CN111499745A

CN111499745A - 热反应蛋白单价及双价纳米抗体及其制备方法、应用

Info

Publication number: CN111499745A
Application number: CN202010341773.1A
Authority: CN
Inventors: 曲光刚; 武曰星; 沈志强; 单玉飞; 王长江; 赵中伟
Original assignee: Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy
Current assignee: Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy
Priority date: 2020-04-27
Filing date: 2020-04-27
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2040-04-27
Also published as: CN111499745B

Abstract

本发明提供了一种CRP单价及双价纳米抗体，所述纳米抗体具有较高的ELISA效价，可以用于CPR的实验室和临床检测，且经试验表明，CRP双价纳米抗体的亲和活性比单价纳米抗体增加了10倍，取得了预料不到的技术效果。所述CRP单价及双价纳米抗体容易利用微生物进行生产，并具有很高的产率，有利于工业化生产。

Description

热反应蛋白单价及双价纳米抗体及其制备方法、应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及热反应蛋白CRP双价纳米抗体及其制备方法、应用。

背景技术

C反应蛋白（C－Reactive，CRP）是由人体肝细胞合成，在正常状态时浓度水平较低，而在出现感染、冠心病、心肌梗死等其他应激反应时，CRP浓度则可在4-6h 内迅速提升，因此临床上CRP 作为急性反应蛋白，是诊断鉴别感染、监测病情进展、确定抗感染治疗的重要指标

单域抗体（variable domain of heavy chain of heavy －chainantibody，VHH），相对分子质量约为15KD，仅为常规抗体的1/15，因此也被称为纳米抗体，它是目前天然来源的相对分子质量最小的抗体。纳米抗体由于其理化性质稳定、易于基因操作和克隆等优势，在疾病诊断、分子检测和治疗等方面受到广泛关注。

自2014年首个双特异性抗体药物Blinatumomab进入市场以来，人们对双价和双特异性抗体的研究兴趣日益。与单价抗体相比，其对应的双价抗体具有更高的抗原结合活性，并且能够显著延长在体内的半衰期；双特异性抗体能够识别相同抗原或不同抗原上的多个抗原表位，因此具有更广泛的功能和用途。传统抗体由于结构复杂、二硫键多，在体内精确组装和体外纯化等方面的困难限制了双价传统抗体的开发应用。而纳米抗体相对分子质量小、结构简单、易于进行基因操作和可使用原核或真核细胞进行表达的优势使其容易被开发成双价或双特异性纳米抗体，以增加纳米抗体在抗原检测、疾病预防和治疗等方面的应用范围。

本发明以CRP蛋白作为靶抗原，从CRP纳米抗体文库中筛选到CRP特异性的纳米抗体序列，制备双价纳米抗体，提供了一种CRP纳米抗体和CRP纳米抗体双价表达方法，在CRP检测、诊断和治疗领域有巨大前景。

发明内容

本发明的目的在于，制备一种CRP双价纳米抗体，并探索其在乳胶增强透射免疫比浊法中的应用。

一种CRP纳米抗体，其特征在于，所述CRP纳米抗体具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

编码所述CRP纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种CRP双价纳米抗体，其特征在于，所述CRP双价纳米抗体具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

编码所述CRP双价纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了CRP纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤。

1）使用CRP抗原蛋白通过背部皮下多点注射方式对羊驼进行免疫；

2）采集免疫后羊驼血液，分离得到淋巴细胞；

3）构建抗体免疫库，筛选纳米抗体序列，得到CRP纳米抗体序列；验证CRP纳米抗体与CRP抗原蛋白结合。

特别指出，步骤3）中，筛选出的CRP纳米抗体的核苷酸序列见SEQ ID No.2。

进一步的，本发明还提供了CRP双价纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤。

2）采集免疫后羊驼血液，分离得到淋巴细胞；

3）构建抗体免疫库，筛选纳米抗体序列，得到CRP纳米抗体序列；验证CRP纳米抗体与CRP抗原蛋白结合；

4）构建双价表达质粒，上游片段引物VHHUP-F具有SEQ ID No .5所示的核苷酸序列，VHHUP-R具有：SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；

所述质粒下游片段引物VHHDOWN-F具有：SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，VHHDOWN-R具有：SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。

5）CRP特异性双价Nb重组表达载体构建及鉴定；

6）双价Nb原核表达与纯化及CRP特异性双价Nb亲和活性分析。

本发明还涉及CRP双价纳米抗体在制备乳胶增强透射免疫比浊法试剂中的应用。

附图说明

图1. 第一轮PCR-VHH凝胶电泳图：M：2000bp Marker；1和2泳道为第一轮PCR扩增产物。

图2. 第二轮PCR-VHH凝胶电泳图：M：2000bp Marker；N1和N2为阴性对照；1和2泳道为第二轮PCR扩增产物。

图3. 鉴定抗体库溶度凝胶电泳图：泳道：21、26、29、43为阴性。

图4. 双酶切鉴定凝胶电泳图：M：2000bp Marker； 1和2泳道为重组双价表达载体双酶切。

图5. 双价与单价纳米抗体诱导表达SDS-PAGE图：M:Marker；1，阴性超声上清；2，阴性超声沉淀；3，单价纳抗上清；4，单价纳抗沉淀；5，阴性超声上清；6，阴性超声沉淀；7，双价纳抗上清；8，双价纳抗沉淀。

图6.CRP特异性双价纳米抗体纯化结果：M, 蛋白Marker；1，超声上清；2，超声沉淀；3-4，纯化后的双价纳米抗体蛋白。

图7. 单双价纳米抗体ELISA效价分析。

具体实施方式

下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。

实施例1 . CRP纳米抗体文库的构建

（1）用1mg CRP抗原蛋白与弗氏佐剂等体积混合并乳化均匀，通过背部皮下多点注射的方式对羊驼进行免疫，共免疫4次，免疫间隔为14天。第4次免疫结束后采血7天，提取羊驼外周血淋巴细胞并提取总RNA，参照QIAGEN RNA提取试剂盒说明书操作。

（2）按照Invitrogen SuperScript III第一链合成系统试剂盒说明书，反转录制备cDNA，使用引物VHH1-F和VHH1-R对cDNA进行扩增，得到VHH基因片段，其中引物VHH1-F和VHH1-R的序列如下：

引物VHH1-F序列：5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3’，见SEQ ID NO:9；

引物VHH1-R序列：5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’，见SEQ ID NO:10。

利用TaKaRa Premix TaqDNA聚合酶，PCR反应体系如下表1：

PCR程序如下表2：

切取第一轮扩增后600 bp大小的目的片段（结果见图1），利用胶回收试剂盒进行回收，以回收产物作为第二轮PCR反应的模板，然后分别用引物VHH3-F、作为上游引物与下游引物VHH3-R为模板扩增VHH片段，体系为40 μL；引物VHH3-F序列（SEQ ID NO:11）：5’-TTTCTATTACTAGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGT-3’；引物VHH3-R序列（SEQ ID NO:12）：5’-AAACCGTTGGCCATAATGGCCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT-3’。

PCR体系如下表3：

PCR程序如下表4：

电泳结果如图2所示，第二轮PCR产物经纯化后与噬菌粒载体pCANTAB 5E分别经Sfi I限制性内切酶双酶切，使用DNA纯化回收试剂盒回收双酶切后的VHH目的片段和pCANTAB 5E载体，定量后使用T4 DNA连接酶连接过夜。

1）将得到的VHH基因片段连接入表达载体，并转化至感受态细胞，涂布于LB-AMP琼脂平板，37℃过夜培养，收集菌体，构建抗体免疫库；随机挑取50个单菌落分别于5mL LB培养基中过夜培养，以过夜培养的菌液作为模板，使用VHH4-F和VHH5-R引物进行PCR反应，鉴定阳性克隆比例。将阳性克隆菌提取质粒后送第三方测序，鉴定抗体文库基因序列多样性。

引物VHH4-F序列：5’-GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG-3’，见SEQ ID NO:13；

引物VHH4-R：5’-CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT-3’，见SEQ ID NO:14。

PCR体系如下表5：

PCR程序如下表6：

将连接产物通过电穿孔转入新鲜制备的E.coli TG1感受态细胞中，电转化后获得转化子数为1.54×10⁸CFU/mL，转化效率约1.5×10⁸CFU/mL。转化子涂布氨苄抗性平板，30℃过夜培养后收获平板上的菌落，最终收获转化重组子数为2.01×10¹⁰CFU/mL。从稀释后菌液涂布的抗性平板上随机挑取50个单菌落进行PCR鉴定，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳（结果见图3），结果显示其中有4个为阴性，其余均扩增出约700bp的预期大小条带，阳性率为92.0%，计算最终库容大小为6.4×10¹⁰CFU/mL。

实施例2：CRP纳米抗体筛选

（一）M13KO7辅助噬菌体增殖

（1）将辅助噬菌体M13KO7划线于 2×YT 琼脂平板上；

（2）制备2×YT半固体琼脂为上层琼脂（Top Agar），冷却至50℃时，取 4 m L Top Agar并加入0.5 m L过夜培养的新鲜TG1菌，沿着划线浓度从低至高的方向，倾注Top Agar；

（3）37℃培养10 h，挑取单个噬菌斑于100 m L 2YT-K培养基，37℃振荡培养过夜；

（4）8000 rpm，4℃，离心15 min；

（5）取上清，用 0.45μm滤膜过滤，分装，4℃保存。

（二）噬菌体毒种滴定

（1）准备2×YT平板 5~6 个，置于37℃培养箱预热备用；

（2）将Top Agar用微波炉融化，放于50℃水浴锅中保温；

（3）将上述噬菌体，在EP管中用2×YT培养基做10^-7、10^-8、10^-9、10^-10和10^-11稀释；

（4）取过夜培养的TG1菌液，分装成500 μL/管，标明10^-7至10^-11稀释度；

（5）加入上述稀释的噬菌体至每个对应稀释度的EP管内，混匀后，37℃轻柔振荡反应30min；

（6）加3 m L的Top Agar至每个EP管，混匀，立即倒入事先预热的平板，37℃倒置过夜培养；

（7）计算平皿上的空斑数，乘于相应稀释倍数，即为噬菌体的滴度。

（三）特异性抗体的淘选

（1）取初级抗体库一支（1 m L），加入250 m L 2×YT-G（2%葡萄糖）培养基中，37℃，250rpm，培养1 h；

（2）取培养液，测定细菌浓度，加入100 μg/m L Amp和辅助噬菌体M13K07噬菌体，37℃水浴轻摇1h；

（3）4000 rpm 离心10 min，小心弃上清；

（4）用2×体积（500 m L）的2×YT-AK悬浮细菌沉淀，37℃，220 rpm，培养过夜；

（5）10000 rpm 离20 min，取上清至另一新管中，准备进行淘筛；

（6）加 100 m L的PEG/ NaCl，4℃冰浴，不超过1 h；

（7）4℃，8000 rpm离心20 min，弃上清，控干；

（8）用5m L 的 2×YT悬浮噬菌体沉淀，再次10000 rpm离心15 min，取上清备用；按照MPBS:上清=2:3的比例将MPBS和噬菌体上清混匀，室温下去干扰化处理20 min；

（9）提前一天将免疫管用抗原包被（包被量2 m L/管）；

（10）包被完毕，用PBS洗管3次，拍干；

（11）用封闭液（2％脱脂乳PBS，MPBS）封闭免疫管，37℃封闭2h；

（12）弃封闭液，用PBS洗管3次，拍干；

（13）向封闭好的免疫管加入处理过的噬菌体上清混合液，2 m L/管，轻摇温育30min，再静置温育1.5 h；

（14）弃去免疫管内噬菌体上清，用PBST（0.1%）洗涤5次，再用PBS洗涤3次，拍干；

（15）洗脱：加入宿主菌TG1（OD₆₀₀=0.5），4 m L/管，37℃，150 rpm振荡培养1h，此时，完成了第一轮淘筛，获得了一级抗体库；

（16）取振荡培养的菌液，用2×YT培养基做倍比梯度稀释，取稀释液100 μL涂布SOBAG平板，30℃培养过夜，计算输出淘筛步骤的噬菌体量；

（17）向一级库中，加入终浓度为100 μg/m L Amp和2%葡萄糖，同时加入4×10¹⁰pfu/mLM13KO7辅助噬菌体，37℃低速培养30 min后，再250 rpm振荡培养30 min；

（18）5000 rpm室温离心10 min，去上清，用100 m L 2×YT-AK轻悬细胞，37℃，220rpm，培养过夜；

（19）从以上第（5）步骤，进行循环淘筛，开始下一轮淘筛；

（20）最终经4轮淘筛，取获得的菌液做倍比梯度稀释，取稀释液100 μL涂布SOBAG平板，30℃培养20-24 h。剩余菌液-80℃冻存，标记为四级抗体库。

实施例3：Phage ELISA鉴定抗原阳性重组抗体

（一）从四级抗体库中单克隆表达重组抗体

（1）从第4轮稀释后的平板上随机挑选单克隆，于400 μL2×YT-AG 培养基中过夜培养；

（2）菌液PCR鉴定阳性克隆，将阳性克隆排为一板，此板标记为 Master Plate；

（3）另取新的灭菌EP管，每管加入400 μL含有2.5×10¹⁰pfu/mL M13KO7的2×YT-AG，此板标记为P1 Plate；

（4）将Master Plate中的细菌培养液每管取40 μL至P1 Plate；

（5）将P1 Plate中的离心管置于摇床，37℃，150 rpm，振荡培养2 h；

（6）4000 rpm离心20 min，小心去上清；

（7）每管加入400 μL 2×YT-AK培养液，37℃，220 rpm振荡培养过夜；

（8）7000 rpm离心20 min，取上清放于4℃备用。

（二）Phage ELISA

（1）包被：按照最佳包被条件，用相应包被原包被ELISA板，设立阳性对照和阴性对照；

（2）洗涤：弃包被液，用PBS洗涤3次；拍干；

（3）封闭：加入2% MPBS至满孔，37℃封闭1.5 h；

（4）洗涤：弃封闭液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；

（5）加重组抗体：提前将160 μL重组抗体和40 μL MPBS混匀，室温孵育20 min，加入封闭好的酶标孔内，37℃反应2 h；

（6）洗涤：弃重组抗体液，先用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干；

（7）加酶标二抗：将HRP标记抗M13单抗用2%MPBS做1:4000稀释，200 μL/孔，37℃孵育1h；

（8）洗涤：弃二抗，洗涤同上，拍干；

（9）显色：加入200 μL/孔TMB显色液，室温显色45 min左右；

（10）终止：用200 μL/孔终止液，终止显色，于450 nm处读值。

通过间接ELISA方法检测94个单克隆对应的噬菌体上清同CRP蛋白的反应性，根据间接ELISA试验的结果挑选出了40个单克隆抗体，这些单克隆均同CRP蛋白有较好的反应性且同BSA蛋白的反应值较弱。

(11) 将40个与CRP蛋白有较好反映性的单克隆抗体菌群进行测序，得到CRP纳米抗体核苷酸序列SEQ ID No.2。

实施例4：CRP特异性双价Nb的制备

（一）CRP特异性双价Nb重组表达载体构建及鉴定

VHH_up和VHH_down PCR产物分别经1%琼脂糖凝胶电泳后割胶，进行纯化回收。VHH_down片段与pET-SUMO载体分别用Sac I和Hind III限制性内切酶进行双酶切，酶切产物分别纯化回收。回收产物经T4 DNA连接酶连接后转入DH5α感受态细胞，涂布Amp抗性平板，于37 ℃恒温培养箱中过夜培养；挑取平板上的单菌落于LB液体培养基中，经过夜培养后进行菌液PCR鉴定。

菌液PCR鉴定为阳性的提取重组质粒，测序正确的重组质粒命名为VHH_down-CRP。VHH_up片段与VHH_down-CRP重组质粒分别用BamH I和XhoI限制性内切酶进行双酶切，酶切产物分别纯化后使用T4 DNA连接酶将VHH_up片段与VHH_down-CRP片段连接，转化DH5α感受态细胞，涂布抗性平板。挑取平板单菌落后进行菌液PCR鉴定，阳性重组菌预期PCR产物条带大小约900 bp；菌液PCR鉴定为阳性的重组菌提取质粒，进一步进行双酶切鉴定（结果见图4），并对重组质粒进行测序验证。测序正确的重组质粒命名为biVHH_crp-pET-SUMO。

（二）双价Nb原核表达与纯化

将测序验证正确的双价重组表达载体biVHH_crp-pET-SUMO转化到表达菌E. coli BL21(DE3)中，涂布Amp抗性平板后挑取单菌落过夜培养，次日按2%比例将过夜培养物接种到新鲜LB培养基中继续培养，至OD₆₀₀达到0.6左右时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG在30 ℃条件下进行诱导表达5 h。

以在相同条件下培养的不加诱导剂的重组菌作为阴性对照；同时将单价重组表达载体VHH_down-CRP转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞，进行相同条件的诱导表达。诱导表达后的菌体细胞经超声波破碎后高速离心分离上清和沉淀，对双、单价Nb表达产物进行SDS-PAGE电泳分析（结果见图5）。

使用Ni²⁺亲和层析柱对双价及单价CRP特异性Nb进行纯化（结果见图6），纯化后的蛋白溶液采用BCA蛋白法检测测定蛋白含量。

实施例5：CRP特异性双价Nb ELISA效价分析

使用间接ELISA试验测定原核表达的CRP特异性双价Nb与抗原的亲和活性，以CRP蛋白作为抗原包被96孔酶标板，包被浓度为10 μg/mL，4℃条件下包被过夜；次日以3% MPBS对反应孔进行封闭。

将纯化后的CRP特异性双价Nb浓度调整为1.0 mg/mL后进行倍比稀释，然后以倍比稀释的双价Nb作为一抗，与包被抗原进行结合反应；将纯化后的单价Nb进行同步操作，与双价Nb ELISA效价做对比分析；以阴性表达菌的超声上清10倍稀释液作为阴性对照，以3%MPBS替代一抗作为空白对照；使用1:2000稀释的Anti His-tag (HRP)鼠源单抗与结合到包被抗原上的双价Nb进行结合反应，37 ℃孵育1 h后进行洗涤，然后加入TMB底物显色液室温下显色15 min，加入终止液结束显色反应，使用酶标仪读取OD₄₅₀吸光值。

CRP特异性双价Nb和单价Nb纯化后分别以相同浓度水平进行倍比稀释，相同稀释倍数下双价NbELISA反应吸光值高于单价Nb，表明CRP特异性双价Nb亲和活性优于单价Nb；以样本OD₄₅₀/阴性OD₄₅₀≥3作为阳性判定标准，CRP特异性单价Nb效价为1:200000，而双价Nb效价为1:2000000，双价Nb的亲和活性比单价Nb增加了10倍（结果见图7）。

实施例6：纳米抗体在CRP胶乳颗粒增强比浊法中应用

胶乳颗粒增强比浊法（Latex particle-enhanced turbidimetric immunoassay,LETIA）是近年来出现的一种较为稳定、准确的CRP蛋白均相免疫比浊检测方法。用高分子乳胶微球表面交联CRP纳米抗体，而当体液中CRP蛋白与交联有纳米抗体的微球结合后，能够在短时间内迅速聚集在一起，改变反应溶液的吸光度。而且，反应液吸光度的改变与被测抗原的浓度在一定范围内具有线性关系，可用来反映被测CRP的浓度。

乳胶增强免疫比浊法具体操作：将标准品稀释并配制为10mg/L、36mg/L、72mg/L、144mg/L 标准溶液，绘制标准曲线。标本为2μL，试剂A 140 μL，混匀，置于37℃孵育1-5min，加入试剂B 为140μL，混匀，孵育10秒后，空白管调零，读取吸光值(A1),5分钟后，读取吸光度（A2）, ΔA=A2-A1。以测定管ΔA在定标曲线上可求得相应的CRP含量。

由上述实施例可知，本发明提供了一种CRP纳米抗体和CRP纳米抗体蛋白的双价表达方法。通过此方法表达的CRP纳米抗体蛋白亲和性比单价增加了10倍。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对上述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 山东省滨州畜牧兽医研究院

<120> 热反应蛋白单价、双价纳米抗体及其制备方法、应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Val Tyr Asp

20 25 30

Ile Tyr Ser Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Ala

35 40 45

Lys Val Ala His Ile Thr Ser Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys His Ser Thr Asn Tyr Phe Ser Asp Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro

115 120 125

Gly His Tyr

130

<210> 2

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggctcagg tgcagctcgt ggagtctggg ggaggcttgg tgcagcctgg ggggtctctg 60

agactctcct gtgtagcctc tggaagcgtc tacgatatct attccatggg ctggtaccgc 120

caggctccgg ggaagcagcg cgccaaggtc gcacatatta ctagtggcgg tactacaaac 180

tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaacgccaa gaacacgata 240

tatctccaaa tgaacaacct ggaacctgag gacacggccg tctattattg ccacagtacc 300

aattacttta gtgacaatga ctactggggc caggggactc aggtcaccgt ctcctcagaa 360

cccaagacac caaaaccaca accaggccat tat 393

<210> 3

<211> 285

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Val Tyr Asp

20 25 30

Ile Tyr Ser Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Ala

35 40 45

Lys Val Ala His Ile Thr Ser Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys His Ser Thr Asn Tyr Phe Ser Asp Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro

115 120 125

Gly His Tyr Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Phe Gln Ala Phe Arg Met Ala Gln Val Gln Leu

145 150 155 160

Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu

165 170 175

Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Ser Met Gly Trp

180 185 190

Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Ala Lys Val Ala His Ile Thr

195 200 205

Ser Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr

210 215 220

Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Asn

225 230 235 240

Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His Ser Thr Asn Tyr

245 250 255

Phe Ser Asp Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

260 265 270

Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gly His Tyr

275 280 285

<210> 4

<211> 855

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggctcagg tgcagctcgt ggagtctggg ggaggcttgg tgcagcctgg ggggtctctg 60

agactctcct gtgtagcctc tggaagcgtc tacgatatct attccatggg ctggtaccgc 120

caggctccgg ggaagcagcg cgccaaggtc gcacatatta ctagtggcgg tactacaaac 180

tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaacgccaa gaacacgata 240

tatctccaaa tgaacaacct ggaacctgag gacacggccg tctattattg ccacagtacc 300

aattacttta gtgacaatga ctactggggc caggggactc aggtcaccgt ctcctcagaa 360

cccaagacac caaaaccaca accaggccat tatccgcggg gatccggtgg cggcggtagc 420

ggcggtggtg gcagtggtgg cggtggtttc caagctttcg aaatggctca ggtgcagctc 480

gtggagtctg ggggaggctt ggtgcagcct ggggggtctc tgagactctc ctgtgtagcc 540

tctggaagcg tctacgatat ctattccatg ggctggtacc gccaggctcc ggggaagcag 600

cgcgccaagg tcgcacatat tactagtggc ggtactacaa actatgcaga ctccgtgaag 660

ggccgattca ccatctccag agacaacgcc aagaacacga tatatctcca aatgaacaac 720

ctggaacctg aggacacggc cgtctattat tgccacagta ccaattactt tagtgacaat 780

gactactggg gccaggggac tcaggtcacc gtctcctcag aacccaagac accaaaacca 840

caaccaggcc attat 855

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgagctcatg gaggtgcagc tggtggag 28

<210> 6

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgggatcccg aaccaccgcc accactgcca ccaccgccgc taccgccgcc acctgaggag 60

acggtgacca gggtc 75

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgggatccat ggaggtgcag ctggtggag 29

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cccaagctta tgaggagacg gtgaccaggg tc 32

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtcctggctg ctcttctaca agg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tttctattac taggcccagc cggcccaggt gcagctggtg gagt 44

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaaccgttgg ccataatggc ctgaggagac ggtgaccagg gt 42

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gatgtgcagc tgcaggagtc tggrggagg 29

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctagtgcggc cgctgaggag acggtgacct gggt 34

Claims

1.一种CRP纳米抗体，其特征在于，所述CRP纳米抗体具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的CRP纳米抗体，其特征在于，编码所述CRP纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种CRP双价纳米抗体，其特征在于，所述CRP双价纳米抗体具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的CRP双价纳米抗体，其特征在于，编码所述CRP双价纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

5.根据权利要求1或2所述的CRP纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2）采集免疫后羊驼血液，分离得到淋巴细胞；

6.根据权利要求3或4所述的CRP双价纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2）采集免疫后羊驼血液，分离得到淋巴细胞；

所述质粒下游片段引物VHHDOWN-F具有：SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，VHHDOWN-R具有：SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；

5）CRP特异性双价Nb重组表达载体构建及鉴定；

6）双价Nb原核表达与纯化及CRP特异性双价Nb亲和活性分析。

7.根据权利要求3或4所述的CRP双价纳米抗体在制备乳胶增强透射免疫比浊法试剂中的应用。