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CN111471667B - 壳聚糖酶Csn-PT及其应用 - Google Patents

壳聚糖酶Csn-PT及其应用 Download PDF

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CN111471667B CN202010491045.9A CN202010491045A CN111471667B CN 111471667 B CN111471667 B CN 111471667B CN 202010491045 A CN202010491045 A CN 202010491045A CN 111471667 B CN111471667 B CN 111471667B
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chitosanase
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lys
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Abstract

本发明公开了一种壳聚糖酶Csn‑PT，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了编码该壳聚糖酶Csn‑PT的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述壳聚糖酶Csn‑PT在降解壳聚糖中的应用，在制备降解壳聚糖的酶制剂中的应用。本发明的壳聚糖酶Csn‑PT，用于降解壳聚糖，其最适pH为8，最适反应温度为50℃，比酶活可达10163.826U/mg具有高催化活性，相较于已报道的壳聚糖酶，在催化活性和效率方面具有明显的优势。

Description

壳聚糖酶Csn-PT及其应用
技术领域
本发明涉及壳聚糖酶Csn-PT，及其在降解壳聚糖中的应用，属于功能酶技术领域。
背景技术
壳寡糖是壳聚糖降解的产物,聚合度(DP)一般在2～10之间,其分子质量低,水溶性好,具有许多生理活性,如抑菌性、抗氧化、抗肿瘤、降胆固醇、降血压、防感染以及控制关节炎等,这使得壳寡糖在医药、保健品、食品、农业等领域有了更大的应用价值。
目前,壳寡糖的制备方法主要有化学法、物理法、生物酶法。化学法、物理法制备壳寡糖存在工艺条件难控制、环境污染大、寡糖产率低等缺点。使用非专一性酶如脂肪酶、蛋白酶等酶解制备壳寡糖时，会出现水解到一定程度时加大酶量也难以提高水解程度的情况，而且水解产物较复杂难以分离。使用专一性的壳聚糖酶(EC：3.2.1.132)制备寡糖的方法具有反应条件温和、反应过程容易控制且产物纯度较高等优点。但野生型菌株产酶水平低,难以满足工业生产和应用的要求,可采用异源表达提高产酶水平，来制备酶制剂，用于工业化生产。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种高催化活性的生成GlcN-(GlcN)6的新型壳聚糖酶——壳聚糖酶Csn-PT，以及其在降解壳聚糖中的应用，从而弥补现有技术的不足。
本发明是通过以下技术方案实现的：
壳聚糖酶Csn-PT，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
MSNARPSKSQTKFLLAFLCFTLVASLFGATALFQPSKAAAASPDDNFSPETLQFLRNNTGLDGEQWNNIMKLINKPEQDDLNWIEYYGYCEDITDERGYTIGLFGATTGGSRDTHPDGPELFKAYDAAKGASNPSADGALKRLGINGKMNGSILEIKDSEKVFCGKIKKLQNDAAWRKAMWETFYNVYIRYSVEQARQRGFASAVTIGSFVDTALNQGATGGSNTLQGLLARSGSSSNEKTFMKNFHAKRTLVVDTNKYNKPPNGKNRVKQWDTLVDMGKMNLKNVDSEIAKVTDWEMK。
一种编码上述壳聚糖酶Csn-PT的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2：
5’-ATGAGCAATGCCCGCCCGAGCAAAAGCCAGACCAAATTTCTGCTGGCCTTTCTGTGTTTTACCCTGGTGGCCAGCCTGTTTGGCGCAACCGCCCTGTTTCAGCCGAGTAAAGCAGCAGCAGCAAGCCCGGATGATAATTTTAGTCCGGAAACCCTGCAGTTTCTGCGTAATAATACCGGTCTGGATGGCGAACAGTGGAATAATATTATGAAACTGATCAACAAGCCGGAACAGGATGATCTGAATTGGATTGAATATTATGGCTATTGCGAAGATATCACCGATGAACGTGGCTATACCATTGGTCTGTTTGGTGCAACCACCGGCGGCAGCCGTGATACCCATCCGGATGGTCCGGAACTGTTTAAAGCATACGATGCAGCCAAAGGTGCCAGCAATCCGAGCGCCGATGGTGCCCTGAAACGCCTGGGTATTAATGGTAAAATGAATGGCAGCATTCTGGAAATTAAGGATAGCGAAAAAGTTTTCTGTGGCAAAATTAAGAAGCTGCAGAATGATGCAGCCTGGCGTAAAGCAATGTGGGAAACCTTTTATAATGTTTATATCCGCTACAGCGTTGAACAGGCACGCCAGCGCGGTTTTGCAAGCGCCGTGACCATTGGTAGTTTTGTTGATACCGCCCTGAATCAGGGCGCCACCGGTGGCAGTAATACCCTGCAGGGTCTGCTGGCCCGCAGCGGTAGCAGTAGTAATGAAAAAACCTTTATGAAGAACTTCCACGCCAAACGTACCCTGGTGGTTGATACCAATAAGTATAATAAGCCGCCGAATGGTAAAAATCGCGTTAAACAGTGGGATACCCTGGTTGATATGGGTAAAATGAACCTGAAAAATGTTGATAGTGAGATTGCAAAAGTGACCGATTGGGAAATGAAA-3’。
上述壳聚糖酶Csn-PT在降解壳聚糖中的应用。
上述壳聚糖酶Csn-PT在制备降解壳聚糖的酶制剂中的应用。
一种降解壳聚糖的方法，采用上述氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的壳聚糖酶Csn-PT降解壳聚糖，生成GlcN-(GlcN)6，主要产物为壳单糖(DP1)到壳三糖(DP3)，优选的降解条件为：温度50℃，pH 8。
一种酶制剂，包含有上述壳聚糖酶Csn-PT。该酶制剂在降解壳聚糖中的应用。
一种重组工程菌，其基因组中插入有上述编码壳聚糖酶Csn-PT的基因，能表达壳聚糖酶Csn-PT。该重组工程菌在制备壳聚糖酶Csn-PT中的应用。
本发明的壳聚糖酶Csn-PT，属于GH46家族，能够降解壳聚糖产生GlcN-(GlcN)6，酶解主要产物为壳单糖(DP1)到壳三糖(DP3)，具有良好的生物催化效率，在50℃时其比酶活为10163.826U/mg，具有高催化活性，可高效降解壳聚糖。利用本发明的壳聚糖酶Csn-PT制备的酶制剂，具有活性好、效率高、纯度高、产量高、稳定性好等优点，具有良好的工业化应用潜质。相比较于现有的壳聚糖酶(如CN108330119A、CN102816751A中提到的壳聚糖酶)，本发明的壳聚糖酶在催化活性和效率方面具有明显的优势。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：本发明的壳聚糖酶纯化后的纯酶SDS-PAGE电泳图，其中，M为标准蛋白Marker；1为粗酶蛋白；2为纯化后的壳聚糖酶蛋白。
图2：温度变化对相对酶活的影响示意图。
图3：本发明的壳聚糖酶，pH变化对相对酶活的影响示意图。
图4：本发明的壳聚糖酶酶解产物的TLC图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1 壳聚糖酶基因Csn-PT的克隆
本发明的壳聚糖酶Csn-PT的产酶基因为人工合成序列。发明人挖掘到保藏于海洋微生物菌种保藏管理中心(Marine Culture Collection of China,MCCC)保藏编号MCCC:1K01247的泰氏芽孢杆菌Paenibacillus tyrfis的壳聚糖酶片段，发明人将该基因序列根据宿主大肠杆菌的密码子偏好性，进行了密码子优化，用于在大肠杆菌中进行高效表达。本发明的壳聚糖酶Csn-PT基因包含有897个碱基序列，如SEQ ID NO.2所示，编码299个氨基酸序列，如SEQ ID NO.1所示。根据进化树比对，发现该壳聚糖酶属于多糖水解酶第46家族(GH-46)。
以合成的片段为模板，在壳聚糖酶基因的上、下游设计用于无缝连接的引物，进行PCR扩增Csn-PT基因片段。
引物的序列如下所示：
上游引物：5’-CGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTTCATTTCCCAATCGGTCAC-3’，如SEQ ID NO.3所示；
下游引物：5’-CAAATGGGTCGCGGATCCTGAGCAATGCCCGCC-3’，如SEQ ID NO.4所示。
PCR反应体系为：2×PCR Buffer 25μl，dNTP 10μl，引物各1.5μl，模板1μl，KODFx酶1μl，无菌水10μl，总体系50ul。
PCR的反应条件为：94℃预变性5min，95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸60s，反应30个循环，72℃后延伸10min。
琼脂糖凝胶电泳后回收900Kb的PCR产物片段。
实施例2 含壳聚糖酶基因的表达载体构建
基因片段与pET-28a克隆载体采用无缝克隆技术进行连接，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有50μg/m L卡那霉素的(LB)培养基固体平板上。37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆至含有50μg/m L卡那霉素LB液体培养基，转速220rpm的37℃摇床培养过夜，阳性验证后测序，并命名为pET28a-Csn-PT。
实施例3 含壳聚糖酶基因的重组质粒及工程菌的构建
提取测序正确的重组质粒，并转化至宿主E.coli BL21感受态细胞中，构建好的工程菌在硫酸卡那霉素抗性平板上长出。
实施例4 利用大肠杆菌工程菌制备重组壳聚糖酶
挑取大肠杆菌重组菌株接种在5ml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养12小时后按1％的接种量接入含有硫酸卡那霉的ZYP-5052培养基，20℃，200rpm培养48h，自诱导表达壳聚糖酶。
4℃，8000g离心10分钟，收集菌体，细胞重悬于50mM pH 8.0的Tirs-HCl缓冲液中，超声破碎30min后12000g离心15min，上清液即为粗酶液。粗酶液使用Ni-NTA柱进行亲和层析纯化，使用10mM咪唑溶液(500mM NaCl,50mM Tris-HCl)平衡柱子，然后用30mM咪唑溶液(500mM NaCl,50mM Tris-HCl)洗脱结合力弱的杂蛋白，40mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，将得到的溶液进行SDS-PAGE检测(图1)，使用Bradford法测定蛋白浓度。
实施例5 重组壳聚糖酶比酶活测定
壳聚糖酶Csn-PT活性的标准测定方法为：10μL酶液加入800μL pH 8的Tris-HCl和190ul的2％的胶体壳聚糖，在50℃下反应15min，取200ul加入300μL的DNS试剂沸水浴10min进行显色，在OD540下检测其吸光度。酶活力定义为在标准条件下每min产生1μM还原糖所需要的酶量。经测定，纯化后的壳聚糖酶活力可达10163.826U/mg。
实施例6 测定重组壳聚糖酶的最适反应条件
反应条件为：选取35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃反应15min测定最适温度；在50℃下，选用pH为3.0～10.0的缓冲液作为酶反应的不同测定pH缓冲液，根据壳聚糖酶的酶活力，确定壳聚糖酶的最适pH。结果如图2，图3所示，重组壳聚糖酶的最适反应温度为50℃，最适pH为8。
实施例7 测定重组壳聚糖酶的降解产物
将实施例4中纯化所得壳聚糖酶Csn-PT与2％的胶体壳聚糖在50℃下分别孵育不同时间，然后用TLC板检测产物。具体为：展开剂(正丙醇:氨水＝2:10)，显色剂(0.5％茚三酮乙醇溶液)110℃显色。如图4所示，壳聚糖酶Csn-PT酶解产物为壳单糖(DP1)到壳六糖(DP6)。
实施例8 利用重组壳聚糖酶制备酶制剂
利用实施例4制备的重组壳聚糖酶制备酶制剂：发酵破碎后的溶液纯化后，用缓冲液置换咪唑，冻干后保存酶粉。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 壳聚糖酶Csn-PT及其应用
<141> 2020-06-02
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 299
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Met Ser Asn Ala Arg Pro Ser Lys Ser Gln Thr Lys Phe Leu Leu Ala
1 5 10 15
Phe Leu Cys Phe Thr Leu Val Ala Ser Leu Phe Gly Ala Thr Ala Leu
20 25 30
Phe Gln Pro Ser Lys Ala Ala Ala Ala Ser Pro Asp Asp Asn Phe Ser
35 40 45
Pro Glu Thr Leu Gln Phe Leu Arg Asn Asn Thr Gly Leu Asp Gly Glu
50 55 60
Gln Trp Asn Asn Ile Met Lys Leu Ile Asn Lys Pro Glu Gln Asp Asp
65 70 75 80
Leu Asn Trp Ile Glu Tyr Tyr Gly Tyr Cys Glu Asp Ile Thr Asp Glu
85 90 95
Arg Gly Tyr Thr Ile Gly Leu Phe Gly Ala Thr Thr Gly Gly Ser Arg
100 105 110
Asp Thr His Pro Asp Gly Pro Glu Leu Phe Lys Ala Tyr Asp Ala Ala
115 120 125
Lys Gly Ala Ser Asn Pro Ser Ala Asp Gly Ala Leu Lys Arg Leu Gly
130 135 140
Ile Asn Gly Lys Met Asn Gly Ser Ile Leu Glu Ile Lys Asp Ser Glu
145 150 155 160
Lys Val Phe Cys Gly Lys Ile Lys Lys Leu Gln Asn Asp Ala Ala Trp
165 170 175
Arg Lys Ala Met Trp Glu Thr Phe Tyr Asn Val Tyr Ile Arg Tyr Ser
180 185 190
Val Glu Gln Ala Arg Gln Arg Gly Phe Ala Ser Ala Val Thr Ile Gly
195 200 205
Ser Phe Val Asp Thr Ala Leu Asn Gln Gly Ala Thr Gly Gly Ser Asn
210 215 220
Thr Leu Gln Gly Leu Leu Ala Arg Ser Gly Ser Ser Ser Asn Glu Lys
225 230 235 240
Thr Phe Met Lys Asn Phe His Ala Lys Arg Thr Leu Val Val Asp Thr
245 250 255
Asn Lys Tyr Asn Lys Pro Pro Asn Gly Lys Asn Arg Val Lys Gln Trp
260 265 270
Asp Thr Leu Val Asp Met Gly Lys Met Asn Leu Lys Asn Val Asp Ser
275 280 285
Glu Ile Ala Lys Val Thr Asp Trp Glu Met Lys
290 295
<210> 2
<211> 897
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atgagcaatg cccgcccgag caaaagccag accaaatttc tgctggcctt tctgtgtttt 60
accctggtgg ccagcctgtt tggcgcaacc gccctgtttc agccgagtaa agcagcagca 120
gcaagcccgg atgataattt tagtccggaa accctgcagt ttctgcgtaa taataccggt 180
ctggatggcg aacagtggaa taatattatg aaactgatca acaagccgga acaggatgat 240
ctgaattgga ttgaatatta tggctattgc gaagatatca ccgatgaacg tggctatacc 300
attggtctgt ttggtgcaac caccggcggc agccgtgata cccatccgga tggtccggaa 360
ctgtttaaag catacgatgc agccaaaggt gccagcaatc cgagcgccga tggtgccctg 420
aaacgcctgg gtattaatgg taaaatgaat ggcagcattc tggaaattaa ggatagcgaa 480
aaagttttct gtggcaaaat taagaagctg cagaatgatg cagcctggcg taaagcaatg 540
tgggaaacct tttataatgt ttatatccgc tacagcgttg aacaggcacg ccagcgcggt 600
tttgcaagcg ccgtgaccat tggtagtttt gttgataccg ccctgaatca gggcgccacc 660
ggtggcagta ataccctgca gggtctgctg gcccgcagcg gtagcagtag taatgaaaaa 720
acctttatga agaacttcca cgccaaacgt accctggtgg ttgataccaa taagtataat 780
aagccgccga atggtaaaaa tcgcgttaaa cagtgggata ccctggttga tatgggtaaa 840
atgaacctga aaaatgttga tagtgagatt gcaaaagtga ccgattggga aatgaaa 897
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cgagtgcggc cgcaagcttt ttcatttccc aatcggtcac 40
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
caaatgggtc gcggatcctg agcaatgccc gcc 33

Claims (1)

1.一种降解壳聚糖制备GlcN-(GlcN)6的方法，其特征在于：采用氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的壳聚糖酶Csn-PT降解壳聚糖，酶解主要产物为壳单糖到壳三糖，降解条件为：温度50℃，pH 8。
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