CN111398020B - 一种机械力对骨影响的研究方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种机械力对骨影响的研究方法，该方法由机械力抵御流失方法和机械力促进骨形成方法构成；其中机械力抵御流失方法，包括以下步骤：⑴配制酸性模拟体液；⑵制备离体骨样本；⑶将离体骨样本固定在机械力装置内并注入酸性模拟体液，然后施加机械力，进行X射线晶体衍射技术分析、谢乐公式计算磷灰石晶体的平均晶粒大小；机械力促进骨形成方法，包括以下步骤：①配制细胞营养液；②制备成骨细胞样本；③将成骨细胞样本固定在机械力装置内并注入细胞营养液，然后施加机械力，提取mRNA、蛋白检测骨形成相关因子的表达水平。本发明操作容易，能够通过计算机控制机械力的施加频率和施加时间，在体外实时观测机械力对骨样本精细结构的影响。
Description
技术领域
本发明涉及骨研究技术领域，尤其涉及一种机械力对骨影响的研究方法。
背景技术
宇航员在太空环境中会遭遇严重的骨丢失，其主要原因是失重条件下骨组织缺少地球引力的刺激所导致的骨流失率大于骨形成率。人在因病卧床或缺乏运动时也会产生骨流失，而举重、跑步等运动产生的冲击力则能够提高骨密度。这些现象都表明力在抵御骨流失和促进骨形成方面具有重要的作用。
德国医学博士Wolff很早就提出了骨骼的机械应变定律，表述为：骨骼的功能是承受活动期间骨组织的机械应变，并具有适应这些功能需要的能力。骨骼的生长会受到力学刺激影响而改变其结构，用之则强，废用则弱。通过X射线晶体衍射技术对骨骼的主要组分-胶原纤维和磷灰石晶体进行精细观测，发现胶原纤维的铺展规律对密质骨的局部应力与应变关系具有重要影响，并且人体骨骼磷灰石晶体的晶粒在0~30岁时比30~80岁时大5~7nm，表明成年后逐渐增加的骨流失能使晶粒变小。此外，成骨细胞的成骨因子RUNX2 和BMP-2能够参与多种细胞因子形成的信号通路，促进成骨性分化和骨基质的合成与分泌，与骨形成密切相关。
人们在力对骨骼的影响方面已经开展了大量的研究。如Souza（Bone, 2005, 37:810-818）等人于2005年以小鼠为实验对象，利用一套带护垫的小杯研究了机械压力对活体骨的影响，发现机械压力促进了小鼠胫骨皮质骨的重建，表明适当的机械压力能够促进骨形成。但是，活体条件下研究骨骼具有很大的局限性，只能通过骨密度测量仪和尿液、粪便中钙离子浓度的变化粗略地观测骨骼的变化并估算钙的吸收量和排放量，很难跟踪骨组织和骨细胞的精细变化过程。因此，研究机械力对骨影响的方法从体内转向体外。Sun（Bone,2012, 50: 581-591）等人于2012年利用固定在光学显微镜上的机械拉力装置实现了离体骨的实时监测，发现机械拉力可以诱导钙离子从骨基质中流出，并刺激成骨细胞的生长，但是这项研究中的装置设计结构复杂、不易实现，既没有涉及机械力在抵御骨流失中的作用，也没有涉及人类活动中经常受到的压力和冲击力对骨骼精细结构的影响。同时，常用的二维平面细胞培养技术很难将机械力传递到成骨细胞，是体外观测机械力对成骨细胞影响的瓶颈。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单的机械力对骨影响的研究方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种机械力对骨影响的研究方法，其特征在于：该方法由机械力抵御流失方法和机械力促进骨形成方法构成；其中
所述机械力抵御流失方法，包括以下步骤：
⑴配制酸性模拟体液：
按质量百分比称取0.7996 % NaCl，0.0350% NaHCO3，0.0224% KCl，0.0228%K2HPO4･3H2O，0.0305 % MgCl2･6H2O，0.0278% CaCl2，0.0071 % Na2SO4，0.6057% (CH2OH)3CNH2，并依次溶解于蒸馏水中，采用浓度为1M的HCl调节pH值至6.40，于115℃蒸汽灭菌20min后置于冰箱冷藏室保存，使用前置于37℃水浴中20 min；
⑵制备离体骨样本：
将一小段打磨平整的新鲜骨块划上几道小口，置于0.5 M 乙二胺四乙酸二钠溶液中室温预处理24 h，即得离体骨样本；
⑶将所述离体骨样本固定在机械力装置内，并注入所述酸性模拟体液，然后施加机械力，在需要观测的时间点取骨块最上端部分，经干燥、灰烬化处理后进行X射线晶体衍射技术分析、谢乐公式计算磷灰石晶体的平均晶粒大小；
所述机械力促进骨形成方法，包括以下步骤：
①配制细胞营养液：
无菌条件下按体积百分比配制含20 %胎牛血清的α-MEM培养基，加入终浓度分别为100U/mL和100μg/mL的青霉素和硫酸链霉素，摇匀后置于冰箱冷藏室保存，使用前置于37℃水浴中20 min；
②制备成骨细胞样本：
将羟基磷灰石含量在10~20 %的多孔磷灰石-壳聚糖支架浸泡于75 %酒精中15分钟，放入培养皿中于无菌条件下自然晾干后备用；
按体积百分比1：9将体外培养的浓度为2~8×107个细胞/mL的成骨细胞悬液与磷酸盐缓冲液配制的2 %低熔点琼脂糖于37℃混匀，倒入所述培养皿中淹没支架，于4℃放置20 min后剔除支架外多余的低熔点琼脂糖，并放入所述细胞营养液中，于37℃预培养24 h，即得成骨细胞样本；
③将所述成骨细胞样本固定在机械力装置内，并注入所述细胞营养液，然后施加机械力，在需要观测的时间点取出，用磷酸盐缓冲液将成骨细胞吹打、分散出来，提取mRNA、蛋白检测骨形成相关因子的表达水平。
所述步骤⑶或所述步骤③中的机械力装置包括置于5% CO2、37℃的培养箱中的步进电机、底座、透明的圆柱形容器、支架以及置于所述培养箱外面的与所述步进电机依次相连接的电机控制器和可编程电源；所述支架上分别设有所述步进电机、活塞和千分尺；所述步进电机通过金属杆连有椭圆形凸轮，该椭圆形凸轮的底部设有所述活塞；所述圆柱形容器的上下面均为开口结构，其侧面上部设有圆形小孔；所述圆柱形容器内设有固定于所述底座上的基座，该基座上固定有骨样本；所述骨样本上设有弹性垫片，该弹性垫片与所述活塞相接；所述电机控制器与计算机的USB接口相连，该计算机安装有与所述电机控制器配套的软件。
所述支架由不锈钢板、不锈钢杆和螺栓连接而成；所述不锈钢板设有圆形窗口，该圆形窗口设有上下移动的所述活塞。
所述活塞上设有橡胶环。
所述弹性垫片为带有小孔洞的弹簧钢薄片。
所述基座设有固定所述骨样本的卡槽。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明中的机械力装置设有千分尺，根据千分尺读数通过调整支架可以精确调节椭圆形凸轮与活塞之间的距离，使椭圆形凸轮的长轴端每次接触活塞时为骨样本提供均匀、稳定的机械力，类似于人类活动中骨骼受到的压力和冲击力。
2、本发明可在需要的时间点取离体骨样本进行X射线晶体衍射技术分析、谢乐公式计算磷灰石晶体的平均晶粒大小，弥补了现有技术不能观测机械力对活体骨骼精细结构影响的缺陷。
3、本发明通过三维立体细胞培养技术，制成了成骨细胞-支架复合体，使机械力能够成功地传递到成骨细胞，解决了机械力难以作用于二维平面细胞的技术难点。
4、本发明可在需要的时间点取成骨细胞样本，提取mRNA、蛋白检测骨形成相关因子的表达水平，实现了体外观测机械力对成骨细胞影响的可能。
5、本发明中圆柱形容器为透明材质，可以从外部直接观察机械力对骨样本的作用过程，侧面上部的圆形小孔可以供容器内外气体的交换和液体的添加。
6、本发明中弹性垫片为带有小孔洞的弹簧钢薄片，其上的小孔洞可以方便液体的流动。
7、本发明结构简单、操作容易，能够通过计算机控制机械力的施加频率和施加时间，不仅为阐明“力能够促进骨形成”提供了可靠的研究方法，而且在开发有效的骨流失防治措施方面具有广阔的应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明中机械力装置的主视图。
图2为本发明中机械力装置的侧视图。
图3为本发明实施例中的离体骨样本的X射线晶体衍射图谱。
图4为本发明实施例中的成骨细胞骨形成相关因子RUNX2、BMP-2的mRNA表达水平。#表示对照结果和机械力结果之间存在显著性差异（p＜0.05）。
图中：1—步进电机；2—椭圆形凸轮；3—活塞；4—弹性垫片；5—千分尺；6—圆柱形容器；7—基座；8—底座；9—支架；10—骨样本。
具体实施方式
一种机械力对骨影响的研究方法，该方法由机械力抵御流失方法和机械力促进骨形成方法构成。其中
机械力抵御流失方法，包括以下步骤：
⑴配制酸性模拟体液：
按质量百分比称取0.7996 % NaCl，0.0350% NaHCO3，0.0224% KCl，0.0228%K2HPO4･3H2O，0.0305 % MgCl2･6H2O，0.0278% CaCl2，0.0071 % Na2SO4，0.6057% (CH2OH)3CNH2，并依次溶解于蒸馏水中，采用浓度为1M的HCl调节pH值至6.40，于115℃蒸汽灭菌20min后置于冰箱冷藏室保存，使用前置于37℃水浴中20 min。
⑵制备离体骨样本：
将一小段打磨平整的新鲜骨块划上几道小口，置于0.5 M 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）溶液中室温预处理24 h，即得离体骨样本。
⑶将离体骨样本固定在机械力装置内，并注入酸性模拟体液，然后施加机械力，在需要观测的时间点取骨块最上端部分，经干燥、灰烬化处理后进行X射线晶体衍射技术分析、谢乐公式计算磷灰石晶体的平均晶粒大小。
机械力促进骨形成方法，包括以下步骤：
①配制细胞营养液：
无菌条件下按体积百分比配制含20 %胎牛血清的α-MEM培养基，加入终浓度分别为100U/mL和100μg/mL的青霉素和硫酸链霉素，摇匀后置于冰箱冷藏室保存，使用前置于37℃水浴中20 min；
②制备成骨细胞样本：
将羟基磷灰石含量在10~20 %的多孔磷灰石-壳聚糖支架浸泡于75 %酒精中15分钟，放入培养皿中于无菌条件下自然晾干后备用；
按体积百分比1：9将体外培养的浓度为2~8×107个细胞/mL的成骨细胞悬液与磷酸盐缓冲液配制的2 %低熔点琼脂糖于37℃混匀，倒入培养皿中淹没支架，于4℃放置20min后剔除支架外多余的低熔点琼脂糖，并放入细胞营养液中，于37℃预培养24 h，即得成骨细胞样本；
③将成骨细胞样本固定在机械力装置内，并注入细胞营养液，然后施加机械力，在需要观测的时间点取出，用磷酸盐缓冲液将成骨细胞吹打、分散出来，提取mRNA、蛋白检测骨形成相关因子的表达水平。
机械力装置包括置于5% CO2、37℃的培养箱中的步进电机1、底座8、透明的圆柱形容器6、支架9以及置于培养箱外面的与步进电机1依次相连接的电机控制器和可编程电源。
支架9上分别设有步进电机1、活塞3和千分尺5；支架9由不锈钢板、不锈钢杆和螺栓连接而成；不锈钢板设有圆形窗口，该圆形窗口设有上下移动的活塞3。活塞3为铝合金材质，其上设有橡胶环。步进电机1通过金属杆连有椭圆形凸轮2，该椭圆形凸轮2的底部设有活塞3；圆柱形容器6的上下面均为开口结构，其侧面上部设有圆形小孔；圆柱形容器6内设有固定于底座8上的基座7，该基座7上固定有骨样本10；基座7设有固定骨样本10的卡槽。骨样本10上设有弹性垫片4，该弹性垫片4与活塞3相接；弹性垫片4为带有小孔洞的弹簧钢薄片（如图1~2所示）。电机控制器与计算机的USB接口相连，该计算机安装有与电机控制器配套的软件。
本发明中机械力装置的工作原理：步进电机1驱动椭圆形凸轮2周期性地作用于活塞3上，千分尺5可调节椭圆形凸轮2与活塞3之间的距离，使椭圆形凸轮2的长轴端压迫活塞3时产生较强的机械力，短轴端与活塞3接触时则没有机械力；活塞3将受到的机械力通过弹性垫片4传递给骨样本10，类似于人类活动中骨骼受到的压力和冲击力。
实施例1 以体外观测机械力对离体骨磷灰石晶体精细结构的影响为例，具体实施方式如下：
【配制酸性模拟体液】
按质量百分比称取0.7996 % NaCl，0.0350% NaHCO3，0.0224% KCl，0.0228%K2HPO4･3H2O，0.0305 % MgCl2･6H2O，0.0278% CaCl2，0.0071 % Na2SO4，0.6057% (CH2OH)3CNH2，并依次溶解于蒸馏水中，采用浓度为1M的HCl调节pH值至6.40，于115℃蒸汽灭菌20min后置于冰箱冷藏室保存，使用前置于37℃水浴中20 min。
酸性模拟体液可以保持离体骨的骨流失状态。
【骨样本制备】
将市场买来的一小段新鲜猪骨剥去表面结缔组织，打磨平整后制成两块质地、大小、形状一样的骨块（长×宽×高约为5cm×1cm×1cm）。在骨块上划几道小口以增加与液体的接触面积，置于0.5 M 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）溶液中室温预处理24 h以形成轻微的骨流失状态并增加骨块承接机械力时的弹性。一块用于观测机械力对离体骨磷灰石晶体精细结构的影响，一块置于相同条件但是不施加用冲击力作为对照。
【操作步骤】
⑴将制备好的骨样本10固定在基座7的卡槽内，使其保持竖直状态。
⑵将圆柱形容器6置于底座8上，使骨样本10置于其中。用透明玻璃胶固定密封圆柱形容器6的底部后，将弹性垫片4、活塞3依次放置在骨样本10上，慢慢注入酸性模拟体液直到浸没骨样本10。
⑶安装支架9，使活塞3置于不锈钢板的圆形窗口中。安装好支架上的步进电机1及其连带的椭圆形凸轮2，并通过千分尺5调节椭圆形凸轮2与活塞3之间的距离，使椭圆形凸轮2的长轴端每次接触活塞3时为骨样本10提供均匀、稳定的机械力。
⑷打开电源，启动计算机，调节好机械力的施加频率和施加时间，开始计时。
【骨样本检测】
在施加机械力60 h 后取骨块最上端部分经干燥、灰烬化处理后，用X射线晶体衍射仪（型号为DRON-4-07，Burevestnik）扫描分析。物相分析使用国际标准JCPDS (JointCommittee on Powder Diffraction Standards)，数据分析由DifWin-1 (Etalon-TC) 软件包完成，得到的骨样本10的X射线晶体衍射图谱如图3所示。同时利用谢乐公式计算磷灰石晶体的平均晶粒大小（L）：
式中：λ是X射线的波长，ϑ是衍射角，β m 是从小晶粒得到的纯衍射谱的线宽，K是晶体形状相关的常数。施加机械力的骨样本10晶粒参数为35 nm，没有施加机械力的骨样本10晶粒参数为27 nm。表明机械力作用能够保持骨组织磷灰石晶体的结构和大小从而有效抵御环境改变造成的骨流失。
实施例2 以体外观测机械力对成骨细胞骨形成相关因子表达变化的影响为例，具体实施方式如下：
【配制细胞营养液】
无菌条件下按体积百分比配制含20 %胎牛血清的α-MEM培养基，加入终浓度分别为100U/mL和100μg/mL的青霉素和硫酸链霉素，摇匀后置于冰箱冷藏室保存，使用前置于37℃水浴中20 min。
细胞营养液可以保持成骨细胞在羟基磷灰石-壳聚糖支架中的细胞活力。
【成骨细胞样本制备】
将两块长×宽×高约为5cm×1cm×1cm的羟基磷灰石含量在10~20 %的多孔磷灰石-壳聚糖支架浸泡于75 %酒精中15分钟，放入直径6 cm的培养皿中于无菌条件下自然晾干后备用。
取10瓶生长良好的小鼠MC3T3-E1成骨细胞（购自中国科学院细胞库），用磷酸盐缓冲液清洗后加入0.05 %胰酶（含EDTA-2Na），37℃消化5 min后用细胞营养液调制成浓度为8×107个细胞/mL的悬液。
取1 mL成骨细胞悬液与9 mL磷酸盐缓冲液配制的2 %低熔点琼脂糖（HyAgaroseTM）于37℃混匀，倒入培养皿中淹没支架，用吸管吸掉多余的气泡。
于4℃放置20 min后剔除支架外多余的低熔点琼脂糖，并放入细胞营养液中，于37℃预培养24 h，即得成骨细胞样本。
取一块成骨细胞样本置于机械力装置内，注入细胞营养液后施加机械力；另一块置于相同条件但是不施加机械力作为对照。
【成骨细胞样本检测】
在施加机械力24 h 后取出成骨细胞样本，用磷酸盐缓冲液将支架中的MC3T3-E1成骨细胞吹打、分散出来，加入Trizol裂解液，冰上放置5 min后-80℃保存。待收集完需要检测的样品，用RT-PCR检测骨形成相关因子RUNX2和BMP-2的表达，以GAPDH作为内参进行校准，采用2-∆∆Ct 方法分析基因表达。
图4给出了MC3T3-E1成骨细胞的骨形成相关因子RUNX2 和BMP-2的mRNA表达水平。在施加机械力的情况下，RUNX2和BMP-2 的mRNA水平分别增加了17.35 %和23.93 %，与没有施加机械力的对照相比具有显著性差异（p＜0.05），表明机械力可以提高成骨细胞中骨形成相关因子的表达，具有促进骨形成的作用。
Claims (5)
1.一种机械力对骨影响的研究方法，其特征在于：该方法由机械力抵御流失方法和机械力促进骨形成方法构成；其中
所述机械力抵御流失方法，包括以下步骤：
⑴配制酸性模拟体液：
按质量百分比称取0.7996 % NaCl，0.0350% NaHCO3，0.0224% KCl，0.0228% K2HPO4･3H2O，0.0305 % MgCl2･6H2O，0.0278% CaCl2，0.0071 % Na2SO4，0.6057% (CH2OH)3CNH2，并依次溶解于蒸馏水中，采用浓度为1M的HCl调节pH值至6.40，于115℃蒸汽灭菌20 min后置于冰箱冷藏室保存，使用前置于37℃水浴中20 min；
⑵制备离体骨样本：
将一小段打磨平整的新鲜骨块划上几道小口，置于0.5 M 乙二胺四乙酸二钠溶液中室温预处理24 h，即得离体骨样本；
⑶将所述离体骨样本固定在机械力装置内，并注入所述酸性模拟体液，然后施加机械力，在需要观测的时间点取骨块最上端部分，经干燥、灰烬化处理后进行X射线晶体衍射技术分析、谢乐公式计算磷灰石晶体的平均晶粒大小；机械力装置包括置于体积浓度为5%CO2、37℃的培养箱中的步进电机（1）、底座（8）、透明的圆柱形容器（6）、支架（9）以及置于所述培养箱外面的与所述步进电机（1）依次相连接的电机控制器和可编程电源；所述支架（9）上分别设有所述步进电机（1）、活塞（3）和千分尺（5）；所述步进电机（1）通过金属杆连有椭圆形凸轮（2），该椭圆形凸轮（2）的底部设有所述活塞（3）；所述圆柱形容器（6）的上下面均为开口结构，其侧面上部设有圆形小孔；所述圆柱形容器（6）内设有固定于所述底座（8）上的基座（7），该基座（7）上固定有骨样本（10）；所述骨样本（10）上设有弹性垫片（4），该弹性垫片（4）与所述活塞（3）相接；所述电机控制器与计算机的USB接口相连，该计算机安装有与所述电机控制器配套的软件；
所述机械力促进骨形成方法，包括以下步骤：
①配制细胞营养液：
无菌条件下按体积百分比配制含20 %胎牛血清的α-MEM培养基，加入终浓度分别为100U/mL和100μg/mL的青霉素和硫酸链霉素，摇匀后置于冰箱冷藏室保存，使用前置于37℃水浴中20 min；
②制备成骨细胞样本：
将羟基磷灰石含量在10~20 %的多孔磷灰石-壳聚糖支架浸泡于75 %酒精中15分钟，放入培养皿中于无菌条件下自然晾干后备用；
按体积百分比1：9将体外培养的浓度为2~8×107个细胞/mL的成骨细胞悬液与磷酸盐缓冲液配制的2 %低熔点琼脂糖于37℃混匀，倒入所述培养皿中淹没支架，于4℃放置20 min后剔除支架外多余的低熔点琼脂糖，并放入所述细胞营养液中，于37℃预培养24 h，即得成骨细胞样本；
③将所述成骨细胞样本固定在机械力装置内，并注入所述细胞营养液，然后施加机械力，在需要观测的时间点取出，用磷酸盐缓冲液将成骨细胞吹打、分散出来，提取mRNA、蛋白检测骨形成相关因子的表达水平。
2.如权利要求1所述的一种机械力对骨影响的研究方法，其特征在于：所述支架（9）由不锈钢板、不锈钢杆和螺栓连接而成；所述不锈钢板设有圆形窗口，该圆形窗口设有上下移动的所述活塞（3）。
3.如权利要求1所述的一种机械力对骨影响的研究方法，其特征在于：所述活塞（3）上设有橡胶环。
4.如权利要求1所述的一种机械力对骨影响的研究方法，其特征在于：所述弹性垫片（4）为带有小孔洞的弹簧钢薄片。
5.如权利要求1所述的一种机械力对骨影响的研究方法，其特征在于：所述基座（7）设有固定所述骨样本（10）的卡槽。
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