CN111380974A - 一种棘白菌素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，提供了一种检测棘白菌素B₀和C₀的高效液相色谱方法。检测条件为：色谱柱为Ultimate

Amide，4.6*250mm，填料粒径3.5μm，柱温30～50℃，流速为1～2.5mL/min，进样体积为10μL‑20μL，检测波长200～230nm，流动相采用水和乙腈梯度洗脱。这种检测方法精密度高、准确度高、重现性好、简便实用，能够实现棘白菌素B₀和C₀的同时检测，具有非常广阔的应用前景。

Description

一种棘白菌素的检测方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及了一种棘白菌素的高效液相色谱检测方法。

背景技术

自20世纪70年代以来，在临床治疗过程中，真菌感染疾病和由于无法控制真菌感染而造成的死亡率逐渐提高，这与广泛使用对人体免疫系统有损害的药物和大量使用广谱抗菌药物有直接的关系。另外，与临床使用体内植入物和像艾滋病这样的慢性免疫抑制病毒的感染有关。因此，研究开发安全、新型和有效的抗真菌药物显得非常重要。众所周知，真菌细胞是具有细胞壁的，哺乳动物细胞没有细胞壁。因此，应将真菌的细胞壁作为新型抗真菌药物的作用靶点。棘白菌素类即是作用于真菌细胞壁的药物。

纽莫康定(Pneumocandins)是由Zalerion arboricola产生的一类天然抗真菌药物，由于它对多种念珠菌、地方性真菌、曲霉及卡氏肺囊虫均有效，因而越来越受到人们的关注。其主要作用机理是能够非竞争性的抑制真菌细胞壁中β-1，3葡聚糖合成酶的活性，进而引起真菌细胞壁的裂解以及细胞内外渗透压的改变从而将真菌细胞彻底杀死。按照其结构中脯氨酸上取代基的不同主要分为三大类：A₀(32羟基242甲基脯氨酸)、B₀(32羟基脯氨酸)和C₀(42羟基脯氨酸)。其中的Pneumocandins B₀脱侧链后的环状六肽母核是合成Pneumocandin类棘白菌素药物醋酸卡泊芬净(caspofungin acetate)的重要原料，卡泊芬净是默克公司开发上市的新广谱抗真菌药物，对包括曲霉和念珠菌属在内的真菌均有良好的抗菌作用；Pneumocandins A₀和PneumocandinsC₀是真菌Zalerion arboricola发酵代谢产物之一，为Pneumocandins B₀类似物之一。

Pneumocandins B₀与Pneumocandins C₀是同分异构体，两者的差别仅在于脯氨酸残基上的一个羟基的位置不同，因此Pneumocandins B₀与Pneumocandins C₀难以实现同时检测。

张雪霞等在《HPLC法同时测定发酵液中纽莫康定A₀与B₀的含量》公开了一种反相HPLC法，可以同时测定纽莫康定A₀和B₀含量，但该方法中B₀和C₀保留时间相同，只能实现其二者与A₀之间的分离。

CN20161236860.0公开了一种纽莫康定分离纯化的方法，纯化后得到的纽莫康定B₀纯度大于99％，杂质C₀小于0.1％，但这种方法无法适用于纽莫康定的含量检测。

CN201080037086.5公开了一种从棘白菌素C₀分离和/或提纯棘白菌素B₀的色谱方法，这种方法分离度较差，不能用于B₀和C₀的同时检测。

CN201080037087.X公开了一种通过液质联用(LC-MS/MS)检测棘白菌素化合物的方法，尽管可以检测B₀和C₀，但液质联用的方法对于仪器维护和检测成本过高。

杨渊，孟慧云等在《亲水作用色谱法测定纽莫康定B₀及其杂质的研究》中报道了一种HILIC方法，虽然能够同时检测出B₀和C₀，但其使用两性离子色谱柱，键合相流失快，并且检测限较高，柱效差，B₀和C₀分离度和塔板数有待提高。

孟慧云，杨渊等在《丝状真菌SIIA-F1108产生抗真菌物质的分离纯化和结构鉴定》中报道了一种正相HPLC的检测方法，虽然能够实现B₀和C₀的同时检测，但正相方法使用二氯甲烷、乙酸乙酯等试剂，一方面流动相采用乙酸乙酯等有机溶剂，毒性较大，另一方面检测采用的截止波长高，采用检测波长278nm，不利于杂质检测。

随着对棘白菌素的进一步研究，精准简单检测发酵液组分和质量控制的方法显得尤为重要。目前，对于棘白菌素B₀的选择性检测或者棘白菌素C₀的选择性检测而言是低效的，二者同时检测时的柱效和稳定性均有待提高。

发明内容

基于现有技术的弊端和研发难点，发明人提供了一种快速检测C₀和B₀的亲水作用色谱方法，弥补了正相色谱法的使用弊端，实现了B₀和C₀的同时检测，并具有良好的柱效和稳定性。

该检测方法通过以下方案实现：

检测方法用由含酰胺基官能团的硅胶微粒为填料的色谱柱，流动相为水和乙腈不同体积配比的A、B两种流动相，进行梯度洗脱。

色谱柱采用的型号规格为

HILIC Amide，4.6*250mm，填料粒径3.5μm。

梯度洗脱时柱温30～50℃。

优选地，梯度洗脱时柱温40℃。

梯度洗脱时流速为1～2.5mL/min。

优选地，梯度洗脱时流速为1.0mL/min。

梯度洗脱时，进样体积为10μL～20μL；优选10μL。

梯度洗脱时，检测波长200～230nm；优选220nm。

梯度洗脱时，流动相A、B的洗脱梯度为：0-21分钟，流动相B 84％-94％。

进一步优选地，梯度洗脱时，流动相A、B的洗脱梯度如下：

在一个优选的实施方案中，该检测方法具体包括如下步骤：

配置供试品溶液：

量取棘白菌素放罐发酵液20ml，加80ml无水乙醇(AR)匀浆10min，过滤，取适量滤液置于4000r/min下离心10min，取上清并用0.45μm滤膜过滤，即得供试品溶液。

配置B₀和C₀的对照品溶液：

B₀对照品溶液

精密称量棘白菌素B₀对照品10.00mg于25ml容量瓶中，加无水乙醇(AR)超声溶解，定容，摇匀，即得，浓度400.00μg/ml。

C₀对照品溶液

精密称量棘白菌素C₀对照品10.00mg于25ml容量瓶中，加无水乙醇(AR)超声溶解，定容，摇匀，即得，浓度400.00μg/ml。

色谱检测条件如下：

色谱柱：

HILIC Amide，4.6*250mm，填料粒径3.5μm；

流动相：A相为水，B相为乙腈，梯度洗脱；

柱温为40℃；

流速为1.0mL/min；

进样体积10μL；

检测波长220nm；

梯度洗脱时，流动相A、B的洗脱梯度如下：

将供试品溶液和对照品溶液按照该检测方法进行方法学验证：

线性关系考察

分别依次精密量取B₀和C₀对照品溶液0.5、1、2、3、4和5mL，置于6个10mL容量瓶中，用乙醇稀释至刻度定容，摇匀，制成不同浓度的系列混合对照品溶液，按照所述的色谱检测，分别进样6个对照品溶液，记录色谱图。以对照品溶液中各组分质量浓度X(μg/mL)为横坐标，对照品峰面积Y为纵坐标进行B₀和C₀的线性回归。B₀回归曲线方程为Y＝2.6142X-8.3922，R²为0.9998；C₀回归曲线方程为Y＝2.5103X-7.4647，R²为0.9998。

检测限与定量限

分别将B₀和C₀对照品溶液逐步稀释，分别按照所述的色谱检测条件进样，按照S/N＝3的浓度为各组分的检测限，S/N＝10的浓度为各组分的定量限要求测定。测定结果见表1。

表1检测限与定量限测定结果

	定量限	检测限
			B<sub>0</sub>	0.095μg/ml	0.029μg/ml
C<sub>0</sub>	0.115μg/ml	0.035μg/ml

精密度实验

分别精密量取B₀和C₀对照品溶液，按照所述的色谱检测条件各重复进样6次检测，记录B₀和C₀的保留时间和峰面积，并计算RSD，结果见表2。

表2精密度实验测定结果

	保留时间RSD	峰面积RSD
			B<sub>0</sub>	0.54％	0.88％
C<sub>0</sub>	0.73％	0.65％

稳定性实验

取同一份供试品溶液，按照本发明所述的色谱检测条件分别在0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h检测，记录B₀和C₀的保留时间和峰面积，并计算RSD，结果见表3。

表3稳定性实验测定结果

	保留时间RSD	峰面积RSD
			B<sub>0</sub>	0.28％	0.67％
C<sub>0</sub>	0.19％	0.34％

从表3可以看出，B₀和C₀保留时间RSD分别为：0.28％和0.19％。峰面积RSD分别为：0.67％和0.34％。说明供试品溶液在24h内稳定。

重复性实验

取同一批发酵液，配置6份供试品溶液，按照本发明所述的色谱检测条件进样检测，记录B₀和C₀的保留时间、峰面积，并计算RSD，结果见表4。

表4重复性实验测定结果

	保留时间RSD	峰面积RSD
			B<sub>0</sub>	0.08％	0.09％
C<sub>0</sub>	0.13％	0.42％

从表4可以看出，B₀和C₀保留时间RSD分别为：0.08％和0.13％，峰面积RSD分别为：0.09％和0.42％。说明检测方法重复性良好。

通过紫外分光光度计对B₀进行波长扫描，图4显示B₀在204nm具有最大吸收，277nm吸收较弱。色谱图(图3)显示供试品B₀保留时间为14.903min，C₀保留时间为15.404min，与对照品(图1和图2)一致。这两种同分异构体的分离度大于2.0，理论塔板数大于10000。

本发明的检测方法B₀和C₀的分离度高、理论塔板数高、重复性好、准确度高、检测限和定量限低，方法简便实用，成本较低，能够实现棘白菌素B₀和C₀的同时快速检测，具有非常广阔的应用前景。

附图说明

图1：对照品B₀高效液相色谱图；

图2：对照品C₀高效液相色谱图；

图3：发酵液供试品高效液相色谱图；

图4：对照品B₀紫外分光光度计波长扫描图。

具体实施方式

下面通过实施例来进一步说明本发明。应该正确理解的是：本发明的实施例仅仅是用于说明本发明而给出，而不是对本发明的限制，所以，在本发明的方法前提下对本发明的简单改进均属本发明要求保护的范围。

实施例1

检测条件：

色谱柱：

HILIC Amide，4.6*250mm，填料粒径3.5μm；

流动相：A相为水，B相为乙腈，梯度洗脱；

柱温为40℃；

流速为1.0mL/min；

进样体积10μL；

检测波长220nm；

梯度洗脱时，流动相A、B的洗脱梯度如下：

配置供试品溶液：

量取棘白菌素放罐发酵液20ml，加80ml无水乙醇(AR)匀浆10min，过滤，取适量滤液置于4000r/min下离心10min，取上清并用0.45μm滤膜过滤，即得供试品溶液。

配置B₀和C₀的对照品溶液：

B₀对照品溶液

精密称量棘白菌素B₀对照品10.00mg于25ml容量瓶中，加无水乙醇(AR)超声溶解，定容，摇匀，即得，浓度400.00μg/ml。

C₀对照品溶液

精密称量棘白菌素C₀对照品10.00mg于25ml容量瓶中，加无水乙醇(AR)超声溶解，定容，摇匀，即得，浓度400.00μg/ml。

通过该检测条件测定上述对照品溶液和供试品溶液的B₀和C₀，记录其保留时间、理论塔板数及分离度，检测结果见表5。

表5检测结果

实施例2

检测条件：

色谱柱：

HILIC Amide，4.6*250mm，填料粒径3.5μm；

流动相：A相为水，B相为乙腈，梯度洗脱；

柱温为30℃；

流速为1.5mL/min；

进样体积20μL；

检测波长200nm；

梯度洗脱时，流动相A、B的洗脱梯度如下：

供试品溶液和对照品溶液配制如实施例1中所述；

通过该检测条件测定上述对照品溶液和供试品溶液的B₀和C₀，记录其保留时间、理论塔板数及分离度，检测结果见表6。

表6检测结果

实施例3

检测条件：

色谱柱：

HILIC Amide，4.6*250mm，填料粒径3.5μm；

流动相：A相为水，B相为乙腈，梯度洗脱；

柱温为50℃；

流速为2.5mL/min；

进样体积15μL；

检测波长230nm；

梯度洗脱时，流动相A、B的洗脱梯度如下：

供试品溶液和对照品溶液配制如实施例1中所述；

通过该检测条件测定上述对照品溶液和供试品溶液的B₀和C₀，记录其保留时间、理论塔板数及分离度，检测结果见表7。

表7检测结果

实施例4

检测条件：

色谱柱：

HILIC Amide，4.6*250mm，填料粒径3.5μm；

流动相：A相为水，B相为乙腈，梯度洗脱；

柱温为40℃；

流速为1.0mL/min；

进样体积10μL；

检测波长220nm；

梯度洗脱时，流动相A、B的洗脱梯度如下：

供试品溶液和对照品溶液配制如实施例1中所述；

通过该检测条件测定上述对照品溶液和供试品溶液的B₀和C₀，记录其保留时间、理论塔板数及分离度，检测结果见表8。

表8检测结果

实施例5

检测条件：

色谱柱：

HILIC Amide，4.6*250mm，填料粒径3.5μm；

流动相：A相为水，B相为乙腈，梯度洗脱；

柱温为40℃；

流速为1.0mL/min；

进样体积10μL；

检测波长220nm；

梯度洗脱时，流动相A、B的洗脱梯度如下：

供试品溶液和对照品溶液配制如实施例1中所述；

通过该检测条件测定上述对照品溶液和供试品溶液的B₀和C₀，记录其保留时间、理论塔板数及分离度，检测结果见表9。

表9检测结果

实施例6

检测条件：

色谱柱：

HILIC Amide，4.6*250mm，填料粒径3.5μm；

流动相：A相为水，B相为乙腈，梯度洗脱；

柱温为40℃；

流速为1.0mL/min；

进样体积10μL；

检测波长220nm；

梯度洗脱时，流动相A、B的洗脱梯度如下：

供试品溶液和对照品溶液配制如实施例1中所述；

通过该检测条件测定上述对照品溶液和供试品溶液的B₀和C₀，记录其保留时间、理论塔板数及分离度，检测结果见表10。

表10检测结果

实施例7

检测条件：

色谱柱：

HILIC Amide，4.6*250mm，填料粒径3.5μm；

流动相：A相为水，B相为乙腈，梯度洗脱；

柱温为40℃；

流速为1.0mL/min；

进样体积10μL；

检测波长220nm；

梯度洗脱时，流动相A、B的洗脱梯度如下：

供试品溶液和对照品溶液配制如实施例1中所述；

通过该检测条件测定上述对照品溶液和供试品溶液的B₀和C₀，记录其保留时间、理论塔板数及分离度，检测结果见表11。

表11检测结果

对比实施例1

色谱条件

色谱柱：反相Xlon色谱柱(4.6mm×250mm，10μm)；

流动相：乙腈-水(87:13)；

流速：2.0mL/min；

检测波长：210nm；

柱温：30℃；

进样量10μL；

等度洗脱。

供试品溶液和对照品溶液配制如实施例1中所述；

通过该检测条件测定上述对照品溶液和供试品溶液的B₀和C₀，记录其保留时间、理论塔板数及分离度，检测结果见表12。

表12检测结果

对比实施例2

色谱柱：

HILIC Amide，4.6*250mm，填料粒径3.5μm；

流动相：乙腈-水(87:13)；

流速：2.0mL/min；

检测波长：210nm；

柱温：30℃；

进样量10μL；

等度洗脱。

供试品溶液和对照品溶液配制如实施例1中所述；

通过该检测条件测定上述对照品溶液和供试品溶液的B₀和C₀，记录其保留时间、理论塔板数及分离度，检测结果见表13。

表13检测结果

对比实施例3

色谱条件

色谱柱：反相Xlon色谱柱(4.6mm×250mm，10μm)；

流动相：A相为水，B相为乙腈，梯度洗脱；

流速：2.0mL/min；

检测波长：210nm；

柱温：30℃；

进样量10μL；

梯度洗脱时，流动相A、B的洗脱梯度如下

供试品溶液和对照品溶液配制如实施例1中所述；

通过该检测条件测定上述对照品溶液和供试品溶液的B₀和C₀，记录其保留时间、理论塔板数及分离度，检测结果见表14。

表14检测结果

对比实施例4

检测条件：

色谱柱：

HILIC Amide，4.6*250mm，填料粒径3.5μm；

流动相：A相为水，B相为甲醇，梯度洗脱；

柱温为30℃；

流速为1.5mL/min；

进样体积20μL；

检测波长200nm；

梯度洗脱时，流动相A、B的洗脱梯度如下：

供试品溶液和对照品溶液配制如实施例1中所述；

通过该检测条件测定上述对照品溶液和供试品溶液的B₀和C₀，记录其保留时间、理论塔板数及分离度，检测结果见表15。

表15检测结果

Claims (9)

1.一种棘白菌素的检测方法，其特征在于，采用由含酰胺基官能团的硅胶微粒为填料的色谱柱，流动相为水和乙腈不同体积配比的A、B两种流动相，进行梯度洗脱。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱采用的型号规格为

HILIC Amide，4.6*250mm，填料粒径3.5μm。

3.根据权利要求1所述棘白菌素的检测方法，其特征在于，梯度洗脱时柱温30～50℃。

4.根据权利要求3所述棘白菌素的检测方法，其特征在于，梯度洗脱时柱温为40℃。

5.根据权利要求1所述棘白菌素的检测方法，其特征在于，梯度洗脱时流速为1～2.5mL/min。

6.根据权利要求1所述棘白菌素的检测方法，其特征在于，梯度洗脱时，进样体积为10μL-20μL。

7.根据权利要求1所述棘白菌素的检测方法，其特征在于，梯度洗脱时，检测波长200～230nm。

8.根据权利要求1所述棘白菌素的检测方法，其特征在于，梯度洗脱时，流动相A、B的洗脱梯度为：0-21分钟，流动相B 84％-94％。

9.根据权利要求8所述棘白菌素的检测方法，其特征在于，梯度洗脱时，流动相A、B的洗脱梯度如下：

Images