共收集了24个新鲜的胰腺组织标本用于组织病理学评估。从每头猪收集四个相等大小(2cm)的横向切片，并用PAN或盐水(对照)处理5或10分钟。5或10分钟后，冲洗指示剂，并立即固定胰腺组织，并置于石蜡块中进行组织学评估。
组织学显示无明显的局部损害、胰腺炎或细胞毒性。在治疗组和对照组之间未观察到急性胰腺损伤的组织病理学评分差异。
在细胞培养试验中进一步评估了PAN的细胞毒性。在与增加量的BTB温育后，通过荧光光度法测定从刃天青代谢的resofurin，评估了活细胞的代谢活性。PAN指示剂水凝胶含有几乎0.5mg/ml的BTB。因此，分别测试了浓度为0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml和5.5mg/ml的BTB溶液。细胞毒性定义为细胞活力小于70％。对于0.5-1.5mg/ml的BTB，未观察到细胞毒性。5.5mg/ml的BTB表现出轻微的毒性。
比较：指示剂(+)/额外缝合、指示剂(+)/无额外缝合和指示剂(-)
通过研究引流液中的p-淀粉酶和p-脂肪酶水平，评估了基于指示剂的胰腺剩余部分的靶向闭合对降低胰瘘率的影响。
在活猪上进行远端胰腺切除术后对指示剂进行测试。根据指示剂反应将猪分为研究组，该指示剂反应将标准闭合的胰腺残余部分外的渗漏可视为“指示剂阴性/阳性”。在“阳性”指示剂反应的情况下，将动物随机分组为接受基于指示剂的靶向闭合(“额外缝合”)的动物或未接受可视化渗漏的任何额外闭合的动物。随机化通过投掷硬币进行。
第1组：指示剂阳性，无额外缝合；
第2组：指示剂阳性，额外缝合；和
第3组：指示剂阴性
为了评估靶向闭合的效果，在第0-8天测量了血清和引流物中的α-淀粉酶和脂肪酶(参见图2和3中显示的结果)。术后腹腔/腹水中胰酶的浓度升高代表可导致术后胰瘘的胰分泌物的生化渗漏的发生和强度。第0天的值表示基线情况，而后续值表示术后病程。根据国际定义，从手术后第三天开始，酶水平必须降至机构正常血清上限的3倍以下，以排除存在生化渗漏。如果临床表现加重了现有的生化渗漏，则可以根据定义诊断为术后胰瘘。
手术后，各治疗组之间腹腔引流液中胰酶的浓度差异显著。与治疗组3(指示剂阴性)相比，治疗组1(指示剂阳性，无额外治疗)的淀粉酶水平有较大升高(图2)。在随后的第5天至第7天，尽管逐渐降低，但仍保持升高趋势。有趣的是，第1组的浓度水平变化(指示剂阳性，无额外治疗)较高，第1天的标准差>10000U/l，第2天，第3天，第5天和第7天的标准差>5000U/l。第2组(指示剂阳性，额外缝合)的变化，尤其是第3组(指示剂阴性)的变化小得多，标准差始终分别<3500U/l和<1500U/l。
与治疗组1(指示剂阳性，无额外治疗)相比，治疗组2(指示剂阳性，额外缝合)的靶向闭合可明确降低引流液酶水平。引流酶水平的降低是如此显著，以致于如果将第2组(指示剂阳性，额外治疗)和第3组(指示剂阴性)进行比较，则不再有显著差异(术后所有天均p>0.05)。
从第0-7天开始分析引流液脂肪酶值。除淀粉酶外，脂肪酶已被证明是胰腺渗漏的早期指标。正如预期的那样，引流液脂肪酶的水平与引流液淀粉酶的水平平行发展(参见图2)，与胰腺渗漏相关。根据淀粉酶水平的结果，与第3组(阴性)相比，第1治疗组(阳性，无额外治疗)的引流液中脂肪酶水平高得多，而第2组(阳性，额外缝合)则减少。
结论
开发了一种新颖的体外体液渗漏检测水性组合物。对体液渗漏检测水性组合物进行评估并在体内进行调整，以最终作为快速反应的体液渗漏检测水性组合物容易地应用于胰腺残余部分或吻合组织。概念验证表明，该组合物可以在远端胰腺切除术的猪模型的切除切缘上准确、快速地可视化胰腺渗漏。
该组合物对胰腺渗漏的灵敏性和特异性均为100％。视觉分辨率小于一个液滴(直径<500μm)。因此，通过无限制地指示剂重复应用进行精细的靶向渗漏闭合和随后的密封性控制成为可能。
在中期到长期的观察性猪研究中，该组合物没有明显损害生物体。重要的是，没有发生全身性副作用。如在组织学上所证实的，在胰腺处，该组合物没有导致显著的胰腺炎、出血或细胞毒性。在所有情况下，通过阳性指示剂反应可视化的检测的胰腺渗漏均可导致术后胰瘘，这不仅通过手术后第一天腹膜液中胰酶浓度的升高得到证实，而且还伴有特定的医疗症状，例如延迟的胃排空或腹腔内脓肿。相反，靶向渗漏闭合可以显著降低术后胰瘘率，正如腹膜液中胰酶水平的大幅降低以及随后动物的快速康复所看到的。
这种体液渗漏检测水性组合物可在没有相关副作用或毒性的情况下容易、快速地可视化实验性胰腺手术中的胰腺渗漏，并可以在手术中直接量化和精确定位胰腺渗漏。可视化使得可以进行适当的围手术期管理，并靶向闭合渗漏，从而显著减少术后胰瘘的发生。
此外，已经证实体液渗漏检测水性组合物是安全的，即其与任何显著的细胞毒性作用无关。此外，已证实该凝胶可有助于降低胰腺手术后的术后风险。

Claims (31)

1.体液渗漏检测水性组合物，所述组合物包含增加所述组合物的粘度的胶凝剂，其中所述胶凝剂是交联的α-葡聚糖微球，和缓冲物质，所述组合物由此被缓冲，其中所述组合物还包含pH指示剂，并且其中所述组合物的pH比所述pH指示剂的pKa低或高至少0.1个pH单位；
其中所述胶凝剂是交联的淀粉微球或交联的葡聚糖微球；
其中所述组合物包含10至20重量％的交联的淀粉微球或交联的葡聚糖微球；
其中以交联剂:淀粉的重量比或以交联剂:葡聚糖的重量比表示的交联度在13.5至18.5重量％的范围内；和
其中所述缓冲物质以0.5至10mM的量存在。
2.根据权利要求1所述的体液渗漏检测水性组合物，其中所述组合物包含13至17重量％的交联的淀粉微球或交联的葡聚糖微球。
3.根据权利要求1所述的体液渗漏检测水性组合物，其中以交联剂:淀粉的重量比或以交联剂:葡聚糖的重量比表示的交联度在15.0至17.0重量％的范围内。
4.根据权利要求1所述的体液渗漏检测水性组合物，其中所述交联的淀粉微球或交联的葡聚糖微球通过表氯醇交联。
5.根据权利要求1所述的体液渗漏检测水性组合物，其中根据ISO 13320:2009使用激光衍射确定的所述组合物中的交联的淀粉微球或交联的葡聚糖微球的基于体积的平均直径D[4,3]为100至1000μm。
6.根据权利要求5所述的体液渗漏检测水性组合物，其中根据ISO 13320:2009使用激光衍射确定的所述组合物中的交联的淀粉微球或交联的葡聚糖微球的基于体积的平均直径D[4,3]为250至750μm。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的体液渗漏检测水性组合物，其中所述组合物的pH比所述pH指示剂的pKa低或高至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0个pH单位。
8.根据权利要求7所述的体液渗漏检测水性组合物，其中所述组合物的pH比所述pH指示剂的pKa低至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0个pH单位。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的体液渗漏检测水性组合物，其中所述pH指示剂的pKa在5至9的范围内。
10.根据权利要求9所述的体液渗漏检测水性组合物，其中所述pH指示剂的pKa在6至8的范围内。
11.根据权利要求10所述的体液渗漏检测水性组合物，其中所述pH指示剂的pKa在6.5至7.5的范围内。
12.根据权利要求9所述的体液渗漏检测水性组合物，其中所述pH指示剂是溴百里酚蓝。
13.根据权利要求12所述的体液渗漏检测水性组合物，其中所述组合物包含0.001至0.5重量％的溴百里酚蓝。
14.根据权利要求13所述的体液渗漏检测水性组合物，其中所述组合物包含0.005至0.25重量％或0.01至0.1重量％的溴百里酚蓝。
15.根据权利要求1至6中任一项所述的体液渗漏检测水性组合物，其中所述组合物的pH在4至7之间。
16.根据权利要求15所述的体液渗漏检测水性组合物，其中所述组合物的pH在5到6之间。
17.根据权利要求1至6中任一项所述的体液渗漏检测水性组合物，其中所述缓冲物质以1.0至5mM的量存在。
18.根据权利要求1所述的体液渗漏检测水性组合物，其中所述组合物是磷酸盐缓冲的。
19.根据权利要求1至6中任一项所述的体液渗漏检测水性组合物，其中所述组合物包含：
-10至20重量％的胶凝剂，所述胶凝剂是交联的淀粉微球；
-0.001至0.5重量％的pH指示剂；
-至少75重量％的水；和
-磷酸缓冲盐水；其中：
-交联的淀粉微球的交联度为13.5至18.5重量％；和
-缓冲液浓度为0.5至10mM。
20.根据权利要求19所述的体液渗漏检测水性组合物，其中所述组合物包含13至17重量％或14至16重量％的胶凝剂。
21.根据权利要求19所述的体液渗漏检测水性组合物，其中所述组合物包含0.005至0.25重量％或0.01至0.1重量％的pH指示剂。
22.根据权利要求19所述的体液渗漏检测水性组合物，其中所述pH指示剂是溴百里酚蓝。
23.根据权利要求19所述的体液渗漏检测水性组合物，其中交联的淀粉微球的交联度为15.0至17.0重量％。
24.根据权利要求19所述的体液渗漏检测水性组合物，其中所述缓冲液浓度为1.0至5mM。
25.根据权利要求1至6中任一项所述的体液渗漏检测水性组合物，其中所述水性组合物还包含：
-防腐剂；和/或
-盐水。
26.根据权利要求1至6中任一项所述的体液渗漏检测水性组合物，其中，所述组合物为胰液渗漏检测水性组合物，且所述组合物的pH在4至6的范围内；其中所述pH指示剂的pKa在6至8的范围内。
27.根据权利要求26所述的体液渗漏检测水性组合物，其中，所述pH指示剂的pKa在6.5至7.5的范围内。
28.根据权利要求26所述的体液渗漏检测水性组合物，其中，所述pH指示剂选自由溴百里酚蓝、酚红、花色素苷和中性红组成的组。
29.根据权利要求26所述的体液渗漏检测水性组合物在制备用于结合胰腺手术来检测胰液渗漏的药物或试剂盒中的用途。
30.根据权利要求26所述的体液渗漏检测水性组合物在制备用于结合部分胰腺切除术来检测胰液渗漏的药物或试剂盒中的用途。
31.权利要求26所述的体液渗漏检测水性组合物在制备用于结合胰腺手术检测胰液渗漏的药物或试剂盒中的用途，其中
通过所述胰液渗漏检测水性组合物的颜色变化来检测和定位胰液在胰腺组织表面上的任何渗漏。
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