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CN111560451A - 一种经济高效的批量测定肠道菌体外生长和互作规律的方法 - Google Patents

一种经济高效的批量测定肠道菌体外生长和互作规律的方法 Download PDF

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CN111560451A
CN111560451A CN202010494365.XA CN202010494365A CN111560451A CN 111560451 A CN111560451 A CN 111560451A CN 202010494365 A CN202010494365 A CN 202010494365A CN 111560451 A CN111560451 A CN 111560451A
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Abstract

本发明涉及一种微生物培养检测领域，尤其涉及一种肠道菌体外生长和互作规律的批量检测方法。上述的批量测定肠道菌的体外生长和互作规律的方法，步骤如下：1）配制厌氧培养所需的培养基组分；2）有氧环境下装配体外培养装置；3）体外接种和培养肠道菌；4）测定单个肠道菌生长曲线；5）测定同一培养孔混合肠道菌中各菌生长曲线。本发明不需要复杂、昂贵的厌氧工作站，只需要在简单的试剂和厌氧装置内即可完成，培养和检测经济高效，特别适合于利用肠道菌筛选食药用物质中的益生组分。

Description

一种经济高效的批量测定肠道菌体外生长和互作规律的方法
技术领域
本发明涉及一种微生物的生长测定方法，尤其涉及一种针对厌氧菌为主的肠道菌，利用专门设计的培养基和体外培养装置，结合光学和分子生物学检测技术，经济高效地批量测定单个和多个肠道菌生长和互作的规律，用于食品和药物功效的辅助筛选方法。
背景技术
厌氧菌是医疗卫生领域、环境保护领域中较为重要的一类细菌，以人体的肠道菌为例，70kg的普通成年男子其肠道细菌重量可达1kg，其细菌的细胞数目更是达到人类身体细胞数目的数倍。这些肠道细菌代谢会产生大量的短链脂肪酸，调节人体的生理状况，并合成多种人体生长所需要的氨基酸以及维生素，B族维生素尤为常见。研究表明，肠道细菌的健康有利于机体免疫系统的建立，而人类多种疾病的产生均与肠道菌群的状态有关，如：产内毒素的肠菌过度繁殖则可诱导脂肪肝的形成，史氏甲烷短杆菌与炎症性肠道病有关，假链状双歧杆菌的缺失与糖尿病症状相关等。由此可见，研究肠道菌生长和互作规律对探索人体健康规律极其重要。目前，国际上已大规模地开展肠道基因组计划、肠道菌药物筛选以及不同种族和饮食习惯肠道菌特点等的研究；
开展肠道菌体外生长规律的研究是了解肠道菌生物学基本规律的重要切入点，有助于克服体内研究的难度和复杂性，例如Maier等用40个代表性的人体肠道菌以体外培养的方式筛选了1000多种目前已批准销售的药物，发现其中24%的靶向药物能抑制其中至少一种肠道菌（2018，doi:10.1038/nature25979）。在我国民间，长期以来倡导的以饮食和中草药调理身体，实践证明是有效的，但是有关其作用的机理并不十分清楚，影响其进一步开发和利用。而肠道菌是食物作用于人体的重要媒介，利用肠道菌的体外培养方法筛选中草药中的益生物质，并揭示这些食药用物质的作用机理是非常好的切入点。然而，大多与动物健康有关的肠道菌群多为严格厌氧菌，对于这类菌的研究通常需要专门的厌氧工作站。这类设备占地较大，价格较高，同时对于氮气的消耗也较大，一般的小规模实验室往往难以开展。由于我国总体科研条件较为落后，普通实验室难以配备较好的厌氧工作环境，往往难以开展肠道菌研究；如果能突破和解决这些瓶颈问题，有经济高效的检测和研究手段，则必将极大地推动我国肠道菌和中草药等作用机理研究的进展，因此发明一种经济高效的批量测定肠道菌体外生长和互作规律的方法则显得非常紧迫。
发明内容
针对上述技术问题，本发明目的是在普通实验室缺乏厌氧工作站等专业仪器设备的情况下，在有氧的一般实验条件下，利用独特的培养基配制和操作方法完成肠道菌的培养，并结合光学和分子生物学技术进行单个和多个肠道菌生长曲线的批量测定，揭示单个或多个菌种在体外培养环境下的生长和互作规律；
为实现上述目的，本发明提出了一种经济高效的批量测定肠道菌体外生长和互作规律的方法，包括如下步骤：
1）配制厌氧培养所需的培养基组分；
2）有氧环境下装配体外培养装置；
3）体外接种和培养肠道菌；
4）测定单个肠道菌生长曲线；
5）测定同一培养孔混合肠道菌中各菌生长曲线；
作为优选，所述的肠道菌包括专性厌氧菌、兼性厌氧菌和微需氧菌；
作为优选，所述的步骤1）配制厌氧培养所需的培养基组分，包括以下的步骤：
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE001
根据不同肠道菌的生长特点配制基本培养基成分，调整好pH值。这些培养基一般包含必要的糖分、蛋白质、维生素、还有一些短链脂肪酸；
Figure RE-81307DEST_PATH_IMAGE002
加入千分之一浓度的刃天青作为氧气指示剂，充氮，高压灭菌或过滤灭菌。氧气指示剂虽然不是所有肠道菌培养时所必须的，但为各种肠道菌培养的操作提供重要依据。在氧气指示剂显红色时，其培养基条件无法满足严格厌氧菌的生长，但仍然可以满足兼性厌氧菌和微需氧菌的生长；
③单独配制1%以上浓度的半胱氨酸溶液，充氮，高压或过滤灭菌，接种前使用。半胱氨酸是常用的水溶性去氧剂，可以直接加入半胱氨酸，也可以加入半胱氨酸盐酸盐，其效果是等同的；
作为优选，所述的步骤2）有氧环境下装配体外培养装置，包括以下的步骤：
Figure RE-960270DEST_PATH_IMAGE001
在8联、12联或96孔微孔板中依次加入1/2孔体积的液体培养基，培养容器不限于多少孔数，但必须适合进行分光光度计透射扫描检测；
Figure RE-813126DEST_PATH_IMAGE002
分别加入1/20-1/10体积的硅油、油性抗氧化剂和液体石蜡，让其自然分层阻隔氧气。油性抗氧化剂可以是维生素E和不饱和脂肪酸；
③加入1/20-1/10体积1%浓度的半胱氨酸溶液，加盖或光学膜，放入厌氧袋，冰箱或室温放置12小时以上，等待氧气指示剂红色褪去。厌氧袋是已获授权的实用新型专利产品（“一种可用于厌氧平板分离和培养的即用型厌氧袋”，专利号：ZL201920214535.7）；
作为优选，所述的步骤3）体外接种和培养肠道菌，包括以下的步骤：
Figure RE-585779DEST_PATH_IMAGE001
取出超低温冰箱中冻存的厌氧菌，常温解冻；
Figure RE-202574DEST_PATH_IMAGE002
用5ml西林瓶准备厌氧培养基至4/5体积，加入1/10体积1%半胱氨酸溶液；
③接入1/20体积的厌氧菌，橡胶塞密封瓶口，培养箱培养至OD值1.0左右；
④从厌氧袋中取出已准备就绪的培养板，每个培养孔可加入1/20体积的单个菌液或多个菌的混合菌液，放回厌氧袋，培养箱培养；
作为优选，所述的步骤4）测定单个肠道菌生长曲线，包括以下的步骤：
Figure RE-571763DEST_PATH_IMAGE001
培养板在厌氧袋中生长1小时以后，开始取出培养板置于酶标仪中扫描OD600的吸光度；
Figure RE-784570DEST_PATH_IMAGE002
根据菌的生长速度快慢，每隔0.5-1小时监测扫描吸光度变化，连续追踪12小时以上。可以在酶标仪中持续监测，也可以每次检测后放回厌氧袋中继续在培养箱中培养；
③所得的OD值绘制该菌在不同培养基条件下的生长曲线；
④培养孔里最终产物也可以进一步提取后进行代谢组分析，比如有机酸的含量变化、特定蛋白的分泌量等；
作为优选，所述的步骤5）测定同一培养孔混合肠道菌中各菌生长曲线，包括以下的步骤：
Figure RE-614991DEST_PATH_IMAGE001
在所述的步骤4）完成的基础上，将培养板迅速冰浴，取出100μl以上菌液到新的收集板中，4℃4000g离心5min，离心收集菌液沉淀，去上清液，加1mg/ml的蛋白酶悬液100μl，转移至0.2ml的12联PCR管或96孔PCR板中，管中预先放有直径0.1mm-0.5mm玻璃珠25μl（堆积体积）；
Figure RE-74792DEST_PATH_IMAGE002
40-70℃保温5-30分钟后，立即1000rpm以上水平或垂直震荡；
③加入10% 螯合树脂液50μl，60-80℃保温10-30min，短时高速冷冻离心，取上清液冷冻保存；
④设计针对不同肠道菌基因序列的特异性引物，取上述DNA模板，建立15μl荧光定量PCR反应体系；
⑤获取不同菌种扩增的Ct值，以2-ΔCt作为OD值的比值，估算出每种菌在同一培养孔的密度比值，绘制不同菌的生长曲线；
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1）能在缺少厌氧操作箱和工作站等装置的普通实验条件下，快速开展厌氧菌的生长监测实验；
2）能同时开展多个菌种在多个药剂处理下的生长比较研究，大大提高了实验筛选效率；
3）与便捷的DNA提取技术结合，能方便批量进行混合菌群的互作分析；
4）与液相色谱等结合，能方便后续蛋白质组和代谢组等的比较研究，有利于药剂筛选的机理研究。
附图说明
图1是长双歧杆菌的生长情况图；
图2酪酸梭菌的生长情况图；
图3是果糖对双歧杆菌的影响图；
图4是果糖对酪酸梭菌的影响图；
图5是果糖对于产气肠杆菌的影响图；
图6是原花青素对双歧杆菌的影响图；
图7是原花青素对酪酸梭菌的影响图；
图8是原花青素对产气肠杆菌的影响图；
图9是长双歧杆菌（BL）和酪酸梭菌（CB）的平均OD值变化图。
具体实施方式
实施例1. YCFA厌氧培养基组分配制
配制步骤：
（1）按照表一配方称量和加入试剂，同时另外配制千分之一浓度刃天青母液；
（2）在1L液体培养基中加入1ml刃天青母液（1000倍），使得培养基中刃天青终浓度为1ppm；
（3）将液体培养基装入厌氧瓶中，通高纯氮气1min，立即加盖，高压灭菌后备用；
（4）按表二准备去氧剂1%半胱氨酸母液，通高纯氮气1min，立即加盖，高压灭菌后备用；
表一.肠道菌通用YCFA液体培养基（1L）
试剂 用量（g）
Casitone（酪蛋白胨） 10g
Lab-lemco（牛肉粉） 10g
yeast extract（酵母膏） 2.5g
NaHCO3 4g
NaAc 2.71g
丙酸钠 0.86g
Glucose（葡萄糖） 2g
Maltose（麦芽糖） 2g
Cellobiose（纤维二糖） 2g
K2HPO4 0.45g
KH2PO4 0.45g
NaCl 0.9g
MgSO4·7 H2O 0.09g
CaCl2 0.09g
Haemin（氯化血红素） 10mg
加刃天青母液 1ml
Isobutyrate（异丁酸盐） 0.09g
Isovalerate（异戊酸盐） 0.10g
Valerate（戊酸盐） 0.10g
表二. 1%半胱氨酸母液（1L）
试剂 用量
K2HPO4 0.45g
KH2PO4 0.45g
NaCl 0.9g
MgSO4·7 H2O 0.09g
CaCl2 0.09g
Haemin（氯化血红素） 10mg
刃天青母液（1000×） 1ml
Isobutyrate（异丁酸盐） 0.09g
Isovalerate（异戊酸盐） 0.10g
Valerate（戊酸盐） 0.10g
半胱氨酸 10g 。
实施例2. 有氧环境下装配96孔酶标板用于体外培养
（1）将酶标板放置在厌氧袋中24h以上；
（2）取出酶标板每孔加入150 μlYCFA液体培养基，然后依次分别加入20μl的液体石蜡和维生素E、硅油；
（3）加入 1%浓度的半胱氨酸溶液20μl除氧，盖上盖子，放回厌氧袋中，冷藏或室温放置12h以上，等待氧气指示剂红色褪去即可用。
实施例3. 接种长双歧杆菌和酪酸梭菌并记录生长曲线
（1）从超低温冰箱取出长双歧杆菌和酪酸梭菌冻存管，室温解冻；
（2）准备两个5ml西林瓶，分别加入4ml YCFA液体培养基，再加入1%半胱氨酸溶液500μl，静置30min；
（3）向两瓶褪色的培养基中分别加入长双歧杆菌和酪酸梭菌，橡胶塞密封，放置在37℃的培养箱中培养过夜，确保使用前OD600大于1.0；
（4）从厌氧袋中取出已褪去氧气指示剂颜色的培养板，加入已培养活化的菌液15μl，在酶标板正面贴一层光学膜，将板放于厌氧袋中，37℃培养30min；
（5）将Thermo varioskan酶标仪设置自动检测程序并预热至37℃后，将酶标板放入检测，每30-60 min检测一次OD值；
（6）每个试验孔设置4个以上重复，同时设置不加菌的对照，数据结果采集后，经excel平均和误差分析，作出生长曲线，如图1、2所示。图示结果表明，长双歧杆菌和酪酸梭菌在培养时间里经历了延滞期，对数生长期和稳定期三个阶段，是可用的肠道菌生长监测平台。
实施例4. 比较果糖和原花青素分别对长双歧杆菌、酪酸梭菌和产气肠杆菌的生长影响
（1）肠道菌活化和接种同实施例3的（1）、（2）和（3）；
（2）培养板在准备时，设置了不同添加试剂和浓度的培养孔位置，每个处理设置4个以上重复，供测试剂为事先配制的10倍以上的母液并进行0.22μm过滤灭菌，加入1%半胱氨酸溶液中，再同半胱氨酸溶液一起加入到培养孔中；
（3）培养和检测方法同实施例3中的（4）和（5），数据结果经excel处理作图如图3、4、5、6、7、8所示。图3、4、5的研究表明，果糖在高浓度下促进双歧杆菌生长，抑制酪酸梭菌生长，而不管果糖的低浓度和高浓度对产气杆菌均有明显的促进作用。而原花青素只在高浓度下明显促进双歧杆菌和产气杆菌的生长。
实施例5. 双歧杆菌和酪酸梭菌混合在YCFA培养下的稳定状态时的互作
（1）肠道菌活化和接种同实施例3的（1）、（2）和（3）；
（2）从厌氧袋中取出已褪去氧气指示剂颜色的培养板，在同一个培养孔内添加了双歧杆菌和酪酸梭菌的混合液，两者都是1.0 OD的浓度，各添加15μl，同时接种于两个板中进行平行试验，将板放于厌氧袋中，37℃培养；
（3）每过12h，收集一块培养板的菌种，进行DNA提取，方法如下：
Figure RE-741396DEST_PATH_IMAGE001
将培养板迅速冰浴，取出100μl到新的收集板中，4℃4000g离心5min，加无菌水清洗一次，去上清，加入1mg/ml的蛋白酶悬液100μl，转移至0.2ml的12联PCR管或96孔PCR板中，管中预先放有直径0.1mm-0.5mm玻璃珠25μl（堆积体积）；
②40-70℃保温5-30分钟后，立即1000rpm以上水平或垂直震荡；
③加入10% 螯合树脂液50μl，60-80℃保温10-30min，短时高速冷冻离心，取上清冷冻保存；
④设计针对长双歧杆菌（Bifidobacteriumlongum，简称BL）和酪酸梭菌（Clostridiumbutyricum，简称CB）的荧光定量PCR引物, 双歧杆菌(5’-3’): Biff1,GATTCTGGCTCAGGATGAACGC；Bifr1, CTGATAGGACGCGACCCCAT，扩增子大小为231bp。酪酸梭菌(5’-3’): Clof1, GCCACATTGGGACTGAGA；Clor1, GCTTCTTAGTCAGGTACCG，扩增子大小为170bp；
⑤建立如下15μl荧光定量PCR反应体系：2*TingkerealPCR buffer 7.5μl, 上下游引物10μM各0.5μl，模板2μl，水4.5μl。反应程序为：95℃ 5min；95℃ 15s，60℃ 1.5min，荧光检测，循环35轮；72℃5min；
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE003
获取不同菌种扩增的Ct值，以2-ΔCt作为OD值的比值，估算出每种菌在同一培养孔的密度比值，绘制不同菌的生长曲线；
表三. 根据总平均OD值和Ct值测算的各菌的OD值
时间 12h 24h 36h 48h 60h 72h
总平均OD 1.75 1.66 1.74 1.53 1.47 1.76
BL平均Ct 24.50 23.20 24.10 25.80 25.50 24.80
CB平均Ct 23.26 22.53 23.39 26.24 25.44 24.20
ΔCt= Ct,BL-Ct,CB 1.24 0.67 0.71 -0.44 0.06 0.60
BL/CB=2-ΔCt 0.42 0.63 0.61 1.35 0.96 0.66
BL平均OD 0.52 0.64 0.66 0.88 0.72 0.70
CB平均OD 1.23 1.02 1.08 0.65 0.75 1.06
（4）每12h取一块板，24h转接两块板，连续72h，共收集6个数据点，分别进行荧光定量PCR检测；
（5）结果如表三和图9所示。结果表明，开始的时候，酪酸梭菌生长较快，双歧杆菌生长较慢，之后慢慢趋于相近，最后酪酸梭菌比值略高。

Claims (7)

1.一种经济高效的批量测定肠道菌体外生长和互作规律的方法，其特征在于，该方法包括以下的步骤：
Figure 393966DEST_PATH_IMAGE001
配制厌氧培养所需的培养基组分；
Figure 461148DEST_PATH_IMAGE002
有氧环境下装配体外培养装置；
Figure 525182DEST_PATH_IMAGE003
体外接种和培养肠道菌；
Figure 70432DEST_PATH_IMAGE004
测定单个肠道菌生长曲线；
Figure 121432DEST_PATH_IMAGE005
测定同一培养孔混合肠道菌中各菌生长曲线。
2.根据权利要求1所述的一种经济高效的批量测定肠道菌体外生长和互作规律的方法，其特征在于，所述的肠道菌包括专性厌氧菌、兼性厌氧菌和微需氧菌。
3.根据权利要求1所述的一种经济高效的批量测定肠道菌体外生长和互作规律的方法，其特征在于步骤
Figure 93936DEST_PATH_IMAGE001
的配制厌氧培养所需培养基组分，包括以下的步骤：
Figure 645266DEST_PATH_IMAGE006
根据不同肠道菌的生长特点配制基本培养基成分，调整好pH值；
Figure 56524DEST_PATH_IMAGE007
加入千分之一浓度的刃天青作为氧气指示剂，充氮、高压灭菌或过滤灭菌；
③单独配制1%以上浓度的半胱氨酸溶液，充氮、高压或过滤灭菌，接种前使用。
4.根据权利要求1所述的一种经济高效的批量测定肠道菌体外生长和互作规律的方法，其特征在于步骤
Figure 6769DEST_PATH_IMAGE002
的有氧环境下装配体外培养装置，包括以下的步骤：
Figure 353437DEST_PATH_IMAGE006
在8联、12联或96孔微孔板中依次加入1/2孔体积的液体培养基；
Figure 392062DEST_PATH_IMAGE007
分别加入1/20-1/10体积的硅油、油性抗氧化剂和液体石蜡，让其自然分层阻隔氧气；
③加入1/20-1/10体积1%浓度的半胱氨酸溶液，加盖或光学膜，放入厌氧袋，冰箱或室温放置12小时以上，等待氧气指示剂的红色褪去。
5.根据权利要求1所述的一种经济高效的批量测定肠道菌体外生长和互作规律的方法，其特征在于步骤
Figure 279116DEST_PATH_IMAGE003
的体外接种和培养肠道菌，包括以下的步骤：
Figure 89727DEST_PATH_IMAGE006
取出超低温冰箱中冻存的厌氧菌，常温解冻；
Figure 358028DEST_PATH_IMAGE007
用2-5ml西林瓶准备厌氧培养基至4/5体积，加入1/10体积的1%半胱氨酸溶液；
③接种入1/20体积的肠道菌，橡胶塞密封瓶口，培养箱培养至OD值1.0；
④从厌氧袋中取出已准备就绪的培养板，每个培养孔可加入1/20体积的单个菌液或多个菌的混合菌液，放回厌氧袋，培养箱培养。
6.根据权利要求1所述的一种经济高效的批量测定肠道菌体外生长和互作规律的方法，其特征在于步骤
Figure 382485DEST_PATH_IMAGE004
的测定单个肠道菌生长曲线，包括以下的步骤：
Figure 571764DEST_PATH_IMAGE006
培养板在厌氧袋中生长1小时以后，取出培养板置于酶标仪中开始扫描OD600的吸光度；
Figure 670170DEST_PATH_IMAGE007
根据菌的生长速度快慢，每隔0.5-1小时监测扫描吸光度变化，连续追踪12小时以上；
③所得的OD值绘制该菌在不同培养基条件下的生长曲线；
④培养孔里最终产物也可以进一步提取后进行代谢组分析。
7.根据权利要求1所述的一种经济高效的批量测定肠道菌体外生长和互作规律的方法，其特征在于步骤
Figure 922423DEST_PATH_IMAGE005
的测定同一培养孔混合肠道菌中各菌生长曲线，包括以下的步骤：
Figure 371858DEST_PATH_IMAGE006
在权利要求6所述步骤完成基础上，将培养板迅速冰浴，取100µl以上菌液到新的收集板，4℃4000g离心5min，收集沉淀，加无菌水，再离心去上清液；
Figure 600714DEST_PATH_IMAGE007
加1mg/ml的蛋白酶悬液100µl，转移至0.2ml的12联PCR管或96孔PCR板中，管中预先放有直径0.1mm-0.5mm的玻璃珠25µl，40-70℃保温5-30分钟后，立即1000rpm以上水平或垂直震荡；
③加入10% 螯合树脂液50µl，60-80℃保温10-30min，短时高速冷冻离心，取上清液冷冻保存；
④设计针对不同肠道菌基因序列的特异性引物，取上述DNA模板，建立15µl荧光定量PCR反应体系；
⑤获取不同菌种扩增的Ct值，以2-ΔCt作为OD值的比值，估算出每种菌在同一培养孔的密度比值，绘制不同菌的生长曲线。
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