CN111549108B - 一种不同剩余采食量对蛋鸭肠道微生物组成、功能差异分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种不同剩余采食量对蛋鸭肠道微生物组成、功能差异分析方法，属于微生物技术领域，该方法通过比较不同剩余采食量个体之间盲肠菌群，找出候选的差异菌群，为以后提高蛋鸭养殖经济效益提供一些思路。本发明的分析结果证明盲肠肠道菌群的丰度和多样性与剩余采食量相关。在不同剩余采食量的绍兴鸭群体中，Chao1指数、Shannon指数以及Simpson指数都有显著差异，在β多样性指数中，根据T检验结果在属水平筛选出18个显著差异菌群，其中LRFI组有17个菌群显著高于HRFI组，且大多数为降解碳水化合物以及产生丁酸盐和丙酸盐的菌群，从营养的角度来看，提高了饲粮的利用效率并且能量转化也相对提高。

Description

一种不同剩余采食量对蛋鸭肠道微生物组成、功能差异分析 方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体地说，涉及一种不同剩余采食量对蛋鸭肠道微生物组成、功能差异分析方法。

背景技术

目前，肠道微生物在动物营养中的作用受到越来越多的关注，益生菌、酶制剂等被添加进动物饲料中，探究肠道微生物消化吸收、能量代谢中的作用。益生菌和酶制剂有利于肠道益生菌的增殖，抗生素则用来治疗细菌感染，畜牧生产过程中存在抗生素等药物滥用的问题，导致耐药细菌的出现，同之前能够杀灭细菌的药物的治疗效果明显降低，甚至可能没有效果，超级细菌会给畜禽和人类的健康带来更大的威胁，，可能会导致不可控的后果^[79-81]。因此减少抗生素在动物饲料中的使用已成为改善牲畜健康的一个非常重要的措施，在减抗和无抗的研究过程中，人们发现机体内的微生物协同机体免疫保卫机体健康因此肠道微生物的研究越来越受关注。动物生产性能的纵向挖掘进程缓慢，因此学者们想在横向上有所突破，研究肠道微生物和生产性能的关系，进而通过改变肠道微生物提高生产性能。

肠道菌群是宿主代谢(如葡萄糖处理)的既定调节因子。尽管公众都承认肠道菌群会对宿主葡萄糖稳态产生影响，但其潜在机制尚不清楚。肠道微生物群也是肠道衍生血清素合成的有效中介，而这种血清素的外周来源本身就是葡萄糖稳态的调节器。Martin AM通过药物抑制和改变基因抑制内脏来源的血清素合成，发现由抗生素引起的微生物区系组成变化所引起的宿主葡萄糖处理的改善依赖于外周血清素的合成。胃肠道微生物群对动物的整体健康和生产性能有重要的影响，这推动了学者对胃肠道微生物群组成、影响微生物组成的因素、以及微生物群对健康、生长性能和宿主行为的影响的深入研究，养猪生产研究主要集中在评估饲料添加剂和饮食调整来选择性改变胃肠道微生物从而提高健康水平和饲料转换效率。粪便微生物群移植(FMT)作为一种可能的通过操纵胃肠道微生物群来改善猪的预后的工具，这是一个新型的研究方向，这个治疗手段存在一定的局限，首先就是内在生物安全性和监管问题，因为供体不被需要的的微生物群永远不可能被完全筛除。然而，考虑到FMT在人类疾病治疗方面的成功，这种策略在猪生产中的应用也值得研究。此外，FMT有利于对特定结果产生至关重要的特定菌群的鉴定，从而开发出可用于靶向治疗的克隆体库。Zhang Y等研究饲粮中添加粪肠球菌(Enterococcus faecalis)对蛋鸡产蛋、产蛋质量和盲肠菌群的影响，结果发现添加粪肠球菌不会对鸡产蛋率、蛋品质造成影响，但可以显著提高饲料转化率，并且显著影响肠道菌群的结构，添加粪球菌组疣微菌门(Verrucomicrobia)和蓝藻菌门(Cyanobacteria)的相对丰度显著提高,粪杆菌属(Faecalibacterium)、克里斯滕森菌属(Christensenellaceae)、瘤胃球菌P属(Coprostanoligenes)相对丰度显著提高。

发明内容

本发明的目的在于提出了一种不同剩余采食量对蛋鸭肠道微生物组成、功能差异分析方法，该方法通过比较不同剩余采食量个体之间盲肠菌群，找出候选的差异菌群，为以后提高蛋鸭养殖经济效益提供一些思路。

其技术方案如下：

一种不同剩余采食量对蛋鸭肠道微生物组成、功能差异分析方法，包括以下步骤：

步骤1、肠道内容物细菌总DNA提取

1).将不同组别的内容物样本放入2ml离心管中。

2).在离心管中加入裂解缓冲液(含有溶菌酶)750μl和瓷珠，并将样品放入到匀浆仪器中以70次/s速度匀浆2min

3).把离心管从匀浆仪中取出，放入37℃的水浴锅中孵育30min

4).向离心管中加入85μl的浓度为10％SDS溶液和20μl蛋白酶K，涡旋震荡5min

5).再次将离心管置于60℃水浴锅中，孵育30min

6).向离心管中加入Tris-饱和酚：氯仿；异丙醇混合液(体积比为25：24：500)

7).将离心管放入研磨器中以70次/s的速度研磨10min

8).取出离心管，在4℃、13200r/min的条件下，离心5min

9).吸取上清，加入Tris-饱和酚：氯仿：异丙醇混合液(体积比为25：24:500μl，涡旋振荡30s

10).在4℃、13200r/min的条件下，离心5min

11).吸取上请，加入氯仿500μl，涡旋振荡30s

12).在4℃、13200r/min的条件下，离心5min

13).吸取上清，加入无水乙醇750μl和乙酸钠溶液35μl，-20℃静置过夜，使DNA充分沉淀。

14).将DNA冻融是冷冻和融化的意思后，在4℃、13200r/min的条件下，离心5min。

15).弃去乙醇和乙酸钠溶液，向离心管中加入70％的乙醇1ml，涡旋振荡。

16).在4℃、13200r/min的条件下，离心5min，弃去70℃乙醇。

17).室温晾干后，加入50μl双蒸水重悬，测定样本浓度，-80℃保存。

步骤2、测序

产物送浙江天科高新技术发展有限公司完成后续测序部分。

步骤3、统计分析

为了系统比较不同剩余采食量的绍兴鸭表型和肠道内容物微生物的组成与差异，使用SPSS22.0进行数据分析，以单因素方差LSD法进行多重比较，P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。

进一步，多样性指数分析结果为：LRFI组在菌群丰富度上显著高于HRFI组，P<0.05、；、LRFI组菌群多样性显著高于HRFI组，P<0.05；HRFI组与LRFI组在组内菌群多样性以及均匀度上均高于0.95，并且LRFI组有高于HRFI的趋势。

本发明的有益效果为：

本发明的分析结果证明盲肠肠道菌群的丰度和多样性与剩余采食量相关。在不同剩余采食量的绍兴鸭群体中，Chao1指数、Shannon指数以及Simpson指数都有显著差异，在β多样性指数中，根据T检验结果在属水平筛选出18个显著差异菌群，其中LRFI组有17个菌群显著高于HRFI组，且大多数为降解碳水化合物以及产生丁酸盐和丙酸盐的菌群，从营养的角度来看，提高了饲粮的利用效率并且能量转化也可能相对提高，这也就可以解释LRFI组在低采食的情况下能不影响产蛋量以及产蛋重的原因。

附图说明

图1是稀释曲线以及Rank Abundance曲线，其中，A为稀释曲线；B为RankAbundance曲线；

图2是不同RFI盲肠微生物α多样性，其中，A为Chao1指数图；B为Shannon指数图；C为Simpson指数图；

图3是属水平上HRFI组与LRFI组中微生物TOP10组成；

图4是HRFI组与LRFI组门水平优势菌群；

图5是不同RFI组主成分分析；

图6是属水平上HRFI-LRFI组间菌群差异分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂及仪器

试剂：氯仿、乙醇、乙酸钠、异戊醇和异丙醇购自浙江天科公司；Tris-饱和酚(waryoung)、溶菌酶(sigma)、蛋白酶K(aladdin)、研磨珠(servicebio)购自上海捷瑞生物公司；

仪器：匀浆仪器(The MiniBeadBeater-1)购自美国Biospec公司；电热恒温水浴槽(DK-8D)购自上海森信实验仪器有限公司；涡旋振荡器(HYQ-2121A)购自上海川翔生物科技有限公司；电子分析天平(BS 200WEI)购自北京赛多利斯天平有限公司；离心机(ThermoMicroCL 21R)购自美国赛默飞科技公司。

1.1.2试验动物

试验用绍兴鸭均来自于绍兴市诸暨市国伟禽业绍兴鸭国家级保种场，从核心群体中选取300只400日龄的绍兴鸭，饲养于3层笼养鸭舍，每个笼位间用隔板隔开，避免因互相啄食饲料而造成实验误差。饲料使用上海香川饲料有限公司的产蛋鸭高峰期配合饲料(蛋倍利)预饲期为10天，正式试验周期60天(即从410天-470天)。期间记录个体采食量，产蛋重，初体重，末体重。

1.2试验方法

1.2.1直肠内容物采集

试验结束后对300只鸭子进行采血，使用人用静脉真空采血管翅下取2ml血液摇匀后放入冰盒内保存，转运到实验室后放入-20℃冰箱保存。根据记录数据计算剩余采食量。挑选出高RFI、低RFI个体各15只进行屠宰，收集十二指肠、盲肠以及直肠内容物约2ml置于灭菌的冻存管中，然后立即放入液氮罐中保存；取十二指肠中部剪下2cm左右组织样用无菌磷酸盐缓冲液冲洗干净后，剪碎放入灭菌冻存管中，立即放入液氮中保存，取下丘脑组织样置于灭菌冻存管中，并放入液氮中保存，上述组织样在转运回实验室后，冻存管中样品全部分类放置于冻存盒中置于-80℃超低温冰箱中保存。

1.2.2肠道内容物细菌总DNA提取

肠道内容物细菌总DNA提取

1.将不同组别的内容物样本放入2ml离心管中。

2.在离心管中加入裂解缓冲液(含有溶菌酶)750μl和瓷珠，并将样品放入到匀浆仪器中以70次/s速度匀浆2min

3.把离心管从匀浆仪中取出，放入37℃的水浴锅中孵育30min

4.向离心管中加入85μl的浓度为10％SDS溶液和20μl蛋白酶K，涡旋震荡5min

5.再次将离心管置于60℃水浴锅中，孵育30min

6.向离心管中加入Tris-饱和酚：氯仿；异丙醇混合液(体积比为25：24：500)

7.将离心管放入研磨器中以70次/s的速度研磨10min

8.取出离心管，在4℃、13200r/min的条件下，离心5min

9.吸取上清，加入Tris-饱和酚：氯仿：异丙醇混合液(体积比为25：24:500μl，涡旋振荡30s

10.在4℃、13200r/min的条件下，离心5min

11.吸取上请，加入氯仿500μl，涡旋振荡30s

12.在4℃、13200r/min的条件下，离心5min

13.吸取上清，加入无水乙醇750μl和乙酸钠溶液35μl，-20℃静置过夜，使DNA充分沉淀。

14.将DNA冻融是冷冻和融化的意思后，在4℃、13200r/min的条件下，离心5min。

15.弃去乙醇和乙酸钠溶液，向离心管中加入70％的乙醇1ml，涡旋振荡。

16.在4℃、13200r/min的条件下，离心5min，弃去70℃乙醇。

17.室温晾干后，加入50μl双蒸水重悬，测定样本浓度，-80℃保存。

1.2.3测定方法

产物送浙江天科高新技术发展有限公司完成后续测序部分。

1.3统计分析

为了系统比较不同剩余采食量的绍兴鸭表型和肠道内容物微生物的组成与差异，使用SPSS22.0进行数据分析，以单因素方差LSD法进行多重比较，P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。

2结果与分析

2.1 Alpha多样性分析

2.1.1稀释曲线和Rank abundance曲线

稀释曲线和Rank abundance曲线是常见的描述组内样品多样性的曲线。其中稀释曲线可以直观的反映得到的数据量的合理性，同时也能反映出物种的丰度。而Rankabundance曲线则可以直接的反映物种的丰度和均匀度，水平方向反映物种丰富度，曲线跨度越大，丰富度越高，垂直方向反映样品均匀度，曲线越平缓，物种分布越均匀。由图1可知，LRFI组各样本稀释曲线基本都在上部，HRFI组大部分分布在下部；LRFI组Rank abundance曲线在垂直方向上较为平缓且在水平方向上跨度较大，HRFI组各样品曲线垂直方向与LRFI组差异不大，水平方向上跨度均较小。

2.1.2多样性指数分析

在微生物多样性中Chao1用来计算菌群丰富度，Shannon指数以及Simpson指数用来表示菌群多样性。由图2左上Chao1指数图可以得知，LRFI组在菌群丰富度上显著高于HRFI组(P<0.05)；右上Shannon指数中可以得知LRFI组菌群多样性显著高于HRFI组(P<0.05)；在左下Simpson指数图中可以得知，HRFI组与LRFI组在组内菌群多样性以及均匀度上均高于0.95，并且LRFI组有高于HRFI的趋势。

2.2菌群结构组成分析

为了解高低剩余采食量组间盲肠微生物组成的情况，根据OTUs结果在属水平对各组排名前十的微生物物种进行分析如图3，其中HRFI组Bacteroides(26.48％)、Faecalibacterium(7.78％)、Anaerobiospirillum(3.38％)以及Mucispirillum(2.81％)，LRFI组中Bacteroides(22.77％)、Faecalibacterium(5.10％)、Anaerobiospirillum(1.29％)以及Mucispirillum(1.00％)，HRFI组以上菌群相对丰度均高于LRFI组，而LRFI组中Rikenellaceae(3.67％)则高于HRFI组中Rikenellaceae(2.21％),并且LRFI组未知的微生物菌群比HRFI组高了7.96％。

对各组菌群聚类分析门水平上优势菌群的分布情况，由图4得知，在LRFI组中厚壁菌门Firmicutes和拟杆菌门Bacteroidetes丰度较高，而相对而言在HRFI组中变形菌门Proteobacteria丰度较高。

随后，基于Unweighted Unifrac距离来进行PCoA分析矩阵的主坐标是否依赖于RFI。根据PCoA的结果进行分析，发现HRFI组与LRFI组的微生物群落明显分离(见图5)。

为了确定是哪些微生物导致在高低剩余采食量鸭群的微生物群落组成的差异，我们做了组间T-test检验，在属水平，共有18个差异菌群，其中HRFI组仅有Mycoplasma(支原体，柔壁菌门)极显著高于LRFI组(P<0.01)；而在LRFI组中Rikenellaceae_RC9_gut_group(理研菌科-RC9，拟杆菌门)、Eubacterium]_coprostanoligenes_group(粪球菌真核菌群，厚壁菌门)、Ruminococcaceae_UCG-010(瘤胃球菌科-UCG-010，厚壁菌门)、Barnesiella(巴恩斯菌，拟杆菌门)、Ruminococcus_2(瘤胃球菌属-2，厚壁菌门)、Lachnoclostridium(厚壁菌门)、Ruminococcaceae_NK4A214_group(瘤胃球菌科-NK4A214，厚壁菌门)、Ruminococcaceae_UCG-009(瘤胃球菌科-UCG-009，厚壁菌门)、Olsenella(欧陆森氏菌属，放线菌门)、Eisenbergiella(厚壁菌门)、Syntrophococcus(互养球菌属，厚壁菌门)、Enorma(放线菌门)、Escherichia-Shigella(大肠杆菌志贺菌，变形菌门)、Fusibacter(梭菌目未知属，厚壁菌门)显著高于HRFI组(P<0.05)，Christensenellaceae_R-7_group(克里斯滕森菌科R-7群，厚壁菌门)、Oribacterium(毛螺菌科未知属，厚壁菌门)、Papillibacter(瘤胃球菌科未知属，厚壁菌门)LRFI组极显著高于HRFI组(P<0.01)(见图6)，并且绝大多数为厚壁菌门菌群。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种不同剩余采食量对蛋鸭肠道微生物组成、功能差异分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、肠道内容物细菌总DNA提取；

1）将不同组别的内容物样本放入2 ml离心管中；

2）在离心管中加入含有溶菌酶的裂解缓冲液750μl和瓷珠，并将样品放入到匀浆仪器中以70次/s速度匀浆2 min；

3）把离心管从匀浆仪中取出，放入37℃的水浴锅中孵育30 min；

4）向离心管中加入85μl的浓度为10% SDS溶液和20μl蛋白酶K，涡旋震荡5 min；

5）再次将离心管置于60℃水浴锅中，孵育30 min；

6）向离心管中加入Tris-饱和酚：氯仿：异丙醇混合液；

7）将离心管放入研磨器中以70次/s的速度研磨10min；

8）取出离心管，在4℃、13200r/min 的条件下，离心5min；

9）吸取上清，加入Tris-饱和酚：氯仿：异丙醇混合液，涡旋振荡30s；

10）在4℃、13200r/min 的条件下，离心5min；

11）吸取上清，加入氯仿500μl， 涡旋振荡30s；

12）在4℃、13200r/min的条件下，离心5min；

13）吸取上清，加入无水乙醇750μl和乙酸钠溶液35μl， -20℃静置过夜，使DNA充分沉淀；

14) 将DNA冻融后，在4℃、13200r/min 的条件下，离心5min；

15) 弃去乙醇和乙酸钠溶液，向离心管中加入70%的乙醇1ml， 涡旋振荡；

16) 在4℃、13200r/min 的条件下，离心5min，弃去70℃乙醇；

17) 室温晾干后，加入50μl双蒸水重悬，测定样本浓度， -80℃保存；

步骤2、测序；

步骤3、统计分析；

为了系统比较不同剩余采食量的绍兴鸭表型和肠道内容物微生物的组成与差异，使用SPSS22.0进行数据分析，以单因素方差LSD法进行多重比较，P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著，多样性指数分析结果为：低剩余采食量组在菌群丰富度上显著高于高剩余采食量组，P<0.05；低剩余采食量组菌群多样性显著高于高剩余采食量组，P<0.05；高剩余采食量组与低剩余采食量组在组内菌群多样性以及均匀度上均高于0.95，并且低剩余采食量组有高于高剩余采食量的趋势；

其中高剩余采食量组仅有Mycoplasma极显著高于低剩余采食量组；而在低剩余采食量组中Rikenellaceae_RC9_gut_group、Eubacterium_coprostanoligenes_group、Ruminococcaceae_UCG-010、Barnesiella、Ruminococcus_2、Lachnoclostridium、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Ruminococcaceae_UCG-009、Olsenella、Eisenbergiella、Syntrophococcus、Enorma、Escherichia-Shigella、Fusibacter显著高于高剩余采食量组，Christensenellaceae_R-7_group、Oribacterium、Papillibacter低剩余采食量组极显著高于高剩余采食量组；

所述步骤1中，Tris-饱和酚：氯仿：异丙醇混合液的体积比为25: 24: 500。