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CN111417714A - 营养性组合物及其相关方法 - Google Patents

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CN111417714A
CN111417714A CN201880070181.1A CN201880070181A CN111417714A CN 111417714 A CN111417714 A CN 111417714A CN 201880070181 A CN201880070181 A CN 201880070181A CN 111417714 A CN111417714 A CN 111417714A
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CN
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organism
feed
nutritional composition
fermentation
phb
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Application number
CN201880070181.1A
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保罗·S·珀尔曼
乌戈·费德里戈·奎托·罗哈斯
加里·史密斯
格雷戈里·S·柯比
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Invista Textiles UK Ltd
Original Assignee
Invista Textiles UK Ltd
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Publication date
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Abstract

本发明提供了含有具有减弱的或无聚(3‑羟基丁酸酯)产生的生物体的营养性组合物。这些营养性组合物可用作饲料，诸如用于反刍动物、非反刍动物和水产养殖等的动物饲料和饲料添加剂。提供了用于产生这些生物体的材料和方法。

Description

营养性组合物及其相关方法
本专利申请要求2017年10月31日提交的美国临时申请序列号62/579,507的优先权权益，该美国临时申请的教导内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明提供了营养性组合物，该营养性组合物含有最初能够产生聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)的生物体，该生物体已被修饰以减弱或消除PHB产生，这些营养性组合物可用作例如营养物、饲料和/或饲料添加剂。提供了用于产生这些在营养性组合物以及饲料和饲料添加剂中使用的生物体的方法。
背景技术
聚(羟基链烷酸酯)(PHA)在大量原核生物中积累，并用作碳和能量的细胞内储存化合物。由于PHA的热塑性和生物降解能力，PHA在工业和医学中具有各种应用。
例如，在过去的几十年中一直在考虑单细胞蛋白质(SCP)，即产生PHA的旨在用作食品或原料的微生物细胞材料和生物体。参见例如Kihlberg,R.Annual Review ofMicrobiology 1972 26:427-466和美国专利6,207,217。
由产生PHA的微生物(诸如钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)，先前被称为富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha))制成的单细胞蛋白质作为动物饲料中的组分已被研究了许多年(Egers,J.和Steinbuchel，A.Applied Environmental Microbiology 2014 80(24):7702-7709以及Raberg等人PLOS ONE 2014 9(5):e95907)。
然而，此类生物体尚未被用作饲料，因为最经常发现的PHA聚合物是很少能被消化并且提供很少乃至不提供营养价值的聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)。PHB组分还降低生物体的蛋白质含量。此外，细胞质中的非营养性PHB储存化合物会占用物理空间，从而为营养性化合物留下较少的空间。此外，在一些情况下，PHB组分对生物功能(诸如消化系统过程)具有有害影响。
在由Boon(美国专利8,603,518)和Nonato(WO 2015149147)进行的最新工作中，显示向饲料混合物中添加PHB解聚酶可导致PHB的可消化性增加。然而，这些饲料混合物的总蛋白质含量仍然降低。
Kunasundari等人(PLOS ONE 2013 8(10):e78528)公开了PHA的生物回收方法，该方法形成了联合协同进料以及从钩虫贪铜菌(C.necator)H16的冻干细胞中纯化和分离PHA颗粒的基础。
WO2018/106549公开了用于产生在饲料和营养补充组合物中使用的PHB和蛋白质的微生物和方法。
需要替代方法来解决基于生物体的营养性组合物和饲料混合物中的PHB问题。
发明内容
本发明的一个方面涉及营养性组合物，该营养性组合物包含最初能够产生聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)的生物体，其中该生物体具有减弱的和/或无PHB产生。
在一个非限制性实施方案中，营养性组合物的生物体不包含外源核酸。在一个非限制性实施方案中，营养性组合物的生物体具有除phasin修饰之外的对phaCAB操纵子酶中的一种或多种的至少一种修饰。在一个非限制性的实施方案中，通过除phasin修饰之外消除或减弱一种或多种phaCAB操纵子酶的活性来减弱或消除生物体中PHB产生。在一个非限制性实施方案中，营养性组合物的生物体是钩虫贪铜菌。在一个非限制性实施方案中，具有减弱的PHB产生的营养性组合物的生物体产生不可检测的PHB。
在一个非限制性实施方案中，该营养性组合物的单细胞蛋白质与不具有该生物体的营养性组合物的单细胞蛋白质相比具有更高浓度的种氨基酸、寡肽、多肽或它们的衍生物。在一个非限制性实施方案中，该营养性组合物与不具有该生物体的营养性组合物相比具有更高粗蛋白质含量。在一个非限制性实施方案中，生物体中的粗蛋白质是生物体质量的至少40％至70％。
本发明的另一方面涉及包含这些营养性组合物的饲料和饲料添加剂。在一个非限制性实施方案中，营养性组合物以按饲料或饲料添加剂的重量计至少10％至30％的水平掺入。
本发明的另一方面涉及产生用于这些营养性组合物和饲料/饲料添加剂的生物体的方法。在这些方法中，用具有减弱的和/或无PHB产生的生物体接种发酵原料。在一个非限制性实施方案中，营养性组合物的生物体不包含外源核酸。在一个非限制性实施方案中，营养性组合物的生物体具有除phasin修饰之外的对phaCAB操纵子酶中的一种或多种的至少一种修饰。在一个非限制性的实施方案中，通过除phasin修饰之外消除或减弱一种或多种phaCAB操纵子酶的活性来减弱或消除生物体中PHB产生。在一个非限制性实施方案中，营养性组合物的生物体是钩虫贪铜菌。然后在导致生物体生长和/或增殖的条件下培养接种后的生物体，之后从发酵原料中分离或收获生物体。可使用液体发酵或气体发酵。在一个非限制性实施方案中，使用混合营养发酵条件。在一个非限制性实施方案中，该方法还包括将分离的生物体掺入到饲料或饲料添加剂中。
本发明的另一方面涉及通过饲喂动物本发明的饲料或饲料添加剂来改善牲畜或水产养殖动物的生存能力的方法。
本发明的另一方面涉及用于减少来自商业操作的一种或多种废产物的方法。在该方法中，使最初能够产生聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)的生物体在该一种或多种废产物中生长，其中该生物体具有减弱的和/或无PHB产生。在一个非限制性实施方案中，该生物体不包含外源核酸。在一个非限制性实施方案中，该生物体具有除phasin修饰之外的对phaCAB操纵子酶中的一种或多种的至少一种修饰。在一个非限制性实施方案中，该生物体是钩虫贪铜菌。然后收获生物体并将其掺入到饲料或饲料添加剂中。
本发明的另一方面涉及用于产生单细胞蛋白质的方法。该方法包括选择能够产生聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)的生物体，并且除phasin修饰之外消除或减弱该生物体中的一种或多种phaCAB操纵子酶的活性。
附图说明
图1是用于在钩虫贪铜菌基因组中产生DNA序列的缺失、置换或插入的重组等位基因构形的图示。等位基因可被认为具有3个部分；“A”、“B”和“C”。如果由“A”和“C”表示的DNA序列在重组等位基因与天然等位基因之间是相同的，则由“B”表示的序列可被删除(以生成基因“敲除”)或(用由“01”表示的序列)置换。另选地，可在“A”与“B”之间插入非天然序列(由“01”表示)。
图2是示出当用蛋白酶K预处理富含蛋白质的培养基BSA时钩虫贪铜菌H16ΔphaCABΔΗ16_Α0006-9菌株的生长增加的图。
图3A、图3B和图3C示出聚羟基丁酸酯(PHB)在钩虫贪铜菌H16野生型细胞(图3A)中积累，并且在钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB(图3B)和钩虫贪铜菌H16 PHB4菌株(图3C)中无聚羟基丁酸酯(PHB)积累。
具体实施方式
本发明涉及营养性组合物。此类营养性组合物适用于例如饲料和饲料添加剂。
如本文所用，术语“饲料”或“饲料组合物”或“饲料添加剂”是指适于或旨在被动物摄取的任何化合物、制剂、混合物或组合物。
如本文所用，术语“营养性”或“营养性组合物”表示诸如在饲料、饲料组合物或饲料添加剂中作为营养组分的有用性。营养性组合物可用作完全动物饲料(饮食)或用作动物饲料的补充剂。
术语“动物”包括所有动物，包括人。动物的示例是非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括例如动物，诸如绵羊、山羊和家牛(例如牛，诸如肉牛和奶牛)。该动物也可以是非反刍动物。非反刍动物包括宠物动物，例如马、猫和狗；单胃动物，例如猪或生猪(包括但不限于小猪、生长猪和母猪)；家禽，诸如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉鸡、蛋鸡)；鱼(包括但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼)；以及甲壳类动物(包括但不限于虾和对虾)。
如本文所用，术语“水产养殖”是指作为食物的水生动物的饲养。
本发明的营养性组合物包含生物体或来源于生物体的SCP，该生物体最初能够产生聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)但具有减弱的和/或无PHB产生。具有减弱的和/或无PHB产生的生物体可经由基因工程、通过适应性突变或通过选择性分离不产生PHB的天然存在的突变菌株来获得。在一个非限制性实施方案中，该生物体不包含外源核酸。适用于本发明的方法在例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版编辑，第1、2和3卷，J.F.Sambrook和D.W.Russell编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001中有所描述。
用于本发明营养性组合物中的最初能够产生PHB的生物体的非限制性示例包括来自变形杆菌属的原核生物，诸如贪铜菌(Cupriavidus)、罗尔斯通氏菌(Ralstonia)和红细菌(Rhodobacter)。在一个非限制性实施方案中，该生物体选自钩虫贪铜菌或浑球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。在一个非限制性实施方案中，该生物体是钩虫贪铜菌。
在一个非限制性实施方案中，通过修饰使菌株能够产生PHB的phaCAB操纵子酶中的一种或多种来减弱或消除该生物体中的PHB产生。在一个非限制性实施方案中，该生物体是ΔphaCAB H16钩虫贪铜菌菌株。在一个非限制性实施方案中，该生物体是PHB菌株。在一个非限制性实施方案中，PHB菌株是由phaC中的G320A点突变产生的。
所谓phaCAB操纵子酶，它旨在包括酶phaA、phaB和phaC。在一个非限制性实施方案中，该生物体具有除phasin修饰之外的对phaCAB操纵子酶中的一种或多种的至少一种修饰。如本文所用，所谓“修饰”旨在包括在编码phaA、phaB或phaC的一个或多个基因中的基因缺失、基因置换或基因插入。可使用各种修饰方法。
在一个非限制性实施方案中，通过等位基因交换进行修饰。在该实施方案中，通过等位基因交换(也称为等位交换)在生物体(诸如钩虫贪铜菌)中进行基因组编辑。在一个非限制性实施方案中，该生物体是使用等位基因交换生成的ΔphaCAB H16钩虫贪铜菌菌株。
在一个非限制性实施方案中，通过化学诱变进行修饰。在一个非限制性实施方案中，PHB-钩虫贪铜菌菌株是通过化学诱变生成的。在一个非限制性实施方案中，化学诱变用于产生在phaC中具有G320A点突变的PHB菌株。
术语“等位基因”通常与术语“基因”互换使用，更一般地，是指限定的基因组基因座。在等位基因交换中，将生物体的基因组中的特定DNA序列段(即天然等位基因)照字面意义交换为重组/突变/合成的DNA序列段(即重组等位基因)。根据重组等位基因的性质，这可能导致基因缺失、基因置换或基因插入(参见图1)。
在一个非限制性实施方案中，重组/合成的等位基因可经由基因合成和/或标准分子生物学技术构建。然后将它们克隆到质粒载体中，该质粒载体用于转移到生物体中并执行等位基因交换程序。在一个非限制性实施方案中，质粒载体包含DNA序列，该DNA序列包括赋予生物体选择性优势的正选择基因(诸如抗生素抗性)以及在选择时消除或抑制宿主生物体生长的负或反选择基因(诸如胸苷激酶)。这些选择基因促进等位基因交换程序的执行。在该程序结束时，质粒载体没有任何部分保留在宿主细胞内。因此，当经修饰的等位基因被传递到子代细胞时，质粒载体没有任何部分被传递。
在一个非限制性实施方案中，该营养性组合物的SCP与不具有该生物体的营养性组合物的单细胞蛋白质相比具有更高浓度的氨基酸、寡肽、多肽或它们的衍生物。因此，与具有未经修饰的生物体的组合物相比使用本发明的生物体可提供具有更高浓度的氨基酸、寡肽、多肽或它们的衍生物的营养性组合物。此外，可使用较少的SCP或本发明的经修饰的生物体来制备浓度类似于具有未经修饰的生物体的组合物的营养性组合物。
在一个非限制性实施方案中，营养性组合物中使用的生物体具有大于40％的总氨基酸水平。在另一个非限制性实施方案中，总氨基酸水平大于50％。在另一个非限制性实施方案中，总氨基酸水平大于60％。在另一个非限制性实施方案中，总氨基酸水平大于70％。在另一个非限制性实施方案中，总氨基酸水平大于75％。在又一个实施方案中，总氨基酸水平大于80％。
在一个非限制性实施方案中，本发明的生物体与未经修饰的相似生物体相比提供具有更高量的总氨基酸的营养性组合物。在另一个非限制性实施方案中，可使用较少的本发明生物体提供具有与含有未经修饰的类似生物体的组合物相似的总氨基酸水平的营养性组合物。
在一个非限制性实施方案中，本发明单细胞蛋白质的总氨基酸水平出乎意料地比以仅PHB水平成比例降低所预期的增加至少10％、20％或甚至30％更多。
本发明的经修饰的生物体与未经修饰的生物体相比表现出更高量的蛋白质。因此，本发明的生物体可提供与具有未经修饰的生物体的组合物相比具有更高量的蛋白质的营养性组合物。在一个非限制性实施方案中，粗蛋白质水平比以仅PHB水平成比例降低所预期的增加至少10％、20％或甚至30％更多。在一个非限制性实施方案中，如通过总氮所估计的，营养性组合物中使用的生物体具有大于40％蛋白质的粗蛋白质水平。在另一个非限制性实施方案中，如通过总氮所估计的，粗蛋白质水平大于50％蛋白质。在另一个非限制性实施方案中，如通过总氮所估计的，粗蛋白质水平大于60％蛋白质。在另一个非限制性实施方案中，如通过总氮所估计的，粗蛋白质水平大于70％蛋白质。在另一个实施方案中，如通过总氮所估计的，粗蛋白质水平大于75％蛋白质。在又一个非限制性实施方案中，如通过总氮所估计的，粗蛋白质水平大于80％蛋白质。在一个非限制性实施方案中，本发明的生物体与未经修饰的相似生物体相比提供具有更高量的蛋白质的营养性组合物。在另一个非限制性实施方案中，可使用较少的本发明生物体提供具有与含有未经修饰的类似生物体的组合物相似的蛋白质水平的营养性组合物。存在测量生物体中的总氮的许多方法。一个非限制性示例是凯氏定氮法(参见带有扩展名//people.umass.edu/～mcclemen/581Proteins.html的https)，其中氮％通过乘以N因子来计算粗蛋白质含量。虽然可使用各种N因子，但在本发明中，乘数是6.25的N因子。
本发明还涉及用于产生在这些营养性组合物中使用的SCP的方法。在一个非限制性实施方案中，该方法包括选择能够产生聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)的生物体，并且除phasin修饰之外消除或减弱该生物体中一种或多种phaCAB操纵子酶的活性。不受任何理论的约束，据信维持phasin可操作的实施方案为生物体提供了生物学优势。
可使用各种方法来产生用于本发明的营养性组合物的生物体。
在一个非限制性实施方案中，生物体经由在生物体生长和/或繁殖的条件下发酵来产生。例如，对于好氧生物体诸如贪铜菌，该生物体可在室温下在6.4至6.8的pH条件下利用通过搅拌/机械方式或通过回路或气升反应器混合来培养。然而，如本领域技术人员在阅读本公开后将理解的，此类示例性发酵条件绝不限制本发明，并且本领域技术人员常规确定的替代发酵条件可用于各种生物体。
在一个非限制性实施方案中，发酵以分批模式进行。
在一个非限制性实施方案中，发酵以补料分批模式进行。
在另一个非限制性实施方案中，发酵以连续模式进行。
在一个非限制性实施方案中，生物体经由液体发酵产生。在一个非限制性实施方案中，液体发酵利用可被生物体发酵或代谢的一种或多种进料组分。进料组分的非限制性示例包括糖、甘油、果糖、脂肪酸、羧酸、单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸和甲酸、氨基酸、蛋白质、甘油三酯、农业废弃物、浓缩蒸馏器的可溶物或城市废弃物、醇和/或作为原料的其他可溶性组分。在一个非限制性实施方案中，用于液体发酵的原料来源于较低价值的副产物或来自商业操作的废产物。在一个非限制性实施方案中，用于液体发酵的原料来源于乙醇稀釜馏物料流。在一个非限制性实施方案中，用于液体发酵的原料来源于食用油。
在另一个非限制性实施方案中，生物体在利用包含可被生物体发酵或代谢的一种或多种进料组分的气态原料的气体发酵中产生。进料组分的示例包括但不限于化学或石油化学工业的一氧化碳、二氧化碳、氢气、甲烷、合成气、乙烷或废弃物料流、或它们的衍生物。在本发明的一方面，生物体使用气体发酵产生，其中所述气体发酵过程包括CO2/H2。
在又一个实施方案中，生物体经由混合营养发酵产生，其中气态和非气态原料被共发酵。
然后，可将由这些生物体产生的本发明的营养性组合物添加到动物饲料中或用作饲料本身。
在一个非限制性实施方案中，经由裂解破坏生物体的细胞膜以改善蛋白质对动物的可用性。可使用机械或化学裂解。
在一个非限制性实施方案中，该生物体是无活性的、非复制性的或不可生存的。在一个非限制性实施方案中，这经由在例如60℃下巴氏灭菌30分钟来实现。然而，如本领域技术人员在阅读本公开后将理解的，可使用替代方法。
在一个非限制性实施方案中，将营养性组合物以大于按动物饲料的重量计的10％掺入到动物饲料中。在另一个非限制性实施方案中，将营养性组合物以大于按动物饲料的重量计的20％掺入到动物饲料中。在又一个非限制性实施方案中，将营养性组合物以大于按动物饲料的重量计的30％掺入到动物饲料中。
动物饲料可用于饲喂非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括例如动物，诸如绵羊、山羊和家牛(例如牛，诸如肉牛和奶牛)。该动物也可以是非反刍动物。非反刍动物包括宠物动物，例如马、猫和狗；单胃动物，例如猪或生猪(包括但不限于小猪、生长猪和母猪)；以及家禽，诸如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉鸡、蛋鸡)。
动物饲料也可用于鱼(包括但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼)的水产养殖；以及甲壳类动物(包括但不限于虾和对虾)，
以下部分提供了本发明的方法和组合物的进一步说明。这些工作实施例仅是说明性的，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1
使三种菌株在相同的实验条件下生长以比较它们的PHB水平。这三种菌株是钩虫贪铜菌H16野生型、钩虫贪铜菌H16ΔphaCABΔA0006-9(如已公布的申请US20180100160中所述，该申请据此全文以引用方式并入)和钩虫贪铜菌H16 PHB4-(参见Schlegel等人ArchMikrobiol 1970 71:283-294)。将三种菌株在培养基1(参见表1)中于30℃、220rpm和6.6的起始pH下生长24小时。测量600nm处的光密度(OD600)，并制备合适的接种体积以允许在随后的Ambrl5F实验(简而言之，设计为积累足够的生物质用于下游氨基酸分析的氮限制补料分批培养)中起始ODD600为0.2。
在Sartorius Ambr15f微发酵系统上运行每种菌株的八个容器。将7.7ml的初始总体积(培养基2(参见表1)并且包含上述接种体积)在30℃、1500rpm和维持在10％的目标溶解氧浓度(DO)(通过在1500rpm下固定搅拌并且根据需要以0.1ml/min至可能的60ml/min通气来实现和维持)下温育。经由添加10％wv KOH和10％vv H2SO4将pH保持在6.6。
允许培养物以分批操作模式积累，直至达到初始氮限制(可观察到DO的峰值，并在稍后经由铵测定确认)，此时以1.5μ/min的速率开启进料48小时，进料总体积为4.32ml的培养基3(参见表1)。
在生长完成后，将每种菌株的所有8个容器合并成单一体积，进行巴氏灭菌(65℃，30分钟)、离心(4000rpm，30分钟)并保留细胞沉淀。将细胞沉淀冷冻干燥48小时(-60℃和120mTor)并送去分析。
表1
组分 培养基1g/L 培养基2g/L 培养基3g/L
果糖 12 19.15 141.89
次氮基三乙酸 0.15 0.15 0.15
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 1.4 0.51 2.97
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 0.94 0.34 1.98
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 3.365 3.37 19.63
MgSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O 0.5 0.5 0.5
CaCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>O 0.01 0.01 0.01
NH<sub>4</sub>(Fe-II)SO4 0.05 0.05 0.05
痕量金属溶液(参见表12A) 10 10 10
消泡剂204 - 0.5 0.5
使用LC-MS进行PHB水平分析。使用其他标准方法(诸如GC-FID气相色谱-火焰离子化检测器)也获得了类似的结果。LC-MS参数如表2所示。
表2
Figure BDA0002469470490000101
Figure BDA0002469470490000111
Figure BDA0002469470490000112
Figure BDA0002469470490000113
分析显示，钩虫贪铜菌H16ΔphaCABΔΑ0006-9和钩虫贪铜菌H16PHB4-菌株缺乏聚羟基丁酸酯(PHB)积累。玻片通过如下制备：将1％琼脂糖溶于水中，向玻片添加100μl热琼脂糖，将盖玻片置于琼脂糖顶部以使其铺展成薄层并使琼脂糖固化。使用来自扩展名为万维网.org/e2748的生物方案改编的方案，使用尼罗红对细胞PHB进行染色。将1ml过夜培养物在12400rpm下离心2min，并重悬于～50μl上清液或水中。将4μl细胞悬液添加到1μl尼罗红(10μg/ml)中。将玻片上的琼脂糖垫上的盖玻片移除，并将1.5μl染色的细胞悬浮液添加到琼脂糖垫上。将新的盖玻片置于细胞上，并在100X显微镜下用DsRed滤镜观察细胞。
结果示于表3以及图3A、图3B和图3C中。
表3
Figure BDA0002469470490000121
wt％PHB：wt％干细胞wt
氨基酸数由美国俄勒冈州Boring的氨基酸分析服务实验室公司分析，并示于表4中。
表4
Figure BDA0002469470490000122
Figure BDA0002469470490000131
实施例2：野生型钩虫贪铜菌H16
在操作员的连续模式下，使野生型钩虫贪铜菌H16菌株在总共6个1L连续搅拌槽反应器(CSTR)中生长。使野生型钩虫贪铜菌H16在培养基1(参见表5)中于30℃、220rpm和6.6的起始pH条件下生长24小时。测量600nm处的光密度(OD600)，并制备合适的接种体积以允许在随后的1L实验中(设计为积累足够的生物质用于下游分析的短氮限制的连续培养中)起始OD600为0.2。
运行六个容器，每个容器的总体积为0.8L(培养基2(参见表5)并且包含上述接种体积)，并在30℃、500rpm和维持在30％的目标溶解氧浓度(DO)(通过搅拌级联达到1500rpm和0.15vvm的固定通气来实现和维持)下温育。经由添加10％wv KOH和10％vv H2SO4将pH保持在6.6。培养物分批生长直至达到果糖限制(可观察到DO的峰值)，此时开启两种进料，每种速率为20g/h(培养基3和4-参见表5)。还开启排放，将泵送速率与设定的平衡相联系，以保持0.8Kg的净重(注意，平衡经校准仅考虑初始培养基的重量)。在40g/h进料下，总共实现0.05h-1的稀释速率。每天收获源于排放管线的培养废弃物(约960g/天/容器)并合并。
表5
组分 培养基1g/L 培养基2g/L 培养基3g/L 培养基4g/L
果糖 12 13.83 - 160
次氮基三乙酸 0.15 0.15 0.3 -
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 1.4 0.55 4.24 -
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 0.94 0.37 2.82 -
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 3.365 3.37 28 -
MgSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O 0.5 0.5 1 -
CaCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>O 0.01 0.01 0.02 -
NH<sub>4</sub>(Fe-II)SO4 0.05 0.05 0.1 -
痕量金属溶液(参见表12A) 10 10 20 -
消泡剂204 - 0.5 1 -
将细胞巴氏灭菌(65℃，30分钟)，离心(4000rpm，30分钟)并保留细胞沉淀。将细胞沉淀冷冻干燥48至96小时(-60℃和120mTor)，并与前几天的沉淀共混，直到获得>1.5Kg的净干燥的细胞生物质。在共混后，将小部分所得生物质送去分析。收集用于蛋白质分析和氨基酸谱分析的样品并进行分析，以得到基于干重的相对％重量氨基酸，AA(氨基酸的WT％/总氨基酸的WT％)氨基酸。在密苏里州哥伦布市密苏里大学的实验站化学实验室根据氨基酸谱代码0002和粗蛋白质/总氮(凯氏)代码0054对样品进行分析。
将氨基酸水平与使用果糖连续发酵生长并分析的钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB菌株的氨基酸水平进行比较。结果示于表6中。结果表明，与野生型钩虫贪铜菌H16相比钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB菌株的总氨基酸含量更高。
表6
Figure BDA0002469470490000141
Figure BDA0002469470490000151
*凯氏粗蛋白质＝(N％)×6.25
实施例3：H16ΔphaCAB钩虫贪铜菌的生成
ΔphaCAB H16钩虫贪铜菌菌株使用等位基因交换如下生成。通过PCR或DNA合成构建具有500-1000bp同源臂的等位基因交换盒，并通过Gibson、CPEC或PvuI限制性酶切消化将其克隆到oriT与sacB盒之间的p(TcColE1oriTsacB)中。通过Sanger测序使用引物BDIPRIM0591(atcgaagagaagcaggacga(SEQ ID NO:1))和BDIPRIM0589(aacggcaggtatatgtgatgg(SEQ ID NO:2))确认插入物的完整性。将质粒通过电穿孔转移到大肠杆菌(E.coli)中，并且随后通过缀合转移到钩虫贪铜菌中。在补充了适当抗生素的确定成分/基本培养基上选择钩虫贪铜菌转移接合子/单个交叉整合体。将平板温育，并且随后在温育几天后检查单个交叉整合菌落。
挑取多个克隆，并重新划线至纯净。然后将单个克隆挑取到1ml TSB培养基中，不进行抗生素选择，并且培养以允许发生第二次重组事件。然后将培养物的等分试样铺板并选择双交叉克隆。随后通过PCR、Sanger测序和适当的表型测试鉴别和确认重组克隆。
实施例4：由澄清乙醇稀釜馏物制备的钩虫贪铜菌的单细胞蛋白质的氨基酸含量
在50mL烧瓶中将1mL的ΔphaCAB H16钩虫贪铜菌菌株接种到25mL的1:4稀释的澄清乙醇稀釜馏物中于30℃和200rpm下温育24h。该乙醇稀釜馏物包含2.61g/kg乳酸；乙酸0.41g/kg；葡萄糖0.73g/kg；和甘油18.3g/kg。
随后，将该50mL烧瓶中的20mL接种到280mL的1:4稀释的乙醇稀釜馏物中，并在1L烧瓶中于37℃和200rpm下温育24h。使用该第二烧瓶的总共300mL在发酵罐中接种2.7kg过滤灭菌的糖浆(1:4稀释)。
使用表7中列出的操作条件和阶段运行分批发酵过程。为了控制生物反应器的pH，从过程开始就用恒定pH的酸和碱控制来维持pH(pH 6.6±0.05)。为了控制pH，使用1mol/kgKOH和10％(w/w)H2SO4(酸)的灭菌(0.2μm)溶液。
表7：
参数 分批阶段
温度 37℃
级联下搅拌以控制DO 500rpm至800rpm
pH 6.6
总质量(包括接种物) 3kg
DO控制器设定点 ≥20％饱和
空气流速(F_AIR) 0.4SLPM
持续时间 54h
在相同条件下使用H16钩虫贪铜菌野生型菌株运行平行生物反应器。
在发酵过程之后，将生物反应器的内容物离心并收获沉淀。沉淀中的氨基酸和蛋白质水平使用众所周知的欧洲药典(Ph.Eur.)的标准氨基酸分析方案进行分析。分析结果示于表8。在该表中，样品ID的F是指发酵罐的数量，而T是指发酵罐接种与收获样品用于分析之间的小时数。
表8：
Figure BDA0002469470490000161
Figure BDA0002469470490000171
(1)天冬酰胺和谷氨酰胺在水解期间转化为天冬氨酸和谷氨酸
(2)通过EP 2.2.56修改方法3进行水解
(3)通过EP 2.2.56修改方法1进行水解
(4)NA＝不包括在分析中
实施例5：由合成的澄清稀釜馏物大规模产生用于鱼试验的钩虫贪铜菌的单细胞 蛋白质
如实施例3中所述，H16ΔphaCAB钩虫贪铜菌菌株通过在含8g/L甘油的基本培养基中继代培养而适应在甘油中生长。
在接种含有合成的稀釜馏物的50L发酵罐之前，使用两步种子培养来扩大该菌株的生长。合成的稀釜馏物的组成为：甘油18.3g/kg，乙酸钠0.5575g/kg，葡萄糖0.7275g/kg，乳酸(86.7％)2.5mL/kg，酵母提取物12.5g/kg，KH2PO43.25g/kg，MgSO4·7H2O 1.25g/kg，柠檬酸铁铵11.25mg/kg和消泡剂204 0.1mL/kg。合成的稀釜馏物如下制备：将以下组分完全溶解(按顺序)在去离子水中：甘油、乙酸钠、葡萄糖、乳酸，占最终体积的70％。一旦所有组分完全溶解，就添加KH2PO4、MgSO4·7H2O和柠檬酸铁铵，并且使溶液的体积达到90％，同时确保所有组分已溶解。添加消泡剂，并用10％w/w NH3和10％v/v H2SO4将pH调节至6.60±0.05。使溶液的体积达到最终体积的100％，并使用0.2μm过滤器对溶液进行过滤灭菌。
将49L合成的稀釜馏物过滤灭菌到50L工作体积发酵罐中；培养基的天然pH值接近4.5，使用过滤灭菌的10％w/w NH3和10％v/v H2SO4在槽内进行pH调节(最终pH＝6.6±0.1)。将两个2.8L Fernbach烧瓶的全部内容物作为接种物转移到发酵罐中，至50L的最终工作体积。初始细胞密度被设计为0.2AU/mL<OD600<0-5AU/mL。
用过滤灭菌的10％w/w NH3和10％v/v H2SO4将发酵的pH控制在6.6±0.1。将pO2控制在15％sat以上，100％DOsat是在1巴(绝对压力)下与空气平衡时的溶解氧浓度。通常，如果初始ΟD600～0.5，则发酵在操作36h后结束。关键的过程参数是细胞密度，目标为>8gCDW/kg(OD600～20AU/mL)。分批结束时必须满足的其他过程参数是：％DO>90％sat，并且甘油转化率>95％。一旦达到这些参数，就使用培养物接种主发酵罐。
50L容器继而是两个750L发酵罐的种子。将750L的产生培养基过滤灭菌到每个750L发酵罐中；培养基的天然pH接近4.5，在槽内进行pH调节，使最终pH＝6.6±0.1。将50L发酵罐中的25L用作种子并转移到750L发酵罐中，使总工作体积为775L。
初始细胞密度被设计为OD600～0.8AU/mL，粗略分批长度为约36h。与上述类似，关键的过程参数是细胞密度，目标>8gCDW/kg(OD600～20AU/mL)。用过滤灭菌的10％w/w NH3和10％v/v H2SO4将发酵的pH控制在6.6±0.1。将pO2控制在15％sat以上，100％DOsat是在1巴(绝对压力)下与空气平衡时的溶解氧浓度。
将来自两个750L发酵罐的批次混合在一起并离心。将浓缩的固体巴氏灭菌以提供无生物活性的生物质。
然后将细胞沉淀冷冻干燥并包装，并且然后用于鱼试验。根据本实施例，制备15kg细胞沉淀。
实施例6：钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB单细胞蛋白质(SCP)鱼饲料评估
在鱼中评估钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB单细胞蛋白质的消耗以及氨基酸的可及性和速率。由于肉食性鱼(即鲑鱼)具有最高的蛋白质转化率、需要最高的蛋白质饮食并且对其食物来源的选择性非常严格，因此进行了28天的大西洋鲑鱼饲料可消化性测试。如实施例5中所述制备15kg巴氏灭菌的冷冻干燥钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB单细胞蛋白质(SCP)。
在该可消化性测试中，将12个槽(每个槽含有25条鲑鱼)分成3组，每槽4条。给3组鲑鱼的每个槽中饲喂具有不同含量％的钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB SCP(参考饮食，10％SCP，20％SCP，和30％SCP)的4种饮食之一，并测量它们的重量增加和消化的饲料量。在试验开始时，每条鲑鱼的重量为50g，并且到试验结束时，重量增加到约100g。此外，收集粪便以确定饲喂给鱼的饲料中每种氨基酸的消化部分。收集以下数据：水温、溶解氧、死亡率(如果有的话)、鱼的平均初始和最终体重、每日饲料摄入量、粪便重量。监测饲喂行为和饲料可接受性，以确保鲑鱼适应其新饮食。
根据28天的可消化性研究，钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB SCP(根据实施例5使用合成的稀釜馏饲料作为原料制备)被鲑鱼充分消化，从而显示出比参考饮食更好的生长和优异的氨基酸消化。
与参考饮食相比钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB SCP不仅含有升高水平的蛋白质，而且基于饲料摄入量(FI)和FCR结果(参见表9)，证明其蛋白质和氨基酸具有优异的质量。钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB SCP膳食包含物与FI和FCR之间存在反比关系。FI和FCR值随着SCP包含水平的增加而显著降低。
鱼的存活率为100％，并且表明钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB SCP对大西洋鲑鱼来说是安全成分。
表9
用含有SCP(钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB)的饮食饲喂的大西洋鲑鱼的初始体重(IBW-第0天)和最终体重(FBW-第28天)、体重增加(WG)、热量单位生长系数(TGC)、饲料摄入量(FI)和饲料转化率(FCR)。数据为平均值(标准误差)；基于Tukey检验，没有共同上标的列中的平均值有显着差异(没有上标表示没有差异)。
Figure BDA0002469470490000201
钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB SCP包含物不影响蛋白质的可消化性，在四种实验饮食之间没有观察到差异，如表10所示。在≥20％SCP包含水平下脂质和总能量可消化性均增加。
表10
用含有SCP(钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB)的饮食饲喂大西洋鲑鱼的饮食中干物质(DM)、蛋白质(P)、脂质(L)和总能量(GE)的表观可消化性系数(ADC)。数据为平均值(标准误差)；基于Tukey检验，没有共同上标的列中的平均值有显着差异(没有上标表示没有差异)。
Figure BDA0002469470490000202
在所有四种实验饮食中，十种必需氨基酸的可消化性均保持在或接近90％(表10)。因此，钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB SCP不影响氨基酸的可用性，无论其包含水平如何。尽管获得了统计上不同的可消化性值，但差异是微不足道的，并且最可能是由于氨基酸分析方法的不精确和与可消化性方法相关的典型实验误差。窄的标准误差表明平行测定之间的结果高度一致。
表11中示出了该测试中使用的鱼饲料配方。
表11
Figure BDA0002469470490000211
Figure BDA0002469470490000212
Figure BDA0002469470490000221
实施例7：使用以甘油作为原料的连续模式发酵的生物质产生
在50mL无菌管中使用来自适应在甘油中生长的钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB的200μL浓缩细胞接种10mL的接种培养基(参见表12)加18g L-1甘油，并在30℃、220rpm下温育24h。使用该培养物以0.2AU/mL的初始OD600接种到具有10mL含甘油的新鲜培养基的不同管中。将这些管在30℃、220rpm下温育24h，直至OD600约为2AU/mL。将其中的2×100mL无菌(monoseptically)转移到1L接种烧瓶中，以备接种。
表12
接种培养基(0.2pm过滤灭菌)
组分 浓度 单位
次氮基三乙酸 0.15 g L<sup>-1</sup>
KH2PO4 1.4 g L<sup>-1</sup>
Na2HPO4 0.94 g L<sup>-1</sup>
(NH4)2SO4 3.365 g L<sup>-1</sup>
MgSO4.7H2O 0.5 g L<sup>-1</sup>
CaCl2.2H2O 0.01 g L<sup>-1</sup>
NH4(Fe-II)SO4.6H2O 0.05 g L<sup>-1</sup>
痕量金属溶液(参见表12A) 10 mL L<sup>-1</sup>
表12A
痕量金属原液
Figure BDA0002469470490000222
在两个发酵罐中装入1kg含有14.77g kg-1甘油作为碳源的初始装料(参见表13)，并用100g如上段中所述的种子培养物接种。接种后的OD600为0.2AU/mL。
表13
分批阶段的初始装料(0.2μm过滤灭菌)
组分 浓度 单位
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 0.37 g kg<sup>-1</sup>
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 5.47 g kg<sup>-1</sup>
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.55 g kg<sup>-1</sup>
次氮基三乙酸 0.15 g kg<sup>-1</sup>
NH<sub>4</sub>(Fe-II)SO4.6H2O 0.05 g kg<sup>-1</sup>
MgSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O 0.5 g kg<sup>-1</sup>
CaCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>O 0.01 g kg<sup>-1</sup>
痕量金属溶液(参见表12A) 10 mL kg<sup>-1</sup>
消泡剂204 0.5 mL kg<sup>-1</sup>
接种后，两种发酵都以分批模式进行，其中有氧异养生长直至稳定期(每种发酵都有足够的碳源以维持分批生长24-48h)。监测有氧异养分批生长，并且一旦建立，就以细胞保留模式开始进料，去除渗透物以维持1.1kg的滞留量。
一旦进入稳定期，将两个发酵罐均置于恒化器模式，保留部分细胞，去除渗透物以保持1.1kg的滞留量，从而实现碳限制的有氧异养生长。
两个发酵罐均由两种单独的进料(100g/h的矿物质进料(参见表14)加15g/Kg的甘油以及20g/h的磷酸盐进料(参见表15))补料。通过NH4OH(10％w/w)和10％(v/v)H2SO4调节pH。细胞稀释速率为D＝0.025h-1。
表14
以100gh-1供应无菌矿物质进料(0.2μm过滤灭菌)
Figure BDA0002469470490000231
Figure BDA0002469470490000241
表15
以20gh-1供应无菌磷酸盐进料(0.2μm过滤灭菌)
组分 浓度 单位
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 3 g kg<sup>-1</sup>
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 2 g kg<sup>-1</sup>
收集用于蛋白质分析和氨基酸谱分析的样品并进行分析，以得到基于干重的相对％重量氨基酸，AA(氨基酸的WT％/总氨基酸的WT％)，如表16所示。在密苏里州哥伦布市密苏里大学的实验站化学实验室根据氨基酸谱代码0002和粗蛋白质/总氮(凯氏)代码0054对样品进行分析。
表16
Figure BDA0002469470490000242
Figure BDA0002469470490000251
*凯氏粗蛋白质＝(N％)×6.25
实施例8：使用以果糖作为原料的连续模式发酵的生物质产生
用于该实验的菌株是钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB。与实施例7中的菌株不同，该菌株没有通过在含甘油的基本培养基中继代培养而适应在甘油中生长。
在50mL无菌离心管中，用4×10ml接种培养基(参见实施例7中的表12)加12g L-1果糖接种来自TSB平板的菌落，并在30℃和220rpm下生长24h。
在1L烧瓶中使用该预培养物接种含12g L-1果糖的3×100ml接种培养基(参见实施例7中的表12)至初始OD 600nm为0.2，然后在30℃和220rpm下温育11h以达到最终OD 600nm为～2.2。将其中的二×100mL无菌转移到1L接种烧瓶中，以备接种。向两个1.5L搅拌槽发酵罐中装入1kg含有13.83g kg-1果糖作为碳源的初始装料培养基(实施例7中的表13)，并如上所述接种100g的种子培养物。接种后的OD600为0.2AU/mL。
接种后，两种发酵都以分批模式进行，其中有氧异养生长直至稳定期(每种发酵都有足够的碳源以维持分批生长24-48h)。监测有氧异养分批生长，并且一旦建立，就以细胞保留模式开始进料，去除渗透物以维持1.1kg的滞留量。
一旦进入稳定期，将两个发酵罐均置于恒化器模式，保留部分细胞，去除渗透物以保持1.1kg的滞留量，从而实现碳限制的有氧异养生长。
两个发酵罐均由两种单独的进料(100g/h的矿物质进料(参见实施例7中的表12A)加14g/Kg的果糖以及20g/h的磷酸盐进料(参见实施例7中的表13))补料。用NH4OH(10％w/w)和10％(v/v)H2SO4调节pH。培养物稀释速率为D＝0.05h-1。
收集用于蛋白质分析和氨基酸谱分析的样品并进行分析，以得到基于干重的相对％重量氨基酸，AA(氨基酸的WT％/总氨基酸的WT％)氨基酸，如表17所示。在密苏里州哥伦布市密苏里大学的实验站化学实验室根据氨基酸谱代码0002和粗蛋白质/总氮(凯氏)代码0054对样品进行分析。
表17
Figure BDA0002469470490000261
Figure BDA0002469470490000271
*凯氏粗蛋白质＝(N％)×6.25
实施例9：由气体发酵产生单细胞蛋白质
在连续的碳限制气体(H2、CO2和空气)发酵期间，使钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB菌株的样品化学自养(chemoautolithotrophically)生长。
对这些样品进行总氨基酸含量和氨基酸谱分析，并与从澄清稀釜馏物和其他甘油培养基上异源生长的细胞中分析的样品进行了比较。
使用含1mL已适应在甘油中生长的钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB菌株的甘油小瓶接种到含有25mL的接种培养基(实施例7的表12)加18g L-1甘油的0.25L带挡板烧瓶中。将培养物温育3-4天(30℃，220rpm)至最终OD600为～2.2AU/mL。预期生长速率为0.08h-1。然后将10mL的培养物转移到两个1L含有90mL的接种培养基(来自实施例7的表12)加18g L-1甘油的带挡板烧瓶中。将这些培养物温育20-24h(30℃，220rpm)至细胞密度为～1.6-2.5AU/mL(～0.75g/L)，其中培养物仍处于指数期。预期生长速率为0.12h-1。
在配有两个Rushton涡轮和细胞再循环错流膜系统的2L搅拌槽生物反应器中，将来自两个接种烧瓶的200mL呈指数生长的钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB接种培养物接种到含有14g kg-1甘油作为碳源的1.3L初始装料培养基(实施例7的表13)中，目标OD600为～0.2AU/mL(0.1g/L)。
接种后，发酵以分批模式进行，其中有氧异养生长直至稳定期(甘油耗尽)。最初将总气体进料流量(通气进料速率)设定为0.050SLPM并且将搅拌速率与DO控制器级联以实现30％DO饱和的设定点，直到达到900rpm的初始最大搅拌设定点。
当培养物进入稳定期时，启动H2和CO2进料，并建立自养生长。通过操作员设定的流量比和级联控制的组合来控制单独的进料气体流速(H2、CO2和空气)。调节CO2进料比(CO2进料流量对总气体进料流量)以达到目标CO2％v/v。手动调节O2进料比(空气进料流量对总气体进料流量)，以满足1％至10％(饱和)的溶解氧目标。将总气体进料流量(空气+H2+CO2)级联到具有3％v/v O2的初始设定点和3.5％v/v O2的最大设定点的废气O2浓度控制器以保持低于限制氧气浓度。在实验期间，手动将搅拌设定点提高至并保持在固定的950rpm(最大允许持续速度，而无需担心搅拌器马达损坏)。
启动矿物质和磷酸盐进料，并将CO2进料控制为总气体进料(CO2、H2和空气)的4％v/v。细胞保留率为100％，并且通过渗透物从错流膜中流出将滞留量(系统总体积)维持在1.5L。废气浓度设定点也从3％v/v增加到3.5％v/v。在部分细胞保留模式下，将矿物质进料设定为0.148L h-1，并且将磷酸盐进料设定为0.045L h-1；启动培养物排放(废弃物)。在这种模式中，渗透物流速是固定的，而排放流速用于控制反应器滞留水平。细胞稀释速率最初为D＝0.042h-1，并将总气体进料中的CO2控制在4％v/v。
利用所建立的进料速率、渗透物速率和排放速率，将总气体进料中的CO2％从4％v/v降低到2％v/v以实现碳限制。首先将矿物质进料速率增加到0.163L h-1，然后将其调节至0.158L h-1。也将磷酸盐进料调节至0.036L h-1。通过调节渗透物速率，将稀释速率D增加到0.05h-1。取全部培养物样品进行冷冻干燥和蛋白质含量及氨基酸分析；在没有冰的情况下取得初始样品，并且然后在冰上从培养物排放管线取得另一样品。
用100％N2以0.5SLPM从发酵系统中清除所有气体。
由于气体流速不是恒定的，因此很难在该系统中建立稳定状态。发酵入口和出口气体通过micro-GC连续在线监测。离线监测生物质(g L-1)、磷酸(g L-1)和甘油(g L-1)。
表18示出了细胞保留模式的发酵参数设定点的总结。
表18
Figure BDA0002469470490000281
Figure BDA0002469470490000291
表19示出了基于干重的相对重量％氨基酸(氨基酸的WT％/总氨基酸的WT％)氨基酸。在密苏里州哥伦布市密苏里大学的实验站化学实验室根据氨基酸谱代码0002和粗蛋白质/总氮(凯氏)代码0054对样品进行分析。
表19
Figure BDA0002469470490000292
Figure BDA0002469470490000301
*凯氏粗蛋白质＝(N％)×6.25
实施例10：从二手食用油中实验室规模产生钩虫贪铜菌的单细胞蛋白质
钩虫贪铜菌可在有氧条件下利用脂肪酸和油类作为碳源和能源(Verlinden等人2011 AMB Express.11doi:10.1186/2191-0855-1-11,2011；Taniguchi I.等人2003Microbial production of poly(hydroxyalkanoates)from waste edible oils，第5卷：第545-548页，doi:10.1039/b304800b)。一种经济上有吸引力的料流为二手食用油(Nielsen等人，2017 Microbial Biotechnology，第10卷，第6期，第1338-1352页，doi:10.1111/1751-7915.12776)，并且已证明钩虫贪铜菌可有效地使用这些料流来制备PHB(Obruca等人，2014 Appl.Microbiol.Biotechnol.第98卷：第5883-5890页，doi:https://doi.org/10.1007/s00253-014-5653-3)。
因此，进行了一项研究以评估使用钩虫贪铜菌以二手食用油作为发酵原料产生单细胞蛋白质(SCP)的可行性。测试分批和补料分批发酵条件，以获得足够的生物质以用于蛋白质含量和氨基酸谱分析。
使如先前实施例中所使用的钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB菌株适应在甘油中生长。
在50mL无菌管中，使用来自钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB菌株培养物的200μl浓缩细胞接种10mL的接种培养基加18g L-1甘油(参见实施例7中的表12)，并在30℃、220rpm下温育24h。使用该培养物以0.2AU/mL的初始OD600接种到具有10mL含甘油的新鲜培养基的不同管中。将这些管在30℃、220rpm下温育24h，直至OD600约为2AU/mL。
使用预培养管在1L烧瓶中接种100mL含甘油的新鲜培养基至起始OD600为0.2AU/mL，使烧瓶生长约40h至最终OD600为2AU/mL，此时以1:10的比率接种发酵罐至初始OD600为0.2AU/mL。实验在发酵单元中进行，每个单元都装载有700g初始装料培养基加14.77g kg-1的作为碳源的甘油(参见实施例7中的表13)并用70g接种物接种。
在所有情况下，将温度控制设定为30℃，并且测量pH并用过滤灭菌(0.2μm)的10％w/w NH3和10％v/v H2SO4将其控制在6.6±0.05。在发酵过程期间，测量溶解氧(％DOsat)并将其控制在30％DOsat以上；100％DOsat是在1巴(绝对压力)下与空气平衡时的溶解氧浓度。通过使搅拌速度在582rpm与1500rpm之间级联并且将气流速率保持恒定在0.390SLPM来实现溶解氧控制。
分批阶段的结束以％DOsat的峰值和废气CO2％的突然降低为标志。所有培养物均处于饥饿期以确保完全的初始C源消耗。补料分批阶段运行6h的操作窗口，设计操作以在发酵罐中的总体积为约620g时停止。此时收获发酵罐以获得用于氨基酸分析的样品。在所有情况下，通过同时进料20g/h的矿物质进料和1g/h的高压灭菌的二手食用油开始补料分批；在同时停止两种进料后30min，取出补料分批操作的样品。
在分批和补料分批阶段结束时获得240mL样品。将样品在50mL无菌管中以12000rpm、4℃离心10min。将细胞沉淀在-20℃下储存24h，然后在低于120Torr的压力与-50℃的冷凝阱工作温度下冻干约48h。分析干固体以确定干生物质中的氨基酸和蛋白质含量。
在分批操作和补料分批操作中，氨基酸谱在所测量的不同氨基酸之间的以小于30％变化率变化。该数据指示C-源和操作模式在确定氨基酸谱中起作用。
结果表明，钩虫贪铜菌使用食用油作为唯一碳源，其中计算的生物质收率为0.8gCDW/g油，比生长速率为0.27 1/h，并且生物质产生能力为约1gCDW/kg/h。
在分析氨基酸谱和蛋白质含量之后，可观察到操作模式之间的差异。实验证据表明，在补料分批操作中，蛋白质含量降低，蛋白质含量作为所有氨基酸的总和(g氨基酸/gCDW)在35％和47％之间变化。分批操作似乎一致地产生具有45％蛋白质含量的生物质，与鱼试验中使用的稀釜馏物中的标准批次相当。另一方面，补料分批操作产生具有37％蛋白质含量的生物质。
表20示出了基于干重的相对重量％氨基酸(氨基酸的WT％/总氨基酸的WT％)。在密苏里州哥伦布市密苏里大学的实验站化学实验室根据氨基酸谱代码0002和粗蛋白质/总氮(凯氏)代码0054对样品进行分析。
表20
Figure BDA0002469470490000321
Figure BDA0002469470490000331
*凯氏粗蛋白质＝(N％)×6.25
实施例11：酶预处理(或共处理)以增加复合碳水化合物或蛋白质向SCP转化的用 途
为增加转化效率而进行了进一步缺失的钩虫贪铜菌H16ΔphaCAB菌株(ΔΗ16_Α0006-9)(如已公布的申请US20180100160中所述，其据此全文以引用方式并入)通过在含有葡萄糖的基本培养基中延长温育而适应使用葡萄糖作为唯一碳源生长。
使用来自钩虫贪铜菌H16ΔphaCABΔH16_A0006-9菌株的浓缩细胞接种含有12gL-1葡萄糖的培养基(参见实施例7中的表12)，并在30℃下振荡培养48h。
将这些预培养物各自转移到50mL无菌管中，并离心以沉淀细胞。去除上清液，并在不含额外碳源的20mL新鲜培养基(参见实施例7中的表12)中洗涤沉淀。最后将沉淀重悬于不含碳源或ddH2O的新鲜培养基(参见实施例7中的表12)中，并测量OD600。
研究了钩虫贪铜菌H16ΔphaCABΔH16_A 0006-9菌株在单独基于复合碳水化合物的培养基上生长或用酶预处理以分解复合碳水化合物时的情况。表15示出了所测试的碳水化合物。
碳水化合物-未经处理：
将2X接种培养基(实施例7中的表12)+2％碳水化合物(调节pH并通过0.2μm膜过滤)在30℃下以220rpm温育过夜，然后接种至约OD600为0.4。在选择的容器中等分最终体积的1/2，并添加无菌ddH2O至最终体积。通过OD600监测生长。将条件设置为一式三份，并将误差计算为2xSTDEV。碳水化合物列于表22。
碳水化合物-酶处理：
将2X新鲜培养基+2％碳水化合物+酶(如表14所示)的pH值调节至6.6，通过0.2μm膜过滤，并在30℃、220rpm下温育过夜。首先将淀粉和果胶直接重悬于约500μL浓缩酶中，并且然后添加2X新鲜培养基以调节至所需的最终体积。将250μL该混合物等分到96深孔方板中。将接种物重悬于无菌ddH2O中至OD600约为0.4，并添加到培养板中的混合物中。通过OD600监测生长。将条件设置为一式三份，并将误差计算为2xSTDEV.S
表21：所测试的酶
Figure BDA0002469470490000341
使用未经处理的碳水化合物以及碳水化合物+酶处理的研究结果如下表22所示。
表22
Figure BDA0002469470490000342
Figure BDA0002469470490000351
数据显示，钩虫贪铜菌H16ΔphaCABΔH16_A0006-9不能利用未经处理的复合碳水化合物(二糖和寡糖)作为唯一碳源。然而，当在已进行酶水解以释放单糖的复合碳水化合物上生长时，在某些条件下观察到生长。
然后进行研究以研究钩虫贪铜菌H16ΔphaCABΔH16_A0006-9在进行或不进行蛋白酶处理的基于蛋白质的基底上的生长情况。使用96孔板测量在下列含有所述浓度的蛋白质或氨基酸作为唯一碳源的培养基中的生长：BSA 1％和2％，酪蛋白氨基酸(即酪蛋白酸性水解产物)1％和2％，胰蛋白胨(即酪蛋白酶消化产物)1％和2％，天冬氨酸0.25％和0.125％，谷氨酰胺0.5％和1％，赖氨酸1％和2％以及D-果糖(1％)或D-葡萄糖1％作为阳性对照。将碳源添加到无菌矿物质盐培养基中，并将pH调节至6.6。平板的每个孔均含有100μL培养基，并用钩虫贪铜菌H16ΔphaCABΔH16_A0006-9以～0.1的初始OD600(用读板机测量)接种。
使用10mL Falcon管规格测量在用蛋白酶K预处理的含有2％BSA的培养基中的生长。具体地，将2％BSA的过滤灭菌溶液与蛋白酶K一起温育24h(每2mL BSA溶液100μL蛋白酶K，pH6.6)，用在1％果糖上生长的钩虫贪铜菌H16ΔphaCABΔΗ16_A0006-9的固定阶段培养物接种(起始OD600＝0.1)。还制备了含有未-经预处理的BSA的对照。空白是接种培养基(参见实施例7的表12)加2％BSA，没有接种物。一式三份制备所有样品。
如图2所示，当用蛋白酶K预处理富含蛋白质的培养基BSA时，钩虫贪铜菌H16ΔphaCABΔΗ16_Α0006-9菌株的生长增加。
Figure IDA0002469470550000011

Claims (43)

1.一种营养性组合物，所述营养性组合物包含最初能够产生聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)的生物体，其中所述生物体具有减弱的和/或无PHB产生，其中所述生物体不包含外源核酸，其中所述生物体具有除phasin修饰之外的对phaCAB操纵子酶中的一种或多种的至少一种修饰，并且其中所述生物体是钩虫贪铜菌。
2.根据权利要求1所述的营养性组合物，其中所述生物体与未根据权利要求1进行修饰的生物体相比具有更高浓度的维生素、矿物质、铁、胆固醇、脂肪、脂质、碳水化合物、氨基酸、寡肽、多肽或它们的衍生物。
3.根据权利要求1所述的营养性组合物，其中所述生物体与未根据权利要求1进行修饰的生物体相比具有更高的粗蛋白质含量。
4.根据权利要求1所述的营养性组合物，其中所述生物体经由基因工程、通过适应性突变或通过选择性分离不产生PHB的天然存在的突变株而获得。
5.根据权利要求1所述的营养性组合物，其中在所述生物体的任何发酵之前，所述生物体中的PHB产生被减弱或消除。
6.根据权利要求1所述的营养性组合物，其中通过除phasin修饰之外消除或减弱包含一种或多种phaCAB操纵子酶的活性来减弱或消除所述生物体中PHB产生。
7.根据权利要求6所述的营养性组合物，其中通过除phasin修饰之外的基因缺失、基因置换或基因插入来修饰编码phaCAB操纵子酶的基因，从而消除或减弱一种或多种phaCAB操纵子酶的活性。
8.根据权利要求1所述的营养性组合物，其中所述生物体中的粗蛋白质是所述生物体质量的至少40％。
9.根据权利要求1所述的营养性组合物，其中所述生物体中的粗蛋白质是所述生物体质量的至少50％。
10.根据权利要求1所述的营养性组合物，其中所述生物体中的粗蛋白质是所述生物体质量的至少60％。
11.根据权利要求1所述的营养性组合物，其中所述生物体中的粗蛋白质是所述生物体质量的至少70％。
12.根据权利要求1所述的营养性组合物，其中所述生物体中的粗蛋白质是所述生物体质量的至少80％。
13.根据权利要求1所述的营养性组合物，其中所述生物体中的总氨基酸是所述生物体质量的至少40％。
14.根据权利要求1所述的营养性组合物，其中所述生物体中的总氨基酸是所述生物体质量的至少50％。
15.根据权利要求1所述的营养性组合物，其中所述生物体中的总氨基酸是所述生物体质量的至少60％。
16.根据权利要求1所述的营养性组合物，其中所述生物体中的总氨基酸是所述生物体质量的至少70％。
17.根据权利要求1所述的营养性组合物，其中所述生物体中的总氨基酸是所述生物体质量的至少80％。
18.根据权利要求1所述的营养性组合物，其中所述生物体被机械或化学裂解。
19.根据权利要求1所述的营养性组合物，其中所述生物体被冷冻干燥。
20.根据权利要求1所述的营养性组合物，其中所述生物体是使用等位基因交换生成的ΔphaCAB H16钩虫贪铜菌菌株。
21.根据权利要求1所述的营养性组合物，其中所述生物体是通过化学诱变生成的PHB-钩虫贪铜菌菌株。
22.根据权利要求21所述的营养性组合物，其中化学诱变用于在phaC中产生点突变。
23.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22所述的营养性组合物，所述营养性组合物用于反刍动物和非反刍动物。
24.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22所述的营养性组合物，所述营养性组合物用于水产养殖。
25.一种饲料或饲料添加剂，所述饲料或饲料添加剂包含根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22所述的营养性组合物。
26.根据权利要求25所述的饲料或饲料添加剂，其中所述营养性组合物以按所述饲料或饲料添加剂的重量计至少10％的水平掺入。
27.根据权利要求25所述的饲料或饲料添加剂，其中所述营养性组合物以按所述饲料或饲料添加剂的重量计至少20％的水平掺入。
28.根据权利要求25所述的饲料或饲料添加剂，其中所述营养性组合物以按所述饲料或饲料添加剂的重量计至少30％的水平掺入。
29.一种用于生产饲料或饲料添加剂的方法，所述饲料或饲料添加剂包含根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22所述的营养性组合物，所述方法包括：
使根据权利要求1所述的生物体生长；
收获所述生物体；以及
将所收获的生物体掺入到所述饲料或饲料添加剂中。
30.根据权利要求29所述的方法，其中将所收获的生物体以至少10％的水平掺入到所述饲料或饲料添加剂中。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述生物体经由发酵生长。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述发酵包括液体发酵或半液体发酵。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述液体发酵或半液体发酵利用选自以下的一种或多种进料组分：糖、甘油、脂肪酸、蛋白质、氨基酸、羧酸、单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、农业废弃物、浓缩蒸馏器的可溶物或城市废弃物、醇和/或其他可溶性组分。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述液体发酵或半液体发酵利用乙醇稀釜馏物料流作为进料组分。
35.根据权利要求31所述的方法，其中所述发酵包括气体发酵。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述气体发酵利用选自以下的一种或多种进料组分：化学或石油化学工业的一氧化碳、二氧化碳(CO2)、氢气(H2)、甲烷、合成气、乙烷或废弃物料流、或它们的衍生物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述气体发酵利用CO2/H2。
38.根据权利要求29所述的方法，其中使用混合营养发酵条件。
39.一种用于改善牲畜或水产养殖动物的生存能力的方法，所述方法包括饲喂所述动物根据权利要求25所述的饲料或饲料添加剂。
40.一种用于减少来自商业操作的废产物的方法，所述方法包括：
使最初能够产生聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)的生物体在所述废产物中生长，其中所述生物体具有减弱的和/或无PHB产生，其中所述生物体不包含外源核酸，其中所述生物体具有除phasin修饰之外的对phaCAB操纵子酶中的一种或多种的至少一种修饰，并且其中所述生物体是钩虫贪铜菌；
收获所述生物体；以及
将所收获的生物体掺入到饲料或饲料添加剂中。
41.一种用于产生单细胞蛋白质的方法，所述方法包括选择能够产生聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)的生物体，并且除phasin修饰之外消除或减弱所述生物体中的一种或多种phaCAB操纵子酶的活性。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述生物体是钩虫贪铜菌。
43.根据权利要求41所述的方法，其中没有外源核酸序列被添加到所述生物体中。
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