CN1114961A

CN1114961A - 细胞粘连肽抑制剂

Info

Publication number: CN1114961A
Application number: CN94115995A
Authority: CN
Inventors: S-L·N·彻昂; P·M·卡德雷里; T·J·洛勃
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1993-01-08
Filing date: 1994-07-11
Publication date: 1996-01-17
Also published as: EP0677060A1; WO1994015958A3; JPH08505628A; SG52262A1; CA2153228A1; WO1994015958A2

Abstract

本发明公开了成环整合素受体拮抗剂，其可用于调节细胞粘连，包括与纤维结合素有关的粘连以及白细胞与内皮细胞的粘连。本发明还公开了做为治疗剂的本发明化合物的合成、试验、配剂及应用方法。

Description

细胞粘连肽抑制剂

本申请与于1992年1月23日公开的wo92/00995的PCT申请有关，并在此做为全文参考。

本发明涉及具有细胞粘连调节活性的新的环状肽和肽模拟化合物。

细胞外基质(ECM)是结缔组织的主要成分，此结缔组织可使结构完整，促进细胞迁移和分化。做为这些功能的一部分，细胞外基质分子如纤维结合素、胶原蛋白、昆布胺酸(laminin)、VonWillebrand因子、血小板反应素、纤维蛋白原和tenascin已被发现在体外可促进细胞粘连。此粘连反应对于许多生物过程会起到关键性作用，此过程包括止血、血栓形成、伤口愈合、肿瘤转移、免疫和炎症。

纤维结合素(FN)是原型ECM分子。纤维结合素分子中主要细胞结合部位已经用氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸或用单一字母命名的RGD经合成方法复制出。含有即可抑制亦可促进细胞粘连的RGD序列的肽已经被公开(美国专利4,589,881；4,661,111；4,517,686；4,683,291；4,578,079；4,614,517和4,792,525)，当用丙氨酸替代甘氨酸或用谷氨酸替代天门冬氨酸，在三肽结构中增加一个甲基或亚甲基时，肽的如此小的变化均会消除这些活性(Pierschbacher等人，PNAS，81：5985(1984))。最近，在分子A链的另一个缝接区中已经鉴定出第二个FN细胞结合区。现已发现FN中十个氨基酸识别序列(GPEILDVPST)(SEQ.ID.NO.：1)是与细胞反应的部位(Wayner等人，J.Cell Biol.，109：1321(1089)；Guan等人。Cell，60：53(1990)。

可识别FN上这些结合部位的受体属于由α和β亚单位非共价键结合的异二聚复合体构成的一类基因总科，其称为整合素(integrin)。普通β亚单位与特定α亚单位结合可形成具有上述特性的粘连受体。至今已克隆出八个β亚单位并已确定序列。β₁亚科，也被称之为VLA科(最迟缓活化抗原)可与ECM分子和FN、胶原蛋白和昆布胺酸结合，参见Hynes.Cell，48：549(1987)；Hemler，Anna，Rev.Immunol.，8：365(1990)。白细胞与FN在两个间隙不同的结合区间的作用可以通过两个独立的整合素(integrin)来调节。RGD部位可被整合素α5β₁识别，而EILDV(SEQ.ID.NO.：2)可被α₄β₁识别(Pytela等人，Cell，40：191(1985))；Wayner等人，J.CellBiol.109：1321(1989)；Guan等人，Cell 60：53(1990))。

血管内皮细胞构成了血液与组织间的界面并且控制着白细胞以及血浆流入组织。在炎症部位产生的各种信号可以活化内皮细胞以及流动的血细胞并使得它们变得彼此更易粘连，此最初的粘连反应之后，白细胞进入组织以完成宿主防御功能。与白细胞-内皮细胞间反应有关的几种粘连分子已经被鉴别出。在白细胞上，现已发现，β2整合素亚科成员，包括CD11a/CD18，CD11b/CD18和CD11c/CD18，在此过程中起着十分重要的作用。在β₁亚科中，除了可与纤维结合素结合外，α4β1还可与内皮细胞上的一种称为血管细胞粘连分子(VCAM)的细胞激动素可诱导分子反应。内皮细胞上可以与白细胞结合的其它分子包括ICAM-1，ICAM-2，E-selectin and P-selectin(Carlos and Harlan，Immunol.Rev.，114：1(1990)；Osborn，L.，Cell，62：3(1990)；Springer T.，Nature，346：425(1990)；Genget al.，Nature，347：757(1990)；Stoolman，L.Cell，56：907(1989))。

最近的数据表明整合素α4β1在炎症中起着重要作用，体外试验数据显示抗α4抗体可阻滞淋巴细胞与滑液内皮细胞粘连；此粘连作用在风显性关节炎中起着十分重要的作用(Van Dinther-Janssen)等人，J Immunol.，147：4207(1991)。在对抗α4单克隆抗体阻滞嗜碱细胞和嗜酸细胞与细胞激动素活化的内皮细胞粘连的研究表明，α4在变态反应和哮喘中起着十分重要的作用(Walsh等人，J.Immunol.，146：3419(1991)；Bocher等人，J.Exp.Med.，173：1553(1991)。另外，体内研究发现试验性自体免疫脑脊髓炎可被抗-α4单克隆抗体阻滞(Yednock等人，Nature，356：63(1992)。白细胞向炎症部位的迁移也可以被抗-α4单克隆抗体阻滞(Issikutz等人，J.Immunol.，147：4178(1991))。最近在接触性过敏反应模型中发现，当给激发的纯系受体小鼠施用致敏细胞时，肽GRGDSP(SEQ.ID.NO：3)或EILDV(SEQ.ID.NO：2)可阻滞耳肿胀，这表明α4β1，也可能是α5β1，两者均与此炎症应答有关(Ferguson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8072(1991)。因而，α4β1和α5β1是控制炎症疾病的重要受体靶分子。

本发明涉及具有细胞粘连调节剂活性的化合物，此化合物不含有氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(Arg-Gly-Asp或RGD)，即RGD三肽表位。实际上，一些此类化合物不具有RGD表位三个氨基酸的任何一个。

一方面，本发明化合物可足以模拟细胞外基质配体或其它细胞粘连配体与细胞表面受体结合。此类受体包括整合素受体，一般包括纤维结合素、胶原蛋白、昆布胺酸、LFA-1、MAC-1、P150、P95、玻璃体结合蛋白和gpIIb/IIIa受体。现已发现，此新的化合物可通过例如与含有适宜氨基酸序列的配体竟争以及通过与细胞表面可与配体直接结合的受体结合来调节细胞粘连。通过与细胞上受体结合有效地抑制细胞粘连蛋白例如(但不仅限于)纤维结合素，以防止或减少细胞粘连。其它方面的应用还包括通过因本发明化合物使细胞表面附着或通过其它促进细胞粘连的方法增强细胞粘连作用。此具有实用价值的化合物在此作为细胞粘连调节剂。

本发明的一个目的是提供一种有调节细胞粘连作用的新的化合物。

本发明的另一个目的是提供一种能够与可调节细胞粘连的细胞上受体结合的新的不含RGD的化合物。

本发明的另一个目的是提供一种用新的化合物调节细胞粘连的新方法。

本发明另一个目的是提供一种可与细胞粘连分子或整合素受体结合的化合物。

本发明的另一个目的是提供一种在调节细胞与整合素受体粘连，包括抑制细胞与纤维结合素粘连中具有显著效力的化合物。一方面，本发明包括在U937-纤维结合素粘连试验中测定的IC₅₀小于约100μM的化合物；另一方面，本发明包括在此试验中测定的IC₅₀小于约100μM的化合物。本发明还包括实现(于体外或体内)此纤维结合素受体粘连抑制作用和整合素受体粘连抑制作用的方法。在较低浓度下，用IC₅₀低于约500μM或低于约100μM的本发明化合物可以达到较强的抑制作用。

本发明还一个目的是提供一种在调节白细胞与内皮细胞粘连中具有较强效力的化合物。因此，一方面，本发明包括在Jurkat-内皮细胞粘连试验中测定的IC₅₀小于200μM的化合物，另一方面，本发明包括在此试验中测定的IC₅₀小于约10μM的化合物。低于10μM的活性化合物是最优选的，低于100μM是不作为优选的，低于500μM是不优选的而大于500μM是更不优选的。本发明还包括实现(于体外或体内)此白细胞受体粘连抑制作用的方法。在较低浓度下，用IC₅₀低于约250μM或低于约50μM的本发明化合物可以达到较强的抑制作用。

本发明还有一个目的是提供一种通过与细胞粘连分子或整合素受体结合调节细胞粘连的新的化合物，其中所述化合物由于包括肽模拟残基、修饰的氨基酸或氨基酸D-异构体而耐受体内降解作用。

本发明还有一个目的是提供可用于涉及或与细胞粘连有关的疾病的研究、诊断、治疗或预防的新的化合物、制剂和方法，所述疾病包括，但不仅限于，风湿性关节炎、哮喘、变态反应、成人呼吸窘迫综合症(ARDS)、心血管病、血栓形成或有害的血小板凝聚、血栓溶解后再闭塞、同种移植排异反应、移植物对宿主排异反应(graftversus host disease)、器官移植、败血症休克、再灌注性损伤、牛皮癣、湿疹、接触性皮炎和其它皮炎、骨质疏松症、骨关节炎、动脉粥样硬化、肿瘤疾病包括肿瘤或癌症生长转移瘤、伤口愈合过强、某些眼病如视网膜脱离的治疗、I型糖尿病、多发性硬化、全身性红斑狼疮(SLE)、炎症和免疫性炎症包括眼炎和肠炎(如溃疡性结肠炎和局限性节肠炎)以及其它自身免疫性疾病。

现已发现，细胞粘连蛋白纤维结合素(FN)与获能精子和卵母细胞的结合有关(Fusi和Broson，J.Androl.，13：28-35(1992))。这样，本发明的另一个目的还涉及可抑制精子与卵母细胞结合的可用作避孕药的化合物。本发明还提供了对精子和卵母细胞不完全粘连引起的不育症的一种可能的诊断方法。

本发明的另一个目的还提供了用于上述细胞粘连相关性疾病的研究、诊断、治疗或预防的衍生化合物，例如，但不仅限于，抗所述化合物的抗体和抗-基因型抗体。

本发明的另一个目的是提供一种基质，它可用于纯化以高亲和力，特异性结合本发明环状肽的蛋白质、多糖或其它化合物。

尽管细胞粘连是某些正常生理功能的需要，但有些情况下不需要细胞粘连，或者有些情况下需要调节细胞粘连。

在许多炎症性疾病中白细胞-内皮细胞间的反应会发生改变，其中白细胞不适宜的附着会导致对受侵袭组织产生进一步的损害。体外试验结果表明，此种有害的附着，其中白细胞与内皮细胞或与细胞外基质间的粘连，可通过白细胞上的整合素受体调节。在此情况下，可与整合素受体亲合结合的肽或其它化合物是所需的竞争性拮抗剂，并可用于治疗炎症，此炎症包括ARDS，哮喘和风湿性关节炎。

细胞粘连也可以引起肿瘤的转移，肿瘤转移被称作“肿瘤致死的主要潜在原因”。Welch等人，Intern.J.Cancer，43：449(1989)。可阻滞与基膜组分发生细胞粘连的含RGD的肽可用于阻滞或消除肿瘤转移。见Humphries等人，Science，223：469(1986)；Liotta，Cancer Res.，46：1(1986)；Roose，Biochem.Biophys.Acta.，738：263(1986)。同样，对RGD受体具有适宜亲合力的肽或其它化合物也应具有抗转移作用。

增强细胞粘连作用还会引起有害的血凝块的形成。血小板在细胞外基质上的附着、散布和凝聚是血栓形成的主要过程，此反应可通过可与血小板粘连的糖蛋白、纤维蛋白原、纤维结合素和凝血因子等来调节。当纤维结合素促进血小板附着和散布反应时，纤维蛋白原成为血小板凝聚的共因子。凝血因子在血小板于内皮下基质上附着和散布中起着十分重要的作用，Plow等人，PNAS-USA，82：8057(1985)。具有拮抗剂功能并可与能识别基质糖蛋白RGD位点的细胞受体结合的肽或其它化合物将是有益的抗血栓形成剂。

其它生理疾病可通过刺激调节细胞粘连治疗。例如，当细胞粘连发生不足时，会延长伤口愈合时间，这是不希望的。例如当与适宜定位基质或表面附着时，对整合素受体具有适宜亲合力的肽或其它化合物可通过使细胞与适宜的RGD-识别受体结合促进细胞粘连和伤口愈合。

例如，在假体移植术中，用此类肽或其它化合物将假体包衣会在此假体上形成一个生物相容的表面，当植入用本发明化合物包衣的假体时，此假体可以被细胞所包盖，此假体周围的细胞层会减低由假体本身激发免疫系统可能出现的排斥反应。另一个实例是，当用一种刺激内皮细胞，特别是暴露于血流表面的内皮细胞粘连的本发明化合物包衣连接循环系统的假体装置时，其会促进内皮细胞的接种并在此装置暴露于血流的表面形成一内皮层，完全形成后，此内皮层可阻止经常规察到的由未被内皮愈合的假体引起的血细胞损害。

一部分具有调节细胞粘连作用的本发明化合物可以用氨基酸序列式来表示，其中各氨基酸可以用常规的三个字母表示，或者也可以用一个字母缩写表示。

对于所用氨基酸缩写，当未指明其对映体结构时，适宜地是可以使用其l-或d-对映体。

本文所用其它缩写包括：

1，1-ACC：1-氨基-1-环己烷甲酸

Ada：1-金刚烷乙酸

(Ada)-Ala：β-金刚烷基丙氨酸

Ada-CA：1-金刚烷羧酸

Aib：α-氨基异丁酸(2-甲基丙氨酸)

β-Ala：β-丙氨酸(3-氨基丙酸)

β-Asp：β-天冬氨酸

(β-CN)A：β-氰基-丙氨酸

AMBA：4-(氨基甲基)苯甲酸

AnB：4-氨基丁酸

AnC：6-氨基己酸

(AMP)：2-氨甲基吡啶

ARDS：成人呼吸窘迫综合症

BOC：叔丁氧羰基

[(3-Br)Tyr]：3-溴代-酪氨酸

BOP：苯并三唑-1-基-三(二甲氨基)鏻六氟磷酸酯

BSA：牛血清白蛋白

CBO：顺式-二环并[3，3，0]辛烷-2-羧酸

Cb2：苄氧羰基

CHA：3-(环己基)丙氨酸

CHAc：3-环己基乙酸

Chx：环己基酯

Cl-Ala：氯代丙氨酸

CPA：环己基苯乙酸

dA：D-丙氨酸

DCC：二环己基碳二亚胺

DCM：二氯甲烷

Dhp：3，4-脱氢-脯氨酸

DIEA：二异丙基乙基胺

DMEM：Dulbecco改进的Eagle培养基

DMF：二甲基甲酰胺

d-Nal：D-3-(2’-奈基)丙氨酸

Dpr：二氨基丙烷

DTC：L-5，5-二甲基噻唑啉-4-羧酸

dv：D-缬氨酸

1-FCA：1-芴羧酸

9-FCA：9-芴羧酸

9-FA：9-芴乙酸

5-FINC：5-氟吲哚羧酸

Fm：芴基甲酯

FMOC：芴基甲氧羰基

FN：纤维结合素

GAC：胍-乙酸

3-Glu：r-氨基戊烷-1，5-二酸

HCA：氢化肉桂酸

HOBt：1-羟基苯并三唑

HomoC：高半胱氨酸

HomoP：高脯氨酸

HomoR：高精氨酸

HomoS：高色氨酸

Hyp：4-羟基脯氨酸

ICAM-1：细胞间粘连分子1

IC50：抑制浓度，粘连被抑制到对照水平50％的浓度

1-Nal：1-3-(2’-萘基)丙氨酸

IPA：异丙基醇

Isoni pecotic acid：4-哌啶羧酸

3-Me-Ada：3-甲基-1-金刚烷乙酸

mono MeR：N-甲基-精氨酸

Mpr：3-巯基丙酸(去-α-氨基半胱氨酸)

MTC：L-2-甲基噻唑啉-4-羧酸

NACA：3-降金刚烷羧酸

Naph-Ac：1-萘基乙酸

NB-Ac：2-降莰烷乙酸

Nic-Lys：烟碱基赖氨酸

Nle：降亮氨酸

[(N-Me)R]：N-甲基精氨酸

norAda-CA：3-降金刚烷羧酸

norArg：降精氨酸

(H₂NC(＝NH)NH(CH₂)₂CH(NH₂)CO₂H)

Orn：鸟氨酸

O-Cys：磺基丙氨酸

Pen：青霉胺

(β，β-二甲基半胱氨酸)

PhAc：苯乙酸

PMP：1-(β-巯基-β，β-环戊亚甲基)丙酸

PyE：焦谷氨酸

Pyro Glu：焦谷氨酸

QC：喹哪啶酸

R.T.室温(约24℃)

Sar：肌氨酸

SLE：全身性红斑狼疮

TA：3-β-噻吩基-丙氨酸

TC：DL-噻唑烷-2-羧酸

TCA：1，4-噻嗪-3-羧酸

TEA：三乙胺

TFA：三氟乙酸

(thiop)：3-硫代脯氨酸或

1-噻唑烷-4-羧酸

TIC：1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸

tlc：薄层色谱

TTC：L-四氢噻嗪-4-羧酸

VLA：最迟缓活化抗原

本文所用下列词语和/或短词具有如下含义：

“类似物”意即在可识别的母体化合物骨架上附加上化学取代基的母体化合物的衍生物，并且，母体化合物用某种方法衍生后所得类似物应保留其基本化学功能。这样，“氨基酸类似物”即为侧链碳或氮被衍化的，与α-碳相连的氮被N-衍化的氨基酸，但其应保留有形成肽键的能力。应当注意地是，氨基酸的D-对映体也包括在此定义中。另一个实例是“精氨酸类似物”指含有精氨酸骨架并在其上连有取代基的化合物。因此此类精氨酸类似物包括，但不仅限于，化合物N-甲基-Arg，N-低级烷基-Arg，N，N-二甲基-Arg，N，N-二低级烷基-Arg，高Arg，降Arg，侧链为胍基取代的N-硝基-Arg，N^ω-硝基-Arg，N，N’-二甲基-Arg，N，N’-二低级烷基-Arg，β，γ或δ碳被硝基-、烷基-、芳基-、硝基烷基-或硝基芳基-基团取代的精氨酸衍生物等。

“苯丙氨酸类似物”包括苯环上连有卤素、甲基或低级烷基、硝基或羟基取代基的化合物；不排除的实例有对硝基-Phe，对卤代-Phe，对氨基-Phe和五氟代-Phe。苯丙氨酸类似物还包括二取代的类似物如二氯代苯丙氨酸、o，m-二甲基苯丙氨酸等，不同取代基二取代的类似物如o-甲基-m-氯代-苯丙氨酸。如上所述N-烷基取代的化合物如N-甲基-Phe也应包括在内。

“酪氨酸类似物”与苯丙氨酸类似物相似，例如：3-溴代-Tyr、3，5-二溴代-Tyr和3，5-二碘代-Tyr，并还包括环羟基衍生物如o-甲基-酪氨酸、o-低级烷基-酪氨酸等。

“脯氨酸类似物”包括含硫化合物如3-硫代脯氨酸及下列化合物：高脯氨酸、羟基脯氨酸、3，4-二羟基脯氨酸、DL-噻唑烷-2-羧酸、1，4-四氢噻嗪-3-羧酸、L-5，5-二甲基噻唑啉-4-羧酸和1，3-四氢噻嗪-4-羧酸、L-四氢噻嗪-4-羧酸和1，3-、1，4-和1，5-硫氮杂。

“天冬氨酸酯类似物”和“谷氨酸酯类似物”包括此氨基酸ω-羧酸功能基的酯。

“赖氨酸类似物”包括α-氨基和ε-氨基的酰胺以及α-氨基和ε-氨基的烷基衍生物。赖氨酸类似物还包括DpR、鸟氨酸、高赖氨酸及这些氨基酸和有关氨基酸的相似类似物。

一方面，本发明涉及下式化合物：

上述结构式1中，在L¹和L²之间经成环基团Z形成一个桥，化合物被环合。在下文进一步描述的结构中，“αHN”表示序列中氨基末端氨基酸的α-氨基。同样，在结构式中α-羧基用“αC＝o”表示。侧链功能基用括号内结构表示。

对L¹和L²的选择应当使其每一个都含有一个能够有助于环桥基团形成的功能基。这样，Z可由L¹和L²贡献出的功能基构成并且还可还可含有其它原子和间隔基团。更具体地讲，优选的功能基包括硫羟基、氨基和羧基。此功能基可以由氨基酸或氨基酸类似物的侧链生成，或者可以由其本身的α-氨基(L¹中)或α-羧基(L²中)构成。另外，对成环做出贡献的功能基还可由与残基1和/或6位共价键连接的非肽成环连接基团提供。

在本发明优选方案中，桥残基L¹和L²分别选自残基Cys、Pen和homoC。对于L¹，其它优选的残基还有Mpr和PMP，所有这些残基均含有巯基。对于L²，其它优选的残基还有巯基-乙胺(MEA)。如果用MEA，则Y¹和Y²将不存在。这样，通过氧化偶合的巯基以在残基L¹和L²之间形成一个二硫键可实现桥环合。在此情况下，成环基团Z为在两个硫原子之间的一个共价键。其还可以表示成其中例如L¹和L²两者均为Cys残基的下式化合物

其中(如本文所用其它相似表述法)侧链功能基部分(此处为两端硫原子)列于具有侧链残基上面的括号内。

更优选的方案是L¹为Cys或Mpr而L²为Cys。

环桥也可以由烃基形成，例如由式-(CH₂)n-其中n为1-8的整数，优选为1-4中的(多)亚甲基桥基形成。一种此类桥可以如下表示，其中环状化合物在两个半胱氨酸侧链硫原子(代表L¹和L²)之间有三个亚甲基残基(代表Z)：

(见，L.Fieser et al.，“Reagents for Organic Synthesis”，Vol.1，pp.356-357，J.Wiley and Sons：(1967)；Fieser，J.Amer.Chem.Soc.，96：1945(1959))。

在另一个优选方案中，L¹和L²可以选自其它氨基酸或类似物或氨基酸模仿物，此氨基酸或类似物或氨基酸模仿物可提供氨基酸或类似残基的侧链或氨基-或羧基-末端做为适于形成成环基团的功能基。例如，L²可以选自Asp，Glu或其它氨基酸或类似物，上述氨基酸或类似物可提高一个适宜的侧链羧基，通过在缩合反应中与L¹上的氨基(例如N^a-氨基，或如Lys或Orn上侧链氨基)形成酰胺键以连接成环，但下式结构并不包括在内。在此情况下成环基团Z为L¹和L²之间的单键。

同样，氨基酸残基L²可提供羧基末端上的1个羧基，以与氨基酸残基或类似物L¹上侧链氨基或α-氨基之间形成酰胺键；或者此酰胺键的方向也可以转换，其中L¹提供1个侧链羧基，L²提供1个侧链氨基。此结构可如下例所示：

其中L¹(Lys)和L²(Aps)的侧链氨基和羰基直接链合；

其中酰胺链的方向(L¹和L²的侧键)被转换；

或其中所述L¹氨基末端与Glu(L²)侧链羧基直接链合，或者所述L²羧基末端与Orn(L¹)侧链氨基直接键合；

其中所述L¹上α-氨基末端与所述L²上羧基末端直接键合，如此在本发明化合物肽“骨架”中形成1个酰胺链。

在本发明另一个优选方案中，也可使用如下所示的二酮和二氨基连接基团Z，如下式

和-NH-(CH₂)_n-NH-其中n如上定义。

例如，二酮连接基团可用于与赖氨酸残基的ε-氨基连接，而二氨基连接基团通常用于与谷氨酸或天冬氨酸残基的δ-羧基成环。此实例所得化合物是有如下结构

和

其中L¹和L²上侧链功能基(氨基和羧基)见残基缩写符上方括号。

上文只涉及适宜的含烃桥的实例，而其它形式对于本领域技术人员是显而易见的。当成环基团Z包括有烃部分时，此烃可以为支链烃，但当此烃大小适合于形成一稳定结构时(特别是Z包含两个或多个亚甲基)，其也可以包括含有1个或多个杂原子的取代基包括羟基、氨基、硝基、烷氧基和卤素取代基。此类取代基可用来改变目的化合物的溶解度和/或生物分布。含有芳基或环烷基烃的桥基团也可用在Z位上，如下列二酮或二氨基结构

或-HN-(C₆H₈)-NH-对于Z基团中的烃基部分，含1至4个碳的简单烃基是优选的

当然，成桥基团为两个不同的功能基的情况也是可能的，也就是说，一端为酮基而另一端为氨基。这样，其中包含有许多上述讨论的基本单元的如下所示的结构也可用作成桥基团：

L¹和L²之间的环合桥还可以经一个如下式所示的单硫键(硫醚)形成。此键的一种形成方法是在L¹和L²上用半胱氨酸而在另一连接位置上使用可提供溴代-乙酸[或通式其中n＝0-4]功能基的残基。(见Barker et al.，J.Med.Chem.，35：2040-2048(1992))。另外，L¹可以是α，β脱氢丙氨酸，L²可以是半胱氨酸残基。二者反应可产生一个羊毛硫氨酸硫醚连接基团。

L¹和L²之间的环合桥也可以经一个如下式所示的单硫键(硫醚)形成。

关于此参见

Palmer et al.，in“Peptides--Chemistry，Structure，Biology”，pp.616-618，Rivier & Marshall，Ed.，Escom.Leider(1990)；and Jung，op.cit.，pp.865-869.

氨基酸残基类似物也可以用作L¹和/或L²，例如同系物(其中侧链变长或变短的同时，仍能提供成环用的羧基、氨基或其它活性前体功能基)、氨基酸d-对映体、侧链中含有适宜功能基的不同侧链类似物(例如β-氰基丙氨酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸，α-重氮苯丙氨酸或2-氨基己二酸)或其它氨基酸类似物(参见例如上文所述氨基酸类似物)。

在L¹和/或L²位上还可以用氨基酸模拟结构，此氨基酸模拟结构应能与在残基序列1-2-3-4-5-6的羧基和/或氨基末端经一个酰胺链共价键键合；并应能提供成环(经Z)用的适宜的前体功能基。此氨基酸模拟结构包括含有一个或多个杂原子的有机片段，其应包含有至少一个参与成环的功能基(优选的是含杂原子的功能基)。实例包括下式残基其中n为1至约8，优选为1-4，例如β-丙氨酸和r-氨基丁酸的残基。(当n＝1时，是氨基酸甘氨酸而不是α-氨基酸模拟物)。此类结构与上述氨基酸和氨基酸类似物相类似，可用作L²(其中例如由羧基前体形成的所述羰基通常可与残基2/或如果可能，残基1的氨基末端形成酰胺链)，或者其也可以用作L¹(其中所述氨基可与末端残基4、5或6的羧基末端形成酰胺链)。如果只用一个此类连接残基L时，其可以代表L¹和L²两者(并在此还包括Z)，成环反应可以通过形成两个酰胺键来完成，在序列1-2-3-4-5-6的每一端上有一个酰胺键，此类结构的实例如下式结构其中序列1-2-3-4-5-6N^α-末端和羧基末端分别与上述模拟氨基酸连接基团的羰基残基和氨基残基直接键合形成两个模拟肽的酰胺键。同样用这种氨基酸模拟连接基团也可以实现成环反应，其中连接在数字序列末端上的第二连接基团(如L¹和L²)上的侧链功能团(如氨基或羰基侧链功能团)与模拟基团相连接，并且此模拟基团(如L²或L¹)将此化合物环化到数字序列的剩余末端残基上。步实例可如下式结构所示其中L²(例如Asp)提供括号中的所述侧链羰基，残基1提供所述N^α-末端氨基，模拟氨基酸连接基团为L¹。

含有芳基、环烷基或其它连接基团的氨基酸模拟结构也可以用作L¹和/或L²，例如下式结构

或

同样，上述二个不同功能基(酮-氨基)结构也可用作Z基团，其中L¹和L²上互补侧链功能基(如L¹上侧链氨基和L²上侧链羧基)经两个酰胺键结构键合成Z基团。

通过适宜地选择L¹、L²和Z成环的其它方法是本技术领域技术人员意想得到的并被包括在本发明范围内。

可以理解地是，上述有关成环基团(Z)、桥连残基(L¹和L²)、取代基、氨基酸类似物、氨基酸模拟物、环合方法等的讨论，在细节上已作必要修正的情况下适用于下文所讨论的其它结构式。结构式I中残基1最优选是不存在；残基2最优选是Arg；残基3最优选是Ala；残基4最优选是Asp；残基5最优选是3-硫代脯氨酸(thiop)以及残基6优选是不存在。对于残基1-2-3-4-5-6序列Arg-Ala-Asp-(thiop)(SEQ.ID.NO.：9)残基1-4是最优选的。更优选的是其中残基1不存在，残基2不存在，残基3为Asp，残基4为(thiop)和残基5和6两者均不存在的序列。这样，对于残基1-2-3-4-5-6序列Asp-(thiop)也是优选的。

第三种更优选的序列是其中X¹为Gly，残基1和残基2两者均存在，残基3为Asp，残基4为(thiop)和残基5和6两者均不存在的序列。

第四种更优选的序列是其中X²为(1-FCA)，X¹和残基1和2均不存在，残基3为Asp，残基4为(thiop)和残基5和6两者均不存在的序列。

第五种更优选的化合物是其中X²为Fmoc，X¹为Arg，残基1和2两者均不存在，残基3为AnB，残基4为(thiop)和残基5和6两者均不存在的化合物，

第六种更优选的化合物是其中X²不存在，X¹为Arg，残基1和2两者均不存在，残基3为Ala，残基4为(thiop)和残基5和6两者均不存在的化合物。

第七种更优选的化合物是其中X¹和X²不存在，残基1不存在，残基2为Arg，残基3为d-Ala，残基4为Asp，残基5不存在和残基6为(thiop)的化合物。

第八种更优选的化合物是其中残基1不存在，残基2为Arg，残基3为Ala，残基4为Leu，残基5不存在和残基6为(thiop)的化合物。

在结构式I中X¹和Y¹每一个均是可任意选择的。当它们存在时，优选的是他们彼此间独立选择，目的是为了提高所得化合物的活性和/或例如在体内环境下保护化合物勉遭代谢以及提高化合物有效的半衰期。为此，更优选的是在化合物的一个或多个末端残基位置上(即在最氨基末端和或最羧基末端残基位置上，或X¹或Y¹中)使用一个或多个d-氨基酸，以提高化合物在体内对蛋白分解或其它酶代谢的稳定性。X¹位置上更具体的优选残基包括Gly、Phe、Leu、Asn、Val、Tyr、Ala、Arg、His、1-或2-萘丙氨酸、环己基-Ala-、AMBA、AnC、AnB和ω-氨基-低级链烷酸、Aib、Ser-Tyr-Asn、Ala-Thr-Val-和对氯代-Phe-。Y¹位置上更优选的残基包括Ala、-Ala-Ser、-Ala-Ser-Ser、-Ala-Ser-Ser-Lys、-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro、Thr，-Thr-Phe、-Aib、对氯代-Phe、AMBA、AnC、AnB、ω-氨基-低级链烷酸、1-或2-萘丙氨酸和-(环己基)Ala相应于下文所述结构式所给位置，此X¹和Y¹也是优选的。

当使用R¹不为氢的取代基X²或Y²时，例如X²优选的是包括酰基R’CO，特别是甲酸、乙酸或其它低级链烷酸，还包括含有氮和硫的直链混合功能基羧酸(例如3-疏基丙酸)。对于Y²优选的是包括式R’NH的氨基，特别是低级烷基胺。对于X²其它优选的取代基包括由化合物如金刚烷乙酸、金刚烷甲酸、1-或2-萘基乙酸、2-降莰烷乙酸、3-降金刚烷甲酸、3-甲基金刚烷乙酸衍生的取代基。对于Y²其它优选的取代基包括低级烷基胺、芳基胺、1-或2-金刚烷胺和被四唑基取代的含α-羧酸的氨基酸。各R¹分别是药物上适宜的取代基，优选的是选自氢、直链和支链、未取代和取代的C₁-C₈低级烷基、C₂-C₈链烯基、C₂-C₈链炔基、C₆-C₁₄芳基、C₇-C₁₄烷芳基、C₇-C₁₄环烷芳基和C₃-C₁₄环烷基，对于-NR’₂，其可以与所连氮原子形成成环基团，即任意含有氧、氮或硫作为另外的环杂原子的5-8元杂环，甲酸、乙酸、杂环羧酸、芳基羧酸、杂芳环羧酸、链烷酸、链烯酸、链炔酸、含硫和氮的其它混合功能基直链羧酸、金刚烷基、芴基、1-FcA、9-FcA、9-FA、FMOC、Ada、Ada-CA、NACA、3-Me-Ada、(NB)-Ac、PhAc、Naph-Ac、HCA、QC、CPA、DTC、TCA、AMBA、其它多环芳环和杂芳环羧酸及乙酸、QC、CPA、BOC、5-FINC和CBO。以下所列举的结构

其中m＝2，3 or 4如结构式I中残基5，表示其中侧链羟基(括号中所示)任意地被式R’基团取代的氨基酸残基衍物，此R’除不为氢外如上述定义。

当结构式I5位上使用此类取代的残基时，优选的是R’选自氢和C₁-C₈低级烷基，特别是甲基和乙基。

结构式I中特别优选的化合物包括：(SEQ.ID.NO.：4)其中缩写结构-Cys-，与本文中其它地方所用相似，表示其侧链硫原子分别描述的半胱氨酸残基，同样，结构(S)…(S)表二硫链。所述化合物具有抑制细胞与纤维结合素的粘连作用。

其它优选的化合物为其中残基1不存在或为Leu；残基2为Arg；残基L¹为Cys；残基4为Asp；残基5不存在或为Ser；残基6不存在，为Pro或(thiop)；残基L²为Cys的化合物。下列表1所列化合物为特别优选的。

表1中所选化合物的序列表如下所示：

cmpd.2，(SEQ.ID.NO.：13)；cmpd.3，(SEQ.ID.NO.：5)；cmpds.23，33，48，49，51，54，.55，62 and 92，(SEQ.ID.NO.：4)；cmpd.29，(SEQ.ID.NO.：6)；cmpd.42，(SEQ.ID.NO.：7)；cmpd.50，(SEQ.ID.NO.：8)；cmpds.65 and 66，(SEQ.ID.NO.：9)；cmpd.67，(SEQ.ID.NO.：10)；cmpd.68，(SEQ.ID.NO.：11)；cmpd.69，(SEQ.ID.NO.：12)；cmpd.71，(SEQ.ID.NO.：14)；cmpd.75，(SEQ.ID.NO.：15)；cmpd.77，(SEQ.ID.NO.：16)；cmpds.78 and 79，(SEQ.ID.NO.：17)；cmpd.80，(SEQ.ID.NO.：18)；cmpd.81，(SEQ.ID.NO.：19)；cmpd.82，(SEQ.ID.NO.：20)；cmpd.84，(SEQ.ID.NO.：21)；cmpd.85，(SEQ.ID.NO.：22)；cmpd.86，(SEQ.ID.NO.：23)；cmpd.87，(SEQ.ID.NO.：24)；cmpd.89，(SEQ.ID.NO.：25).

表1

保留

梯度化合物号序列质谱 (％A-min-＞％B) 时间(min) ％纯度1 C^★(NiC-Lys)GDSPC^★ 8-20′-＞28 9.9 99.92 C^★R(Sar)DSPC^★ 0-20′-＞20 10.9 96.93 C^★RGNSPC^★ 0-20′-＞20 9.2 98.14 RC^★NPC^★ 0-20′-＞20 7.5 97.85 FmocKC^★DPC^★ 40-20′-＞60 8.9 97.36 KC^★DPC^★ 2-30′-＞32 3.9 82.97 FmocAC^★D(thiop)C^★ 50-20′-＞70 12.5 99.78 FmocFC^★D(thiop)C^★ 70-20′-＞90 8.1 99.49 FmocHC^★D(thiop)C^★ 55-20′-＞75 9.3 ^★69.210 FmocLC^★D(thiop)C^★ 55-20′-＞75 11.0 99.011 FmocRC^★A(thiop)C^★ 50-20′-＞70 7.6 97.412 FmoCRC^★L(thiop)C^★ 55-20′-＞75 10.2 95.313 FmocRC^★F(thiop)C^★ 55-20′-＞75 10.3 98.614 AC^★D(thiop)C^★ 0-30′-＞30 5.2 88.515 RC^★A(thiop)C^★ 0-20′-＞20 10.1 ^★64.3

梯度保留时间化合物号序列质谱

％纯度

(％A-min-＞％B) Time(min)16 LC^★D(thiop)C^★ 2-30′-＞32 13.9 87.417 FC^★D(thiop)C^★ 2-20′-＞22 17.1 88.118 RC^★F(thiop)C^★ 2-20′-＞32 27.1 77.719 HC^★D(thiop)C^★ 2-30′-＞32 21.0 ^★61.220 Rc^★L(thiop)C^★ 2-30′-＞32 22.9 ^★54.621 FmocGC^★D(thiop)C^★ 50-30′-＞70 6.5 99.222 FmocPC^★D(thiop)C^★ 45-20′-＞65 10.8 99.723 AdaC^★D(thiop)C^★ 45-20′-＞65 6.3 99.724 FmocAC^★A(thiop)C^★ 60-20′-＞80 6.2 96.425 (1-FCA)AC^★D(thiop)C^★ 715.90 45-20′-＞65 7.1 98.126 (1-FCA)C^★D(thiop)C^★ 645 45-20′-＞65 8.7 99.027 (1-FCA)RC^★[(p-Cl)Phe](thiop)C^★ 60-20′-＞80 7.1 98.528 GC^★D(thiop)C^★ 40-20′-＞60 8.0 95.729 C^★GKGESPC^★ 2-20′-＞22 6.4 96.830 (1FCA)(Sar)C^★D(thiop)C^★ 45-20′-＞65 6.3 99.131 (thiop)C^★D(thiop)C^★ 2-20′-＞22 15.5 99.532 PC^★D(thiop)C^★ 2-20′-＞22 7.0 88.933 (Sar)C^★D(thiop)C^★ 2-20′-＞22 6.6 93.5

梯度保留时间化合物号序列质谱

％纯度

(％A-min-＞％B) (min)34 FmocRC^★(thiop)C^★ 55-20′-＞75 6.9 99.135 (1-FCA)(thiop)C^★D(thiop)C^★ 50-20′-＞70 5.9 86.736 FmocK-AdaC^★D(thiop)C^★ 980 75-20′-＞95 6.8 97.737 FmocRC^★(BD)(thiop)C^★ 831 45-20′-＞65 12.2 96.738 FmocK(AnB)C^★D(thiop)C^★ 45-20′-＞65 6.8 98.539 [(N-Me)R]C^★D(thiop)C^★ 2-20′-＞22 8.2 92.940 C^★RGA[(p-Cl)Phe](thiop)C^★ 35-20′-＞55 6.5 98.141 AdaGGC^★RGA[(p-Cl)Phe](thiop)C^★ 60-20′-＞80 8.0 96.642 C^★AGD[(p-Cl)Phe](thiop)C^★ 30-20′-＞50 6.2 97.243 AdaGGC^★AGD[(p-Cl)Phe](thiop)C^★ 55-20′-＞75 5.4 97.244 FmocRC^★(AnB)(thiop)C^★ 800.89 50-20′-＞70 7.0 99.345 FmocRC^★(AiB)(thiop)C^★ 45-20′-＞65 7.9 96.646 FmocRC^★V(thiop)C^★ 60-20′-＞80 6.7 98.147 FmocRC^★(β-CN)A(thiop)C^★ 75-20′-＞95 10.3 89.048 (GAC)C^★D(thiop)C^★ 2-20′-＞22 13.6 96.149 (DTC)C^★D(thiop)C^★ 15-20′-＞35 10.0 89.8

梯度保留时间化合物号序列质谱

％纯度

(％A-min-＞％B) (min)50 C^★GRGA[(p-Cl)Phe](thiop)C^★ 30-20′-＞50 7.5 99.251 FmocC^★D(thiop)C^★ 50-20′-＞70 8.9 89.552 (TCA)C^★D(thiop)C^★ 2-20′-＞22 9.1 98.153 (1-FCA)GC^★D(thiop)C^★ 701.94 45-20′-＞65 6.4 97.854 (5-FINC)C^★D(thiop)C^★ 35-20′-＞55 9.7 98.655 (CBO)C^★D(thiop)C^★ 35-20′-＞55 8.8 95.756 FmocKPC^★D(thiop)C^★ 45-20′-＞65 8.7 98.357 RC^★(AnB)(thiop)C^★ 2-20′-＞22 12.3 91.158 DC^★R(thiop)C^★ 2-20′-＞22 9.9 89.659 KPC^★D(thiop)C^★ 2-20′-＞22 10.7 88.760 (1-FCA)KC^★E(thiop)C^★ 45-20′-＞65 6.3 99.761 RC^★(O-Cys)(thiop)C^★ 2-20′-＞22 19.1 99.662 (1-FCA)C^★(thiop)DC^★ 55-20′-＞75 5.8 86.963 FmocRC^★N(thiop)C^★ 40-20′-＞60 11.0 99.064 RC^★(β-Ala)(thiop)C^★ 20-20′-＞40 10.1 84.765 R^★AD(thiop)D^★ 2-20′-＞22 12.8 89.466 (Anb)^★RAD(thiop)D^★ 658.25 2-20′-＞22 9.9 92.9

梯度保留时间化合物号序列质谱

％纯度

(％A-min-＞％B) (min)67 (Anb)^★RVD(thiop)D^★ 5-20′-＞25 10.8 99.868 (1-FCA)K^★AD(thiop)D^★ 737.27 45-20′-＞65 6.4 94.769 G^★RAD(thiop)D^★ 630.19 2-20′-＞22 7.0 96.170 (1-FCA)K^★(dA)D(thiop)D^★ 40-20′-＞60 10.1 98.071 (1-FCA)Orn^★AD(thiop)D^★ 40-20′-＞60 8.5 98.872 (1-FCA)(dK)^★AD(thiop)(dD)^★ 40-20′-＞60 9.3 95.273 (1-FCA)(dK^★)(dA)(dD)(dP)(dD^★) 40-20′-＞60 8.1 96.474 (1-FCA)(dK^★)AD(thiop)D^★ 40-20′-＞60 8.5 97.275 G^★RVD(thiop)D^★ 2-20′-＞22 12.1 99.676 (Anb)^★R(D-Nal)D(thiop)D^★ 30-20′-＞50 9.3 96.077 (Anb)^★RFD(thiop)D^★ 15-20′-＞35 6.9 98.478 (1-FCA)K^★ADPD^★ 45-20′-＞65 6.5 99.979 (1-FCA)K^★D(thiop)D^★ 666.19 45-20′-＞65 6.3 98.180 G^★RAL(thiop)D^★ 15-20′-＞35 12.1 83.181 (Aib)^★RAD(thiop)D^★ 658.7 2-20′-＞22 10.3 97.482 G^★RFD(thiop)D^★ 10-20′-＞30 10.9 98.683 RGC^★D(thiop)C^★ 2-20′-＞22 8.4 97.884 G^★R[(3-Br)Tyr]D(thiop)D^★ 10-20′-＞30 12.2 99.685 G^★R[(3-Br)Tyr](thiop)C^★ 2-20′-＞22 7.6 97.686 G^★R[(3-pyridyl)A]D(thiop)D^★ 2-20′-＞22 12.0 98.987 (AMBA)^★RAD(thiop)D^★ 10-20′-＞30 10.8 92.2

梯度保留时间化合物号序列质谱

％纯度

(％A-min-＞％B) (min)88 (1-FCA)C^★D(TIC)C^★ 689.06 50-20′-＞70 8.4 98.889 G^★MD(thiop)D^★ 2-20′-＞22 8.1 91.190 [(N-Me)R]C^★L(thiop)C^★ 621.05 15-20′-＞3 5 11.7 99.291 RC^★Y(thiop)C^★ 10-20′-＞30 12.6 98.092 (1-FCA)C^★D(thiop)C^★-NH2 644 55-20′-＞75 7.8 99.9

上述结构式I，其中连接残基L¹和L²不为Cys，Z不为单键的此结构也可使用。此时我们发现，L¹上任一侧存在的残基会经侧链或者L¹上存在的不与其相邻残基成键的其它功能基与L²成环(经Z)。通常残基L²经末端功能基(典型的是羧基)或侧链功能基成环。

X¹位优选残基包括Gly、Phe、Leu、Ash、Val-、Tyr、1-或2-萘丙甲酸、环己基Ala-、AMBA、AnC、AnB、ω-氨基低级链烷酸、Aib-、Ser-、Tyr-Ash-、Ala-Thr-Val-和对氯代-Phe-。Y¹位优选的残基包括-Ala、-Ala-Ser、-Ala-Ser-Ser、-Ala-Ser-Ser-Lys、-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro、-Thr、-Thr-Phe、-Aib、-对氯代-Phe、AMBA、AnC、AnB、ω-氨基-低级链烷酸、1-或2-萘丙氨酸和-(环己基Ala)。

当使用R’不为氢的取代基X²或Y²时，如酰基R’CO或式R’NH氨基时，对X²优选的取代基包括由化合物如金刚烷乙酸、金刚烷甲酸、1-或2-萘基乙酸、2-降莰烷乙酸、3-降金刚烷甲酸、3-甲基金刚烷乙酸衍生的取代的，而对Y²优选的取代基包括1-或2-金刚烷胺。其它适宜的R’基团为由低级烷胺、低级芳基胺或酸如9-芴乙酸、1-芴甲酸、4-芴甲酸、2-芴甲酸、9-芴甲酸、苯乙、羟基琥珀酸、喹哪啶酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、环己基乙酸和3-巯基丙酸衍生的基团。通常，X²选酸残基而Y²选碱性基团。

式I化合物的衍生物可用于制备抗原，因而也可用于制备抗体。在许多情况下，此抗体本身可通过用作基质蛋白或其它配体的受体，或者，作为抗遗传型抗体时，通过阻滞细胞受体有效地抑制细胞粘连或调节免疫活性。

在实施本发明治疗方法时，可通过本领域公知的任何常规的和可接受的方法，或者单独施用或者与另一种或几种本发明化合物或其它药剂如免疫抑制剂、抗组胺剂、皮质甾类等结合施用有效量的活性化合物包括其衍生物或盐，或如下所述的含有它们的药物组合物。这些化合物或组合物可以通过口服、舌下、局部(如于皮肤上或眼内)、吸入或栓剂、非肠道(如肌内、静脉内、皮下、皮内)或吸入法并以固体或液体剂型如片剂、悬浮液和气雾剂形式施用，对此下文还将做更详细的讨论。施用时，可以使用连续治疗用的单一单位剂型或治疗中随意加入的单一剂量对于病人来讲，单位剂量在1-3000mg。

本发明药物组合物制备中适用的药物载体可是固体、液体或其混合物；这样，此组合物可以是片剂、粒剂、胶囊、粉剂、包有肠溶衣的或有其它保护的制剂(如结合到离子交换树脂或其它载体上，或包于脂质或脂蛋白囊中或加入其它末端氨基酸)、持续释放剂、易被侵蚀性制剂、植入器或植入药、微球剂、溶液(如眼滴液)、悬浮液、酏剂、气雾剂等。

水、盐水、葡萄糖水溶液和乙二醇是优选的液体载体、特别是对注射液(对等渗注射液)。此载体可选自下述各种油，其包括来自石油、动物、植物或合成的油，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等，适宜的药物赋形剂包括淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、-硬脂酸甘油酯、氯化钠、干脱脂奶、甘油、丙二醇、水、乙醇等。此组合物可进行常规药物处理如灭菌并可含有常规药物添加剂如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、调节等渗压的盐、缓冲液等。适宜的药物载体和制剂如Martin，″Remington′s Pharmaceutical Sciences″，15th Ed.；Mack Publishing Co.，Easton(1975)；参见，pp.1405-1412 and pp.1461-1487。中所述。通常，此组合物应含有有效量的活性化合物和适宜量的载体，以制成适于宿主施用的合适剂型。

一个优选的方案是，当需要或可能是在紧急情况下需要减轻症状时，施用本发明的治疗方法，另一个优选的方案是，当连续治疗或预防性治疗时，有效地施用本方法。

在实施本发明治疗方法时，给宿主施用药物组合物的具体剂量取决于各种情况，其包括疾病的种类、其严重程度、用药方案、宿主年龄和身体状况等等。适宜的剂量可以根据医药领域熟知的临床用量来确定。当经注射或口服用药时，可以使用的剂量为每公斤宿主体重0.1-100mg化合物，一般优选的是每公斤体重1-100mg。局部使用剂量是每日多次施用对每毫升液体载体或赋形剂最低含0.1mg化合物的配剂。

本发明化合物和治疗或药用组合物可用于通过整合素受体与配体结合来调节的疾病或其它症状的研究和治疗，此疾病或症状包括与细胞和天然或其它配体结合不正常(如过强或不足)有关的疾病。此类疾病或症状可包括炎症性疾病如风湿性关节炎、哮喘、变态反应、成人呼吸窘迫综合症、肠炎(如溃疡性结肠炎和局限性节肠炎)和眼炎；自身免疫性疾病、血栓形成或血小板不适宜迁移引起的疾病，以及心血管疾病；血栓溶解后闭塞预防；肿瘤疾病包括转移瘤；受精抑制引起的不育和胚胎移植；以及需要增强细胞粘连时，及如上所述的伤口愈合或假体移植。

本发明化合物被发现还可用于对由于细胞粘连不正常引起的疾病的诊断，例如，白细胞与内皮细胞或与血管内暴露的细胞外基质间的粘连过度均与早期动脉粥样硬化有关，这样，白细胞与内皮细胞间粘连过度的人会存在引起血管闭塞的危险。对这危险情况进行检测时，首先通过测定本发明哪种化合物能够抑制白细胞与内皮细胞间的结合，然后在通过测定此化合物与宿主内皮细胞间的结合确定是否存在这样危险。

另外，本发明还被发现可用于由抗体引起的自身免疫性疾病的诊断，所述抗体可与细胞粘连分子结合或者可与细胞粘连分子的受体结合，例如，如果一种疾病是由一种抗体引起的，而这种抗体可以结合由结构I的化合物模似的细胞粘连分子，那么可以通过使用结合到一种底物上的结构I化合物对病人血液或血清进行免疫测定以捕获这种抗体，从而容易地实现检测这种抗体存在的诊断试验。用本领城常规方法如标记的抗人抗体Fc部分的第二抗体或使用标记的来源子细菌的Fc结合蛋白(蛋白A或蛋白G)可检测结合的抗体。另一种情况是，当结构式I化合物可与引起疾病的抗体的受体结合时，可以使用竟争免疫测定法。在此情况下，将式I化合物标记并可测定其与底物上受体蛋白间竟争性结合作用。

另外，本发明化合物的衍生物还可用于抗原生成，此抗原可通过本发明肽与载体蛋白偶合生成，用此复合物将动物免疫后，会产生抗此肽的抗体，在某些情况下，这些抗体本身通过作为基质蛋白或其它细胞粘连配体的受体，或者，如果是抗遗传型抗体，还可通过阻滞细胞受体有效地抑制细胞粘连或调节免疫活性。

另外，本发明化合物还可用于生产基质，以用于纯化可与本发明化合物结合并具有较强亲合力的物质。例如，此类基质可以通过本发明化合物与衍生的色谱载体共价键结合来制备。对此本发明的一个具体方案是，表1所列含有游离氨基的环状肽可与溴化腈活化的色谱树脂(由Pharmacia，Uppsala，Sweden，Cat.no.52-1153-00-AK)偶合。如果必要，可以通过加入赖氨酸残基或者通过加入另一种含氨基的殊基，将氨基引入到所需的肽中。另外，当然可用碳化二亚胺活化的树脂与带有羧基功能基的环状肽结合。

肽的偶合反应基本上可以用厂家所提供的方法进行。而环状肽-衍生的树脂可用于纯化能以较高亲合力与环状肽结合的蛋白质、多糖或其它物质。此纯化可以用下述过程实现，即将环状肽-衍生的树脂与含有欲纯化亲合性的化合物的样品结合，纯化条件是能使其形成特异性复合物，用可除去不需要物质但不损坏复合物的溶液洗涤结合到树脂上的复合物，然后用可解离出此复合物的溶液洗涤树脂，洗脱得到欲纯化的物质。

尽管与本文所述相似或相同的任何方法和原料可用于本发明实施或试验中，但在此仍给出了优选的方法和原料，如上文所述，参考文献中所有公开的内容均可作为本文的参考。

实施例1

化合物的合成和通式

“主链”即本发明环状化合物的肽键连接的部分通常用固相肽合成法合成，然后，如果必要，用在成环时只可选择性地脱除残基中保护基的方法成环，通过这种方法，化合物中肽序列不会被改变，或者被增长，但此肽可以适宜地被成环。末领域公知的其它合成和环合方法也可用于制备本文所述环状化合物和通式化合物。除非另有说明，PCT国际公开WO92/00995(1992.1.23公开)中所述方法一般可用于本发明肽的合成。

因此，本发明化合物中肽序列可以通过固相肽合成法(如BOC或FMOC法)，液相合成法或其它本领域公知的方法包括上述方法的结合方法合成。已知并被广泛应用的BOC和FMOC法可见下列参考文献：

Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，88：2149(1963)；

Meienhofer，“Hormonal Proteins andPeptides”，pp.48-267，C.H.Li，Ed.，AcademicPress(1983)；

Barany et al，in“The Peptides”，pp.3-285，E.Gross and J.Meienhofer，Eds.，Academic Press，New York(1980).

具体合成实施例

N，N-二烷基-精氨酸

用本文参考文献PCT国际公开WO92/00995(1992.1.23公开)中的常规方法合成N，N-二甲基-精氨酸、N，N’-二甲基-精氨酸和N，N’-二乙基-精氨酸。

被修饰精氨酸的保护：上述所得原料适宜于BOC-保护，而无需结晶或其它纯化过程。将1当量氨基酸溶于1当量1N NaOH和等体积的二噁烷中。将BOC-酸酣(1.1eq)溶于二噁烷并于室温搅拌4小时，此时如果必要可通过加入1N NaOH保持PH为9。反应用tlc监测，直到原料消失(用茚三酮喷雾显色)。反应完成时，加入乙酸直至PH到5。搅拌15分钟后，分离出产物，随后冷冻干燥。tlc系统-甲醇/氢氧化铵，1∶1二甲基-精氨酸的Rf为0.6，二乙基-精氨酸的Rf为0.8。

脯氨酸类似物

(D，L)-噻唑烷-2-羧酸、N-BOC-(D，L)-噻唑烷-2-羧酸，N-BOC-(L)-5，5-二甲基-噻唑烷-4-羧酸，(L)-2-甲基噻唑烷-4-羧酸和N-BOC(L)-2-甲基噻唑烷-4-羧酸的合成公开于本文参考文献PCT国际公开WO92/00995(1992.1.23公开)中。L-1，3-四氢噻嗪-4-羧酸方法：

向于75ml水中的5g高半胱氨酸硫代内酯盐酸化物(Sigma)中加入3ml 1N Hcl和16ml 37％甲醛水溶液(Aldrich)。于室温搅拌2天后，将溶液浓缩至干(水浴温度40-50℃)。将产物溶于100ml 3乙醇中，过滤并真空浓缩至25ml，滴加等体积的乙酸乙酯并令混合物于冰箱中静置过夜。灰白色或褐色结晶用乙酸乙酯洗涤并真空干燥，得到约3.0g(产率50.4％)。将此粗产物溶于最小量的热3乙醇中并于冰浴中冷却，开始析晶后加入等体积的乙酸乙酯，混合物于冷浴中冷却4小时。收集生成的结晶，用乙酸乙酯洗涤并真空干燥得到2gm L-1，3-四氢噻嗪-4-羧酸。分析：系统A(丁醇/乙酸/水/吡啶4∶1∶2∶1)中硅胶tlc：产物的Rf为0.4。熔点：208-210℃分解.旋光度[水]-14.03°d＝1。N-BOC-(L)-1，3-四氢噻嗪-4-羧酸方法：

向于50ml水，17ml 1N NaOH和50ml二噁烷(不含过氨化物)中的3gm L-1，3-四氢噻嗪-4羧酸(16.3mmol)中加入3.8gm(BOC)₂O(17.4mmol)的10ml二噁烷溶液，用1N NaOH使反应的PH保持在8-9并将反应搅拌过夜。过夜后发现反应未完全，再加入(BOC)₂O(0.38gm)并将混合物再搅拌4小时至反应完全。将反应混合物真空浓缩至一半体积并用己烷萃取(2×50ml)，除去己烷层，水层用冰浴冷却，用1N NaHSO₄酸化至PH3并用3份50ml乙酸乙酯萃取。冷却的乙酸乙酯层用水洗涤(3×50ml)，无水MgSO₄干燥并过滤。真空除去溶剂得到自发析晶的亮琥珀色油状物。用少量己烷处理并收集固体，将产物真空干燥，得到3.6gm灰白色固体。分析：硅胶tlc，系统A；产物的Rf为0.8。M.P.112°-113℃。丙酮中旋光度-162.4°，d＝1。元素分析C₁₀H₁₇N₁O₄S₁；F.W.247；计算值：C，48.58；H，6.88；N₁5.67。实测值：C，48.52；H₁6.94；N₁5.67。(L)-1，4-四氢噻嗪-3-羧酸

步骤1：于1/2小时内向钠(16.8gm)的1.51液氨溶液中分批加入L-半胱氨酸(Sigma，38gm)，直至兰色完全消失。于45分钟内缓慢加入溴代乙醇(Aldrich，56gm)并搅拌过夜，令氨蒸发。步骤2：将步骤1所得残余物溶于1500ml浓Hcl并加热至90-95℃，加热7小时。溶液真空浓缩，收集固体。固体于1200ml异丙醇中制成浆并过滤，母液浓缩成膏，过滤平将滤饼于空气中干燥。步骤3：将步骤2所得固体(45gm)溶于1L DMF并加入750ml三乙胺。混合物于90-95℃加热2.5小时，然后于旋转蒸发器上浓缩至干。固体溶于1.5L水并在800ml Amberlite IR-120 H+树脂柱上进行处理，洗脱，直至用1.5N氢氧化铵水溶液洗脱出中性产物。将产物浓缩至干，溶于水，用碳处理，经硅藻土垫过滤并用约2ml丙酮缓慢稀释。收集结晶，用丙酮洗涤，空气干燥，得到16.2gm所需的(L)-1，4-四氢噻嗪-3-羧酸。

N-BOC-(L)-1，4-四氢噻嗪-3-羧酸

向溶于1∶1二噁烷/1N NaOH中的(L)-1，4-四氢噻嗪-3-羧酸(16gm)混合物中加入溶于10ml二噁烷的(BOC)₂O(24gm)，令PH保持在9并于室温静置过夜。将溶液浓缩至1/2体积并于吸滤器中用三份50ml己烷萃取。水层用水稀释至300ml，冷却并用NaHSO₄酸化至PH3。收集固体，用水洗涤并用P₂O₅干燥，得22.4gm白色粉末状所需的N-BOC-(L)-1，4-四氢噻嗪-3-羧酸。

氨基酸前体由BACHEN(Torrance，California)买到。DCC由Sigma公司(st.Louis，Mo)得到；TFA由Halocarton公司(New York，NY)得到。三乙胺由Fisher Scientific(Fairlane，NJ)得到。4-甲基二苯甲基胺树脂由CBA Inc(Boulder.CO)得到。其它试剂为分析纯或更高级别的试剂。

所有的肽均可用BOC/DCL化学法

(Baranyet al，The Peptides，E.Gross and J.Meienhofereds.，Volume 2，Part A，Chapter 1，AcademicPress，Inc.，1-284(1979)).由贝克曼自动肽合成器(System 990，Beckman Instruments，Inc.，Palo Alto，California)通过固相法

(Barany et al，The Peptides，E.Gross and J.Meienhofer eds.，Volume 2，Part A，Chapter 1，Academic Press，Inc.，1-284(1979))合成。其它活化剂还包括DCC/HOBT

(D.L.Nyugen and B.Castro，＂Peptide Chemistry＂，pp.231-238 ProteinResearch Foundation Press，Osaka(1987))or BOPor BOP/HOBt(D.Hudson，J.Org.Chem.，53：617-624(1988)).

N-BOC-S-(4-甲基苄基)半胱氨酸(BOC-Cys-(4-MeBzl))在氯甲基聚苯乙烯树脂(Merrifield树脂)上的吸附反应应在氟化钾存在下进行(Horiki，Chem.Lett.(#2)：166-168(1978))合成环状肽的一般方法肽的合成：如表2所述在用BOC氨基酸制备肽的所有步骤均使用BOC-Cys(4-MeBzl)-聚苯乙烯树脂(对C-末端羧酸)或4-甲基二苯甲基胺树脂(对C-末端甲酰胺)。有关过程可参见本文参考文献国际专利申请WO92/00995。在最后一个氨基酸被偶合后，可通过将树脂与TFA∶DCM(1∶1)混合20分钟脱除N-末端BOC保护基。随后，树脂依次用DCM(3X)、MeOH(2X)、DCM(3X)、洗涤，树脂于空气中干燥。解离：通过与新蒸无水HF(10ml/g树脂)、苯甲醚(1ml/g树脂)和甲硫醚(0.5ml/g树脂)的混合物于-5-0℃下一起搅拌可将树脂上脱BOC保护的肽解离掉。1小时后，减压蒸除HF，解离的肽/树脂混合物用乙醚洗涤三次，然后用80％乙酸水溶液萃取。将合并的萃取液(200ml/g树脂)冷却并继续进行成环步骤。成环：用碘氧化法可形成分子内二硫桥

(Wunch et al，Int.J.Peptide Protein Res.，32：368-383(1988)，Bodanszky，Int.J.Peptide Protein Res.，25：449-474(1985)).搅拌下向于80％乙酸水溶液中的粗品肽中滴加I₂的饱和冰醋酸溶液，直至溶液呈亮褐色。于室温搅拌1小时后，加入饱和抗坏血酸水溶液以除去过量的碘。将成环的肽真空浓缩，再悬浮于水中并冷冻干燥。纯化：环状肽可用装有Vydac C₁₈柱(15-20mm，5×30cm ID)的Waters Delta Prep 3000系统(Waters，Milford，Massachwetts)纯化，用不断增大乙腈在1％三乙铵磷酸盐(TEAP，PH2.3)中的浓度所得线性梯度液作流动相。收集适宜的组分，得到磷酸盐形式的纯肽。肽盐再次用柱子处理并用0.5％含水HOAc的乙腈溶液洗脱，得到所需的乙酸盐。分析：用装有Beckman C₁₈柱(RPC18特种球，5μm，4.6×150mmID)的Beckman System 126(166型检测器)对纯化的肽进行分析。用缓冲液B的线性梯度液洗脱，流速为1ml/min，(缓冲液A＝0.1M磷酸钠水溶液，PH4.4-4.5，缓冲液B＝60％乙腈的缓冲液A溶液)。调节每种肽的梯度洗脱时间，应在20或30分钟，使肽在近中间梯度时被洗脱出。每种优选的肽的保留时间如优选化合物表(表1)中所示。Fmoc的脱除：向含有1g FMOC肽的24ml DMF溶液中加入哌啶(6ml)，得到20％哌啶的DMF溶液。溶液于室温搅拌20分钟，然后真空蒸干。将残余物溶于乙酸乙酯/水(1∶1)中并收集水层，水层再用乙酸乙酯萃取两次，过滤并冷冻干燥。

表2

固相肽合成法流程(TFA脱保护/DCC偶合)步骤试剂体积_★(ml) 时间(min)1 DCM wash(3x) 20 0.52 TFA-DCM(1∶1) 20 13 TFA-DCM(1∶1) 20 204 DCM wash(3X) 20 0.55 MeOH wash(2X) 20 0.56 DCM wash(3X) 20 0.57 TEA-DCM(1∶9) 20 18 TEA-DCM(1∶9) 20 59 DCM wash(3X) 20 0.510 MeOH wash(2X) 20 0.511 DCM wash(3X) 20 0.512A BOC-AA(3.2mM，

2 equiv.)in DCM

(DMF)^★★ 1012B DCC in DCM(0.5M) 6.4 120^★★★13 DCM wash(2X) 20 0.514 DCM-MeOH(1∶1)(2X) 20 0.515 TEA-DCM(1∶9) 20 0.516 MeOH wash(2X) 20 0.517 DCM wash(3X) 20 0.518 Ac20 in DCM(1∶3) 20 2019 DCM wash(3X) 20 0.520 MeOH wash(2X) 20 0.521 DCM wash(3X) 20 0.5^* 所给体积为用2g树脂代替0.8mM/g树脂合成时的体积。^** 当BOC-AA于纯DCM中不溶时，加入DMF。^*** 当经茚三酮试验表明偶合反应未完全时，有必要用1∶1∶3

的氨基酸、于DMF中的BOP试剂和DIEA的混合物再

次进行偶合反应1小时。偶合反应后，将树脂过滤并用茚三

酮试验检测偶合反应是否完全。如果不完全，则重复此过程，

直至试验显示偶合反应完全。

酰胺键连的环状化合物

(侧链-侧链键连)的合成本实施例中，将合成下式化合物：

所有氨基酸和氨基酸衍生物均买自BACHEM(Torrance，California)。9-芴基甲醇和DDC得自Sigma Chemical Co.(St.Louis，Missouri)，二异丙基乙基胺和4-(二甲氨基)吡啶得自Aldrich(Milwaukee，Wisconsin)。除非另有说明，其它试剂均为分析纯试剂，而无需进一步纯化。

所有残基均是用BOC保护中经固相法连接。Asp和Glu的侧链羧基可被保护成芴基甲酯而Lys的ε-氨基和Gly的α-氨基可被保护成N-FMOC。两个侧链(Asp和Lys上)间的酰胺桥可在肽吸附于树脂的同时合成。此方法如附图1a所示。

(a)天冬氨酸和谷氨酸的N-BOC-O-9-芴基甲基ε-

酯的制备

天冬氨酸和谷氨酸的N-BOG-O-9-芴基甲基ε-酯可以按照作了某些修改的Bolin所述的一般方法制备(Bolin等人，Organic Preparations and Procedures(Intern.，21：67-74(1989))。N-BOC-O^β-9-芴甲基天冬氨酸酯

将8.31g(25.7mmol)N-BOC-O^α-苄基天冬氨酸酯和4.80g(25.4mmol)9-芴基甲醇溶于150ml DCM中。溶液于冰浴中冷却，于10分钟内分批向其中加入30mg(0.24mmol)4-(二甲氨基)吡啶，随后加入5.31g(25.7mmol)DCC。所得混合物在继续冷却下搅拌1小时，过滤除去沉淀出的N，N’-二己基脲，滤液用250ml DCM稀释。此溶液用(依次用)10％柠檬酸(2×50ml)、H₂O(1×50ml)、25％NaHCO₃(2×50ml)、H₂O(1×50ml)、盐水(1×50ml)萃取，然后溶液用MgSO₄干燥，浓缩得一油状残余物。于甲醇/乙醚/石油醚(1∶3∶10)中重结晶，得到10.85g(84％)N-BOC-O^α-苄基-O^β-芴基甲基天冬氨酸酯，熔点为74-77℃。将5.5g(10.9mmol)上述产物溶于150ml热甲醇中，于室温35-40psi压力下用300mg 20％pd(OH)₂/C氢化1.5小时，滤除催化利并将溶液真空蒸发。残余油状物再溶于200ml二乙醚中，用(依次用)1％NaHCO₃(3×50ml)、H₂O(1×50ml)、5％柠檬酸(2×50ml)和盐水(1×50ml)萃取，乙醚层用MgSO₄干燥并浓缩。由二乙醚/石油醚中重结晶，得到3.53g N-BOC-O^β-9-芴甲基天冬氨酸酯，熔点为135-137℃。N-BOC-O-芴甲基-谷氨酸酯(γ酯)

将N-BOC-O^α-苄基谷氨酸酯(4.5g，13.3mmol)和9-芴基甲醇(2.5g，12.5mmol)溶于100ml DCM，溶液于冰浴中搅拌冷却。向溶液中加入15.5mg(0.13mmol)4-(二甲氨基)吡啶和2.75g(13.3mmol)DCC，将所得混合物在继续冷却下搅拌4小时。滤除沉淀出的N，N’-二环己基脲，滤液用200ml DCM稀释。溶液用与上述天冬氨酸酯中所述相同的方法萃取和处理，得到N-BOC-O^α-苄基-O-芴甲基谷氨酸酯(γ酯)(4.2g)，熔点为97-99.5℃。将4.0g(7.75mmol)上述产物于200ml MeOH/EtOH/IPA(2∶1∶1)混合物中室温和40psi下用125mg 10％pd/C氢化2小时，将反应混合物过滤以除去催化剂，浓缩得油状残余物。残余物与150ml乙醚混合，而合并的水层再用乙醚萃取(2×40ml)。合并的乙醚层用MgSO₄干燥，过滤并浓缩得一白色物。将粗品残余物于乙醚/石油醚(1∶10)中重结晶，得到N-BOC-芴甲基谷氨酸酯(γ酯)(2.3g)，熔点为123.5-126℃。

(b)保护的RK*D(thiop)D*肽序列的合成

上述肽的合成可通过联合使用自动肽合成器(System 990，Beckman Instruments，Inc.，Palo Alto，California)和手动肽合成装置(S.C.Glass Tech，Bonica，California)进行。由AppliedBiosystems(Foster City，California)得到的BOC-Asp(OFm)OCH₂-PAM树脂(1.0g，0.75mmol)用作原料树脂。合成中使用下列氨基酸：BOC-(3-thiop)、BOC-Asp(O-苄基)、BOC-Lys(N^ε-FMOC)和BOC-Ary(Nδ-tos)。每步偶合反应中均使用过量的氨基酸(2-3倍)。肽链可于贝克曼肽合成器中用BOC原料构成，在做适当调整的情况下按照与表2所示相似的标准循环逐步加入每种氨基酸。在每步偶合反应中50％TFA的DCM溶液、5％DIEA的DCM溶液和0.5M DCC的DCM溶液分别用作脱保护剂、中和剂和活化剂。

(c)肽序列的封闭

在用50％TFA的DCM溶液脱除了Arg N-末端的BOC基团之后，用5％DIEA的DCM溶液中和，将树脂上被保护的肽与活化的AdaCA反应。树脂上N-末端被脱保护的、侧链被保护的肽用MeOH(2×1min)、DCM(3×1min)洗涤，用5％DIEA和DCM(1×1min，1×20min)中和；用DCM(3×1min)洗涤并于DMF中用(AdaCA)、DCC和HoBt封端。然后，按照下述一般方法此肽通过在Asp的β-羧基和Lys的ε-氨基间形成酰胺键而被环合。

(d)形成酰胺桥的一般成环方法

在肽链形成后，酰胺化成环反应可按下述方法进行，下述每步之间均进行过滤：(1)MeOH(2×1min)；(2)DCM(3×1min)；(3)20％哌啶的DMF溶液，洗涤1分钟并脱保护20分钟；(4)DMF(2×1min)；(5)MeOH(2×1min)；(6)DCM(3×1min)；(7)BOP试剂(4当量)的DMF(20ml/g树脂)溶液，搅拌2分钟并加入DIEA(20％DMF体积)，搅拌4小时(用茚三酮试验监测反应是否完全；若4小时时判定反应未完全，则反应继续进行，直至茚三酮试验呈阴性)；(8)DMF(2×1min)；(9)DCM(2×1min)；(10)MeOH(2×1min)。

在10％苯甲醚存在下于0℃用HF处理1小时，将最终环状化合物由树脂上解离出。蒸除HF后，残余物用乙醚洗涤并用5％HOAc的H₂O萃取树脂。将水萃取液冷冻干燥，得到粗品肽。

(e)纯化

用装有C₁₈柱的Waters Delta Prep 3000系统(Waters，Milford，MA)纯化化合物，用不断增加乙腈在TEAP中的浓度所得线性梯度液(PH2.2-2.4)作流动相。汇集收集到的含有纯化合物的组分并再次用C₁₈柱处理，此时用0.5％HOAc洗脱，样品由肽的磷酸盐形式转变成所需的乙酸盐形式。将含纯肽的组分汇集，真空浓缩，再溶于水中并冷冻干燥，得到92.9mg肽白色粉末，HPLC纯度为98.7％。

酰胺键连的环状化合物的合成

(主键-侧链键连)

在此实施例中，将合成下式化合物：

上述化合物由CBA，Inc.(Boulder，Colorado)所得4-甲基二苯甲基胺树脂(2.0g，1.4mmol)开始用手工操作合成。用上述实施例4化合物合成中所述BOC法合成肽链，合成中使用BOC-Asp(Fm)、BOC-1.4-TTC、BOC-Asp(O-苄基)、BOC-Val、BOC-Arg(N-tosyl)和N-FMOC-Gly 。

Gly末端氨基和Asp⁶末端β-羧基间的成环反应可按上述一般的酰胺成环方法进行。

于0℃用HF和10％苯甲醚处理1小时将环状化合物由树脂上解离出。随后，蒸除HF，混合物用乙醚洗涤(除去乙醚层)并用1N HOAc萃取。将水萃取液冷冻干燥，得到1.23g粗品化合物。

按照上述实施例所述方法，用装有C₁₈柱的Waters制备HPLC系统纯化此化合物，得到678mg纯化合物，白色粉末，HPLC纯度为99.7％。

酰胺键连的环状化合物的合成

(在链合成完之前成环)

本实施例中，将合成下式化合物(SEQ.ID.NO.：18)：

此化合物可用PCT申请WO92/00995(1992.1.23公开)中所述方法制备。

环状二硫化合物的合成

在此实施例中，将制备下式化合物(SEQ.ID.NO.：4)：

1-FCA由Alrich Chemical Company(Milwaukee，WI)买到。所有氨基酸、氨基酸衍生物和类似物以及非天然氨基酸均由BACHEM(Torrance，Califoraia)买到。DCC得于Sigma Chemical Co.(St.Louis，Missouri)，三氟乙酸得于Halocarbon Co.(NewYork，New York)，三乙胺得于Fisher Scientific(Fair Lawn，New Jersey)。其它试剂均可由常规来源得到并为分析纯试剂。

所有的肽均可用BOC原料用贝克曼自动肽合成器(System 990，Beckman Instruments，Inc.，Palo Alto，California)经固相法合成。

N-BOC-S-P甲基苄基苄胱氨酸(BOC-Cys(4-MeBzl))在氯甲基聚苯乙烯树脂(Merrifield树脂)上的附着反应应在氟化钾存在下进行。在KF(1.8摩尔当量)存在下于80℃将BOC-Cys(4-MeBzl)(0.9摩尔当量)与溶胀的Merrifield树脂(Bio-Radlab.，Richmond，California)(1.0摩尔当量)在DMF中反应16小时，然后将树脂过滤、洗涤并干燥。通过测定重量比测得树脂上取代物的摩尔数。按照上述表2中的方法用BOC方法依次分步对BOC-Cys(4-MeBzl)树脂上的肽链进行处理，最后，用TFA：DCM(1∶1)脱除N-末端BOC保护基30分钟。

然后用HF将化合物由树脂上解离出，如上所述制得二硫化物并用常规方法纯化。

含有羧基末端NHNR’(特别是AMP)或

四唑的环状肽的合成

通常羧基末端被酰胺化成NHNR’而修饰的肽，特别是具有羧基末端AMP衍生物的化合物，或其中羧基末端被四唑取代的肽可以用对制备本发明其它肽的方法稍作改变来制备。在制备此类化合物时，环状肽中除了羧基末端氨基酸以外(即除了Y¹以外)的部分可以用上述固相法合成并由树脂上解离出，然后用液相法将此肽与适宜衍生的羧基末端氨基酸偶合。此方法参见本文参考文献-已公开的PCT专利申请W92/000995。液相肽合成法的详细情况可参见Boolanszky，“Peptide Synthesis”，Springer-Verlag，New York(1984)。

其中α-羧酸被四唑取代的氨基酸的合成可按照Langry(Langry，K.C.，J.Org.Chem.56：2400-2404(1991))所述的方法进行。

实施例2细胞粘连抑制试验：U937细胞纤维结合素粘连试验

下述试验是在有代表性的体外系统中对本发明化合物抑制细胞粘连活性进行试验，此试验是纤维结合蛋白和试验化合物两者均存在下的竞争性试验。首先，将微滴板用纤维结合素包覆，然后以逐渐增大的浓度将所试验的肽和已知含有纤维结合素受体的细胞一起加入。将此微滴板培养、清洗并染色以计算吸附的细胞数。本试验可直接测得本发明化合物的抗细胞粘连活性和粘连调节剂活性。

细胞系U937买自American Type Culture Collection(Rockville，MD)。细胞培养是在含10％胎牛血清的RPMI培养基(J.R.Scientific Company，Woodland Hills，CA)中进行，纤维结合素是按照Engvall等人(Int.J.Cancer，20：1-4(1977))所述方法由人血浆中提纯出。

于4℃用0.1ml 5μg/ml纤维结合素的磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)将微滴板(96-井，Falcon)包覆过夜。作为对照，向井中加入5μg/ml牛血清白蛋白(BSA)。用PBS清洗除去板上未结合蛋白。为了阻滞未反应部位，于37℃用100μl 2.5mg/ml BSA的PBS溶液包覆1小时滴定板，收集U937细胞并用Hanks平衡盐溶液(HBSS)清洗两次，计算细胞数并在Dulbecco修饰的Eagle培养基(DMEM)和BAS(2.5mg/ml)中调至2.5×10⁶细胞/ml，进行细胞结合试验。将试验化合物溶于DMEM-BSA中并用7.5％碳酸氢钠将PH调至7.4。以500、250、125、62.5、31.3、15、6、7.8、3.9、1.95和最终浓度0.98μg/ml的浓度。将此化合物(100μl)加到FN-包覆的滴定板井中，试验所用浓度是根据肽的效力来调节的。将U937细胞(100μl)加到各井中并将微滴板于37℃培养1小时。培养后，此板用PBS清洗一次并用3％多聚甲醛的PBS溶液固化吸附的细胞，用0.5％甲苯胺兰的3.7％甲醛溶液染色，于室温下将细胞染色过夜。用垂直路途分光光度计测定590nm下甲苯胺兰染色细胞的光学密度以计算结合数(VMAX Kinetic MicroplateReader，Molecular Devices，Menlo Park，CA)。此方法是对在先公开的方法的改进行法(见Cardarelli等人，PNAS-USA 83：2647-2651(1986))。Jurkat-CS-1粘连试验(Jurkat-24试验)

按照已知方法(Pierschbacher，PNAS-USA 80：1224(1983))用不同的两个功能基交联的3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-羟基琥珀酰胺酯(SPDP)(Sigma，St.Louis，MO)将CS-1衍生的肽CLHPGEILDVPST(SEQ.ID.NO.：26)和CLHGPIELVSDPT(SEQ.ID.NO.：27)固定于微滴板上。简单地讲，于室温用20μg/ml人血清白蛋白(HSA)将微滴板包覆20小时，然后用10μg/ml SPDP处理1小时。除去过置的未结合试剂后，加入含有肽的半胱氨酸并令其于4℃交联过夜。第二天，除了用人T-白细胞系Jurkat外，如在“U937细胞纤维结合素粘连试验”中所述进行本细胞粘连试验。Jurkat-内皮细胞粘连试验

下述试验是在有代表性的体外系统中对本发明化合物抑制细胞粘连活性进行试验。本试验用于测定在试验化合物存在下T-细胞系Jurkat与内皮细胞单层间的粘连作用，将试验化合物与T细胞一起以逐渐增大的浓度加入，并将其加到内皮细胞单层上。将板培养、清洗并计算结合细胞的百分数。本试验可直接测定本发明化合物的细胞粘连抵制剂活性和粘连调节剂活性。

第二代人脐静脉内皮细胞得自Clonetics(San Diego，CA)。将细胞在装有补充了10％胎牛血清的EGM-UV培养基(Clonetics，San Diego，CA)的烧瓶中培养，此烧瓶预先用0.5％猪皮明胶包覆(Sigma，St.Louis，MO)，此细胞每2-3天补养一次，直到4-6天时发生融合为至。检测细胞对因子VIII抗原的作用，结果表明在第12代，细胞对此抗原呈阳性，超过12代的内皮细胞不使用。

T-细胞系Jurkat得自American Type Culture Collection并将其在含有10％胎牛血清的RPMI中培养。此细胞用HBSS清洗两次并再悬于含有2.5mg/ml人血清白蛋白(HSA)的Dulbecco’s Minimal Eagle’s Media(DMEM)中。Jurkat细胞(1×10⁶个细胞/ml)用10μg/ml二乙酸荧光素(Sigma，St.Louis，MO)的含5％胎牛血清的HSSS溶液染色，细胞于室温下暗室中染色15分钟，清洗两次，并再悬浮于DMEA-HSA溶液中。

于37℃下将于96-井组织培养板中生长的融合的单层内皮细胞用0.1ng/ml(50U/ml)重组体IL-1(Amgen，Thousand Oaks，CA)激发4小时，培养后，单层细胞用HBSS清洗两次并加入0.1ml DMEM-HSA溶液。将Jurkat细胞(5×10⁵个细胞)与适宜浓度的肽结合并将0.1ml Jurkat细胞-肽混合物加到单层内皮细胞中。一般，肽的试验浓度为250，50，10和2μM。对于几种有效力的肽，试验测得此肽的IC₅₀为50、10、2和0.4μM。将微滴板放于冰上5分钟，令Jurkat细胞沉降并将此板于37℃培养20分钟。培养后，单层细胞用含有1mM氯化钙和1mM氯化镁的PBS清洗两次，此板用Pandex荧光浓度分析仪(Baxter，Mundelein，IL)读数，以绝对荧光单位测定每个孔的荧光。将肽不存在下的百分粘连度定为100％，计算肽存在下的百分粘连度。用3％多聚甲醛将单细胞层固定并用显微镜法评估粘连程度。

除了用人T-白细胞系Jurkat代替U937细胞外，本细胞粘连试验如上述“U937-FN试验”所述进行。对纤维结合素的U937细胞粘连试验结果

此处效力是用μM作单位表示，在此试验中IC₅₀低于500μM认为有活性。对此应当理解为需要以更高摩尔数达到50％抑制粘连的化合物仍然有活性，但总的来讲其用处不大，因为在给人体内施用时，需要更高的剂量。活性低于10μM的化合物为优选化合物，低于100μM的不是优选的，低于500μM是较不优选的而大于500μM是最不优选的。

因此，本发明提供了在调节细胞粘连中具有显著效力的化合物，包括但不仅限于抑制与纤维结合素的细胞粘连。所提供的数据还表明不含RGD序列的化合物是对FN粘连有效的抑制剂。Jurkat-内皮细胞粘连试验结果

此试验结果为抑制Jurkat细胞与IL-1激活的内皮细胞间的粘连试验结果。在此试验中，设定IC₅₀低于250μM为有活性(A)，而IC₅₀＞250μM为无活性。以上所述并不是说IC₅₀＞250μM的化合物实际上没有活性，而是IC₅₀较低的化合物，它们在对人施用时不具有足够的效力。

因此，本发明提供了在调节细胞粘连中具有显著效力的化合物，包括但不仅限于抑制T-细胞与内皮细胞的粘连。此作用中涉及的特定受体及本试验化合物的特异性靶受体包括，但不仅限于，白细胞上的α₄β₁，α₄β₇和内皮细胞上的VCAM-1。所提供的数据表明不含RGD序列的化合物是有效的细胞-细胞粘连抑制剂。

下列表3中给出了本发明各化合物在上述三个试验中所得结果。

表3中所选化合物在序列表中的位置如下：

cmpd.2，(SEQ.ID.NO.：13)；cmpd.3，(SEQ.ID.NO.：5)；cmpds.23，33，48.49.51.54.55，62 and 92，(SEQ.ID.NO.：4)；cmpd.29，(SEQ.ID.NO.：6)；cmpd.42，(SEQ.ID.NO.：7)；cmpd.50，(SEQ.ID.NO.：8)；cmpds.65 and 66，(SEQ.ID.NO.：9)；cmpd.67，(SEQ.ID.NO.：10)；cmpd.68，(SEQ.ID.NO.：11)；cmpd.69，(SEQ.ID.NO.：12)；cmpd.71，(SEQ.ID.NO.：14)；cmpd.75，(SEQ.ID.NO.：15)；cmpd.77，(SEQ.ID.NO.：16)；cmpds.78 and 79，(SEQ.ID.NO.：17)；cmpd.80，(SEQ.ID.NO.：18)；cmpd.81，(SEQ.ID.NO.：19)；cmpd.82，(SEQ.ID.NO.：20)；cmpd.84，(SEQ.ID.NO.：21)；cmpd.85，(SEQ.ID.NO.：22)；cmpd.86，(SEQ.ID.NO.：23)；cmpd.87，(SEQ.ID.NO.：24)；cmpd.89，(SEQ.ID.NO.：25).

表3CMPD 序列 IC₅₀(μM)

FN-U937 Jrkt-EC Jrkt-α41 C^★(NIC Lys)GDSpC^★ ＞500 nda nd2 C^★R(Sar)DSPC^★ ＞500 nd nd3 C^★RGNSPC^★ ＞500 nd nd4 RC^★NPC^★ 17 116 215 FmocKC^★DPC^★ ＞500 ＞200 nd6 KC^★DPC^★ 712 ＞10 nd7 FmocAC^★D(thiop)C^★ 585 5 nd8 FmocFC^★D(thiop)C^★ ＞500 6 nd9 FmocHC^★D(thiop)C^★ ＞500 190 nd10 FmocLC^★D(thiop)C^★ ＞500 8 nd11 FmocRC^★A(thiop)C^★ 25 15 nd12 FmocRC^★L(thiop)C^★ ＞500 34 nd13 FmocRC^★F(thiop)C^★ 15 18 nd14 AC^★D(thiop)C^★ 124 17 315 RC^★A(thiop)C^★ 25 37 416 LC^★D(thiop)C^★ ＞500 15 1.317 FC^★D(thiop)C^★ 388 46 0.8518 RC^★F(thiop)C^★ 37 65 919 HC^★D(thiop)C^★ 637 25 4.720 RC^★L(thiop)C^★ 69 55 421 FmocGC^★D(thiop)C^★ 320 1 ndCMPD 序列 IC₅₀(μM)

FN-U937 Jrkt-EC Jrkt-α422 FmocpC^★D(thiop)C^★ 129 ＜2 2423 AdaC^★D(thiop)C^★ ＞500 2 0.10424 F7mocAC^★A(thiop)C^★ ＞500 5 0.57225 (1-FCA)AC^★D(thiop)C^★ 460 ＜.4 0.926 (1-FCA)C^★D(thiop)C^★ ＞500 2 0.927 (1-FCA)RC^★[(p-Cl)Phe](thiop)C^★ ＞500 5 nd28 GC^★D(thiop)C^★ 57 49 2.829 C^★GKGESPC ＞500 nd nd30 (1-FCA)(sar)C^★D(thiop)C^★ 278 ＜0.4 43l (thiop)C^★D(thiop)C^★ 51 25 0.25532 PC^★D(thiop)C^★ 433 9 0.72933 (Sar)C^★D(thiop)C^★ 119 ＞50 3.434 FmocRC^★(thiop)C^★ ＞500 ＞50 nd35 (1-FCA)(thiop)C^★D(thiop)C^★ 27 1 nd36 FmocK(AdaC)^★D(thiop)C^★ ＞500 13 nd37 FmocRC^★(βD)(thiop)C^★ ＞500 4 0.30638 FmocK(AnB)C^★D(thiop)C^★ ＞500 1 nd39 (N-MeR)C^★D(thiop)C^★ 2 24 240 C^★RGA[(p-Cl)Phe](thiop)C^★ ＞500 50 nd41 AdaGGC^★RGA[(p-Cl)Phe](thiop)C^★ l＞50 140 nd42 C^★AGD[(p-Cl)Phe](thiop)C^★ ＞500 ＞50 nd43 AdaGGC^★AGD[(p-Cl)Phe](thiop)C^★ ＞500 ＞50 ndCMPD 序列 IC₅₀(μM)FN-U937 Jrkt-EC Jrkt-α444 FmocRC^★(AnB)(thiop)C^★ 21 4 nd45 FmocRC^★(AiB)(thiop)C^★ ＞500 ＞50 nd46 FmocRC^★V(thiop)C^★ 31 26 nd47 FmocRC^★[(β-CN)A](thiop)C^★ ＞500 ＞250 nd48 (GAC)C^★D(thiop)C^★ 460 ＞50 nd49 (DTC)C^★D(thiop)C^★ ＞500 2 nd50 C^★GRGA[(p-Cl)Phe](thiop)C^★ ＞500 ＞50 nd51 FmocC^★D(thiop)C^★ ＞500 8 0.31552 (TCA)C^★D(thiop)C^★ 656 18 0.09753 (1-FCA)GC^★D(thiop)C^★ 603 0.6 nd54 (5-FINC)C^★D(thiop)C^★ ＞500 23 nd55 (CBO)C^★D(thiop)C^★ ＞500 1 nd56 FmocKPC^★D(thiop)C^★ ＞500 2 nd57 RC^★(AnB)(thiop)C^★ 67 8 nd58 DC^★R(thiop)C^★ 594 ＞50 nd59 KPC^★D(thiop)C^★ 603 ＞50 nd60 (1-FCA)KC^★E(thiop)C^★ ＞25 2 nd61 RC^★(O-Cys)(thiop)C^★ ＞50 32 nd62 (1-FCA)C^★(thiop)DC^★ ＞50 ＞50 nd63 FmocRC^★N(thiop)C^★ 20 15 nd64 RC^★(β-Ala)(thiop)C^★ 119 ＞50 nd65 R^★AD(thiop)D^★ ＞50 ＞250 ＞250

IC₅₀(μM)

序列CMPD FN-U937 Jrkt-EC Jrkt-α466 (Anb)^★RAD(thiop)D^★ 21 ＞250 5167 (Anb)^★RVD(thiop)D^★ 12 ＞250 5668 (1-FCA)K^★AD(thiop)D^★ ＞50 ＞500 10669 G^★RAD(thiop)D^★ 0.088 ＞250 ＞25070 (1-FCA)K^★(dA)D(thiop)D^★ ＞50 ＞250 nd71 (1-FCA)Orn^★AD(thiop)D^★ ＞50 ＞250 nd72 (1-FCA)(dK)^★AD(thiop)(dD)^★ ＞50 ＞250 nd73 (1-FCA)(dK^★)(dA)(dD)(dP)(dD^★) ＞50 ＞250 ＞25074 (1-FCA)(dK^★)AD(thiop)D^★ ＞50 ＞250 nd75 G^★RvD(thiop)D^★ 0.198 ＞250 ＞10076 (Anb)^★R(D-Nal)D(thiop)D^★ 56 ＞250 nd77 (Anb)^★RFD(thiop)D^★ 15 ＞250 nd78 (1-FCA)K^★ADPD^★ ＞50 ＞250 nd79 (1-FCA)K^★D(thiop)D^★ 500 ＞250 nd80 G^★RAL(thiop)D^★ 14 ＞250 ＞10081 (Aib)^★RAD(thiop)D^★ 73 ＞250 nd82 G^★RFD(thiop)D^★ 0.445 ＞250 ＞10083 RGC^★D(thiop)C^★ 170 111 884 G^★R(3-Br-Tyr)D(thiop)D^★ 4 ＞250(d)b nd85 G^★R(3-Br-Tyr)(thiop)C^★ ＞50 ＞250 nd86 G^★R[(3-pyridyl)A]D(thiop)D^★ 12 223 nd87 (AMBA)^★RAD(thiop)D^★ 268 ＞250 nd

IC₅₀(μM)CMPD 序列 FN-U937 Jrkt-EC Jrkt-α488 (1-FCA)C*D(TIC)C* ＞50 11 nd89 G*MD(thiop)D* ＞50 ＞250 nd90 [(N-Me)R]C*L(thiop)C* 6 11 nd91 RC*Y(thiop)C* 20 250 nd92 (1-FCA)C*D(thiopP)C*-NH2 ＞100 ＞100* 64a未做b＞250(d)在250μM或更大浓度下单层内皮细胞脱离。

对于所述本发明，对上述发明中原料和所用制备和使用方法做出的各种变化对本领域技术人员来讲是显而易见的，因此，这些变化应被认为包括在所述权利要求所限定的本发明范围内。

序列表(1)一般资料

(ⅰ)申请人：Chang，Shiu-Lan N.

Carderelli，Pina M.

Lobl，Thomas J.

(ⅱ)发明名称：细胞粘连肽抑制剂

(ⅲ)序列数：28个

(ⅳ)联系地址：

(A)地址：Birch，Stewart，Kolasch & Bireh，

(B)街道：P.O.Box 747

(C)城市：Falls Church

(D)州： Virginia

(E)国家：USA

(F)ZIP：22040-3487

(ⅴ)计算机可读形式：

(A)媒体类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：Patent In Release#1.0，Version#1.25

(ⅵ)目前申请数据：

(A)申请号：US 08/001，773

(B)申请日：08-JAN-1993

(C)分类：

(ⅷ)代理人/代理机构：

(A)姓名：Murphy Jr.，Gerald M.

(B)登记号：28，977

(C)副卷/备案号：485-103P

(ⅸ)联系电话

(A)电话：703-241-1300

(B)传真：703-241-2848

(C)电传：248345(2)SEQ ID N0：1：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：10个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链：单链

(D)拓扑：直链

(ⅱ )分子类型：肽

(ⅲ)假设：无

(ⅴ)片段类型：内含

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：肽

(B)位置：1..10

(D)其它信息：/标记＝肽

/注释＝＂纤维结合素中细胞识别部位＂

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：1：

Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr

1 5 10(2)SEQ ID NO：2：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：5个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链：单链

(D)拓扑：直链

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅲ)假设：无

(ⅴ)片段类型：内含

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：肽

(B)位置：1..5

(D)其它信息：/标记＝肽

/注释＝＂α-4-β-1 integrin识别肽＂

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：2：

Glu Ile Leu Asp Val

1 5(2)SEQ ID NO：3：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：6个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链：单链

(D)拓扑：环状

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅴ)片段类型：内含

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：肽

(B)位置：1..6

(D)其它信息：/标记＝肽

/注释＝＂接触性过敏激发试验中的阻滞肽＂

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：3：

Gly Arg Gly Asp Ser Pro

1 5(2)SEQ ID NO：4：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：4个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅴ)片段类型：内含

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂用1-FCA、Ada、GAc、TDC、Fmoc、

5-FINC、CBO或肌氨酸衍生＂

(ⅸ )特征：

(A)命名/关键词：修饰位点

(B)位置：3

(D)其它信息：/卷标＝修饰的_aa

/注释＝＂硫代脯氨酸＂

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：修饰位点

(B)位置：4

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂C-末端可被酰胺化，如表1和3中化

合物92，或如权利要求8中用AMP衍

生的C-末端＂

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：4：

Cys Asp Xaa Cys

1(2)SEQ ID NO：5：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：7个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅴ)片段类型：内含

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：肽

(B)位置：1..7

(D)其它信息：/标记＝肽

/注释＝＂表1和3中化合物3＂

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：5：

Cys Arg Gly Asn Ser Pro Cys

1 5(2)SEQ ID NO：6：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：8个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅴ)片段类型：内含

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：肽

(B)位置：1..8

(D)其它信息：/标记＝肽

/注释＝＂表1和3中化合物29＂

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：6：

Cys Gly Lys Gly Glu Ser Pro Cys

1 5(2)SEQ ID NO：7：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：7个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅴ)片段类型：内含

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：修饰位点

(B)位置：5

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂对氯苯丙氨酸＂

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：6

(D)其它信息：/卷标＝修饰的_aa

/注释＝＂硫代脯氨酸＂

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：7：

Cys Ala Gly Asp Phe Xaa Cys

1 5(2)SEQ ID NO：8：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：9个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅴ)片段类型：内含

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：7

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂对氯苯丙氨酸＂

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：8

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂硫代脯氨酸＂

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：8：

Cys gly Arg Ala Gly Ala Phe Xaa Gys

1 5(2)SEQ ID NO：9：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：5个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：1

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂可用Anb衍生的＂

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：4

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂硫代脯氨酸＂

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：9：

Arg Ala Asp Xaa Asp

1 5(2)SEQ ID NO：10：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：5个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅴ)片段类型：内含

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：1

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂可用Anb衍生的＂

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：4

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂硫代脯氨酸＂

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：10：

Arg Val Asp Xaa Asp

1 5(2)SEQ ID NO：11：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：5个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅴ)片段类型：内含

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：5

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂硫代脯氨酸＂

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：11：

Lys Ala Asp Xaa Asp

1 5(2)SEQ ID NO：12：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：6个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅴ)片段类型：内含

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：5

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂硫代脯氨酸＂

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ IDNO：12：

Gly Arg Ala Asp Xaa Asp

1 5(2)SEQ ID NO：13：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：7个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅴ)片段类型：内含

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：3

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂肌氨酸＂

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：13：

Cys Arg Xaa Asp Ser Pro Cys

1 5(2)SEQ ID NO：14：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：5个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅴ)片段类型：内含

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：1

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂鸟氨酸＂

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：4

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂硫代脯氨酸＂

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：14：

Xaa Ala Asp Xaa Asp

1 5(2)SEQ ID NO：15：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：6个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅴ)片段类型：内含

(ⅸ)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：5

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂硫代脯氨酸＂

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：15：

Gly Arg Val Asp Xaa Asp

1 5(2)SEQ ID NO：16：

(i)序列特征：

(A)长度：5个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内含

(ix)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：1

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂用Anb衍生的＂

(ix)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：4

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂硫代脯氨酸＂

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：

Arg phe Asp Xaa Asp

1 5(2)SEQ ID NO：17：

(i)序列特征：

(A)长度：5个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内含

(ix)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：1

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂用1-FCA衍生的＂

(ix)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：4

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂可以是硫代脯氨酸，见化合物79＂

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：

Lys Ala Asp Pro Asp

1 5(2)SEQ ID NO：18：

(i)序列特征：

(A)长度：6个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ii )分子类型：肽

(v)片段类型：内含

(ix)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：5

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂硫代脯氨酸＂

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：

Gly Arg Ala Leu Xaa Asp

1 5(2)SEQ ID NO：19：

(i)序列特征：

(A)长度：5个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内含

(ix)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：1

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂用Aib衍生的＂

(ix)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：4

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂硫代脯氨酸＂

(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：

Arg Ala Asp Xaa Asp

1 5(2)SEQ ID NO：20：

(i)序列特征：

(A)长度：6个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内含

(ix)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：5

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂硫代脯氨酸＂

(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：

Gly Arg Phe Asp Xaa Asp

1 5(2)SEQ ID NO：21：

(i)序列特征：

(A)长度：6个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内含

(ix)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：3

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂3-Br半胱氨酸＂

(ix)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：5

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂硫代脯氨酸＂

(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：

Gly Arg Tyr Asp Xaa Asp

1 5(2)SEQ ID NO：22：

(i)序列特征：

(A)长度：5个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内含

(ix)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：3

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝“3-Br半胱氨酸”

(ix)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：4

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂硫代脯氨酸＂

(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：

Gly Arg Tyr Xaa Cys

1 5(2)SEQ ID NO：23：

(i)序列特征：

(A)长度：6个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内含

(ix)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：3

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝“3-吡啶基丙氨酸”

(ix)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：5

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝“硫代脯氨酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：

Gly Arg Ala Asp Xaa Asp

1 5(2)SEQ ID NO：24：

(i)序列特征：

(A)长度：5个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内含

(ix)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：1

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝“用AMBA衍生的”

(ix)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：4

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝“硫代脯氨酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：

Arg Ala Asp Xaa Asp

1 5(2)SEQ ID NO：25：

(i)序列特征：

(A)长度：5个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内含

(ix)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：4

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂硫代脯氨酸＂

(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：

Gly Met Asp Xaa Asp

1 5(2)SEQ ID NO：26：

(i)序列特征：

(A)长度：13个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：直链

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内含

(ix)特征：

(A)命名/关键词：肽

(B)位置：1…13

(D)其它信息：/标记＝肽

/注释＝＂CS-1衍生的肽＂

(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：

Cys Leu His Pro Gly Glu Ile Leu Asp Val Pro

1 5 10

Ser Thr(2)SEQ ID NO：27：

(i)序列特征：

(A)长度：13个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：直链

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内含

(ix)特征：

(A)命名/关键词：肽

(B)位置：1…13

(D)其它信息：/标记＝肽

/注释＝＂CS-1衍生的肽＂

(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：

Cys Leu His Gly Pro Ile Glu Leu Val Ser Asp

1 5 10

Pro Thr(2)SEQ ID NO：28：

(i)序列特征：

(A)长度：4个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：环状

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内含(ix)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：1

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂用1-FCA或乙酰化衍生的＂(ix)特征：

(A)命名/关键词：修饰部位

(B)位置：4

(D)其它信息：/标记＝修饰的_aa

/注释＝＂C-末端酰胺化的＂(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：

Cys Asp Val Cys

1

Claims

1. 下式化合物或其药物上可接受的盐：其中

L¹和L²分别或者一起选自Lys、Pen、Mpr、AnB、AnC、β-Ala、Lys、Orn、Dpr、Asp、Glu、具有适于形成L¹和L²之间环桥的功能基的氨基酸残基、氨基酸类似物和氨基酸模拟物；

Z为成环基团或L¹和L²间的键；

1可存在或不存在，当存在时，其选自Leu、Tyr、Phe、Ile、Pro、Pro类似物、Gly、Ala、Val、降Leu、降Val、Trp、D-Nal、Sar、(Ada)-Ala、AnC、AnB、Lys、ω-氨基-低级链烷酸、Gly、Ala、Gly-Gly、Ala-Ala、AnC-AnC、AnB-AnB、β-Ala、β-Ala-β-Ala、l-Nal、TTC、TcA、DTC和MTC；

2可存在或不存在，当存在时，其选自Arg、Arg类似物、Lys、Lys类似物、His、Ala、Gly、Sar、Leu、AnB、Phe类似物、Pro、Pro类似物、TCA、TTC、DTC和Dpr；

3选自Gly、Sar、Ala、Ala类似物、d-Ala、Ile、Val、d-Val、d-Nal、Phe、Lys、Arg、Asp、β-Asp、Asn、AiB、AnB、β-Ala、Glu、Met、Leu、Tyr、3 Br-Tyr、磺基丙氨基、3，5-二溴代-Tyr和3，5-二碘代-Tyr；

4选自Asp、d-Asp、Glu、Asn、Gln、Asp和Glu的Fm酯、Asp和Glu的其它取代的烷基、芳基和烷芳基酯、Asn和Gln的烷基、芳基和烷芳基酰胺、Gly、Ala、β-Ala、Leu、Val、AnB、Phe、邻、间、对-卤代-Phe、对硝基-Phe、Arg、Cys、TIC、Pro和thiop；

5可存在或不存在，当存在时，其选自Ser、Thr、Trp、Ala、Val、Phe、邻、间、对-卤代-Phe、对硝基-Phe、对氟-Phe、对氯-Phe、3，5-二溴代-Tyr、对甲氧基-Tyr、

其中m为2，3或4

6可存在或不存在，当存在时，其选自Pro、d-Pro、thiop、1，3-二硫杂氮杂、(1，3-dithiazepine)、1，4-二硫杂氮杂、1，5-二硫杂氮杂、Pro类似物、1，1-ACC、Dhp、Hyp、高Pro、Phe、DTC、TTC、TC、MTC、TCA、邻卤代-Phe、间卤代-Phe、对卤代-Phe、对硝基-Phe、3-哌啶甲酸(isonipecotic acid)、N-甲基丙氨酸和TLC；

X¹可存在或不存在，当存在时，其选自1-4个D-或L-氨基酸和氨基酸类似物的序列、Ala、AnC、AnB、CBO、ω-氨基低级链烷酸和AMBA、低级烷基、芳基羧酸、烷芳基羧酸和SAR；

Y¹可存在或不存在，当存在时，其选自1-4个D-或L-氨基酸和氨基酸类似物的序列、Ala、AnC、AnB、CBO、ω-氨基低级链烷酸、AMBA、氨甲基吡啶、低级烷胺、芳基胺、烷芳基胺和SAR；

X²任意地是N^α-取代基R’或R’CO-、甲酸、乙酸、杂环羧酸、芳基羧酸、杂芳基羧酸、链烷酸、链烯酸、链炔酸、含硫和氮的其它混合功能基直链羧酸、金刚烷基、芴基、1-FCA、9-FCA、9-FA、FMOC、Ada、Ada-CA、NAcA、3-Me-Ada、(NB)-Ac、PhAc、Naph-Ac、HCA、QC、CPA、DTC、TCA、AMBA、其它多环芳基和杂芳基羧酸及乙酸、QC、CPA、BOC、5-FINC和CBO；

Y²为任意的羧基末端取代基，其选自-OR’、NHR’、NR’NH₂、-NHNR’、-NRS、-NHNH₂、-SR’、氨甲基吡啶和α-羧酸基团被四唑取代的氨基酸；

而其中每个R’各自为药物上适宜的取代基，优选的是选自氢、直链和支链、末取代和取代的C₁-C₈低级烷基、C₂-C₈链烯基、C₂-C₈链炔基、C₆-C₁₄芳基、C₇-C₁₄烷芳基、C₇-C₁₄环烷芳基和C₃-C₁₄环烷基，对于-NR’₂，其可与其相连的氮原子一起形成成环基团，即任意含有氧、氮或硫做为另外的环杂原子的5-8元杂环，

条件是

(1)当3为Gly和2为Arg或Arg类似物时，4不为Asp、Asp类似物、Glu或Glu类似物和

(2)当3为Gly和4为Asp、Asp类似物、Glu或Glu类似物时，2不为Ary或Ary类似物。

2. 权利要求1的化合物，其中L¹和L²分别为Cys，而环是由二硫键、内酰胺、羊毛硫氨酸样-硫化物或其它可成环桥的键实现。

3. 权利要求1的化合物，其中所述化合物具有下列结构：

NO.：4)，

NO.：4)，

NO.：4)，

4. 权利要求1的化合物，其中所述化合物具有下列结构：NO.：28)，

NO.：28)，

NO.：4)，

5. 权利要求1的化合物，其中Z为选自由二酮—、二氨基—、和不同的两个功能基的连接基团组成的一组二功能基连接基团。

6. 下式化合物

其中X¹、X²、1、2、L¹、4、5、6、L²、Y¹和Y²如权利要求1定义。

7. 下式化合物

其中X²为保护基而6为Pro或Pro衍生物。

8. 根据权利要求7的化合物，其为下式化合物

NO.：4)or

ID.NO.：4)

9. 一种药物组合物，其含有权利要求1的化合物和药物上可接受的载体。

10. 一种药物组合物，其含有权利要求6的化合物和药物上可接受的载体。

11. 一种药物组合物，其含有权利要求7的化合物和药物上可接受的载体。

12. 一种预防或治疗因对细胞外基质的细胞粘连不正常而引起的疾病的方法，其包括给患者施用范围在每一剂量在0.1-100mg/kg的权利要求9的组合物。

13. 一种预防或治疗因对细胞外基质的细胞粘连不正常而引起的疾病的方法，其包括给患者施用有效量的权利要求10的组合物，以恢复正常的对细胞外基质的细胞粘连。

14. 一种预防或治疗因对细胞间粘连不正常而引起的疾病的方法，其包括给患者施用有效量的权利要求11的组合物，以恢复正常的细胞间粘连。

15. 一种抑制白细胞与内皮细胞或与细胞外基质粘连的方法，其包括施用有效量的权利要求9的组合物，以抑制所述白细胞与内皮细胞和与细胞外基质的粘连。

16. 一种可与权利要求1的化合物特异性结合的抗体。

17. 一种诊断因存在能与内皮细胞结合的抗体而引起的疾病的方法，其包括：

i)在一种底物上固定至少一种权利要求1所述化合物以形成一种衍生的底物；

ii)取得患者的血液或血清样品；

iii)将(i)所得所述衍生的底物与(ii)所得所述血液或血清样品结合，此时，其中存在的能与所述内皮细胞特异性结合的抗体将与所述衍生的底物结合；和

iv)对与所述衍生的底物结合的抗体进行检测。

18. 一种诊断因存在能与细胞外基质结合的抗体而引起的疾病的方法，其包括：

ii)取得患者的血液或血清样品；

iv)对与所述衍生的底物结合的抗体进行检测。

19. 一种诊断因与内皮细胞的细胞粘连过度而引起的疾病的方法，其包括：

i)取得患者的内皮组织样品；

ii)将由所述内皮组织所得细胞与权利要求1所述化合物接触；和

iii)测定被所述内皮细胞特异性结合的所述化合物的量。

20. 一种生产假体的生物相容表面的方法，其包括用权利要求1所述化合物包覆所述假体表面。

21. 根据权利要求13的方法，其中所述疾病选自风湿性关节炎、哮喘、变态反应、成人呼吸窘述综合症、心血管疾病、血栓形成或有害的血小板凝聚、血栓溶解后再闭塞、同种移植排异反应、移植物对宿主的排异反应、器官移植、败血症休克、重灌注性损伤(reperfusion injury)、牛皮癣、湿疹、接触性皮炎和其它皮炎、骨质疏松症、骨关节炎、动脉粥样硬化、肿瘤疾病包括肿瘤或癌症生长转移瘤、眼病如视网膜脱离、I形糖尿病、多发性硬化、全身性红斑狼疮(SLE)、炎症和免疫性炎症包括眼炎和肠炎、溃疡性结肠炎、局限性节肠炎及其它自身免疫性疾病。

22. 一种抑制受精、抑制精子成熟或抑制精子功能的避孕方法，其包括给宿主施用对抑制受精、抑制精子成熟或抑制精子功能避孕有效量的权利要求1的化合物。

23. 一种用于纯化对权利要求1化合物具有亲合力的大分子的基质，其包括将权利要求1的化合物与不溶载体共价键结合。

24. 一种纯化以高亲和力与权利要求1化合物特异性结合的大分子的方法，其包括：

i)用权利要求1化合物衍生一种不溶基质；

ii)与含有对所述权利要求1化合物具高亲合力的大分子的样品反应，此时所述大分子与所述权利要求1化合物形成一复合物，所述复合物与所述基质结合；

iii)结合上所述复合物的基质用不致裂解复合物的溶液清洗去污；

iv)通过用可裂解所述大分子与权利要求1化合物形成的复合物的溶液洗涤所述载体，洗脱出所述底物；和

v)回收对权利要求1的化合物具有高亲合力的大分子。