CN111557952A - 间充质干细胞在制备用于促进脂肪移植的制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了间充质干细胞在制备用于促进脂肪移植的制剂中的应用，涉及生物技术领域，经过发明人研究发现，相对于体细胞来源的MSCs，人胚胎干细胞来源的MSCs的质量更稳定，且不受供体身体素质、疾病和治疗过程的影响，能够通过增强组织重构、血管新生、脂肪细胞存活和降低组织纤维化来促进脂肪移植。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，且特别涉及间充质干细胞在制备用于促进脂肪移植的制剂中的应用。
背景技术
自体脂肪填充术被用来矫正和修复软组织畸形已有超过100年的历史。它主要用于癌症手术后的面部及身体其它部位重构，修复伤疤和皱纹以及隆胸(Zhu et al.2010)。自体脂肪通常从皮下脂肪组织抽提，由于其天然形态，高度生物相容性，低价，无免疫原性及外源病原体污染的优点，已成为最常被使用的填充材料。
尽管如此，由于移植物存活率很不稳定(25-90％)，另外，因为缺少血管生成引起部分坏死，自体脂肪移植依然存在许多障碍(Butala,Hazen et al.2012,Trojahn Kolle,Oliveri et al.2012)。脂肪移植物的存活有赖于血管快速形成以提供氧气和营养(Domenis et al.2015)，而血供不足可导致大量的脂肪细胞死亡，处于移植物中心的细胞尤甚、容易纤维化，从而导致移植物变小。
鉴于此，提出本申请。
发明内容
本发明的目的在于提供间充质干细胞在制备用于促进脂肪移植的制剂中的应用以及制剂。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
第一方面，本发明实施例提供了间充质干细胞在制备用于促进脂肪移植的制剂中的应用，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞。
第二方面，本发明实施例提供了间充质干细胞在制备用于激活脂肪移植早期的CCL2信号通路的制剂中的应用，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞。
第三方面，本发明实施例提供了间充质干细胞在制备用于在脂肪移植早期的募集巨噬细胞的制剂中的应用，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞。
第四方面，本发明实施例提供了间充质干细胞在制备用于促进脂肪细胞的重聚的药物中的应用，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞。
第五方面，本发明实施例提供了间充质干细胞在制备用于促进血管再生的药物中的应用，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞。
第六方面，本发明实施例提供了间充质干细胞在制备用于提高脂肪细胞的存活率的药物中的应用，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞。
第七方面，本发明实施例提供了间充质干细胞在制备用于抑制组织纤维化的药物中的应用，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞。
有益效果是：
本发明实施例提供了间充质干细胞在制备用于促进脂肪移植的制剂中的应用，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞(简称为EMSCs)。经过研究发现，相对于体细胞来源的MSCs，EMSCs的质量更稳定，且不受供体身体素质、疾病和治疗过程的影响，能够通过增强组织重构、血管新生、脂肪细胞存活和降低组织纤维化来促进脂肪移植。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例和试验例1提供的EMSCs促进人脂肪抽提后的重聚和移植的结果图；
图2为本发明试验例1中所提供的EMSCs促进脂肪重聚和存留的结果图；
图3为本发明试验例2中EMSCs在脂肪移植物中的存留与分化实验结果图；
图4为本发明试验例2中宿主小鼠组织参与对人类脂肪的移植的结果图；
图5为本发明试验例3中脂肪移植物的转录组学分析图；
图6为本发明试验例3中EMSC组中小鼠免疫应答以及炎症相关的基因的表达图；
图7为本发明试验例4中EMSCs的促移植作用依赖于CCL2的实验结果图；
图8为本发明试验例4中CCL2在EMSC促进脂肪移植中的作用的实验结果图；
图9为本发明试验例5中EMSCs或者PBS组的脂肪移植依赖于巨噬细胞的实验结果图；
图10为本发明试验例5中RNA测序分析结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的间充质干细胞在制备用于促进脂肪移植的制剂中的应用和制剂进行具体说明。
名词定义
本文中的“MSCs”是指间充质干细胞，是一种多能干细胞，存在于身体绝大多数组织间质中的一组具有多能性的细胞，它们参与组织稳态、修改以及再生过程。一旦从组织中分离并在体外扩增，MSCs能够自我更新、增殖并分化成多种其他类型的细胞，例如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、血管平滑肌、内皮细胞、神经细胞和肝细胞。MSCs与其他类型的干细胞不同，具有显著的免疫调节功能。
本文中的“hESCs”是指人胚胎干细胞，指一类取自早期胚胎，处于未分化状态，可以长期自我分化和自我更新，具有在一定条件下分化形成各种组织细胞潜能的细胞。在组分明确的支持条件下，可以基本上维持其基因稳态。
本文中的“EMSCs”是指来源于hESCs的MSCs。
技术方案
已往研究显示，与单独的脂肪抽提物移植相比，使用混合Ad-MSCs(来源于脂肪的间充质干细胞)的脂肪抽提物对颅面短小畸形进行矫正，移植物中脂肪细胞的体积及存活率显著提高。但是，由于依赖于供体的捐献，体细胞来源的MSCs质量不稳定，而且易被病原体污染。另外，来源于病人的Ad-MSCs的质量还可能受到疾病本身以及治疗过程的影响，而且难以从瘦小的病人体内获得大量的脂肪抽提物。
基于此，本发明实施例提供了一种间充质干细胞在制备用于促进脂肪移植的制剂中的应用，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞，即由hESCs细胞系诱导分化而成。
已往研究表明体细胞来源的MSCs可通过以下途径促进脂肪移植：(1)旁分泌(主要途径)；(2)直接分化为脂肪及血管细胞(次要途径)(Chen et al.2016；Fu etal.2013)。尽管如此，由什么因子介导其促移植作用依然不清楚。在本申请中，发明人使用hESCs来生产MSCs(EMSCs)，发现EMSCs能够促进脂肪移植，并通过活细胞示踪、RNA测序、基因敲除等方法揭示了介导该促进作用的新的机制。
在移植后的第1天可知，含EMSCs的脂肪移植物很快的就变成相互粘连、在悬浮到PBS之后依然保持完整的整体，而对照组移植物则更为松散、在悬浮于PBS后迅速分离。EMSCs通过促进细胞外基质(ECM)的重构以及脂肪细胞的重聚而像胶水一样帮助脂肪组织粘合在一起。这是一个新的发现，这个功能有助于EMSCs促进脂肪移植。在一些实施方式中，所述间充质干细胞还通过在移植早期提高血管再生和/或脂肪细胞的存活率，以促进脂肪移植。
在移植后的第14、30和90天可知，含EMSCs的移植物比对照组具有更好的移植效果，表现为移植物更大、更重而且在其表面含有更多的毛细血管。组织学分析也显示含EMSCs的移植物中存在较多的脂肪细胞和血管细胞和较少的纤维化和坏死组织。尽管移植物内大部分的EMSCs快速消失，但是依然还有少数的EMSCs能够存留到移植后第90天，其中部分EMSCs还分化成脂肪细胞和血管细胞。
为了剖析上述促移植作用的分子机制，发明人收集了移植后第1到90天的脂肪移植物(含或不含EMSCs)并进行RNA测序。结果显示，EMSCs组中与VEGF信号通路、PPAR信号通路、细胞因子相互作用和ECM形成相关的基因多数发生了上调。在这些基因中，EMSCs组的CCL2在移植后第一天起高表达并持续到第30天，尽管在后阶段的表达有所下降。
通过对EMSCs中的CCL2基因进行敲除，以检测其分泌的CCL2在脂肪抑制中的作用，结果显示，CCL2敲除后的EMSCs对脂肪移植物的促进效果下降，体现在移植物的大小，重量，血管数目以及移植物质量的降低。体外实验显示，CCL2敲除后，EMSCs对巨噬细胞的募集能力有所下降。因此，CCL2/Ccr2信号通路能帮助招募宿主巨噬细胞到移植物中从而促进脂肪再生。
巨噬细胞在脂肪移植的不同阶段起不同的作用，如在早期阶段促进移植物中ECM的重建以及血管再生，而在后期促进移植物纤维化。EMSCs能在早期帮助招募巨噬细胞而有利于脂肪移植。用抑制剂去除巨噬细胞后EMSCs的促脂肪移植作用消失，移植物变成不规则组织团快。在后期，含EMSCs的移植物中的CCL2的表达下调，这与巨噬细胞的数目下降以及纤维化减少相一致。这种阶段特异性的对巨噬细胞动员的调控能力在EMSCs促进脂肪移植的过程中发挥重要作用。
所述人胚胎干细胞所采用的细胞系不作具体限定，所有的hESC细胞系均可采用。在一些实施方式中，所述人胚胎干细胞选自以下任一细胞系：Envy、CT3、CT1，CT2，CT4、H1、H7、H9、H13和H14。
在一些实施方式中，所述间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：将人胚胎干细胞通过滋养层细胞中间态分化而成间充质干细胞；将分化得到的间充质干细胞进行培养，每隔5～7天传代一次。
所述制备方法为：申请号为CN201380036985.7的专利中，采用的将人胚胎干细胞衍生制备为间充质样干细胞的方法。
本发明实施例还提供了间充质干细胞在制备用于激活脂肪移植早期的CCL2信号通路的制剂中的应用，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞。需要说明的是，本实施例以及后续实施例中的间充质干细胞的制备方法同上述任一实施方式所述的间充质干细胞的制备方法，不再赘述。
本发明实施例还提供了间充质干细胞在制备用于在脂肪移植早期的募集巨噬细胞的制剂中的应用，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞。
本发明实施例还提供了间充质干细胞在制备用于促进脂肪细胞的重聚的药物中的应用，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞。
本发明实施例还提供了间充质干细胞在制备用于促进血管再生的药物中的应用，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞。
本发明实施例还提供了间充质干细胞在制备用于提高脂肪细胞的存活率的药物中的应用，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞。
本发明实施例还提供了间充质干细胞在制备用于抑制组织纤维化的药物中的应用，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例
本实施例提供EMSCs在脂肪移植中的应用。
材料与方法
hESCs和EMSCs
本研究中的所有实验都遵循美国国立健康研究院关于人类干细胞研究的指南进行。本研究中的所有的实验方案都已经获得澳门大学研究伦理委员会的批准。使用了两个hESCs细胞系，Envy(GFP+)(Costa et al.2005)和CT3(Martins-Taylor,et al.2011)。将hESCs通过滋养层细胞中间态分化成为MSCs(EMSCs)(Wang et al.2016)。
分化方案：将EMSCs培养于含20％胎牛血清，1％非必需氨基酸，1％谷氨酰胺的α-MEM培养基中，培养条件为37℃，5％CO2，每隔5-7天传代一次，实施例采用的EMSCs代数在第6-9代之间。
人类脂肪抽提物及基质血管成分(SVF)
从整形医院中获得人类脂肪抽提物，相应的澳门大学批准的人类伦理方案编号为：#BSERE17-APP019-FHS。脂肪供体为30-60岁之间的健康女性，他们到整形医院接受整形手术时将脂肪从她们的腹部或者大腿抽提出来以作为填充组织。在签署知情同意书后，多余的脂肪抽提物的一部分捐赠于本项目的研究。根据已报道的实验流程(Moscatello etal.2005)，通过1500rpm、5分钟的离心将脂肪抽提物与液体，油以及细胞碎片分离出来。随后，将脂肪抽提物与等体积的含有10％胎牛血清，10％二甲基亚砜的DMEM培养基相混合后，按照每管10ml的体积冻存于-80℃。在移植实验前最多冻存2～3周。
另外根据已发表的实验方案将SVF从新鲜的脂肪抽提物中分离出来(Fu etal.2013)。简而言之，使用0.075％的胶原酶I将脂肪抽提物在150rpm，37度的摇床上消化30分钟。随后在600g下离心10分钟以去除成熟的脂肪细胞及结缔组织。最后使用PBS重悬含有SVF的细胞沉淀，SVF中的细胞有台盼蓝染色后计数。
在小鼠中移植人类脂肪
所有动物使用都遵循澳门大学动物使用指南以及澳门大学动物伦理委员会批准的实验方案(#UMARE-043-2017)进行。实施例使用17-20克雌性无胸腺裸鼠作为实验对象，按照4只小鼠/组进行人类脂肪移植。小鼠按照正规流程饲养于鼠笼中。将0.2ml(200mg)的人类脂肪抽提物与悬浮于20μl PBS中的106EMSCs(Envy hESC细胞系，GFP+)混合后作为实验组(EMSC组)，脂肪抽提物与20μl PBS混合后作为阴性对照组(PBS组)。移植示意图请参照附图1中A。
根据已报道的实验方案(Chung et al.2013)，使用16G针头的1ml注射器将实验组或对照组的脂肪混合物注射到小鼠后背的两侧皮下。首先，先用针头在小鼠背部的皮肤下制造出一个皮下通道，随后将脂肪混合物注射到该通道中。注射后，使用6/0号的尼龙线对皮肤伤口进行缝合，术后未见出血。每天观察动物，并在特定的时间点取样分析。
需要说明的是，试验例1～5中提到的移植，均采用本实施例提供的方法进行。
试验例1
EMSCs促进脂肪重聚和存留
如附图1中A所示，移植后，每日观察小鼠，并在第1、14、30和90天将移植物收集分析。
具体地，在移植前，抽提的脂肪组织结构松散并能分散于PBS中。移植后24h，移植物的示意图如附图1中B所示，由附图可知，PBS组中的脂肪组织在PBS中快速解聚并成小块状，而EMSC组的脂肪组织则在PBS中保持完整的块状形态。
免疫染色显示(图2)，EMSC组中含有更多的活的脂肪细胞(perilipin+)和胞外基质(ECM)(胶原I阳性，ColI+)，EMSC组移植物的边缘清晰并且富含巨噬细胞(MAC2+)(图2中A)。已有研究表明，在抽提的脂肪组织中，脂肪细胞及其ECM受到剧烈的破坏(Erdimetal.2009；Eto et al.2009)。图2结果表明EMSCs可促进ECM重建以及脂肪细胞重聚。
移植后第90天的结果请参照附图1中C，不论从原位观察还是离体比较，EMSC组的移植物都比对照组的更大；另外从分离的移植物表面上看，对照组有更多的深色区域(纤维化)，而EMSC组有更多的红色区域(毛细血管富集)。
同时，从不同时间收集的EMSC组移植物的平均重量都比对照组高(附图1中D)。例如，第90天的对照组和EMSC组的移植物平均重量分别为30mg和70mg，分别为原始重量的16.7％和35.7％(附图1中E)。已有研究显示，脂肪移植后，机械损伤和血供不足可引起大多数移植的脂肪细胞死亡，表现为组织完整性受到破坏，在移植的脂肪组织特别是中心位置形成囊泡性空腔以及纤维化(Kato,Mineda,et al.2014)。
与PBS或EMSCs共移植后第90天(D90)移植物切片的H&E染色结果请参照附图1中F，基于两组多个D90移植物切片的H&E染色获得的移植物完整性、空腔数目和纤维化水平评分请参照附图1中G，可知与对照组相比较，在第90天的EMSC组的移植物中含有更多的均匀分布且完整的脂肪细胞，更少的空腔。而且，天狼星红及胶原I染色显示对照组含有更多的纤维化组织。
类似的结果也在另一种hESC细胞系(CT3)(Martins-Taylor,et al.2011)来源的EMSCs中发现(图2中C)。然而，与PBS对照组相比，HaCat细胞(角质细胞系，Boukamp etal.1988)却不能增加脂肪移植物的重量(图2中D)，说明了EMSCs能够特异的帮助脂肪移植物在体内的存留。此外，还比较了EMSC和分离自同一脂肪抽提物的SVF的作用，我们发现两者的效果类似，其移植物在第90天的重量都比对照组大(图2中E)。这些结果表明EMSC与SVF的促脂肪移植效果不相上下。
试验例2
EMSCs在脂肪移植物中的存活(图3)
为了追踪活的EMSC在脂肪移植物中的存留，将人类脂肪抽提物与使用慢病毒载体荧光素酶标记的EMSCs(Wang,Kimbrel et al.2014)共移植到裸鼠中，并在移植后的90天内持续追踪移植位点的荧光信号，检测结果请参照附图3中A。
由附图3中A可知，检测到移植后荧光信号逐步并显著的下降，特别是从第0天(D0)到第7天(D7)，信号急剧下降(约44％)，到第90天(D90)，则几乎检测不到荧光信号。PBS对照组则在全程检测不到任何信号(数据未给出)。
EMSCs的致瘤性
使用GFP阳性的EMSC与人类脂肪抽提物共移植后，从第3天到第90天分别从小鼠中收集脂肪移植物以及主要器官包括肺，肝，心脏，肾和脾脏等。基于外观观察及组织学分析，没有在这些组织器官中观察到任何肿瘤。
移植后D3和D90，将分离的脂肪移植物收集后提取总RNA，使用NanoDrop对总RNA定量后使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)将RNA反转录为cDNA。随后使用iTaq Universal SYBR Green试剂(Bio-Rad)在CFX96Touch RT-PCR仪器(Bio-Rad)上进行定量PCR分析。使用GFP阳性的EMSCs作为阳性对照，并以不同的EMSCs数目及其得到的Ct值做出标准曲线，从而对移植物中可能存在的EMSC数目进行定量。定量结果请参照附图3中B。
由结果可知，在脂肪移植物中的GFP基因的RNA水平随着时间急剧下降，而在其他的器官中都未能检测到其RNA。这些数据显示EMSCs在移植物中快速消失，说明EMSCs致瘤的可能性微乎其微。
EMSCs在脂肪移植物中的分化
在移植后30天，分别对脂肪+EMSCs(GFP+)组与脂肪+PBS组进行免疫染色，将GFP染成红色，平滑肌细胞标志蛋白αSMA染成绿色，细胞核使DAPI进行复染。标尺为50μm。
在移植后90天，分别对脂肪+EMSCs(GFP+)组与脂肪+PBS组进行免疫染色。GFP染成绿色，Perilipin染成红色，细胞核使用DAPI进行复染。标尺为50μm。
免疫染色：将石蜡切片按照以下程序进行脱腊水化：100％二甲苯，20分钟；100％，100％，95％，95％，90％和80％乙醇各5分钟，最后切片在PBS中洗涤3次。随后通过柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，并使用10％过氧化氢处理10分钟以去除内源性的过氧化物酶。切片进一步使用0.3％的Triton X-100进行透膜10min，PBS洗涤3次后使用5％BSA封闭1小时。随后使用特定的一抗包括豚鼠抗perilipin(Progen Biotechnik,Heidelberg,Germany),小鼠抗αSMA(eBiosciences,Sandiego,CA,USA),大鼠抗小鼠MAC-2(Cedarlane,Burlington,Ontario,Canada),和山羊抗GFP(Abcam,Cambridge,United Kingdom)对处理好的切片进行孵育，并使用相应的二抗包括Alex Fluor 568-山羊抗豚鼠,Alex Fluor 488-山羊抗小鼠,Alex Fluor488-驴抗山羊,and Alex Fluor 594-驴抗山羊抗体(Invitrogen,Carlsbad,California)进一步孵育后，使用DAPI进行细胞核复染。所有的切片都在Carl Zeiss AxioObserver显微镜下进行拍照并使用ZEN成像软件进行分析。
D30后转移物的免疫染色结果请参照附图3中C，D90后转移物的免疫染色结果请参照附图3中D。与对照组相比，在移植后30天，EMSC组移植物中含有更多的血管细胞(αSMA阳性)和活的脂肪细胞(perilipin阳性)。这些细胞的一部分同时显示GFP阳性，这些结果表明有一部分的EMSCs也分化成了血管平滑肌细胞和脂肪细胞。
宿主小鼠组织参与人类脂肪的移植
使用GFP小鼠作为人类脂肪移植的对象。将脂肪抽提物与CT3hESC来源的EMSCs混合皮下注射到GFP小鼠的后背两侧。观察到与在裸鼠中相似的结果，与对照组相比，移植后90天EMSC组中的移植物更大，更重(图4中A)。
另外，除了少量的细胞显示von Willebrand因子(VWF，血管内皮细胞的标志基因)及GFP双阳性外(图4中B)，所有Perilipin阳性的细胞都不是GFP阳性的(图4中C)，此结果说明了宿主细胞对脂肪再生和血管再生的贡献微乎其微。
试验例3
脂肪移植物的转录组学分析
为了进一步阐明移植物的组成并揭示EMSC促进脂肪移植的分子机制，对不同时间点(第1，7，14，30和90天)的EMSC组和PBS组的脂肪移植物进行RNA测序分析，样本分离和分析示意图请参照附图5中A。
RNA测序：我们将同时间点同组的4个脂肪移植物混合在一起，使用组织匀浆器将移植物裂解于Trizol中(Thermofisher)。随后我们使用RNeasy Lipid Tissue Mini Kit(Qiagen)试剂盒进行RNA提取，并使用Nano RNA Bioanalyzer(Agilent Technologies)对RNA进行定量及质量评价。RNA integrity number(RIN)≥8的样本则可以使用NEBNextUltra TM Directional RNA Library Prep Kit for Illumina(New England BioLabs)将其用来制备下一代测序的文库。
使用移植前的脂肪以及与EMSC混合后的脂肪作为标准化的对照。随后，将测序读数值分别匹配到人类及小鼠基因组上，为防止混淆，排除了同时匹配到人类及小鼠基因组的数值。
脂肪+PBS与脂肪+EMSC组在移植前及移植后D1-D90的RNA测序结果映射到人类基因组(蓝色)和小鼠基因组(橙色)的比例请参照附图5中B。
由结果可知，在移植24小时后，对照组中的人类RNA在总RNA的占比由98％下降到5％，而小鼠RNA则由2％上升到98％，并且持续到移植后第90天。EMSC组人类的RNA则由24小时的30％逐渐下降到第90天的12％。由于在脂肪细胞中，脂滴占据了大部分空间，因此RNA的量在单独的脂肪抽提物中的量要比与EMSC混合后或者被宿主细胞浸染后的脂肪移植物要少得多。因此，人类RNA占比的下降以及小鼠RNA占比的上升或许可以解释为移植后大部分人类脂肪细胞快速死亡，同时大量的小鼠细胞浸染到移植物中。这个结论与前面观察到的脂肪移植物在移植后快速收缩相一致。EMSCs减少移植物收缩可能与其增大移植物细胞数目以及提高移植物中的脂肪细胞的存活率有关。
通过将移植后的每个时间点的EMSC组和PBS组的测序数值匹配到人类基因组后，发现了许多差异表达基因(DEGs)，样本的RNA测序中人类基因的表达热图请参照附图5中C。在颜色标尺中，从蓝到红(自下而上)根据Log2表达倍数变化(FC)(-2到2)来分配，分别表示在每个时间点含EMSCs移植组相对于PBS对照组中的相应基因表达水平的下降或者上升。
EMSCs移植组中与脂肪再生有关的人类基因的表达变化的箱式图请参照附图5中D，每个图代表一个信号通路或者功能组。根据基因本体注释，依照样本中显著性富集的DEGs绘制的热图请参照附图5中E；颜色显示方式与图5中C中一致。由图5中D和E可知，许多上调的基因与VEGF通路、细胞因子间的相互作用、PPAR信号通路和ECM受体相互作用相关，这与EMSC组移植物的血管再生，脂肪再生以及ECM重建的现象相一致。
与此一致的是，与对照组相比，EMSC组中的分泌性的人类趋化因子和细胞因子包括CCL2，CCL5，CCL8和IL16的表达水平更高，具体请参照附图5中F，样本中编码人类分泌因子的基因热图，图中，每组中移植后样本的基因上调及下调水平都与对应的移植前(D0)的样本相比较(图6中A)。另一方面，EMSC组中小鼠免疫应答以及炎症相关的基因包括CCL2信号通路中的靶基因的表达也更高(图6中B)。
CCL2(或者MCP1)是一种与其受体CCR2具有高亲和力的细胞因子，与通过Pearson关联分析发现的小鼠Ccr2受体与人CCL2显著相关的结果相一致(图6中C)，另外CCL2还是单核细胞和巨噬细胞的趋化因子。巨噬细胞在脂肪移植中扮演了阶段性的角色，包括在早期促进ECM重建和血管新生以及晚期促进纤维化。
另外，RNA测序结果也显示两者的基因表达具有关联性，这说明EMSCs分泌的CCL2可能通过结合并激活小鼠巨噬细胞上的Ccr2来募集它们到达移植物的位置。
试验例4
EMSC对脂肪移植的促进作用依赖于CCL2-Ccr2信号通路。
通过qPCR验证了移植早期(第1，7和14天)脂肪移植物中人类CCL2以及小鼠Ccr2的表达，CCL2的RNA表达水平请参照附图7中A，Ccr2的RNA表达水平请参照附图7中B，图7中A和B中，GAPDH作为内参，*P<0.05，**P<0.01。结果显示，虽然在第7和14天时，在两组中的Ccr2的表达都发生下降，但是与对照组相比，EMSC组中的CCL2及Ccr2的表达都更高。
随后，使用慢病毒介导CCL2特异的sgRNA/Cas9将EMSC中CCL2基因进行敲除(EMSCsgCCL2-1和EMSC sgCCL2-2)。同时我们使用慢病毒介导的乱序sgRNA/Cas9转导的EMSC(EMSC sgControl)作为阴性对照。
CCL2基因敲除：为构建sgCCL2的慢病毒载体，设计合成了CCL2特异的寡核苷酸序列并克隆到BsmBI酶切的LentiCRISPRv2(Addgene#52961)中。设计在人类基因组中没有识别位点的寡核苷酸序列作为阴性对照。随后将使用lipofectamine 3000(invitrogen)将构建好的慢病毒穿梭载体与包膜质粒pMD2.G，包装质粒pCMV delta R8.2(Addgene#12259and12263)共同转染到293FT细胞中以包装病毒。随后将收集的病毒感染EMSCs，并使用嘌呤霉素(1μg/ml)进行筛选2周。最后，将得到的EMSCs进行敲除的验证。为了验证CCL2的敲除，收集EMSC的裂解液使用western印迹检测CCL2的表达。首先使用CCL2(Abcam,ab214819)抗体孵育过夜，随后与对应的HRP标记的二抗进行孵育。最后使用Clarity TM Western ECL底物在ChemiDoc成像系统(Bio-Rad)中成像。为了检测CCL2的分泌，收集EMSCs培养48小时后的上清后使用CCL2ELISA试剂盒(R&D systems,DCP00)，按照厂商的说明测定CCL2的分泌。
Western印迹结果请参照图8中A，免疫酶联反应检测野生型和CCL3敲除的EMSCs的培养上清中CCL2的水平请参照图7中C(**P<0.001，***P<0.0001)，由结果可知，EMSCsgCCL2-1中CCL2的表达降低接近一半，而在EMSC sgCCL2-2中几乎完全消失。因此，采用EMSC sgCCL2-2用于后续的实验。
巨噬细胞对CCL2敲除及未敲除的EMSC的应答。
通过Transwell系统检测RAW264.7(小鼠巨噬细胞系)朝向培养在底面的EMSC的迁移能力。
Transwell的巨噬细胞迁移实验：使用3.0-μm孔径的Transwell小室系统，将1ⅹ105EMSCs接种到Transwell培养板的底面，培养过夜后，我们将1ⅹ105RAW264.7巨噬细胞接种于Transwell小室的膜上。继续在37℃，5％CO2下培养24小时后，收集Transwell小室，固定后使用结晶紫染料染色后，在显微镜下选择随机5个区域对跨膜巨噬细胞进行拍照(20X)和计数(**P<0.01，n＝3)。
拍照结果请参照附图7中D，计数结果请参照附图7中E。由结果可知，与对照组相比，CCL2敲除的EMSC组中RAW264.7细胞迁移得更少。
此外，使用CCL2中和抗体处理的EMSC条件培养基培养的RAW264.7细胞的迁移能力也下降(图8中B和图8中C)。这些结果表明EMSCs可能通过CCL2/Ccr2信号通路来募集巨噬细胞。
CCL2在EMSC促进脂肪移植中的作用。
分别将人类脂肪抽提物与EMSC sgCCL2-2，EMSCsgControl以及PBS共移植，并在移植后的第14，30及90天后收集样品并称重。
移植后D90原位以及离体的移植物的拍照结果请参照附图7中F，在第90天，与EMSCsgControl相比，EMSC sgCCL2-2组的脂肪移植物中含有更多的深色(纤维化及坏死)区域及囊腔。
不同时间点移植物的重量结果请参照附图7中G，可知从第0天到第90天，各组的脂肪移植物逐步的缩小，重量减轻。与PBS组相比，EMSC sgControl组中移植物的重量相对更大。而EMSC sgCCL2-2组中的移植物的重量与EMSC sgControl组相比仅有少量的无显著性的下降。
D90移植物于D0相比的存留率结果请参照附图7中H(*P<0.05，n＝4)。与PBS及EMSCsgCCL2-2组相比，EMSC sgControl组的移植物中含有更多完整的脂肪细胞，血管以及更少的纤维化，坏死及囊腔(参照附图8中D和E)。
这些结果表明EMSCs促进脂肪移植至少有一部分机制是通过分泌CCL2来募集巨噬细胞来完成的。
试验例5
EMSCs在脂肪移植的不同阶段对巨噬细胞的动员。
由于发明人发现早期EMSC-脂肪移植物中含有显著增多的巨噬细胞，因此，本试验例验证这些巨噬细胞如何在脂肪移植物中产生作用的。
实验示意图请参照附图9中A，分别在移植后第0，2，4和6天为清除巨噬细胞，从脂肪移植开始，每两天将0.5ml/100g动物体重的氯膦酸盐脂质体及PBS脂质体(Liposoma BV)分别皮下注射到脂肪移植物内，然后在第7天收集移植物样本。
移植7天后的移植物图请参照附图9中B。由结果可知，当使用PBS脂质体(阴性对照)注射后，与PBS对照组(白色表面)相比，在EMSCs组中的移植物(红色表面)表面有更多的毛细血管。而当使用氯膦酸盐脂质体注射时，不论PBS对照组还是EMSCs组中的移植物表面都呈现白色，显示没有毛细血管的存在。
移植7天后移植物的重量结果请参照附图9中C，可知，无论在PBS对照组还是EMSCs组中，所有使用氯膦酸盐脂质体处理的移植物的重量都比使用PBS脂质体处理的更重。
另外，还分别通过MAC2和GFP免疫染色确认了移植物中巨噬细胞的清除以及EMSC(GFP阳性)的存留。移植7天后移植物切片后的H&E染色结果请参照附图9中D，移植7天后移植物免疫荧光染色结果请参照附图9中E，发现，在氯膦酸盐脂质体处理的第7天移植物中，脂肪细胞被无规则的细胞团所取代。
通过对不同组别的RNA测序结果分析后得到差异表达基因的分群并通过热图方式显示(图10中A)。另外，韦恩图显示有1591个基因的表达上调和1064个基因的表达下调同时在对照组及EMSC组中发现(图10中B)。功能及信号通路分析显示，与PBS脂质体处理组相比，在氯膦酸盐脂质体处理的EMSC脂肪移植物中的免疫，炎症应答以及凋亡相关的基因表达都发生上调，而细胞粘附，血管新生相关的基因表达则发生下调(图10中C)。类似的表达谱变化也发生在PBS脂肪移植物中(图10中D)。这些结果显示，不论EMSCs存不存在，巨噬细胞都是脂肪移植所必须的，它们通过抑制炎症及凋亡，促进细胞粘附与血管再生来发挥作用。EMSC的促移植作用可能有一部分是通过早期募集和激活巨噬细胞来完成的。
由于在脂肪移植的后期，聚集的巨噬细胞会促进纤维化，因此在这个阶段减少巨噬细胞的聚集会帮助脂肪移植物的重塑。有趣的是，我们的结果显示，在移植的第90天，与PBS组相比，EMSC组中含有更少的巨噬细胞，这与其含有更少的纤维化相一致(图9中E)。这些结果表明，EMSC在脂肪移植过程中在不同阶段对巨噬细胞动员发挥不同的作用，比如在移植早期募集巨噬细胞来促进移植物存活，而在后期清除巨噬细胞来降低纤维化作用。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (10)
1.间充质干细胞在制备用于促进脂肪移植的制剂中的应用，其特征在于，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞。
2.间充质干细胞在制备用于激活脂肪移植早期的CCL2信号通路的制剂中的应用，其特征在于，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞。
3.间充质干细胞在制备用于在脂肪移植早期的募集巨噬细胞的制剂中的应用，其特征在于，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞。
4.间充质干细胞在制备用于促进脂肪细胞的重聚的药物中的应用，其特征在于，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞。
5.间充质干细胞在制备用于促进血管再生的药物中的应用，其特征在于，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞。
6.间充质干细胞在制备用于提高脂肪细胞的存活率的药物中的应用，其特征在于，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞。
7.间充质干细胞在制备用于抑制组织纤维化的药物中的应用，其特征在于，所述间充质干细胞来源于人胚胎干细胞。
8.根据权利要求1～7任一项所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞的制备方法如下：将人胚胎干细胞通过滋养层细胞中间态分化而成间充质干细胞，将分化得到的间充质干细胞进行培养，每隔5～7天传代一次。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述制备方法为：申请号为CN201380036985.7的专利中，采用的将人胚胎干细胞衍生制备为间充质样干细胞的方法。
10.根据权利要求1～8任一项所述的应用，其特征在于，所述人胚胎干细胞选自以下任一细胞系：Envy、CT3、CT1，CT2，CT4、H1、H7、H9、H13和H14。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200821 |
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