CN111565732A - 复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟促进剂、上皮疾病治疗剂以及复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟促进方法 - Google Patents

Abstract

本发明的问题在于提供一种针对干眼症等与复层扁平上皮细胞相关的疾病有效的新的治疗剂。本发明是一种包含间充质干细胞的分泌物的复层扁平上皮细胞的正常分化‑成熟促进剂。优选地，上述分泌物不含动物血清，上述间充质干细胞为来源于脂肪的间充质干细胞、来源于脐带的间充质干细胞或来源于骨髓的间充质干细胞，上述复层扁平上皮细胞为选自由角膜上皮细胞、结膜上皮细胞、表皮角化细胞、口腔上皮细胞、会厌上皮细胞、食道上皮细胞、阴道上皮细胞、声带皱襞上皮细胞、鼻腔上皮细胞以及鼻前庭上皮细胞组成的群组中的至少一种。

Description

复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟促进剂、上皮疾病治疗剂 以及复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟促进方法

技术领域

本发明涉及复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟促进剂、上皮疾病治疗剂以及复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟促进方法。

背景技术

为了保护眼睛免受外界的感染源感染，眼睛表面起到重要的作用。作为上述眼睛表面的主要疾病的干眼症是泪液以及角膜上皮、结膜上皮的慢性疾病，由于泪液的质或量的异常而引起，造成眼睛不适、视觉功能异常。在这样的干眼症中，在干燥综合征等重症干眼症中，还存在带来生活质量(QOL)的显著降低、以至失明的情况。此外，日本的干燥综合征患者数为7万人，但如果将潜在患者也包括在内，据说有20万人以上。

作为以往的干眼症的治疗方法，已知有使用人工泪液的滴眼剂、在眼镜的两侧装配面板来防止眼泪蒸发的保湿辅助(Moisture Aid)的方法、通过将作为眼泪的排出口的泪点封闭而将泪液保持在结膜囊内的泪点封闭法、通过透明质酸滴眼来进行保水的方法、通过药剂促进粘蛋白以及水分泌的方法等，但这些方法都不是能够令人满意的状况。

另一方面，作为细胞、细胞的培养上清液的医药品的开发也正在广泛进行。例如，间充质干细胞是由弗里登斯坦(Friedenstein)首次从骨髓中分离的具有多向分化能力的前体细胞(参照非专利文献1)。已明确该间充质干细胞存在于骨髓、脐带、脂肪等各种组织中，并且具有各种组织的修复、免疫抑制效果，间充质干细胞移植作为针对各种顽固性疾病的新的治疗方法而受到期待(参照专利文献1以及专利文献2)。另外，还已知有将包含间充质干细胞的培养上清液的医药组合物用于修复靶组织的损伤部的方法(参照专利文献3以及专利文献4)、将包含间充质干细胞的培养上清液的医药组合物用于治疗由疾病或损伤引起的继发性肌肉纤维化等的方法(参照专利文献5)等。

在非专利文献2中，报告了如下内容：在通过苯扎氯铵的滴眼而诱发了干眼症的大鼠模型中，通过以间充质干细胞本身滴眼，能够改善泪液的稳定性。并记载了在该模型中，所滴眼的间充质干细胞浸润于睑板腺、结膜上皮中，从而有助于改善泪液的稳定性。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2012-157263号公报

专利文献2：日本特表2012-508733号公报

专利文献3：国际公开2011/118795号

专利文献4：日本特表2010-540662号公报

专利文献5：日本特表2007-528703号公报

非专利文献

非专利文献1：PittengerF.M.et.al.,Science,1999,284,pp.143-147

非专利文献2：BeyazyildizE.et.al.StemCellsInt.2014；vol.2014:250230

发明内容

发明所要解决的问题

在这样的情况下，要求一种针对干眼症等与复层扁平上皮细胞相关的疾病而具有比以往更高的效果的治疗剂、特别是基于新的作用机理的治疗剂。因此，本发明的问题在于提供一种针对干眼症等与复层扁平上皮细胞相关的疾病而有效的新的治疗剂。

用于解决问题的手段

本发明的发明人为了解决上述问题而进行了各种研究的结果是，发现通过将间充质干细胞的分泌物添加到角膜上皮细胞中，能够促进正常分化-成熟、细胞间的紧密连接的形成从而提高屏障功能，进而完成了本发明。本发明的要点如下所述。

[1]一种复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟促进剂，其中，所述正常分化-成熟促进剂包含间充质干细胞的分泌物。

[2]根据[1]所述的正常分化-成熟促进剂，其中，所述分泌物不含动物血清。

[3]根据[1]或[2]所述的正常分化-成熟促进剂，其中，所述间充质干细胞为来源于脂肪的间充质干细胞、来源于脐带的间充质干细胞或来源于骨髓的间充质干细胞。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的正常分化-成熟促进剂，其中，所述复层扁平上皮细胞为选自由角膜上皮细胞、结膜上皮细胞、表皮角化细胞、口腔上皮细胞、会厌上皮细胞、食道上皮细胞、阴道上皮细胞、声带皱襞上皮细胞、鼻腔上皮细胞以及鼻前庭上皮细胞组成的群组中的至少一种。

[5]一种上皮疾病治疗剂，其中，所述上皮疾病治疗剂包含[1]-[4]中任一项所述的正常分化-成熟促进剂。

[6]根据[5]所述的上皮疾病治疗剂，其中，所述上皮疾病是与具有复层扁平上皮细胞的组织相关的疾病。

[7]根据[6]所述的上皮疾病治疗剂，其中，所述上皮疾病为角膜疾病、结膜疾病、口腔疾病或表皮疾病。

[8]根据[7]所述的上皮疾病治疗剂，其中，所述上皮疾病为干眼症、翼状胬肉、瘢痕、EB病毒性角膜炎、角膜上皮干细胞衰竭症、干燥综合征或硬皮病。

[9]一种复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟促进方法，其特征在于，所述正常分化-成熟促进方法使用间充质干细胞的分泌物。

发明效果

根据本发明，通过将包含间充质干细胞的分泌物的正常分化-成熟促进剂添加到作为复层扁平上皮细胞的角膜上皮细胞等中，能够促进正常的分化-成熟、细胞间的紧密连接(Tight Junction)的形成从而提高屏障功能。包含该正常分化-成熟促进剂的治疗剂对于具有复层扁平上皮细胞的组织、例如眼睛的干眼症等上皮疾病是有效的。

附图说明

图1是表示间充质干细胞的分泌物(MSC-CM)针对角膜上皮细胞的屏障功能增强效果的图。

图2是表示间充质干细胞的分泌物(MSC-CM)针对角膜上皮细胞的屏障功能增强效果的图。

图3是表示确认间充质干细胞的分泌物(MSC-CM)针对屏障功能降低的角膜上皮细胞的效果的试验方案的图。

图4是表示间充质干细胞的分泌物(MSC-CM)针对屏障功能降低的角膜上皮细胞的效果的图。

图5是表示由间充质干细胞的分泌物(MSC-CM)处理引起的角膜上皮细胞的各种基因表达的变化的图。

图6是以免疫组织化学的方式表示通过间充质干细胞的分泌物(MSC-CM)处理后的角膜上皮细胞中的Claudin-1以及KRT12表达的图。

图7是以免疫组织化学的方式表示通过间充质干细胞的分泌物(MSC-CM)处理后的角膜上皮细胞中的Claudin-1以及KRT12表达的图。

图8是表示由间充质干细胞的分泌物(MSC-CM)处理产生的角膜上皮细胞的正常分化-成熟促进以及紧密连接形成促进效果的图。(扫描型电子显微镜照片)

图9是表示间充质干细胞的分泌物(MSC-CM)针对干眼症模型动物的治疗效果的图。

具体实施方式

以下对本发明进行详细说明。

<复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟促进剂>

本发明的复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟促进剂包含间充质干细胞的分泌物。根据本发明的正常分化-成熟促进剂，能够促进角膜上皮细胞等复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟，并且还能够促进细胞间的紧密连接的形成从而提高组织的屏障功能。

[关于复层扁平上皮细胞]

上皮组织根据排列的细胞的形状而分为扁平、立方、圆柱的各上皮细胞组，根据这些细胞是一层还是上下大量地堆叠而分为单层和复层。例如，覆盖血管、淋巴管的内腔的上皮属于单层扁平上皮，覆盖肠内腔的肠上皮为单层圆柱上皮的例子。本发明的正常分化-成熟促进剂起到分化-成熟诱导效果的复层扁平上皮为覆盖眼睛、皮肤等的表面的上皮，已知耐摩擦等机械刺激。

本发明中的复层扁平上皮细胞是除了上述眼睛、皮肤之外，口腔、会厌(咽后部)、食道、阴道、声带皱襞、鼻前庭、鼻腔等的上皮组织所具有的细胞，具体而言，可列举为角膜上皮细胞、结膜上皮细胞、表皮角化细胞、口腔上皮细胞、会厌上皮细胞、食道上皮细胞、阴道上皮细胞、声带皱襞上皮细胞、鼻腔上皮细胞、鼻前庭上皮细胞等。其中，从由间充质干细胞的分泌物产生的正常分化-成熟促进效果、细胞间的紧密连接的形成效果显著的观点出发，优选为角膜上皮细胞、结膜上皮细胞、口腔上皮细胞、表皮角化细胞。

本发明的正常分化-成熟促进剂中的“正常分化-成熟”是指复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟。当复层扁平上皮细胞正常分化时，在形态上形成扁平且尺寸较大的细胞，从而促进细胞间的紧密连接的形成。另外，从基因表达的方面出发，当复层扁平上皮细胞正常分化时，KRT12、KRT13、KRT14、CLDN1、TJP1、CDH1等的表达上升。即，本发明的复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟促进剂能够使复层扁平上皮细胞正常分化并诱导表达各种蛋白，能够促进细胞间的紧密连接的形成，从而最终形成屏障功能优异的组织。此外，将复层扁平上皮细胞正常分化并最终形成具有功能的成熟细胞、即到达分化的最终阶段称为成熟。这样来说正常分化和成熟是具有关联的现象，因此本发明的正常分化-成熟促进剂也可以称为正常分化促进剂。

以下，对本发明的复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟促进剂所包含的各成分进行说明。本发明的复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟促进剂，在作为必须成分的间充质干细胞的分泌物的基础上，还可以在不损害本发明的效果的范围内含有其他成分。

[间充质干细胞的分泌物]

(间充质干细胞)

在本发明中，间充质干细胞是指具有向骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等属于间充质系的细胞中的任一种的分化能力、且能够在维持该分化能力的状态下进行增殖的细胞。例如可列举为来源于脂肪、脐带、骨髓、血液、骨膜、真皮、胎盘、羊膜、绒毛膜、脱落膜、肌肉、子宫内膜、真皮、牙小囊、牙根膜、牙髓、牙胚等的间充质干细胞，优选为来源于脂肪、来源于脐带、来源于骨髓的间充质干细胞，更优选为来源于脂肪、来源于脐带的间充质干细胞，进一步优选为来源于脂肪的间充质干细胞。在此，“来源于”是指上述细胞是从作为供给源的组织获得的、生长或在体外(in vitro)操作的细胞。此外，本发明中的间充质干细胞是上述间充质干细胞的集合体，可以包含具有互不相同的特性的多种间充质干细胞，也可以是实质上均一的间充质干细胞的集合体。可以是从供体的组织中分离出的原代细胞，也可以是株化后的细胞。

本发明中的间充质干细胞可以是来源于与被包含间充质干细胞的分泌物的正常分化-成熟促进剂处置的对象(受试体)同种的细胞，也可以是来源于异种的细胞。作为本发明中的间充质干细胞的种类，可列举为人、马、牛、绵羊、猪、狗、猫、兔、小鼠、大鼠，优选为来源于与被处置的对象(受试体)同种的细胞。本发明中的间充质干细胞可以来源于被处置的对象(受试体)，即自体细胞(同种同系)，也可以来源于同种的其他对象，即异体细胞(同种异系)。优选为异体细胞(同种异系)。

间充质干细胞对于同种异系的受试体也不易产生排斥反应，因此认为关于其分泌物也不易产生排斥反应。因此，能够将预先制备的供体的细胞进行扩大培养并冷冻保存，并根据需要进行解冻而用于分泌物的制备。由于不需要制备自体的间充质干细胞来使用，因此从还易于商品化、且易于稳定地获得一定效果的观点出发，本发明中的间充质干细胞更优选为同种异系。

在本发明中，间充质干细胞是指包含间充质干细胞的任意的细胞集团。该细胞集团的至少20％以上、优选为30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、96％、97％、98％或99％为间充质干细胞。

在本发明中，脂肪(组织)是指含有包含脂肪细胞以及微小血管细胞等的间充质干细胞的组织，例如，是对哺乳动物的皮下脂肪进行外科切除或吸引而得到的组织。脂肪组织可以从皮下脂肪获得。考虑到向人给药，更优选为人的皮下脂肪。皮下脂肪的供给个体可以是生存的也可以死亡的，但在本发明中使用的脂肪组织优选为从生存个体采集的组织。在从个体采集的情况下，吸脂例如可举例示出为PAL(动力辅助)吸脂、Erchonia激光吸脂或Body-Jet吸脂等，从维持细胞的状态的观点出发，优选不使用超声波。

在本发明中，脐带是指连接胎儿和胎盘的白色管状的组织，由脐静脉、脐动脉、胶状组织(华尔通氏胶；Wharton’s Jelly)、脐带基质本身等构成，包含大量的间充质干细胞。脐带优选从与受试体(给药对象)同种的动物获得，若考虑向人给药，则更优选为人的脐带。

在本发明中，骨髓是指填充骨的内腔的软组织，是造血器官。在骨髓中存在骨髓液，将其中存在的细胞称为骨髓细胞。在骨髓细胞中，除了红细胞、粒细胞、巨核细胞、淋巴细胞、脂肪细胞等之外，还包含间充质干细胞、造血干细胞、血管内皮前体细胞等。骨髓细胞例如可以从人肠骨、长管骨或其他骨中采集。

在本发明中，来源于脂肪的间充质干细胞、来源于脐带的间充质干细胞、来源于骨髓的间充质干细胞之类的来源于各组织的间充质干细胞是指分别包含来源于脂肪的间充质干细胞、来源于脐带的间充质干细胞、来源于骨髓的间充质干细胞之类的来源于各组织的间充质干细胞的任意的细胞集团。该细胞集团的至少20％以上、优选为30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、96％、97％、98％或99％为来源于脂肪的间充质干细胞、来源于脐带的间充质干细胞、来源于骨髓的间充质干细胞之类的来源于各组织的间充质干细胞。

本发明的间充质干细胞可以通过生长特征(例如，从传代到衰老的集团倍增能力、倍增时间)、核型分析(例如，正常的核型、母体系统或新生儿系统)、基于流式细胞术(例如，FACS分析)的表面标记物表达、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如，表位检测)、基因表达谱(例如，基因芯片阵列；逆转录PCR、实时PCR、常规PCR等聚合酶链式反应)、miRNA表达谱、蛋白质阵列、细胞因子等蛋白质分泌(例如血浆凝结分析、ELISA、细胞因子阵列)、代谢产物(代谢组分析)、本领域已知的其他方法等来进行表征。

(间充质干细胞的制备方法)

可以通过本领域技术人员公知的方法来制备间充质干细胞。如上所述，可以是从供体的组织中分离出的原代细胞，也可以是株化后的细胞。以下，作为一个例子，对来源于原代细胞的脂肪的间充质干细胞的制备方法进行说明。例如可以通过美国专利第6,777,231号中记载的制造方法来得到来源于脂肪的间充质干细胞，例如可以通过包含以下工序(i)～(iii)的方法进行制备：

(i)：通过利用酶对脂肪组织进行消化而得到细胞悬浮物的工序；

(ii)：使细胞沉降，并将细胞再悬浮于适当的培养基中的工序；以及

(iii)在固体表面对细胞进行培养，去除未显示出与固体表面的结合的细胞的工序。

在步骤(i)中使用的脂肪组织优选使用洗涤后的脂肪组织。可以通过使用生理学上适合的生理盐水(例如磷酸缓冲盐溶液(PBS))，剧烈搅拌并使脂肪组织沉降来进行洗涤。这是为了从组织中去除脂肪组织中包含的夹杂物(也称为碎片，例如损伤组织、血液、红细胞等)。因而，一般反复进行洗涤以及沉降，直到从上清液中总体上去除碎片为止。由于残存的细胞以各种尺寸的块存在，因此为了在将细胞本身的损伤抑制在最小限度的同时进行解离，优选通过减弱或破坏细胞间结合的酶(例如胶原酶、分散酶或胰蛋白酶等)对洗涤后的细胞块进行处理。这样的酶的量以及处理期间根据所使用的条件而变化，但在本技术领域中是已知的。可以代替这样的酶处理或者与这样的酶处理并用地通过机械搅拌、超声波能量、热能等其他处理方法对细胞块进行分解，但是为了将细胞的损伤抑制在最小限度，优选仅通过酶处理来进行分解。在使用酶的情况下，为了将对细胞的有害作用抑制在最小限度，优选在隔开适当的期间后使用培养基等使酶失活。

由步骤(i)得到的细胞悬浮物包含凝集状的细胞的浆液或悬浮物以及各种夹杂细胞，例如红细胞、平滑肌细胞、内皮细胞以及成纤维细胞。因而，可以接着分离、去除凝集状态的细胞和上述夹杂细胞，但由于能够通过后述的工序(iii)中的粘接以及洗涤来去除，所以也可将该分离、去除省略。在分离、去除夹杂细胞的情况下，可以通过将细胞强制地分为上清液和沉淀的离心分离来实现。使得到的包含夹杂细胞的沉淀悬浮于生理学上适合的溶剂中。在悬浮状的细胞中有可能包含红细胞，但通过由后述的向个体表面的粘接而进行的选择，红细胞被去除，因此不一定需要溶解的工序。作为选择性溶解红细胞的方法，例如可以使用在通过氯化铵进行溶解的高渗培养基或低渗培养基中进行培育(incubation)等本技术领域中公知的方法。在溶解后，例如可以通过过滤、离心沉降或密度分级将溶解物从所期望的细胞中分离。

在步骤(ii)中，在悬浮状的细胞中，为了提高间充质干细胞的纯度，可以进行一次或连续多次洗涤，离心分离，并再悬浮于培养基中。除此之外，也可以基于细胞表面标记物分布或者基于细胞的尺寸以及颗粒性对细胞进行分离。

在再悬浮中使用的培养基只要是能够对间充质干细胞进行培养的培养基即可，没有特别限定，这样的培养基可以在基础培养基中添加血清和/或添加白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、亚硒酸钠、胆固醇、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3'-硫醇甘油等一种以上的血清替代物来制作。在上述培养基中，可以根据需要进一步添加脂质、氨基酸、蛋白质、多糖、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等物质。

作为上述基础培养基，例如可列举为IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle’sMinimum Essential Medium(EMEM)培养基、αMEM培养基、Dulbecco’s modified Eagle’sMedium(DMEM)培养基、Ham’s F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、MCDB201培养基以及它们的混合培养基等。

作为上述血清，例如可列举为人血清、胎牛血清(FBS)、牛血清、小牛血清、山羊血清、马血清、猪血清、绵羊血清、兔血清、大鼠血清等，但不限于此。在使用血清的情况下，相对于基础培养基，可以添加5v/v％～15v/v％，优选为10v/v％。

作为上述脂肪酸，可举例示出为亚油酸、油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、棕榈酸以及硬脂酸等，但不限于此。脂质可举例示出为磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱等，但不限于此。氨基酸例如包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸等，但不限于此。蛋白质例如可举例示出为大肠杆菌素(Ecotin)、还原型谷胱甘肽、纤连蛋白、β2-微球蛋白等，但不限于此。多糖可举例示出为糖胺聚糖，在糖胺聚糖中，尤其举例示出为透明质酸、硫酸乙酰肝素等，但不限于此。生长因子例如可举例示出为血小板源生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)、上皮生长因子(EGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)等，但不限于此。从将在本发明中得到的来源于脂肪的间充质干细胞用于细胞移植的观点出发，优选使用不含有血清等来源于异种的成分的(Xeno-Free)培养基。作为这样的培养基，例如可以使用由PromoCell公司、Lonza公司、BiologicalIndustries公司、Veritas公司、R&D Systems公司、Corning公司以及Rohto公司等作为间充质干细胞(间质细胞)用并作为预先制备的培养基而提供的培养基。

接着，在工序(iii)中，不对在工序(ii)中得到的细胞悬浮液中的细胞进行分化而在固体表面上使用上述适当的细胞培养基并在适当的细胞密度以及培养条件下进行培养。在本发明中，“固体表面”是指能够进行本发明中的来源于脂肪组织的间充质干细胞的结合、粘接的任意的材料。在特定的方式中，这样的材料是以促进哺乳类细胞与该表面的结合、粘接的方式进行处理后的塑料材料。对具有固体表面的培养容器的形状没有特别限定，优选使用培养皿、烧瓶等。为了去除非结合状态的细胞以及细胞的碎片，在培育后对细胞进行洗涤。

在本发明中，可以选择最终以与固体表面结合、粘接的状态保留的细胞作为来源于脂肪的间充质干细胞的细胞集团。

对于所选择的细胞，为了确认是本发明中的来源于脂肪的间充质干细胞，也可以针对表面抗原使用流式细胞术等通过以往的方法进行分析。进一步地，也可以对分化为各细胞谱系的能力进行检查，可以通过以往的方法进行这样的分化。

本发明的间充质干细胞可以如上述那样进行制备，但并不限定于这样的原代细胞，也可以使用株化后的细胞。此外，也可以定义为具有在标准培养基中的培养条件下对塑料显示出粘接性、表面抗原CD44、CD73、CD90为阳性且CD31、CD45为阴性、在培养条件下能够分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞这样的特性的细胞。

(间充质干细胞的分泌物)

可以以如下物质作为本发明的正常分化-成熟促进剂中的间充质干细胞的分泌物：通过以下方法对上述间充质干细胞进行培养而得到的上清液、通过透析、超滤等方法从该上清液中去除不需要的成分后得到的上清液、通过柱等对该上清液进行分级而得到的组分、使用针对特定的分子的抗体等进行选择后的组分、通过离心操作获取到的组分等。

作为在上述培养中使用的培养基，可以使用与在间充质干细胞的制备的项目中说明的培养基相同的培养基。间充质干细胞的培养方法只要是适合于各个间充质干细胞的方法即可，没有特别限定，可以使用与以往相同的方法。通常，在30℃～37℃的温度、2％～7％CO₂环境下、5％～21％O₂环境下进行，优选在37℃、5％CO₂环境下进行。另外，间充质干细胞的传代的时期以及方法也只要适合于各个细胞即可，没有特别限定，可以一边观察细胞的情况一边与以往同样地进行。

对于在上述培养基中进行培养后的间充质干细胞，在考虑细胞的状态进行适当次数的传代之后，培养至50～95％汇合、优选为60～90％汇合、更优选为70-80％汇合，之后，更换为新鲜的培养基，通常在其1天后～5天后、优选为2天后～5天后、更优选为2天后～4天后、进一步优选为2天后～3天后，离心分离并回收细胞培养上清液。细胞培养上清液可以仅回收一次，也可以经过多天回收多次。回收后的培养上清液可以根据需要进行过滤器灭菌、透析、浓缩、柱分级、稀释等来作为本发明的正常分化-成熟促进剂所包含的间充质干细胞的分泌物。此外，传代培养用的培养基和培养上清液回收用的培养基可以相同，也可以不同。

(正常分化-成熟促进剂的制备方法)

本发明的正常分化-成熟促进剂可以在不损害本发明的效果的范围内含有其他成分。作为其他成分，可列举为其他有效成分、一般的医药品、准药品等所能够含有的有效成分以外的药学上所允许的载体等成分。可以将上述得到的间充质干细胞的分泌物和根据需要配合的其他成分按照常规方法混合来作为本发明的正常分化-成熟促进剂。

(正常分化-成熟促进剂的用途)

本发明的正常分化-成熟促进剂能够促进角膜上皮细胞等复层扁平上皮细胞的正常分化，并且还能够促进细胞间的紧密连接的形成从而提高组织的屏障功能，因此能够用于预防和/或治疗上皮疾病。即，可以将本发明的正常分化-成熟促进剂本身直接用于上皮疾病的预防和/或治疗，也可以用于添加必要的成分等而形成为适当的剂型以适合于各上皮疾病的处置的上皮疾病治疗剂。

<上皮疾病治疗剂>

本发明的上皮疾病治疗剂的特征在于，包含上述正常分化-成熟促进剂。本发明的正常分化-成熟促进剂能够促进角膜上皮细胞等复层扁平上皮细胞的正常分化，并且还能够促进细胞间的紧密连接的形成从而提高细胞的屏障功能，因此含有该正常分化-成熟促进剂的上皮疾病治疗剂也具有同样的效果。此外，关于正常分化-成熟促进剂的具体说明，可以直接适用上述复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟促进剂的项目中的说明。

(上皮疾病治疗剂的制备方法)

可以将上述的正常分化-成熟促进剂(包含间充质干细胞的分泌物)和其他成分通过常规方法进行混合来制造本发明的上皮疾病治疗剂。

(上皮疾病治疗剂的用途)

本发明的上皮疾病治疗剂适合用于预防和/或治疗与具有复层扁平上皮细胞的组织相关的疾病。其中，更适合用于通过促进复层扁平上皮细胞的正常分化、促进细胞间的紧密连接的形成而发挥效果的疾病。作为这样的复层扁平上皮细胞，例如可列举为角膜上皮细胞、结膜上皮细胞、表皮角化细胞、口腔上皮细胞、会厌上皮细胞、食道上皮细胞、阴道上皮细胞、声带皱襞上皮细胞、鼻腔上皮细胞、鼻前庭上皮细胞等。

作为使用本发明的上皮疾病治疗剂的疾病，例如可列举为角膜疾病、结膜疾病、表皮疾病、口腔疾病等，具体而言，可列举为干眼症、翼状胬肉、瘢痕、EB病毒性角膜炎、角膜上皮干细胞衰竭症、硬皮病、干燥综合征、点状表层角膜症、角膜糜烂、角膜溃疡、特应性皮炎、热腐蚀、碱腐蚀、酸腐蚀、药物毒性、史蒂文斯-约翰逊综合征、眼部类天疱疮、持续性角膜上皮缺损、角膜穿孔、角膜周边部溃疡、角膜溃疡、准分子激光手术后的上皮剥离、放射线角膜症、无虹膜症、沙眼后角膜混浊、萨尔兹曼角膜变性、睑球粘连、原因不明的角膜上皮的干细胞消失的疾病、缘部(輪部)肿瘤、移植物抗宿主病(GVHD)、角膜炎、点状表层角膜症、干性角膜炎、干性结膜炎、角膜营养不良、糖尿病角膜症、角膜上皮障碍、口腔干燥症(Dry Mouth)、口内炎、口腔念珠菌病、口角炎、缺铁性吞咽困难(Plummer-Vinson综合征)、恶性贫血(莫列-亨特舌炎)、口腔扁平苔藓、口腔念珠菌病、肉芽肿性唇炎等。其中，优选为本发明的上皮疾病治疗剂的效果显著的干眼症、干燥综合征、翼状胬肉、瘢痕、EB病毒性角膜炎、角膜上皮干细胞衰竭症或硬皮病，更优选为干眼症。

除上述以外，作为使用本发明的上皮疾病治疗剂的疾病，可列举为食道癌、胃食管反流病、巴雷特食管、咽喉癌、鼻癌、阴道癌、肛门癌、声带癌、葡萄膜炎过敏性鼻炎、系统性红斑狼疮、慢性复发性口疮、白塞(Behcet)病、赖特(Reiter)病、克罗恩(Crohn)病、费尔蒂(Felty)综合症、周期性中性粒细胞减少症、顽固性溃疡、天疱疮、类天疱疮、疱疹感染症、手足口病、疱疹性咽峡炎、传染性单核细胞症、麻疹、猩红热、先天性或后天性表皮水泡症、口腔扁平苔藓、牙龈增生、达里埃(Darier)病、先天性厚甲症、先天性角化不良、泪液分泌不足等。

本发明的上皮疾病治疗剂也可以与包含其他有效成分的药剂并用。可以与其他药剂同时给药，也可以在给药其他药剂前后的适当时期给药。

(上皮疾病治疗剂的制剂)

本发明的上皮疾病治疗剂可以通过常规方法制成适当的制剂。作为制剂的剂型，可以是散剂、颗粒剂等固体制剂，但从得到优异的预防、治疗效果的观点出发，优选为溶液剂、乳剂、悬浮剂等液剂。特别是在作为滴眼剂的情况下，更优选为溶液剂。作为上述液剂的制造方法，例如可以优选地举例示出为直接使用上述间充质干细胞的分泌物的方法、与其他溶剂混合的方法、进一步混合助悬剂、乳化剂的方法。如上所述，在本发明的上皮疾病治疗剂的制剂中，根据制剂上的需要，可以配合适当的药学上所允许的载体，例如赋形剂、结合剂、溶剂、增溶剂、助悬剂、乳化剂、等渗剂、缓冲剂、稳定剂、舒缓剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、润滑剂、崩解剂、润湿剂、吸附剂、甜味剂、稀释剂等任意成分。

作为本发明的上皮疾病治疗剂的给药方法没有特别限制，优选为基于滴眼、血管内给药(优选为静脉内给药)、腹腔内给药、肠道内给药、皮下给药的给药等。

本发明的上皮疾病治疗剂的给药量可以根据疾病的种类、其症状的程度、剂型、给药对象的体重等而变化。可以在一天之中分为一次至多次进行给药。另外，本发明的上皮疾病治疗剂的制剂的给药可以是单次给药，也可以持续地进行给药。在持续地进行给药的情况下，例如，可以按三天一次以上的频率两次以上持续地给药，其中，优选为按两天一次以上的频率三次以上持续地给药，更优选为按一天一次以上的频率四次以上持续地给药。

在本发明的上皮疾病治疗剂为滴眼剂的情况下，可以使用在滴眼剂中通用的技术，并根据需要使用制药学上所允许的添加剂来进行制备。

例如，可以根据需要从氯化钠、浓甘油等等渗剂；盐酸、氢氧化钠等pH调节剂；磷酸钠、乙酸钠等缓冲剂；聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油等表面活性剂；柠檬酸钠、依地酸钠等稳定剂；苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯等防腐剂等中选择使用来进行制备。本滴眼液的pH只要在眼科制剂所允许的范围内即可，通常优选在4～8的范围内。

作为成为本发明的上皮疾病治疗剂的给药对象的动物，没有特别限制，优选为人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、牛、猪、马、兔、绵羊、山羊、猫、狗等，其中更优选为人。另外，从获得针对疾病的更稳定的优异的预防和/或治疗效果的观点出发，本发明的上皮疾病治疗剂所包含的间充质干细胞的细胞分泌物优选来源于与作为给药对象的动物的种类一致的细胞。

<复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟促进方法>

本发明还包括以使用间充质干细胞的分泌物为特征的复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟促进方法。通过将间充质干细胞的分泌物添加到角膜上皮细胞等复层扁平上皮细胞中，能够促进复层扁平上皮细胞的正常分化、细胞间的紧密连接的形成，使细胞成熟，从而提高组织的屏障功能。关于间充质干细胞分泌物、复层扁平上皮细胞的分化诱导等的具体内容，可以直接适用复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟促进剂的项目中的说明。此外，由于正常分化和成熟是具有关联的现象，因此本发明的正常分化-成熟促进方法也可以称为正常分化促进方法。

<复层扁平上皮细胞的屏障功能增强方法>

本发明还包括以使用间充质干细胞的分泌物为特征的复层扁平上皮细胞的屏障功能增强方法。通过将间充质干细胞的分泌物添加到角膜上皮细胞等复层扁平上皮细胞中，能够促进复层扁平上皮细胞的正常分化、细胞间的紧密连接的形成，使细胞成熟，从而增强组织的屏障功能。关于间充质干细胞的分泌物、复层扁平上皮细胞的屏障功能增强等的具体内容，可以直接适用复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟促进剂的项目中的说明。

实施例

以下，基于实施例对本发明更详细地进行说明，但本发明不限于这些实施例。

1、间充质干细胞的分泌物(MSC-CM)的获取

作为间充质干细胞，使用来源于脂肪的间充质干细胞(AD-MSC，PromoCell)，培养液使用人间充质干细胞专用完全合成培养基试剂盒(MSC-GMCD，Lonza)或增殖培养基DXF(PromoCell)。在上述培养液中，以2,500-5,000cells/cm²的密度接种AD-MSC，培养至70-80％汇合。之后，更换为MSC-GMCD或DMEM/F-12基础培养基(Lifetechnologies)，培养2-3天。回收培养上清液，以300×g进行离心处理后，去除细胞，获得评价用的间充质干细胞分泌物(MSC-CM)。根据需要通过15μm的过滤器进行灭菌，直到使用时为止在-80℃下进行保存。

2、由间充质干细胞的分泌物产生的角膜上皮细胞的屏障功能促进作用(跨上皮电阻TER的测定)

将来源于人供体角膜的角膜上皮细胞接种在12孔板的细胞培养插件(cellculture insert)中，培养至汇合。培养液使用含有2％B27细胞培养添加剂(supplement)(Lifetechnologies)、20ng/mL KGF(Wako)、10μM Y-27632(Wako)的DMEM/F-12(Lifetechnologies)。在达到汇合后，将MSC-CM添加到插件内。作为对照组，仅使用在获取上述MSC-CM时并行地进行相同处理而获取到的无细胞的培养基。使用Endohm-12chamber和EVOM voltmeter(World precision instruments)随时间的推移对所制备的角膜上皮细胞的TER进行测定。将结果示于图1以及图2。

图1是使用DMEM/F-12基础培养基作为获取MSC-CM时的培养用培养基的情况下的结果。如图1所示，在添加MSC-CM后的第五天以后，添加MSC-CM后的角膜上皮细胞与对照组相比显示出明显较高的TER值，可知MSC-CM具有角膜上皮细胞的屏障功能促进效果。尤其是在第七天以后，由MSC-CM引起的TER值的增加显著，可知MSC-CM的角膜上皮细胞的屏障功能促进效果显著。

图2是使用MSC-GMCD作为获取MSC-CM时的培养基的情况下的结果。如图2所示，在添加MSC-CM后的第13天以后，添加MSC-CM后的角膜上皮细胞与对照组相比显示出明显较高的TER值，该值随时间而增加，从培养开始到第33天维持为较高的值。可知MSC-CM具有在长时间内显著地促进角膜上皮细胞的屏障功能并维持该屏障功能的效果。

接着，进行用于确认MSC-CM针对屏障功能降低的角膜上皮细胞的效果的试验。即，与上述同样地，将来源于人供体角膜的角膜上皮细胞接种在12孔板的细胞培养插件中，培养至汇合。在达到汇合后，添加TGF-β1至浓度为10ng/mL，并进一步进行五天的培养之后，添加AD-MSC的培养上清液(全部为MSC-GMCD培养基)至培养基整体的一半量，并进一步进行培养。培养时间表的方案如图3所示。随时间的推移对如上所述制备的角膜上皮细胞的TER值进行测定。将结果示于图4。

角膜上皮细胞的TER值因TGF-β1处理而减少，但若在添加有MSC-CM的培养基中进行培养，则TER值增加，并且进一步显著增加到因TGF-β1处理而减少的部分恢复的程度以上。可知，MSC-CM作用于屏障功能降低的细胞，不仅具有使该降低的屏障功能恢复的效果，还具有进一步显著地促进屏障功能的效果。

3、间充质干细胞的分泌物对角膜上皮细胞的正常分化-成熟促进以及紧密连接形成促进效果(基因表达分析)

用PBS对在上述2中制备的细胞培养插件上的角膜上皮细胞片进行洗涤之后，使用QIAzol Lysis Reagent(QIAGEN)对RNA进行纯化。接着，通过SuperScript(商标)IIIFirst-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR(Invitrogen)进行逆转录，将所制作的cDNA用于铸模，通过ABI Prism 7500Fast Sequence Detection System(LifeTechnologies)进行定量实时PCR(qRT-PCR)。进行表达分析的基因为KRT12、KRT13、KRT14、CLDN1、TJP1、CDH1。此外，将GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)设为100％时的各个基因的相对表达量(％)示于图5。

如图5所示，通过添加MSC-CM，在角膜上皮细胞中，作为正常分化标记物的KRT12、KRT13、KRT14、CLDN1、TJP1、CDH1的表达上升。更详细而言，KRT12、KRT13是角膜上皮细胞、结膜上皮细胞的分化标记物，KRT14是复层上皮细胞的分化标记物，CDH1是上皮细胞标记物，CLDN1、TJP1是紧密连接标记物。这些结果表示MSC-CM促进角膜上皮细胞的正常分化。

4、间充质干细胞的分泌物的正常分化-成熟促进以及紧密连接形成促进效果(免疫组织化学)

使用手术刀将在上述2中制备的细胞培养插件上的角膜上皮细胞与插件的薄膜一起挖通，以5％NST(5％正常驴血清，0.3％Triton-X100)/TBS在室温下封闭1小时后，加入一次抗体，在室温下反应1小时或在4℃下反应过夜。用TBS洗涤3次后，加入二次抗体，在室温下反应1小时。一次抗体使用抗Claudin-1抗体(小鼠单克隆：2H10D10)、抗K12抗体(山羊多克隆；N-16、Santa Cruz Biotechnology)。二次抗体使用Alexa Fluor(注册商标)488或567标记抗小鼠、绵羊IgG抗体(Invitrogen)。抗体均以1％NST/TBS(1％正常驴血清、0.3％Triton-X100)进行稀释来使用。通过用100倍稀释浓度的Hoechst 33342在室温下处理10分钟来进行核的染色。在观察、拍摄中使用LSM710(Carl Zeiss)。使用Zen软件进行共聚焦图像的三维构建。将结果示于图6以及图7。在彩色照片中，Claudin-1的表达(细胞间的紧密连接)用绿色表示，KRT12的表达(正常分化的扁平细胞)用红色表示。

如图6以及图7所示，由于MSC-CM的作用，角膜上皮细胞的Claudin-1蛋白质的表达增加。这表示由于MSC-CM的作用促进了角膜上皮细胞间的紧密连接的形成。另外，由于MSC-CM的作用，角膜上皮细胞的KRT12蛋白质的表达增加。这表示由于MSC-CM的作用促进了角膜上皮细胞的正常分化。尤其是在位于复层的角膜上皮细胞的最上层的细胞中，Claudin-1蛋白质以及KRT12蛋白质的表达增加显著。

5、间充质干细胞的分泌物的正常分化-成熟促进以及紧密连接形成促进效果(扫描型电子显微镜观察)

将在上述2中制备的细胞培养插件上的角膜上皮细胞片用2％戊二醛固定后，用PBS进行洗涤。用乙醇脱水后，用叔丁醇进行置换。之后，进行冷冻干燥，溅射涂布，使用扫描型电子显微镜进行观察。将结果示于图8。

如图8所示，由于MSC-CM的作用，显著地诱导了角膜上皮细胞上的微绒毛的成熟，使角膜上皮细胞正常地进行分化，并且促进了细胞间的紧密连接的形成。

6、间充质干细胞的分泌物的正常分化-成熟促进以及紧密连接形成促进效果(RNA序列分析)

按照上述2的方法，在人角膜上皮细胞中添加MSC培养上清液(CM)并培养16小时。用QIAzol Reagent回收所得到的人角膜上皮细胞，使用miRNeasy Mini Kit(Qiagen)按照推荐的方法对RNA进行纯化。使用TruSeq strand mRNA sample prep kit(Illumina，SanDiege，CA)进行文库的制备。RNA序列在Illumina Hiseq 2500中进行。使用IlluminaCasava ver1.8.2软件进行基因测序，使用TopHat(ver.2.0.13)、Bowtie2(ver.2.2.3)、SAMtools(ver.0.1.19.)基于人参照基因组(hg19)进行映射。使用Cuffnom(ver.2.3.1)计算出FPKM值(每百万映射片段中每千碱基的外显子片段数，the number of fragments perkilobase of exon per million mapped fragments)。将分析结果示于表1。

表1

FPKM	对照组	CM
			MUC1	0.205	5.960
MUC15	0.881	2.384
			MUC16	4.288	19.101
MUC20	3.705	10.857
			MUC21	1.686	9.406
MUC22	11.175	46.277
			MUC4	0.209	2.715
MUCL1	0.401	0.653

FPKM	对照组	CM
			CLDN1	172.199	276.781
CLDN11	0.855	0.651
			CLDN12	5.884	11.250
CLDN15	1.680	1.880
			CLDN16	0.446	0.533
CLDN23	0.452	1.856
			CLDN4	77.083	525.564
CLDN7	67.374	205.666

FPKM	对照组	CM
			TJP1	22.882	45.369
TJP2	54.760	112.420
			TJP3	2.177	4.908

如表1所示，通过添加MSC培养上清液(CM)，与角膜的成熟相关的MUC基因群以及与紧密连接相关的CLDN和TJP基因群显示出表达上升。

7、MSC分泌物针对干眼症模型动物的的治疗效果

基于Fujihara等的方法(Improvement of corneal barrier function by theP2Y(2)agonist INS365in a rat dry eye model.Invest Ophthalmol Vis Sci.2001Jan；42(1)：96-100)，在单眼中摘除SD大鼠(雄)的眶外泪腺来制作干眼症模型。在将干眼症模型大鼠麻醉后，切开皮肤，摘除眶外泪腺。在摘除泪腺后，进行四周的间充质干细胞分泌物(培养上清液)的滴眼。在对眼睛表面进行分析时，在麻醉后，通过荧光素进行染色，对角膜上皮障碍进行评价。将结果示于图9。图9的右图为进行MSC分泌物的滴眼后的眼球，左图为对照组。

如图9所示，通过MSC分泌物的滴眼，干眼症的症状显著改善。由此可知，MSC分泌物具有针对干眼症的优异的治疗效果。

产业上的可利用性

根据本发明，通过在作为复层扁平上皮细胞的角膜上皮细胞等中添加包含间充质干细胞的分泌物的正常分化-成熟促进剂，能够促进正常的分化、成熟、细胞间的紧密连接的形成，从而提高屏障功能。包含该正常分化-成熟促进剂的治疗剂对具有复层扁平上皮细胞的组织例如眼睛的干眼症等上皮疾病是有效的。

Claims (9)

1.一种复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟促进剂，其特征在于，所述正常分化-成熟促进剂包含间充质干细胞分泌物。

2.根据权利要求1所述的正常分化-成熟促进剂，其特征在于，所述分泌物不含动物血清。

3.根据权利要求1或2所述的正常分化-成熟促进剂，其特征在于，所述间充质干细胞为来源于脂肪的间充质干细胞、来源于脐带的间充质干细胞或来源于骨髓的间充质干细胞。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的正常分化-成熟促进剂，其特征在于，所述复层扁平上皮细胞为选自由角膜上皮细胞、结膜上皮细胞、表皮角化细胞、口腔上皮细胞、会厌上皮细胞、食道上皮细胞、阴道上皮细胞、声带皱襞上皮细胞、鼻腔上皮细胞以及鼻前庭上皮细胞组成的群组中的至少一种。

5.一种上皮疾病治疗剂，其特征在于，所述上皮疾病治疗剂包含权利要求1-4中任一项所述的正常分化-成熟促进剂。

6.根据权利要求5所述的上皮疾病治疗剂，其特征在于，所述上皮疾病是与具有复层扁平上皮细胞的组织相关的疾病。

7.根据权利要求6所述的上皮疾病治疗剂，其特征在于，所述上皮疾病为角膜疾病、结膜疾病、口腔疾病或表皮疾病。

8.根据权利要求7所述的上皮疾病治疗剂，其特征在于，所述上皮疾病为干眼症、翼状胬肉、瘢痕、EB病毒性角膜炎、角膜上皮干细胞衰竭症、干燥综合征或硬皮病。

9.一种复层扁平上皮细胞的正常分化-成熟促进方法，其特征在于，所述正常分化-成熟促进方法使用间充质干细胞的分泌物。

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