CN111454355A - 一种sox6纳米抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种SOX6纳米抗体及其应用，属于生物工程技术领域，所述SOX6纳米抗体具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明提供的SOX6纳米抗体能够抑制黑色素瘤细胞的迁移。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种SOX6纳米抗体及其应用。
背景技术
骆驼科动物(羊驼、骆驼)和软骨鱼体内的一种天然缺失重链但仍然具有生物活性的特异性抗体称单域抗体，单域抗体的抗原结合位点(VHH)具有独立的抗原识别能力，独立表达的VHH又被称为纳米抗体。纳米抗体是一类具有体积小(纳米级)特点的新一代抗体，在各种组织中渗透能力强，在困难环境中稳定性好，在微生物系统中易于生产。纳米抗体实际上是具有结合能力的抗体的最小片段。纳米体的独特特性使其成为开发新的基于抗体治疗方法的合适候选对象。在降低生产成本方面纳米抗体结构简单易于体外表达，同时体外表达不易产生包涵体，生产工艺简单；同时纳米抗体的分子量小，结构简单，更有利于进行基因改造，纳米抗体人源化修饰等特性。在这方面，纳米抗体是许多研究人员和生物制药公司感兴趣的诊断和治疗应用。
黑色素瘤是由黑色素细胞癌化形成的一种最具侵袭性的发生于皮肤部位的恶性癌症。性别决定区域Y-box(SOX)家族由20个基因组成。这些基因编码转录因子和一个高流动性组(HMG)盒DNA结合域，这与性别决定区域(Sry)蛋白质非常相似。性别决定区域Y-box6(SOX6)属于大多数脊椎动物的SOXD组，还有SOX5和SOX13。SOX蛋白质的表达，作为转录调控因子，受到许多信号通路的严格控制。SOX6是在小鼠黑色素瘤细胞(B16)中表达，SOX6的下调并不影响B16细胞中的MITF水平。SOX6抑制细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)基因胰腺b细胞表达及e-球蛋白表达。SOX6可以促进黑色素瘤细胞的生长和增殖，制备SOX6纳米抗体，一方面可以成为利用分子成像技术研究SOX6作用机制的示踪工具，另一方面可以作为抑制黑素瘤生长的小分子工具。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种SOX6纳米抗体及其应用，本发明提供的SOX6纳米抗体能够抑制黑色素瘤细胞的迁移。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种SOX6纳米抗体，所述SOX6纳米抗体具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
本发明还提供了上述技术方案所述的SOX6纳米抗体在制备抑制黑色素瘤细胞迁移的药物中的应用。
本发明提供了一种SOX6纳米抗体及其应用，所述SOX6纳米抗体具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明提供的SOX6纳米抗体能够抑制黑色素瘤细胞的迁移。
附图说明
图1SOX6纳米抗体的SDS-PAGE及Western Blotting鉴定；
图2SOX6-VHH1在B16细胞中的定位；
图3添加SOX6-VHH1抑制B16黑素瘤细胞增殖迁移。
具体实施方式
本发明提供了一种SOX6纳米抗体，所述SOX6纳米抗体具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，具体如下：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLGGWNIGWFRQAPGKEREGVLCISDSGESVYYLDSVKGRFTISSDYAENTVYLQMNSLKPEDTAIYFCAATYYRCSDYAPEFSSWGQGTQVTVSSAHHSEDPSSRPLWP。
在本发明中，所述SOX6纳米抗体的筛选方法，优选包括以下步骤：
1)将黑素瘤纳米抗体库进行第一轮淘洗，得到B16-SOX6-VHH1；
所述第一轮淘洗的SOX6蛋白的包被浓度为18～22μg/ml；
2)将所述步骤1)得到的B16-SOX6-VHH1依次进行第二轮、第三轮和第四轮淘洗，得到噬菌体溶液；
所述第二轮淘洗的SOX6蛋白的包被浓度为8～12μg/ml；
所述第三轮淘洗的SOX6蛋白的包被浓度为3～8μg/ml；
所述第四轮淘洗的SOX6蛋白的包被浓度为3～8μg/ml；
3)将所述步骤2)得到的噬菌体液与TG1菌液混合、感染后进行培养，得到菌株；
4)将所述步骤3)得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、感染，将得到的感染物进行第一振荡培养后进行第一离心，将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养后，进行第二离心，将得到的第二上清液与封闭液混合、孵育后进行间接ELISA检测，检测第二上清液同SOX6蛋白的反应性，以确定所述菌株与SOX6蛋白具有反应性；
所述第一振荡的温度为35～42℃，所述第二振荡的温度为28～32℃；
所述第一离心的离心力为7500～8500g，所述第二离心的离心力为2000～2100g；
5)将所述步骤4)与SOX6蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取，以所述质粒为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到纳米抗体VHH片段，将所述纳米抗体VHH片段与表达载体连接，得到重组质粒；
所述质粒引物包括质粒上游引物和质粒下游引物，所述质粒上游引物具有SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列，具体序列如下：
GTGAGGATCCGAGTCTGGAGGRRGCTTGGTGCA，其中，GGATCC为BamHⅠ酶切位点。
所述质粒下游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
TCTGAGTCGACTGAGGAGACGRTGACSTSGGTC，其中，GTCGAC为SaⅠl酶切位点。
6)将所述步骤5)得到的重组质粒、pColdⅠ转入大肠杆菌，得到纳米抗体表达菌株，对所述纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导后，提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白，根据蛋白分子量及His-tag标签对所述蛋白进行Western Blotting鉴定，蛋白分子量为15kDa的蛋白为SOX6纳米抗体。
在本发明中，所述黑素瘤纳米抗体库优选为中国专利CN201910057953.4中公开的黑素瘤纳米抗体库。
在本发明中，所述第一轮淘洗的SOX6蛋白的包被浓度为18～22μg/ml，优选为10μg/ml。本发明对所述第一轮淘洗的方法没有特殊限定，采用本领域常规淘洗的方法即可。
本发明将得到的B16-SOX6-VHH1依次进行第二轮、第三轮和第四轮淘洗，得到噬菌体溶液；所述第二轮淘洗的SOX6蛋白的包被浓度为8～12μg/ml；所述第三轮淘洗的SOX6蛋白的包被浓度为3～8μg/ml；所述第四轮淘洗的SOX6蛋白的包被浓度为3～8μg/ml。
在本发明中，所述第二轮淘洗的SOX6蛋白的包被浓度为8～12μg/ml，优选为10μg/ml；所述第三轮淘洗的SOX6蛋白的包被浓度为3～8μg/ml，优选为5μg/ml；所述第四轮淘洗的SOX6蛋白的包被浓度为3～8μg/ml，优选为5μg/ml。本发明对所述第二轮淘洗、第三轮淘洗和第四轮淘洗的方法没有特殊限定，采用本领域常规淘洗的方法即可。
本发明将得到的噬菌体液与TG1菌液混合、感染后进行培养，得到菌株。
在本发明中，所述噬菌体液与TG1菌液的体积比优选为1:4。在本发明中，所述TG1菌液的OD600值优选为0.4。在本发明中，所述培养的温度优选为25～35℃，更优选为30℃。
本发明将得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、感染，将得到的感染物进行第一振荡培养后进行第一离心，将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养后，进行第二离心，将得到的第二上清液与封闭液混合、孵育后进行间接ELISA检测，检测第二上清液同SOX6蛋白的反应性，以确定所述菌株与SOX6蛋白具有反应性；所述第一振荡的温度为35～42℃，所述第二振荡的温度为28～32℃；所述第一离心的离心力为1700～1900g，所述第二离心的离心力为2000～2100g。
在本发明中，所述菌株与KM13辅助噬菌体混合后优选以静置的方式进行感染，所述感染的时间优选为25～35min，优选为30min。
在本发明中，所述第一振荡的温度优选为35～42℃，更优选为37℃；所述第二振荡的温度优选为28～32℃，更优选为30℃；所述第一离心的离心力优选为1700～1900g，更优选为所述第二离心的离心力为1800g；所述第二离心的离心力优选为2000～2100g，更优选为2020g。
本发明将与SOX6蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取，以所述质粒为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到纳米抗体VHH片段，将所述纳米抗体VHH片段与表达载体连接，得到重组质粒；所述质粒引物包括质粒上游引物和质粒下游引物，所述质粒上游引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述质粒下游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
本发明对质粒的提取没有特殊限定，采用常规提取质粒的方法即可。本发明对所述PCR扩增使用的体系和程序没有特殊限定，采用常规使用的体系和程序即可。在本发明中，所述所述质粒引物包括质粒上游引物和质粒下游引物，所述质粒上游引物优选具有SEQID No.2所示的核苷酸序列，具体如下：
GTGAGGATCCGAGTCTGGAGGRRGCTTGGTGCA；
所述质粒下游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，具体序列如下：
TCTGAGTCGACTGAGGAGACGRTGACSTSGGTC。
本发明对所述纳米抗体VHH片段与表达载体连接的方法没有特殊限定，采用本领域常规连接方法即可。
本发明将得到的重组质粒、pColdⅠ转入大肠杆菌，得到纳米抗体表达菌株，对所述纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导后，提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白，根据蛋白分子量(15kDa左右)及His-tag标签对所述蛋白进行Western Blotting鉴定，蛋白分子量为15kDa的蛋白为SOX6纳米抗体。
本发明对所述重组质粒、pColdⅠ转入大肠杆菌的转入方法没有特殊限定，采用常规方法即可。本发明对所述纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导的诱导方法除浓度外没有特殊限定，采用常规诱导方法即可。本发明对提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白的提取方法没有特殊限定，采用常规提取微生物中的蛋白的方法即可。本发明对所述SDS-PAGE鉴定的方法没有特殊限定，采用常规即可。
本发明还提供了上述技术方案所述的SOX6纳米抗体在制备抑制黑色素瘤细胞迁移的药物中的应用。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用SOX6纳米抗体在医学上可接受的剂型即可。在本发明中，所述药物中以SOX6纳米抗体为唯一活性物质。本发明对所述药物中SOX6纳米抗体的含量没有特殊限定，采用药物中活性物质的常规含量即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将实验室保留的黑素瘤纳米抗体库(中国专利CN201910057953.4中公开的黑素瘤纳米抗体库)进行第一轮淘洗，得到B16-SOX6-VHH，分装冻存于-70℃。
淘洗时用50mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液作为包被缓冲液，包被浓度20μg/ml，包被体积2ml，以SOX6多肽蛋白包被免疫管。
淘洗方法如下：
(1)将500μl黑素瘤纳米抗体库接种于100ml 2×YTAG培养基，37℃200rmp振荡培养1小时至OD600为0.4；
2)加入KM13辅助噬菌体，100ml菌液加100μl KM13辅助噬菌体，37℃静置感染30分钟，而后振荡培养30分钟；
3)4000×g离心10分钟，去除培养基上清，用100ml 2×YTAK培养基重悬菌体沉淀，30℃200rmp振荡培养过夜；
4)次日上午11000×g，4℃离心过夜培养菌液10分钟，将上清转至新的离心瓶并加入20ml PEG/NaCl溶液，混匀冰浴90分钟；
5)11000×g，4℃离心30分钟，弃上清，而后再次离心2分钟，彻底吸尽上清；
6)使用2.6ml PBS缓冲液重悬沉淀，而后将其分装于2个1.5ml离心管中，11600×g离心10分钟；
7)回收上清，命名为ZJ-B16-SOX6-VHH1，取100μl待用于滴度测定，剩余同1.6mlMPBS溶液混合，室温共孵育1h，得到混合液(MPBS溶液处理过的SOX6-VHH1)，待用。
包被蛋白处理：
(1)包被蛋白次日，将免疫管内的液体倒出，使用PBS缓冲液洗管3次。
(2)在每管中加满MPBS，室温封闭2h后使用PBS缓冲液洗管3次。
(3)在免疫管中加入2ml上述步骤(7)得到的混合液，室温孵育2h后使用PBST溶液洗管10次，而后用PBS缓冲液洗管10次。
(4)在每管中加入2ml 100mM TEA溶液，室温轻摇15min洗脱结合的噬菌体，而后加入2ml Tris-HCl溶液中和。
(5)将洗脱的噬菌体(命名为XT-B16-SOX6-VHH1)转至50ml离心管，并加入16mlOD600为0.4的TG1菌液，37℃水浴30分钟，使洗脱的噬菌体感染TG1菌液。(并在免疫管内加入4ml的OD600为0.4的TG1菌液进行感染，最后合并，总共24ml的体积)
(6)取100μl菌液待用于滴度测定，剩余菌液于4000g离心10min。
(7)使用1ml 2×YT培养基重悬菌体沉淀，将重悬后的菌液涂布于5个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，置于30℃孵箱培养过夜。
(8)次日用2×YT培养基收集平板上长出的菌落，加入60％的甘油至终浓度为15％，其即为一级文库菌，命名为B16-SOX6-VHH1，分装冻存于-70℃。
测定拯救噬菌体滴度：ZJ-B16-SOX6-VHH1进行梯度稀释，稀释度从10-7～10-13；每个稀释度取10μl噬菌体感染190μl OD600为0.4的TG1菌液；每个稀释度取100μl菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算ZJ-B16-SOX6-VHH1滴度。
测定洗脱噬菌体滴度：将用于滴度测定的菌液梯度稀释，稀释度从10-1～10-5；每个稀释度取100μl菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算XT-B16-SOX6-VHH1滴度；进而计算第一轮淘洗的输入输出比I/O。
在一轮淘洗的基础上，依次进行二至四轮淘洗：SOX6多肽蛋白包被浓度分别为10μg/ml、5μg/ml、5μg/ml；拯救噬菌体滴度测定稀释度分别为10-7～10-12、10-8～10-11、10-8～10-11；洗脱噬菌体M13-SOX6的滴度测定稀释度分别为10-1～10-6、10-3～10-6、10-3～10-6；洗脱的噬菌体用Tris-HCl溶液(1M，pH值为7.4)中和后，取200μl噬菌体感染800μl OD600为0.4的TG1菌液(取100μl进行梯度稀释，剩余的进行保菌)，而后做10-3～10-6共4个稀释度，每个稀释度涂布3个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，每板100μl菌液，置于30℃培养过夜；对培养板菌落计数，计算滴度，并将培养板标记为平板，置于4℃冰箱待用。
特异性纳米抗体的筛选：
单克隆噬菌体上清的制备：从平板各挑取130个单克隆菌株共接种2块96孔深孔培养板，每孔中均含200μl 2×YTAG培养基，培养板分别标记为E-1、E-2，于30℃振荡培养。8h后，从每孔中吸取20μl菌液接种于180μl 2×YTAG培养基，于37℃振荡培养，原平板的剩余菌液中则加入60μl 60％的甘油至终浓度为15％，冻存于-80℃。转接平板振荡培养1h后，在每孔中加入20μl KM13(60μlKM13+12ml2*YTAG)辅助噬菌体，37℃静置感染30min，而后37℃振荡培养40min。1800×g离心深孔板10min，弃上清并在每孔中加入400μl 2×YTAK培养基重悬沉淀，30℃振荡培养过夜。次日，最大转速2020xg离心20分钟，从各孔中吸250μl噬菌体上清转移至新的深孔板中，并在每孔中加入250μl封闭液(含3％BSA的PBS缓冲溶液)常温共孵育1小时，待用于间接ELISA检测。
特异性单克隆噬菌体的鉴定：通过间接ELISA试验检测噬菌体上清同SOX6蛋白的反应性，具体方法如下：使用SOX6蛋白，包被96孔酶标板，包被浓度为2μg/ml，每孔100μl，置于4℃过夜。次日弃孔内包被液体，在每孔中加入100μl封闭液于37℃封闭1h。弃孔内封闭液，在每孔分别中加入100μl封闭液处理过的四轮筛选得到的噬菌体上清作为一抗，37℃孵育1h。用PBST洗液洗板12次。在每孔中加入100μl二抗(HRP-M13Antibody，稀释度1:10000)，37℃孵育1h。用PBST洗液洗板12次。在每孔中加入100μl显色底物，避光反应5-15min，而后在每孔中加入50μl终止液终止反应。将96孔酶标板置于读板机上读取OD450吸收值。对ELISA结果进行分析并确定阳性孔号。
通过间接ELISA方法检测130个单克隆对应的噬菌体上清同SOX6蛋白的反应性，根据间接ELISA试验的结果挑选出了20个单克隆，这些单克隆均同SOX6蛋白有较好的反应性且同BSA蛋白的反应值较弱。将20个单克隆的培养菌液送测序公司测序。
SOX6纳米抗体表达活性和亲和性：
原核表达重组质粒的构建：将上述测序结果正确的克隆株的甘油菌接种5ml 2×YTAG培养基培养，并利用质粒小量提取试剂盒提取质粒作为原核表达的模板质粒。之后设计用于原核表达的引物，并在引物的5’端和3'端分别引入BamHⅠ和SalI酶切位点。利用设计的引物扩增纳米抗体VHH序列，并通过上述酶切位点将其连接入pColdⅠ原核表达载体，构建纳米抗体原核表达重组质粒以进行纳米抗体的SOX6特异性鉴定。
原核表达的引物：
(SEQ ID No.2)F:
GTGAGGATCCGAGTCTGGAGGRRGCTTGGTGCA；
(SEQ ID No.3)R:
TCTGAGTCGACTGAGGAGACGRTGACSTSGGTC。
筛选步骤如下
将重组质粒和pColdⅠ空载转化入BL21(DE3)菌株并获得相应的纳米抗体表达菌株。而后对纳米抗体进行诱导表达，具体方法为：
将转化后涂板后的菌液进行过夜培养，次日挑取培养板上的单克隆菌落过夜培养。将次日培养的菌液进行保菌。
吸取10μl甘油菌接种于5mlAmp抗性的LB培养基，30℃振荡培养过夜；
第二天吸取50μl菌液接种5mlAmp抗性的LB培养基，各接种2管，37℃振荡培养至OD600为0.6；
在其中1管菌液中加入IPTG诱导(终浓度0.2mM)，另1管不加IPTG做为未诱导对照，15℃振荡培养过夜；
同时做BL21(DE3)空菌株对照，空菌株对照培养使用无抗性的LB培养基。
SOX6纳米抗体纯化：
将诱导表达成功的1L SOX6纳米抗体菌液分装，11000×g，4℃离心15min，弃掉上清。使用100ml PBS重悬菌体沉淀后分装50ml离心管，每管分装25ml。将50ml离心管中的菌液分别在超声破碎仪中进行超声破碎处理。待超声结束，16500×g离心10min，收集超声上清并过滤0.02μm滤膜，以备上机(AKTApure)纯化。
根据所纯化蛋白大小，设置0.5Mpa柱前压，2Mpa系统压。待SOX6纳米抗体超声样品全部上柱后，分别设置5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％的咪唑(咪唑浓度为500mM)进行洗脱。并回收洗脱液鉴定是否为目的蛋白。
纳米抗体的SDS-PAGE鉴定：
将对纳米抗体的表达进行SDS-PAGE鉴定，具体方法为：
吸取1ml菌液于1.5ml离心管，13000rpm离心2min；
弃上清，使用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀2次；
用20μl PBS缓冲液重悬菌体沉淀，而后加入5μl 5×蛋白上样缓冲液，并于沸水中煮样5分钟。用10％的聚丙烯酰胺凝胶对样品进行电泳。待电泳结束后，用考马斯亮蓝染液染胶1h，而后用脱色液进行脱色。
SOX6纳米抗体的亲和性：
用5μg/ml得SOX6包被ELISA板；经BSA封闭后将纯化稀释后的SOX6纳米抗体作为一抗，分别梯度稀释到5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.3125μg/ml，进行ELISA鉴定。
结果：
1.ELISA筛选结果
通过间接ELISA方法检测130个单克隆对应的噬菌体上清同SOX6蛋白的反应性，根据间接ELISA试验的结果挑选出了10个单克隆，这些单克隆均同SOX6蛋白有较好的反应性且同BSA蛋白的反应值较弱(表1)。将10个单克隆的培养菌液送测序公司测序。
表1 SOX6单克隆ELISA筛选结果
经ELISA筛选后，阳性最强的两个克隆是SOX6-VHH1和SOX6-VHH2，将上述所有10个克隆进行测序，经测序并预测的氨基酸序列为：
N.1.(SEQ ID No.1)(SOX6-VHH1)氨基酸序列：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLGGWNIGWFRQAPGKEREGVLCISDSGESVYYLDSVKGRFTISSDYAENTVYLQMNSLKPEDTAIYFCAATYYRCSDYAPEFSSWGQGTQVTVSSAHHSEDPSSRPLWP；
N.2.(SEQ ID No.4)(SOX6-VHH2)氨基酸序列：
ESGGGSVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYYMSWVRQAPGEEPEWVTFITNDGSGVRYADSVKGRFTVSRNNVENTVYLRMDNLQPNDTARYYCVRGRLTATSPLIPDDSWGQGTQVTVSS；
N.3.(SEQ ID No.5)(SOX6-VHH3)氨基酸序列：
ESGGGLVQPGGSLRLSCLASGFSFDSYAMSWYRQAPGKEREWVAHITSGGSTNYSDSVKGRFTISRDNAKNAVYLQMDNLKPEDTAVYYCNEVSTSLDDYDYWGKGTQVTVSA；
N.4.(SEQ ID No.6)(SOX6-VHH4)氨基酸序列：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAAPGFSLSSYQMSWVRQSPGKGPEWVSTIAASSGNTWYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNTLKPEDTALYYCAKRNRAGLSAYDYWGQGIQVTVS；
N.5.(SEQ ID No.7)(SOX6-VHH5)氨基酸序列：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAAPGFSLSSYQMSWVRQSPGKGPEWVSTIAASSGNTWYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNTLKPEDTALYYCAKRNRAGLSAYDYWGQGIQVTVSS；
N.6.(SEQ ID No.8)(SOX6-VHH6)氨基酸序列：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLGGWNIGWFRQAPGKEREGVLCISDSGESVYYLDSVKGRFTISSDYAENTVYLQMNSLKPEDTAIYFCAATYYRCSDYAPEFSSWGQGTQVTVS；
N.7.(SEQ ID No.9)(SOX6-VHH7)氨基酸序列：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAAPGFTLSSYNMSWVRQSPGKGPEWVSTIAASSGNTWYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNTLKPEDTALYYCAKRNRAGLSAYDYWGQGIQVTVSS；
N.8.(SEQ ID No.10)(SOX6-VHH8)氨基酸序列：
ESGGGLVQPGGSLRLSCLAPGFSLSSYQMSWVRQSPGKGPEWVSTIAASSGNTWYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNTLKPEDTALYYCAKRNRAGLSAYDYWGQGIQVTVSS；
N.9.(SEQ ID No.11)(SOX6-VHH9)氨基酸序列：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAAPGFSLSSYQMSWVRQSPGKGPEWVSTIAASSGNTWYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNTLKPEDTALYYCAKRNRAGLSAYSSWGQGTQVTVSS；
N.10.(SEQ ID No.12)(SOX6-VHH10)氨基酸序列：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAAPGFSLSSYQMSWVRQSPGKGPEWVSTIAASSGNTWYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMDSLKPEDTALYYCAKRNRAGLDAYDYWGQGIQVTVSS。
2.SOX6纳米抗体亲和性检测：
选择上述两个最强的阳性克隆进行表达后，亲和性检测结果为：SOX6纳米抗体N.1对SOX6蛋白的灵敏度为1.25μg/ml；SOX6纳米抗体N.2对SOX6蛋白的灵敏度为2.5μg/ml。
由以上实施例可知，本发明提供的SOX6纳米抗体能够特异性结合SOX6蛋白，对该蛋白的灵敏度为1.25μg/ml。
3.对SOX6纳米抗体1进行表达和纯化
SOX6纳米抗体在40％咪唑浓度成功洗脱下来，经SDS-PAGE鉴定条带单一，大小为15kDa。根据蛋白分子量及His-tag标签对所述蛋白进行Western Blotting鉴定，蛋白分子量为15kDa的蛋白为SOX6纳米抗体。实验结果如图1。
实施例2
细胞培养及SOX6纳米抗体功能：研究发现SOX6在黑色素瘤细胞中高表达且与细胞增殖迁移有重要联系。通过细胞划痕实验和细胞免疫组织化学来鉴定SOX6纳米抗体。用含10％FBS的DMEM高糖培养基培养B16细胞，待细胞长至6孔板80％时消化传代，将一部分细胞1:2传至新的6孔板中，另一部分传至有无毒的载玻片上，摇匀，置于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。
免疫细胞化学定位：待载玻片的B16细胞长满后用PBS冲洗3次，之后加入500μl4％的多聚甲醛于4℃环境中静置30min；之后使用PBS冲洗3次并加入3％的H2O2溶液，静置15min；PBS充分冲洗，加入牛血清封闭20min后加入SOX6纳米抗体置于4℃环境过夜孵育；第二天将孵育盒放于室温复温30min后，PBS冲洗3次；加入带有His标签的二抗在37℃孵育30min，PBS冲洗3次，滴加50μl DAB在暗盒孵育3-10min后于显微镜下观察。显色完成后滴加蒸馏水终止染色，弃掉蒸馏水后加入苏木精进行核染，30s后自来水冲洗返蓝。
细胞划痕实验鉴定：DMEM高糖培养基培养B16细胞在6孔板中长满一层后，用消毒的直尺和中枪头在培养孔中划1条直线，划时枪头保持竖直。PBS冲洗3次，去除掉落的细胞，重新加入无血清的DMEM高糖培养基置于培养箱中培养。每6个小时在同一位置记录一次并拍照。
结果：
1.SOX6纳米抗体在B16细胞中的定位
对照组添加的是等量的PBS，实验组添加SOX6纳米抗体的浓度为100μg/ml。根据结果发现：SOX6纳米抗体主要分布到B16细胞的细胞质中，说明该纳米抗体可以进入到细胞内发挥作用。实验结果如图2(箭头所示)。
2.添加SOX6纳米抗体对B16细胞划痕实验的影响
对照组添加的是等量的PBS，实验组添加SOX6纳米抗体的浓度为100μg/ml。根据结果发现：添加PBS的组在36小时内，划痕基本长满细胞。实验组在24小时处最明显，36小时还有20％左右未长满，结果说明SOX6纳米抗体添加B16细胞后，随着时间的增长起到了抑制B16细胞迁移的过程。实验结果如图3。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山西农业大学
<120> 一种SOX6纳米抗体及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Gly Gly Trp Asn Ile Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Leu Cys Ile Ser Asp
35 40 45
Ser Gly Glu Ser Val Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Ser Asp Tyr Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Arg Cys Ser Asp Tyr Ala Pro Glu Phe Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser Ala His His Ser Glu Asp Pro Ser Ser Arg
115 120 125
Pro Leu Trp Pro
130
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgaggatcc gagtctggag grrgcttggt gca 33
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctgagtcga ctgaggagac grtgacstsg gtc 33
<210> 4
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Tyr Met Ser Trp Val
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Glu Glu Pro Glu Trp Val Thr Phe Ile Thr Asn
35 40 45
Asp Gly Ser Gly Val Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Val Ser Arg Asn Asn Val Glu Asn Thr Val Tyr Leu Arg Met Asp Asn
65 70 75 80
Leu Gln Pro Asn Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Val Arg Gly Arg Leu
85 90 95
Thr Ala Thr Ser Pro Leu Ile Pro Asp Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asp Ser Tyr Ala Met Ser Trp Tyr
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ala His Ile Thr Ser
35 40 45
Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Glu Val Ser Thr Ser
85 90 95
Leu Asp Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
100 105 110
Ala
<210> 6
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Pro Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Gln Met Ser Trp Val
20 25 30
Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Thr Ile Ala Ala
35 40 45
Ser Ser Gly Asn Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Arg Asn Arg
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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Cys Ala Ala Pro Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Gln Met Ser Trp Val
20 25 30
Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Thr Ile Ala Ala
35 40 45
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65 70 75 80
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Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Gly Gly Trp Asn Ile Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Leu Cys Ile Ser Asp
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Ser Gly Glu Ser Val Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
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Ile Ser Ser Asp Tyr Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
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Gln Val Thr Val Ser
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Leu Ala Pro Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Gln Met Ser Trp Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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<210> 12
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Pro Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Gln Met Ser Trp Val
20 25 30
Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Thr Ile Ala Ala
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Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser
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85 90 95
Ala Gly Leu Asp Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
Claims (2)
1.一种SOX6纳米抗体，其特征在于，所述SOX6纳米抗体具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的SOX6纳米抗体在制备抑制黑色素瘤细胞迁移的药物中的应用。
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