CN111437224B - 一种利用微生物从大麻花叶中提取抗氧化成分的方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物提取技术领域，公开了一种利用微生物从大麻花叶中提取抗氧化成分的方法和应用。本发明所述方法将茯苓和/或灵芝制备种子液，将种子液中的菌体接种至大麻花叶或提取CBD后的大麻花叶废渣中进行培养，然后向培养后的固体中加入乙醇进行醇提，所得的醇提液为抗氧化提取物。本发明选用在食品和化妆品目录中的茯苓和灵芝两种微生物菌对大麻花叶或其提取CBD后的废渣进行处理，使包裹在大麻花叶和大麻花叶废渣内部的抗氧化活性物质暴露出来，再结合醇提方式从而提高了活性物质的转化率；相比根霉、米曲霉的处理方式以及单纯醇提方式，本发明方法能够获得更高抗氧化活性的抗氧化提取物，可最大程度上的利用大麻花叶资源。

Description

一种利用微生物从大麻花叶中提取抗氧化成分的方法和应用

技术领域

本发明涉及植物提取技术领域，具体涉及一种利用微生物从大麻花叶中提取抗氧化成分的方法和应用。

背景技术

大麻（Hewp）属于木兰纲（magnoliopsida）荨麻目(Urticales)大麻科（Cannabinaceae）大麻属（Cannabis）大麻种(Cannabis sativa L)的一年生草本植物，又称汉麻、线麻、火麻、寒麻、魁麻等。大麻中四氢大麻酚((THC)含量低于0.3%的大麻称为工业大麻，也是目前国内外广泛应用的大麻。超纯大麻二酚（CBD）是工业大麻核心成分，能有效抗衰老、抗氧化以及提高自身免疫，具有消炎、延缓衰老、滋润干燥肌肤，处理皮肤感染、帮助愈合皮肤损伤等功效。除了CBD以外，花叶中还含有三萜类化合物、黄酮类化合物以及生物碱类。

大麻花叶活性物质传统的提取方法是醇提，乙醇属于亲水性有机溶剂，对各类化学成分的溶解度都较好，提取成分全面。目前常用醇提的乙醇浓度是70%，但是醇提转化率普遍为40%-50%，而且乙醇提取时间多为5-6小时，提取时间长，且醇提转化率不高，抗氧化活性成分含量普遍较低，另外乙醇容易着火，对工厂防火防爆要求较高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用微生物从大麻花叶中提取抗氧化成分的方法，使得所述方法获得的提取物具备较高的抗氧化活性；

本发明的另外一个目的在于提供上述方法提取的抗氧化提取物；

本发明的另外一个目的在于提供茯苓和/或灵芝在从大麻花叶或提取CBD后的大麻花叶废渣中提取抗氧化成分的应用；

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种利用微生物从大麻花叶中提取抗氧化成分的方法，将茯苓和/或灵芝制备种子液，将种子液中的菌体接种至大麻花叶或提取CBD后的大麻花叶废渣中进行培养，培养至菌丝长满后（一般为14±2天）直接加入乙醇进行醇提，所得的醇提液为抗氧化提取物。

针对目前大麻花叶醇提效果不佳的问题，本发明通过微生物先期处理而后再醇提的方法，获得了较多的抗氧化活性物质，在DPPH自由基清除率，超氧阴离子自由基清除率和总还原力上具备更高的活性。

作为优选，所述菌体的接种量在10%±2%，所述大麻花叶或大麻花叶废渣的含水量为60-70%。

作为优选，本发明所述灵芝购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号ACCC50088；所述茯苓购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号ACCC50876。

作为优选，所述种子液为二级种子液，即利用种子液的培养基将菌种培养两次，培养环境为30℃下摇床培养3-7天，种子液的培养基如下：

葡萄糖20g/L，发酵麦芽浸粉20g/L，大豆蛋白胨1g/L，发酵酵母浸粉1g/L，硫酸镁0.05g/L，磷酸二氢钾0.1g/L。

具体地二级种子液制备过程为，在茯苓和灵芝各自的平板培养基上挑取两块1平方厘米大小菌块于灭菌过的一级种子液（300ml规格锥形瓶，100ml装液量）内， 30摄氏度、150r/min摇床内培养7天，取一级种子液5ml至二级种子液（300ml规格，95ml装液量）内，30摄氏度、150r/min摇床内培养第3－4天即可用于接种。

其中，所茯苓采的平板培养基为PDA培养基；在本发明具体实施方式中，所述PDA培养基（1L）制备过程如下：

取200g 新鲜的马铃薯切块煮沸，纱布过滤，取其滤液，与20.0g 葡萄糖，15~20g琼脂混合溶解，溶解后转移至容量瓶定容1000mL，115℃灭菌 30 min，倒平板。

作为优选，所述灵芝的平板培养基为MEA培养基；在本发明具体实施方式中，所述MEA（1L）培养基制备过程如下：

麦芽浸粉：30.0g，大豆蛋白胨：3.0g，琼脂：15.0g，pH5.6±0.2(25℃) g/L，121℃灭菌 30 min，倒平板。

作为优选，所述菌体接种至大麻花叶或提取CBD后的大麻花叶废渣中进行培养为在20-30℃下恒温培养，所述醇提在50-70℃下提取。所述乙醇选择为≥50%浓度的乙醇；在本发明具体实施方式中，培养后长满菌丝的固体培养基与乙醇的质量体积比为1:15-1:30，优选为1:20，所述醇提附加超声波提取。

本发明分别选择灵芝、茯苓、根霉和米曲霉四种微生物对大麻花叶及其大麻花叶渣进行处理，而后再醇提；结果显示，无论在大麻花叶中还是在大麻花叶提取CBD后的废渣中，采用灵芝和茯苓处理的试验组相比其他微生物菌种处理的试验组以及单独进行醇提的试验组，在DPPH自由基清除率，超氧阴离子自由基清除率和总还原力上具备更高的活性，这表明本发明所述方法能够获得活性更高的抗氧化提取物。

因此，本发明还提供了一种本发明所述方法提取的抗氧化提取物。

此外，从本发明的对比试验可以看出，仅在微生物菌种不同的区别下，茯苓和灵芝均能够从大麻花叶或其废渣中提取到更多的抗氧化成分，因此本发明还提出了茯苓和/或灵芝在从大麻花叶或提取CBD后的大麻花叶废渣中提取抗氧化成分的应用；所述应用中，茯苓和/或灵芝在与大麻花叶或提取CBD后的大麻花叶废渣共培养后再进行醇提。

由以上技术方案可知，本发明选用在食品和化妆品目录中的茯苓和灵芝两种微生物菌对大麻花叶或其提取CBD后的废渣进行处理，使包裹在大麻花叶和大麻花叶废渣内部的抗氧化活性物质暴露出来，再结合醇提方式从而提高了活性物质的转化率；相比根霉、米曲霉的处理方式以及单纯醇提方式，本发明方法能够获得更高抗氧化活性的抗氧化提取物，可最大程度上的利用大麻花叶资源。

具体实施方式

本发明公开了一种利用微生物从大麻花叶中提取抗氧化成分的方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在具体实施例中，对比试验中除应有的技术区别外，其余所用原料、试剂等试验环境保持一致；

以下就本发明所提供的一种利用微生物从大麻花叶中提取抗氧化成分的方法和应用做进一步说明。

实施例1： 不同微生物处理大麻花叶

1、微生物培养

将购自中国农业微生物菌种保藏管理中心的茯苓ACCC50876、灵芝ACCC50088、根霉ACCC30416和米曲霉ACCC30323进行平板培养，茯苓、米曲霉和根霉平板培养基为马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，灵芝平板培养基为MEA培养基。

2、种子液制备

从长势正常的茯苓、灵芝、米曲霉和根霉平板培养基上挑取两块1平方厘米大小菌块于灭菌过的一级种子液（300ml规格锥形瓶，100ml装液量）内，待30摄氏度、150r/min摇床内培养7天，取一级种子液5ml至二级种子液（300ml规格，95ml装液量）内，30摄氏度、150r/min摇床内培养第3－4天即可用于接种。

3、处理大麻花叶

取大麻花叶、大麻渣各3g，分别加入长圆柱瓶内（圆柱瓶平放），加入7ml去离子水，搅拌均匀。分别接种茯苓、灵芝、米曲霉和根霉，接种时用灭过菌且剪过口的5ml规格枪头吸取5ml茯苓、灵芝、米曲霉和根霉的二级种子液于灭过菌的10ml离心管内（菌体接种量在10%±2%），6000r/min离心后去除上清，将固体均匀打入长圆柱瓶内，封口后，放至30℃恒温箱培养，在14d停止对茯苓、灵芝、米曲霉和根霉固体培养基培养，对其进行醇提处理；

醇提处理（单独醇提同此方式）：

固体培养基：醇液＝1：20（质量体积比），于50摄氏度水浴和超声辅助下60min，每10min摇匀一次。醇提三次，每次需离心后回收固体重新加入50%乙醇，最后将3次醇提液汇合再定容。

上述每种处理组做3组，后续测定结果取均值。

4、指标的测定方法

（1）DPPH自由基清除能力测定法

A. 准备2mlEP管。实验组加入1ml样液+1ml 0.2mmol/L的DPPH。对照组加入1ml 样液+1ml 无水乙醇。空白组加入1ml 无水乙醇+1ml 0.2mmol/L的DPPH。

B. 于517nm下，测定实验组吸光度，记为Ai。测定对照组吸光度，记为Aj。记空白组为A₀。

C. 公式为：DPPH清除率（%）=[1-(Ai-Aj)/A₀] ×100%

（2）超氧阴离子自由基清除能力测定法

A. 取10ml EP管，加入5.7ml 的50mmol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液，后加入0.2ml样液，混匀后于25℃保温10min。

B. 在25℃下预热10mmol/L的邻苯三酚溶液，加入0.1ml于EP管中。

迅速摇匀，在320nm波长记录其处1min内吸光度的增加值（A_S）。用等体积纯水替代样液，测定其在320nm波长下1min内吸光度的增加值（A₀）。

注:同时迅速测量第一次吸光度，后接连测量3次吸光度。需消耗3min+。

C. 公式：超氧阴离子自由基清除率 ( % )= (A₀- A_S) / A₀或1- A_S/ A₀

（3）总还原力的测定法

A.取用10ml EP管。吸取1ml待测液（空白组用蒸馏水），依次加入2.5ml 0.2ml/L的PBS（pH=6.6）溶液和2.5ml 1%的铁氰化钾溶液。

B.混合溶液置于50℃水浴锅保温20min。

C.加入2.5ml 10%的三氯乙酸。

D.若产生浑浊，则将混合液于室温3500r/min离心10 min，吸取2.5ml上清液，后吸取2.5ml 纯水。若不产生沉淀，则直接吸取2.5ml上清液，加入2.5ml纯水。

E.最后加入0.5ml 0.1%的FeCl₃溶液，混匀反应10min。

吸取300ul，于波长700nm下测其吸光度，吸光度与还原能力成正比；

5、试验结果

见表1-表3。

表1DPPH自由基清除率

表2超氧阴离子自由基清除率

表3总还原力

由表1-表3的结果可以清楚的看到，采用本发明方法提取的抗氧化提取物在DPPH自由基清除率，超氧阴离子自由基清除率和总还原力上具备更高的活性，明显优于根霉组、米曲霉组以及单纯乙醇提取组。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种利用微生物从大麻花叶中提取抗氧化成分的方法，其特征在于，将茯苓和/或灵芝制备种子液，将种子液中的菌体接种至大麻花叶或提取CBD后的大麻花叶废渣中进行培养，培养至菌丝长满后加入乙醇进行醇提，所得的醇提液为抗氧化提取物；

所述培养为在20-30℃下恒温培养；

所述醇提在50-70℃下提取，所述乙醇为≥50%浓度的乙醇。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述种子液为二级种子液。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述制备种子液的培养基为：

葡萄糖20g/L，发酵麦芽浸粉20g/L，大豆蛋白胨1g/L，发酵酵母浸粉1g/L，硫酸镁0.05g/L，磷酸二氢钾0.1g/L。

4.权利要求1-3任意一项所述方法提取的抗氧化提取物。