CN111487328A - 一种用质谱法检测人体中多种痕量激素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用质谱法检测人体中多种痕量激素的方法，属于血清中类固醇激素检测技术领域。它包括以下步骤：(1)配制试剂；(2)配制萃取溶剂；(3)配制标准储备液；(4)配制内标物质储备液；(5)配制标准曲线溶液；(6)样品处理；(7)质谱仪检测样品；(8)液相色谱/串联质谱测定结果。使用该方法不存在嗜异性或自身抗体干扰；对激素代谢的结构类似物能够区别检测，不存在交叉反应；动态线性范围较宽，能够满足浓度跨度范围较大的激素检测需求，比如同一激素在不同个体间或同一个体不同应激状态下浓度差异较大的情况(睾酮等)；对含量相对较低的激素检测的灵敏度得到提高；能够同时检测多种激素。
Description
技术领域
本发明涉及一种用质谱法检测人体中多种痕量激素的方法，属于血清中类固醇激素检测技术领域。
背景技术
痕量激素是指在血清中含量极小的激素，例如，血清中睾酮、雄烯二酮、二氢睾酮、孕酮、17-羟孕酮、皮质醇、皮质酮、皮质脂酮、醛固酮、脱氢表雄酮和孕烯醇酮等类固醇激素。类固醇激素是一类由肾上腺和性腺分泌的微量高效能四环脂肪烃化合物，具有环戊烷多氢菲母核。在维持生命、调节性功能，对机体发展、免疫调节、皮肤疾病治疗及生育控制方面有明确的作用，新生儿筛查、内分泌疾病及相关代谢性疾病的诊断中具有重要的临床意义和疗效判定意义。
现有的精准定量人体中痕量激素的平台，一般采用放射免疫测定法，免疫学方法在激素检测上的缺点包括：存在嗜异性或自身抗体干扰；对激素代谢的结构类似物不能区别检测，存在交叉反应；动态线性范围较窄，不能满足浓度跨度范围较大的激素检测需求，比如同一激素在不同个体间或同一个体不同应激状态下浓度差异较大的情况(睾酮等)；对含量相对较低的激素检测的灵敏度不够；不能同时检测多种激素。免疫学方法的这些缺点，一定程度上不能满足内分泌疾病领域需要更全面、更精准诊断的需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：提供一种用质谱法检测人体中多种痕量激素的方法，它解决了目前采用免疫学方法检测痕量激素，存在诸多缺点，导致检测结果无法满足更全面、更精准的诊断需求问题。
本发明所要解决的技术问题采取以下技术方案来实现：
一种用质谱法检测人体中多种痕量激素的方法，它包括以下步骤：
(1)配制试剂：准备甲醇(色谱级)，甲酸铵(色谱级)；
0.2mol/L甲酸铵溶液：1.26g甲酸铵用水溶解并定容到100mL；
2mmol/L甲酸铵溶液：吸取1mL 0.2mol/L甲酸铵溶液，加入到水中溶解并定容至100mL；
2mmol/L的甲酸铵甲醇溶液：吸取1mL 0.2mol/L甲酸铵溶液加入到甲醇中溶解并定容至100mL；
(2)配制萃取溶剂：准备甲基叔丁基醚(色谱级)，正己烷(色谱级)，乙酸乙酯(色谱级)，按照正己烷：乙酸乙酯：甲基叔丁基醚＝1:1:1(体积比)配制萃取溶剂；
(3)配制标准储备液：准备11种标准物质，睾酮、雄烯二酮、二氢睾酮、孕酮、17-羟孕酮、皮质醇、皮质酮、皮质脂酮、醛固酮、脱氢表雄酮和孕烯醇酮，纯度均>97％，分别准确称取10mg以上标准物质，用甲醇配制成一定浓度标准储备液，-18℃冷冻避光保存；
(4)配制内标物质储备液：准备同位素内标物质，睾酮-d5，孕酮-d9,17-羟孕酮-d8，醛固酮-d7，皮质醇-d4，脱氢表雄酮-d6，皮质酮-d8，皮质脂酮-d8，根据同位素内标物质的容量，用甲醇配制成0.1-1.0mg/mL的内标储备液，-18℃冷冻避光保存；
(5)配制标准曲线溶液：
使用标准储备液、内标物质储备液，配制孕酮、17-羟孕酮、雄烯二酮、皮质酮的线性浓度点为0.05、0.2、0.5、2.0、5.0、10、20mg/L，内标为1.0mg/L，配制睾酮、二氢睾酮、皮质脂酮、醛固酮的线性浓度点为0.1、0.2、0.5、2.0、5.0、10、20mg/L，内标为1.0mg/L，配制皮质醇的线性浓度点为1.0、5.0、10、20、50、100、200mg/L，内标为1.0mg/L，配制脱氢表雄酮、孕烯醇酮的线性浓度点为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50mg/L，内标为10mg/L；具体地，吸取适当体积和浓度的标准储备液，每个浓度点加适当体积0.1mg/L的内标物质储备液，用2mmol/L的甲酸铵水溶液：2mmol/L的甲酸铵甲醇＝2:8(体积比)溶液定容到1mL；
(6)样品处理：
准确移取血清样本400μL，测定睾酮、雄烯二酮、二氢睾酮、孕酮、17-羟孕酮、皮质醇、皮质酮、皮质脂酮、醛固酮9种类固醇激素时，加入0.01mg/L的内标20μL，测定脱氢表雄酮和孕烯醇酮2种类固醇激素时，加入0.1mg/L的内标20μL；涡旋30s，加入萃取溶剂1.0mL，涡旋3min，4000r/min离心5min，取上0.9mL清液至另一个离心管中，再加0.8mL萃取溶液，重复一次，合并两次萃取液，氮吹干，用2mmol/L的甲酸铵水溶液：2mmol/L的甲酸铵甲醇＝2:8(体积比)溶液定容到0.2mL，上机待测；
(7)质谱仪检测样品：
色谱条件：
a.色谱柱：CORTECS-C18,2.7μm,100mm×2.1mm；
b.流动相：流动相A：2mmol/L甲酸铵水溶液；流动相B:2mmol/L甲酸铵甲醇溶液；
c.流速：0.4mL/min；
d.柱温：40℃；
e.进样量：20uL；
质谱条件：
a.离子源：电喷雾离子源；
b.扫描方式：正离子扫描；
c.检测方式：多反应监测；
d.IonSpray Voltage：5500V；
e.Temperature：600℃；
f.Curtain Gas：25μL/min；
g.Collision Gas：7μL/min；
h.Ion Source Gas 1：50μL/min；
i.Ion Source Gas 2：55μL/min；
j.定性离子对、定量离子对、碰撞能量及去簇电压；
通过以上条件设置的质谱仪，对11种类固醇激素溶液的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压进行测定；
(8)液相色谱/串联质谱测定结果：
a.定性测定
按照上述步骤测定样品溶液和标准溶液，如果样品溶液的质量色谱峰保留时间和标准溶液一致；定性离子对的相对丰度与相当浓度的混合溶液的相对丰度相一致，相对丰度偏差不超过定性测定时离子相对丰度的最大允许偏差，则可判断样品中存在相应的被测物；
b.定量测定
待仪器稳定后，将样品溶液与标准溶液等体积进样，绘制标准工作曲线，采用内标法对样品进行定量计算，样液中待分析物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，得到定量结果。
定量计算：
测定结果由仪器工作站按内标法自动计算。
样品中类固醇激素的含量按下式进行计算：
X＝Ci×V2/V1
式中：
X----样品中激素的含量，单位为纳克每千克(ng/mL)；
Ci----样品制备液中类固醇激素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
V2----最终定容体积，单位为毫升(mL)；
V1----样品的体积，单位为毫升(mL)。
方法定量限：
本方法的孕酮、17-羟孕酮、雄烯二酮、皮质酮检出限为0.01ng/mL，定量限为0.025ng/mL；睾酮、二氢睾酮、皮质醇、皮质脂酮、醛固酮的检出限为0.025ng/mL，定量限为0.05ng/mL；脱氢表雄酮、孕烯醇酮的检出限为0.10ng/mL，定量限为0.25ng/mL。
回收率：
本方法添加浓度在0.025ng/mL～5.0ng/mL时，回收率为80～110％。
本发明的有益效果是：
(1)不存在嗜异性或自身抗体干扰；
(2)对激素代谢的结构类似物能够区别检测，不存在交叉反应；
(3)动态线性范围较宽，能够满足浓度跨度范围较大的激素检测需求，比如同一激素在不同个体间或同一个体不同应激状态下浓度差异较大的情况(睾酮等)；
(4)对含量相对较低的激素检测的灵敏度得到提高；
(5)能够同时检测多种激素。
血清样本加入内标后，用甲基叔丁基醚、正己烷和乙酸乙酯的混合溶液萃取，氮吹后用甲酸铵、甲醇溶液定容；液相色谱-串联质谱仪测定，多反应离子监测检测，内标法定量；。
具体实施方式
为了对本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面进一步阐述本发明。
一种用质谱法检测人体中多种痕量激素的方法，它包括以下步骤：
(1)配制试剂：准备甲醇(色谱级)，甲酸铵(色谱级)；
0.2mol/L甲酸铵溶液：1.26g甲酸铵用水溶解并定容到100mL；
2mmol/L甲酸铵溶液：吸取1mL 0.2mol/L甲酸铵溶液，加入到水中溶解并定容至100mL；
2mmol/L的甲酸铵甲醇溶液：吸取1mL 0.2mol/L甲酸铵溶液加入到甲醇中溶解并定容至100mL；
(2)配制萃取溶剂：准备甲基叔丁基醚(色谱级)，正己烷(色谱级)，乙酸乙酯(色谱级)，按照正己烷：乙酸乙酯：甲基叔丁基醚＝1:1:1(体积比)配制萃取溶剂；
(3)配制标准储备液：准备11种标准物质，睾酮、雄烯二酮、二氢睾酮、孕酮、17-羟孕酮、皮质醇、皮质酮、皮质脂酮、醛固酮、脱氢表雄酮和孕烯醇酮，纯度均>97％，分别准确称取10mg以上标准物质，用甲醇配制成一定浓度标准储备液，-18℃冷冻避光保存；
(4)配制内标物质储备液：准备同位素内标物质，睾酮-d5，孕酮-d9,17-羟孕酮-d8，醛固酮-d7，皮质醇-d4，脱氢表雄酮-d6，皮质酮-d8，皮质脂酮-d8，根据同位素内标物质的容量，用甲醇配制成0.1-1.0mg/mL的内标储备液，-18℃冷冻避光保存；
(5)配制标准曲线溶液：
使用标准储备液、内标物质储备液，配制孕酮、17-羟孕酮、雄烯二酮、皮质酮的线性浓度点为0.05、0.2、0.5、2.0、5.0、10、20mg/L，内标为1.0mg/L，配制睾酮、二氢睾酮、皮质脂酮、醛固酮的线性浓度点为0.1、0.2、0.5、2.0、5.0、10、20mg/L，内标为1.0mg/L，配制皮质醇的线性浓度点为1.0、5.0、10、20、50、100、200mg/L，内标为1.0mg/L，配制脱氢表雄酮、孕烯醇酮的线性浓度点为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50mg/L，内标为10mg/L；具体地，吸取适当体积和浓度的标准储备液，每个浓度点加适当体积0.1mg/L的内标物质储备液，用2mmol/L的甲酸铵水溶液：2mmol/L的甲酸铵甲醇＝2:8(体积比)溶液定容到1mL；
(6)样品处理：
准确移取血清样本400μL，测定睾酮、雄烯二酮、二氢睾酮、孕酮、17-羟孕酮、皮质醇、皮质酮、皮质脂酮、醛固酮9种类固醇激素时，加入0.01mg/L的内标20μL，测定脱氢表雄酮和孕烯醇酮2种类固醇激素时，加入0.1mg/L的内标20μL；涡旋30s，加入萃取溶剂1.0mL，涡旋3min，4000r/min离心5min，取上0.9mL清液至另一个离心管中，再加0.8mL萃取溶液，重复一次，合并两次萃取液，氮吹干，用2mmol/L的甲酸铵水溶液：2mmol/L的甲酸铵甲醇＝2:8(体积比)溶液定容到0.2mL，上机待测；
(7)质谱仪检测样品：
色谱条件：
a.色谱柱：CORTECS-C18,2.7μm,100mm×2.1mm；
b.流动相：流动相A：2mmol/L甲酸铵水溶液；流动相B:2mmol/L甲酸铵甲醇溶液；流动相梯度(见表一)；
c.流速：0.4mL/min；
d.柱温：40℃；
e.进样量：20uL；
表一流动相梯度表
质谱条件：
a.离子源：电喷雾离子源；
b.扫描方式：正离子扫描；
c.检测方式：多反应监测；
d.IonSpray Voltage：5500V；
e.Temperature：600℃；
f.Curtain Gas：25μL/min；
g.Collision Gas：7μL/min；
h.Ion Source Gas 1：50μL/min；
i.Ion Source Gas 2：55μL/min；
j.定性离子对、定量离子对、碰撞能量及去簇电压(见表二)；
通过以上条件设置的质谱仪，对11种类固醇激素溶液的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压进行测定；
表二11种类固醇激素的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压
(8)液相色谱/串联质谱测定结果：
a.定性测定
按照上述步骤测定样品溶液和标准溶液，如果样品溶液的质量色谱峰保留时间和标准溶液一致；定性离子对的相对丰度与相当浓度的混合溶液的相对丰度相一致，相对丰度偏差不超过定性测定时离子相对丰度的最大允许偏差(见表三)，则可判断样品中存在相应的被测物；
表三定性测定时离子相对丰度的最大允许偏差
| 相对离子丰度 | >50％ | >20～50％ | >10～20％ | ≤10％ |
| 允许的相对偏差 | ±20％ | ±25％ | ±30％ | ±50％ |
b.定量测定
待仪器稳定后，将样品溶液与标准溶液等体积进样，绘制标准工作曲线，采用内标法对样品进行定量计算，样液中待分析物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，得到定量结果。
定量计算：
测定结果由仪器工作站按内标法自动计算。
样品中类固醇激素的含量按下式进行计算：
X＝Ci×V2/V1
式中：
X----样品中激素的含量，单位为纳克每千克(ng/mL)；
Ci----样品制备液中类固醇激素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
V2----最终定容体积，单位为毫升(mL)；
V1----样品的体积，单位为毫升(mL)。
方法定量限：
本方法的孕酮、17-羟孕酮、雄烯二酮、皮质酮检出限为0.01ng/mL，定量限为0.025ng/mL；睾酮、二氢睾酮、皮质醇、皮质脂酮、醛固酮的检出限为0.025ng/mL，定量限为0.05ng/mL；脱氢表雄酮、孕烯醇酮的检出限为0.10ng/mL，定量限为0.25ng/mL。
回收率：
本方法添加浓度在0.025ng/mL～5.0ng/mL时，回收率为80～110％。
血清样本加入内标后，用甲基叔丁基醚、正己烷和乙酸乙酯的混合溶液萃取，氮吹后用甲酸铵、甲醇溶液定容；液相色谱-串联质谱仪测定，多反应离子监测检测，内标法定量；使用该方法不存在嗜异性或自身抗体干扰；对激素代谢的结构类似物能够区别检测，不存在交叉反应；动态线性范围较宽，能够满足浓度跨度范围较大的激素检测需求，比如同一激素在不同个体间或同一个体不同应激状态下浓度差异较大的情况(睾酮等)；对含量相对较低的激素检测的灵敏度得到提高；能够同时检测多种激素。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入本发明要求保护的范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (1)
1.一种用质谱法检测人体中多种痕量激素的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)配制试剂：准备甲醇(色谱级)，甲酸铵(色谱级)；
0.2mol/L甲酸铵溶液：1.26g甲酸铵用水溶解并定容到100mL；
2mmol/L甲酸铵溶液：吸取1mL 0.2mol/L甲酸铵溶液，加入到水中溶解并定容至100mL；
2mmol/L的甲酸铵甲醇溶液：吸取1mL 0.2mol/L甲酸铵溶液加入到甲醇中溶解并定容至100mL；
(2)配制萃取溶剂：准备甲基叔丁基醚(色谱级)，正己烷(色谱级)，乙酸乙酯(色谱级)，按照正己烷：乙酸乙酯：甲基叔丁基醚＝1:1:1(体积比)配制萃取溶剂；
(3)配制标准储备液：准备11种标准物质，睾酮、雄烯二酮、二氢睾酮、孕酮、17-羟孕酮、皮质醇、皮质酮、皮质脂酮、醛固酮、脱氢表雄酮和孕烯醇酮，纯度均>97％，分别准确称取10mg以上标准物质，用甲醇配制成一定浓度标准储备液，-18℃冷冻避光保存；
(4)配制内标物质储备液：准备同位素内标物质，睾酮-d5，孕酮-d9,17-羟孕酮-d8，醛固酮-d7，皮质醇-d4，脱氢表雄酮-d6，皮质酮-d8，皮质脂酮-d8，根据同位素内标物质的容量，用甲醇配制成0.1-1.0mg/mL的内标储备液，-18℃冷冻避光保存；
(5)配制标准曲线溶液：
使用标准储备液、内标物质储备液，配制孕酮、17-羟孕酮、雄烯二酮、皮质酮的线性浓度点为0.05、0.2、0.5、2.0、5.0、10、20mg/L，内标为1.0mg/L，配制睾酮、二氢睾酮、皮质脂酮、醛固酮的线性浓度点为0.1、0.2、0.5、2.0、5.0、10、20mg/L，内标为1.0mg/L，配制皮质醇的线性浓度点为1.0、5.0、10、20、50、100、200mg/L，内标为1.0mg/L，配制脱氢表雄酮、孕烯醇酮的线性浓度点为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50mg/L，内标为10mg/L；具体地，吸取适当体积和浓度的标准储备液，每个浓度点加适当体积0.1mg/L的内标物质储备液，用2mmol/L的甲酸铵水溶液：2mmol/L的甲酸铵甲醇＝2:8(体积比)溶液定容到1mL；
(6)样品处理：
准确移取血清样本400μL，测定睾酮、雄烯二酮、二氢睾酮、孕酮、17-羟孕酮、皮质醇、皮质酮、皮质脂酮、醛固酮9种类固醇激素时，加入0.01mg/L的内标20μL，测定脱氢表雄酮和孕烯醇酮2种类固醇激素时，加入0.1mg/L的内标20μL；涡旋30s，加入萃取溶剂1.0mL，涡旋3min，4000r/min离心5min，取上0.9mL清液至另一个离心管中，再加0.8mL萃取溶液，重复一次，合并两次萃取液，氮吹干，用2mmol/L的甲酸铵水溶液：2mmol/L的甲酸铵甲醇＝2:8(体积比)溶液定容到0.2mL，上机待测；
(7)质谱仪检测样品：
色谱条件：
a.色谱柱：CORTECS-C18,2.7μm,100mm×2.1mm；
b.流动相：流动相A：2mmol/L甲酸铵水溶液；流动相B:2mmol/L甲酸铵甲醇溶液；
c.流速：0.4mL/min；
d.柱温：40℃；
e.进样量：20uL；
质谱条件：
a.离子源：电喷雾离子源；
b.扫描方式：正离子扫描；
c.检测方式：多反应监测；
d.IonSpray Voltage：5500V；
e.Temperature：600℃；
f.Curtain Gas：25μL/min；
g.Collision Gas：7μL/min；
h.Ion Source Gas 1：50μL/min；
i.Ion Source Gas 2：55μL/min；
j.定性离子对、定量离子对、碰撞能量及去簇电压；
通过以上条件设置的质谱仪，对11种类固醇激素溶液的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压进行测定；
(8)液相色谱/串联质谱测定结果：
a.定性测定
按照上述步骤测定样品溶液和标准溶液，如果样品溶液的质量色谱峰保留时间和标准溶液一致；定性离子对的相对丰度与相当浓度的混合溶液的相对丰度相一致，相对丰度偏差不超过定性测定时离子相对丰度的最大允许偏差，则可判断样品中存在相应的被测物；
b.定量测定
待仪器稳定后，将样品溶液与标准溶液等体积进样，绘制标准工作曲线，采用内标法对样品进行定量计算，样液中待分析物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，得到定量结果。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200804 |
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