CN111537635B - 精确配制醋酸标准曲线溶液及保护氨基酸醋酸检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种精确配制醋酸标准曲线溶液及保护氨基酸醋酸检测方法，包括以下步骤：S1、配制醋酸储备液，精密称取设计量的无水乙酸钾，根据检测浓度需求，加超纯水定容后得到设计浓度的醋酸储备液；S2、配制醋酸标准曲线溶液，对储备液进行加超纯水稀释，得到设计浓度的醋酸标准曲线溶液，配制时，加入设计量的三氟乙醇或甲醇等步骤。本发明通过改进标准曲线的配方，让标准曲线配制过程更简便、准确，避免使用有机溶剂，不仅减少了溶剂的挥发，还降低了检测成本；同时，通过采用离子色谱法来检测，并通过设计合理的梯度条件，使干扰峰与目标峰有效分离，最终使目标峰表现明显，易于判断、计算，解决了现有技术易出现误判和错判的问题。
Description
技术领域
本发明涉及保护氨基酸醋酸检测技术领域，特别涉及一种精确配制醋酸标准曲线溶液及保护氨基酸醋酸检测方法。
背景技术
随着多肽合成的发展，市场对保护氨基酸需求越来越大，同时对保护氨基酸的质量要求也越来越严苛。通过大量实践，保护氨基酸中含有的醋酸杂质对终产品的质量控制有较大的消极影响，所以客户对保护氨基酸中的醋酸控制很严格，通常控制在200ppm以下，更有甚者控制在50ppm以下，而如何对醋酸含量进行精确控制，首先需要一种准确度高、检测精度高的高效检测方法来检测醋酸含量，进而为质量控制提供可靠的检测数据。
在现有技术中，现有的技术方案大多都存在醋酸标准曲线配制过程复杂，质控标准低于定量限，检测结果误差大等缺点，例如，现有的技术方案大多采用气相色谱法检测保护氨基酸中的醋酸，也有部分采用高效液相色谱法对其进行检测，其都普遍存在以下缺点：
1、配制醋酸标准曲线溶液时，一般是在溶剂(一般为有机溶剂，如四氢呋喃、DMF等)中加入醋酸，通过精密称量、稀释得到标准曲线的浓度，进而得到醋酸标准曲线溶液。在该配制方法中，溶剂和醋酸易挥发，称样量少，过程困难，称样结果误差大，配制的醋酸标准曲线溶液浓度不稳定、不准确，导致得到的标准曲线误差大，进而使检测结果误差大，并且，挥发的醋酸气体会腐蚀设备，影响检测设备(例如天平)的使用寿命。
2、气相和液相色谱图中存在很多其它杂质峰，目标峰含量低，在色谱图中表现不明显，主要原因就是杂质分离效果差，导致干扰峰和目标峰不能有效分离，进而造成容易误判、错判。
因此，如何开发出一种准确度高、检测精度高的高效检测方法来检测醋酸含量迫在眉睫，是保护氨基酸提质的关键点。
发明内容
本发明的第一个发明目的在于：针对目前现有技术配制醋酸标准曲线溶液时，存在的浓度不稳定、不准确，标准曲线误差大的问题，提供一种精确配制醋酸标准曲线溶液的方法，以解决现有技术所存在的问题。
本发明采用的技术方案如下：一种精确配制醋酸标准曲线溶液的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、配制醋酸储备液，精密称取设计量的无水乙酸钾，根据检测浓度需求，加超纯水定容后得到设计浓度的醋酸储备液；
S2、配制醋酸标准曲线溶液，根据检测需求，对储备液进行加超纯水稀释，得到设计浓度的醋酸标准曲线溶液，其中，加超纯水配制醋酸标准曲线溶液时，加入设计量的三氟乙醇或甲醇。
在上述方法中，通过改进标准曲线的配方，让标准曲线配制过程更简便、准确，采用固体无水乙酸钾来配置醋酸标准曲线溶液，称样过程简单，结果更加准确，几乎不挥发，同时用三氟乙醇或甲醇以及超纯水溶解并稀释至标准曲线浓度，配制过程简单易操作，避免使用有机溶剂，不仅减少了溶剂的挥发，还降低了检测成本。
进一步，所述的可溶性无水乙酸盐，可以为无水乙酸钠或无水乙酸钾。加入三氟乙醇或甲醇的目的是：使标准曲线溶液中目标峰保留时间与样品一致，如果标准曲线溶液中不加这些溶剂，目标峰与供试液中的目标峰保留时间有较大差异，容易引起误判，因此，为了解决现有问题，需要加入三氟乙醇或甲醇，当然也可以更换为其它能溶解保护氨基酸并能与水互溶且不影响醋酸含量的溶剂，但是必须要与供试品溶液中加的溶剂一致。
进一步，在配制醋酸标准曲线溶液时，超纯水与三氟乙醇或甲醇的体积比为9-11:1。
作为优选，超纯水与三氟乙醇或甲醇的体积比为9:1。
本发明的第二个发明目的在于：针对目前气相和液相色谱图中干扰峰和目标峰不能有效分离，导致误判、错判的问题，提供一种保护氨基酸醋酸检测方法，以解决现有技术所存在的不足。
发明采用的技术方案如下：一种保护氨基酸醋酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、配制醋酸储备液，精密称取设计量的无水乙酸钾，根据检测浓度需求，加超纯水定容后得到设计浓度的醋酸储备液；
S2、配制醋酸标准曲线溶液，根据检测需求，对储备液进行加超纯水稀释，分别配制得到不同设计浓度的醋酸标准曲线溶液，其中，加超纯水配制醋酸根标准曲线溶液时，需加入设计量的三氟乙醇或甲醇；
S3、配制供试液①，精密称取设计量的样品，加三氟乙醇或甲醇溶解，然后加超纯水稀释至刻度线定容，摇匀，然后进行超声振荡，超声振荡后所得滤液即为供试液①；
S4、配制供试液②，精密称取设计量的样品，加三氟乙醇或甲醇溶解，然后加超纯水稀释至刻度线定容，摇匀，然后进行超声振荡，超声振荡后所得滤液即为供试液②；
S5、采用离子色谱法进行检测，检测梯度条件为：
S6、进行检测实验，采用空白溶液、标准曲线溶液从低浓度至高浓度依次进样、空白溶液、供试液①、空白溶液、供试液②、空白溶液的顺序进行实验，得到检验报告。
在上述方法中，设计不同浓度的醋酸标准曲线溶液的目的在于：使检测结果在标准曲线浓度范围内，结果更加准确可靠。例如：根据企业产品的检测要求，标准曲线溶液浓度范围一般是固定的，如标准曲线浓度范围是10-150ppm,检测结果是100ppm，说明检测结果是可信的。在S3和S4中，三氟乙醇或甲醇用于溶解样品，保护氨基酸不溶于水，先用三氟乙醇或甲醇将其溶解，再用水稀释至刻度线，摇匀后进行超声振荡，这个过程类似于萃取，相应地，三氟乙醇或甲醇可以更换为其它能溶解保护氨基酸并能与水互溶且不影响醋酸的溶剂。在上述方法中，供试液①和供试液②可以是同一个供试品制备出两份供试液，也可以不同，在进行检测时，供试液①和供试液②之间设置空白溶液的原因是减少上一个供试品溶液对下一个供试品溶液的影响，如果同一个供试品的醋酸含量不大，可以省略掉之间的空白溶液进样，如果是不同供试品，则供试液①和供试液②之间一定要间隔一针空白溶液。进一步，对于S6的进样顺序，序列顺序中标准曲线溶液部分不可以改变，必须是由低浓度到高浓度，如果更改了标准曲线溶液的进样顺序，不是从低浓度到高浓度，则必须间隔空白溶液，相应地，供试液进样序列部分可以更改顺序，或者省去中间的空白溶液，但是这样的检测结果可能存在较大误差。
在上述方法中，检测梯度条件具体解释为：在前10分钟内，氢氧化钾(或氢氧化钠)淋洗液浓度为45mMol；梯度变化为0.2分钟，氢氧化钾(或氢氧化钠)淋洗液浓度从45mMol变化至2mMol；接着11分钟氢氧化钾(或氢氧化钠)淋洗液浓度为2mMol；梯度变化为0.2分钟，氢氧化钾(或氢氧化钠)淋洗液浓度从2mMol变化至45mMol；最后7分钟氢氧化钾(或氢氧化钠)淋洗液浓度为45mMol。通过采用离子色谱法来检测，并通过设计合理的梯度条件，使干扰峰与目标峰有效分离，最终使目标峰表现明显，易于判断、计算，解决了现有技术易出现误判和错判的问题。
进一步，在配制醋酸标准曲线溶液时，超纯水与三氟乙醇或甲醇的体积比为9-11:1；在配制供试液时，供试液中超纯水与三氟乙醇或甲醇的体积比为9-11:1。
进一步，在配制标准曲线溶液和供试液时，超纯水与三氟乙醇或甲醇的体积比值，和供试液中超纯水与三氟乙醇或甲醇的体积比值相同。例如精密称量50mg样品置于10ml容量瓶中，溶于1ml三氟乙醇或甲醇，加超纯水稀释至刻度线(超纯水9ml)，此时供试液中超纯水和三氟乙醇或甲醇体积比为9:1，则标准曲线溶液中超纯水和三氟乙醇或甲醇的体积比就是9:1，以避免浓度不同而造成负面影响。
进一步，在配置供试液时，将定容后的溶液放入超声波清洗器中，超声振荡至少1h，然后取出样品，冷却至室温，过滤即得供试液，如果超声振荡时间低于1h，则可能会导致检测结果偏小。
进一步，采用离子色谱法进行检测时，检测条件为：
流速：0.8-1.5mol/min；进样量：30-60ul；
柱温：35-45℃；输送速度：0.8-1.5ml/min；
冲洗因子：10。
进一步，在检测梯度条件中，将前10min氢氧化钾(或氢氧化钠)淋洗液浓度45mMol，放置梯度条件最后运行。设置前10min氢氧化钾(或氢氧化钠)淋洗液浓度45mMol作用是为了平衡进样系统，放在提梯度洗脱条件前面就是预运行，放后面就是后运行。
进一步，在S5中，计算样品中醋酸含量的公式为：醋酸含量＝供试液醋酸浓度×1000/样品浓度，其中醋酸含量的单位为ppm。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明通过改进标准曲线的配方，让标准曲线配制过程更简便、准确，采用固体无水乙酸钾来配置醋酸标准曲线溶液，称样过程简单，结果更加准确，几乎不挥发，同时用三氟乙醇或甲醇以及超纯水溶解并稀释至标准曲线浓度，配制过程简单易操作，避免使用有机溶剂，不仅减少了溶剂的挥发，还降低了检测成本；
2、本发明通过采用离子色谱法来检测，并通过设计合理的梯度条件，使干扰峰与目标峰有效分离，最终使目标峰表现明显，易于判断、计算，解决了现有技术易出现误判和错判的问题。
附图说明
图1是本发明的实施例1标准曲线溶液校正曲线报告图；
图2是本发明实施例1的Fmoc-Thr(tBu)-OH供试液①的峰分析报告；
图3是本发明实施例1的Fmoc-Thr(tBu)-OH供试液②的峰分析报告；
图4是本发明实施例1的Fmoc-Tyr(tBu)-OH供试液①的峰分析报告；
图5是本发明实施例1的Fmoc-Tyr(tBu)-OH供试液②的峰分析报告；
图6是本发明实施例1的阴离子总结报告。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明作详细的说明。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种保护氨基酸醋酸检测方法，包括以下步骤：
S1、设置检测参数及条件：
仪器：离子色谱仪
分析柱：Dionex IonpacTM AS11-HC 4X250mm
淋洗液：氢氧化钾
试剂：无水乙酸钾、三氟乙醇、超纯水。
流速：0.8-1.5ml/min进样量：50μl柱温：40℃
输送速度：1ml/min冲洗因子：10
检测梯度条件：
以上过程的具体解释为：在前10分钟内，氢氧化钾淋洗液浓度为45mMol，梯度变化为0.2分钟，氢氧化钾淋洗液浓度从45mMol变化至2mMol；接着11分钟氢氧化钾淋洗液浓度为2mMol，梯度变化为0.2分钟，氢氧化钾淋洗液浓度从2mMol变化至45mMol，最后7分钟氢氧化钾淋洗液浓度为45mMol；
S2、配制供试液
S2.1配制Fmoc-Thr(tBu)-OH供试液
a、供试液①：精密称取Fmoc-Thr(tBu)-OH测试样品250.49mg，置50ml容量瓶中，加5ml三氟乙酸溶解，再用超纯水稀释至刻度线，摇匀，放入超声波清洗器中，超声振荡1h，取出冷却至室温，过滤即得；
b、供试液②：精密称取Fmoc-Thr(tBu)-OH测试样品249.92mg，置50ml容量瓶中，加5ml三氟乙酸溶解，再用超纯水稀释至刻度线，摇匀，放入超声波清洗器中，超声振荡1h，取出冷却至室温，过滤即得；
S2.2配制Fmoc-Tyr(tBu)-OH供试液
a、供试液①：精密称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH测试样品249.97mg，置50ml容量瓶中，加5ml三氟乙酸溶解，再用超纯水稀释至刻度线，摇匀，放入超声波清洗器中，超声振荡1h，取出冷却至室温，过滤即得；
b、供试液②：精密称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH测试样品250.39mg，置50ml容量瓶中，加5ml三氟乙酸溶解，再用超纯水稀释至刻度线，摇匀，放入超声波清洗器中，超声振荡1h，取出冷却至室温，过滤即得；
S3、配制标准曲线溶液
S3.1、配制储备液
配制ACO-(用“ACO-”表示醋酸根)浓度为100μg/ml的储备液，精密称取0.082g无水乙酸钾至500ml容量瓶中加水溶解并定容，摇匀备用；
S3.2、配制标准曲线溶液
对ACO-浓度为100μg/ml的储备液进行稀释，分别得到浓度为0.1μg/ml、0.3μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、1.5μg/ml的ACO-标准曲线溶液，在配制标准曲线溶液过程中，在溶液中加入适量三氟乙醇，其比例约为超纯水：三氟乙醇≈9：1；
S4、实验序列顺序
进行检测实验，采用空白溶液、5种标准曲线溶液从低浓度至高浓度依次进样、空白溶液、Fmoc-Thr(tBu)-OH供试液①②、空白溶液、Fmoc-Tyr(tBu)-OH供试液①②、空白溶液的顺序进行实验，得到检验报告。
如图1所示，从校正报告中可以看出，相关系数为：99.9919％(即报告中的判定系数)，说明本发明的相关性高，通过曲线计算样品溶解的检测结果更准确。
从图2-5可以看出，干扰峰少，目标峰明显，易于判断和计算，检测结果如下：
Fmoc-Thr(tBu)-OH检测结果：
称样量：样①250.49mg样②：249.92mg；
供试液①:
供试液②:
平均值：105.9ppm相对标准偏差：8.5％(小于10.0％)；
Fmoc-Tyr(tBu)-OH检测结果：
称样量：样①：249.97mg样②：250.39mg
供试液①:
供试液②:
平均值：108.0ppm相对标准偏差：7.3％(小于10.0％)。
由上述得到，检测结果准确，误差小，同时，从图6可以得到，醋酸根保留时间稳定。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种保护氨基酸醋酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、配制醋酸储备液，精密称取设计量的无水乙酸钾，根据检测浓度需求，加超纯水定容后得到设计浓度的醋酸储备液；
S2、配制醋酸标准曲线溶液，根据检测需求，对储备液进行加超纯水稀释，分别配制得到不同设计浓度的醋酸标准曲线溶液，其中，加超纯水配制醋酸根标准曲线溶液时，需加入设计量的三氟乙醇或甲醇；
S3、配制供试液①，精密称取设计量的样品，加三氟乙醇或甲醇溶解，然后加超纯水稀释至刻度线定容，摇匀，然后进行超声振荡，超声振荡后所得滤液即为供试液①；
S4、配制供试液②，精密称取设计量的样品，加三氟乙醇或甲醇溶解，然后加超纯水稀释至刻度线定容，摇匀，然后进行超声振荡，超声振荡后所得滤液即为供试液②；
S5、采用离子色谱法进行检测，检测梯度条件为：在前10至前0.2分钟内，氢氧化钾或氢氧化钠淋洗液浓度为45mM；梯度变化为0.2分钟，氢氧化钾或氢氧化钠淋洗液浓度从45mM变化至2mM；接着11分钟氢氧化钾或氢氧化钠淋洗液浓度为2mM；梯度变化为0.2分钟，氢氧化钾或氢氧化钠淋洗液浓度从2ml变化至45mM；最后6.8分钟氢氧化钾或氢氧化钠淋洗液浓度为45mM；
S6、进行检测实验，采用空白溶液、标准曲线溶液从低浓度至高浓度依次进样、空白溶液、供试液①、空白溶液、供试液②、空白溶液的顺序进行实验，得到检验报告；
其中，所述保护氨基酸为 Fmoc-Thr(tBu)-OH或Fmoc-Tyr(tBu)-OH，分析柱为AS11-HC离子柱，尺寸为4×250mm。
2.如权利要求1所述的保护氨基酸醋酸检测方法，其特征在于，在配制醋酸标准曲线溶液时，超纯水与三氟乙醇或甲醇的体积比为9-11:1；在配制供试液时，供试液中超纯水与三氟乙醇或甲醇的体积比为9-11:1。
3.如权利要求2所述的保护氨基酸醋酸检测方法，其特征在于，在配制标准曲线溶液和供试液时，超纯水与三氟乙醇或甲醇的体积比值，和供试液中超纯水与三氟乙醇或甲醇的体积比值相同。
4.如权利要求1所述的保护氨基酸醋酸检测方法，其特征在于，在配置供试液时，将定容后的溶液放入超声波清洗器中，超声振荡至少1h，然后取出样品，冷却至室温，过滤即得供试液。
5.如权利要求1所述的保护氨基酸醋酸检测方法，其特征在于，采用离子色谱法进行检测时，检测条件为：
流速：0.8-1.5mol/min；进样量：30-60ul；
柱温：35-45℃；输送速度：0.8-1.5ml/min；
冲洗因子：10。
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