CN111377994A - 七种来源于灯笼果的醉茄内酯类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

七种来源于灯笼果的醉茄内酯类化合物及其制备方法和用途，本发明涉及灯笼果中五个新的(1‑5)与两个已知的(6‑7)醉茄内酯类化合物的结构、制备方法及其在抗炎、治疗神经退行性疾病药物中的应用，所述的化合物1‑7，具有如下结构。本发明的化合物(2‑4，6，7)有较好的NO抑制活性，可用于抗炎、治疗神经退行性疾病药物的开发和应用。

Description

七种来源于灯笼果的醉茄内酯类化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及灯笼果中醉茄内酯类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

Nitric oxide(NO)是一重要的信使分子，在各种生理生化过程中，起着关键的作用，具有神奇的生理调节功能。在许多组织中，尽管其真正的释放量目前尚难于检测，但已明确释放不同浓度的NO，且浓度的变化与机体的生理机能紧密相关。许多疾病，包括炎症、神经退行性疾病、癌症等，可能是NO的释放或调节不正常引起的。

炎症反应时，炎症介质或致炎物可诱导或增加局部NO的合成及释放，而NO的释放又可诱导促炎症细胞因子产生，如IL-1、TNF-α等。过量的NO可促进血管扩张，增强血管通透性和渗漏，产生细胞毒性。过多的NO的细胞毒性是非特异性的，不仅针对微生物，而且导致细胞周围组织和细胞损害。鉴于炎症与NO的密切关系，抑制NO的生成，已成为抗炎药物的靶标之一。

在中枢神经系统中，NO是神经炎症反应的一个信号。炎症反应伴随着小胶质细胞的活化，并释放大量的NO，产生神经毒性，导致神经元的退化与死亡，进而引起神经退行性疾病。因此，抑制中枢神经系统NO的产生，在治疗神经炎症的同时，对与神经炎症相关的神经退行性疾病，如阿尔兹海默症、帕金森症等有潜在的治疗作用。

植物为我们提供了结构与生物活性多样性的天然产物。为了寻找新的NO抑制剂、进而开发抗炎、以及治疗神经退行性疾病的药物，我们建立了BV-2细胞筛选模型。此细胞在脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)的刺激下，产生NO；在LPS刺激的同时，加入受试药物(化合物或植物提取物)，评价药物抑制NO活性，从而发现抗炎以及治疗神经退行性疾病的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供灯笼果中7个醉茄内酯类化合物及其制备方法和应用。

本发明提供的化合物1-7属于醉茄内酯，其具有如下结构。

本发明还提供了所述化合物1-7的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)灯笼果(Physalis peruviana)全株用溶剂提取，回收提取液得粗提物；

(2)步骤(1)所得粗提物溶解于水中，采用与水不相混溶的有机溶剂萃取，回收溶剂得到萃取物；

(3)步骤(2)所得萃取物经硅胶柱色谱法分离，以石油醚/丙酮或石油醚/乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱；

(4)上述步骤(3)中所得流份经MPLC(中压液相色谱，色谱填料为ODS)分离，以甲醇/水，或乙腈/水混合溶剂为流动相梯度洗脱；

(5)上述步骤(4)中所得流份经HPLC-RI(高效液相-示差检测)色谱分离，以甲醇/水为流动相洗脱，或以乙腈/水为流动相梯度洗脱，得到化合物1-7。

本发明提供的化合物1-7的制备方法，所述灯笼果为茄科(Solanaceae)酸浆属灯笼果(Physalis peruviana)全株的提取物。

本发明提供的化合物1-7的制备方法，步骤(1)所述的提取方法为加热回流提取或超声提取，所用溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙醇中的至少一种，药材：溶剂的重量体积比为1∶5～1∶15。

本发明提供的化合物1-7的制备方法，步骤(2)所述的萃取方法，所用有机溶剂为石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯中的任意一种，水溶液和有机溶剂体积比1∶1～1∶2。

本发明提供的化合物1-7的制备方法，步骤(3)中，洗脱溶剂为石油醚/丙酮或石油醚/乙酸乙酯混合溶剂，其比例为100∶2～100∶33。

本发明提供的化合物1-7的制备方法，步骤(4)中，所述甲醇/水混合溶剂的比例为7∶3～9∶1，优选7∶3～9∶1，或乙腈/水混合溶剂比例为6∶4～9∶1，优选6∶4～9∶1。

本发明提供的化合物1-7的制备方法，步骤(5)中所述流动相甲醇和水混合溶剂、或乙腈和水混合溶剂的体积比例为7∶3～9∶1，优选7∶3～9∶1。

本发明提供的7个醉茄内酯类化合物，其中5个(2-4，6，7)具有NO抑制活性。用于制备抗炎、治疗神经退行性疾病药物。

附图说明

图1本发明化合物1的¹H NMR谱；

图2本发明化合物1的¹³C NMR谱；

图3本发明化物1的DEPT135谱；

图4本发明化合物1的HMQC谱；

图5本发明化合物1的HMBC谱；

图6本发明化合物1的¹H-¹H COSY谱；

图7本发明化合物2的¹H NMR谱；

图8本发明化合物2的¹³C NMR谱；

图9本发明化合物2的HMQC谱；

图10本发明化合物2的HMBC谱；

图11本发明化合物3的¹H NMR谱；

图12本发明化合物3的¹³C NMR谱；

图13本发明化合物3的HMQC谱；

图14本发明化合物3的HMBC谱；

图15本发明化合物4的¹H NMR谱；

图16本发明化合物4的¹³C NMR谱；

图17本发明化合物4的HMQC谱；

图18本发明化合物4的HMBC谱；

图19本发明化合物5的¹H NMR谱；

图20本发明化合物5的¹³C NMR谱；

图21本发明化合物5的HMQC谱；

图22本发明化合物5的HMBC谱；

图23本发明新化合物1-5的HMBC与¹H-¹H COSY相关信号图；

图24本发明新化合物1-5的实验和(或)计算ECD谱。

图25本发明化合物1-7的结构式

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1

(1)灯笼果全株10kg用甲醇加提取3次(用量3×60L)，减压回收提取液得粗提物；

(2)步骤(1)所得甲醇提取物，加水制成混悬液，用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物；

(3)步骤(2)经硅胶柱色谱法分离，依次以石油醚∶丙酮100∶0，100∶2，100∶4，100∶7， 100∶10，100∶14，100∶19，100∶25，100∶33洗脱；

(3)上述步骤(2)中所得的石油醚∶丙酮100∶2～100∶25流份经中压液相色谱(MPLC)分离，以甲醇/水6∶4～9∶1为流动相梯度洗脱；

(4)上述步骤(3)中所得甲醇/水(7∶3)流份经HPLC-RI分离，以甲醇/水60∶40～ 90∶10为流动相洗脱得到化合物1(收率0.001％)，2(收率0.001％)，3(收率0.001％)， 4(收率0.002％)，5(收率0.002％)，6(收率0.002％)，和7(收率0.007％)。

新化合物1-5，根据其理化性质和波谱数据鉴定了结构(化合物1-5的波谱图见图1-图22)。

化合物1的结构鉴定数据如下：

白色粉末(甲醇)；

CD(CH₃CN)213(Δε+0.84)nm；IR(film)v_max3420，2928，2867，1716，1646，1223，735cm^-1；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)and¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)数据见表1和表2；ESIMS m/z 461[M+H]⁺；HRESIMS m/z 461.3270[M+H]⁺，calcd forC₂₈H₄₅O₅，461.3267。化合物的HMBC相关信号见图23。该化合物的绝对构型通过运用TDDFT(时间密度泛函理论)方法进行ECD(电子圆二色谱)计算确定，将实验测出的ECD谱图与计算得到的对映异构体的ECD图谱进行比较，确定了该化合物的绝对构型为1S，3R，8S，9S，10R，13S，14S，17R，20S，22R，24S，25S，26R ECD图谱见图24。

化合物2的结构鉴定数据如下：

白色粉末；

CD(CH₃CN)221(Δε+3.59)，264(Δε-0.83)，281(Δε-0.24)，327(Δε-1.56)nm；IR(film)v_max3421，2925，1701，1658，1245，1036，734cm^-1；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)and¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)数据见表1和表2； ESIMS m/z 455[M+H]⁺；HRESIMS m/z 455.2800[M+H]⁺，calcd for C₂₈H₃₉O₅，455.2797。该化合物的绝对构型通过运用TDDFT(时间密度泛函理论)方法进行ECD(电子圆二色谱)计算确定，将实验测出的ECD谱图与计算得到的对映异构体的ECD图谱进行比较，确定了该化合物的绝对构型为8S，9S，10R，13S，14S，17R，20S，22R，24S，25S，26R， ECD图谱见图24。

化合物3的结构鉴定数据如下：

白色粉末；

CD(CH₃CN)197(Δε-19.29)，215(Δε+7.03)nm；IR(film)v_max3446，2953，1730，1677，1246，1106，1055，712cm^-1；¹H NMR(400MHz， CDCl₃)and¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)数据见表1和表2；ESIMS m/z 545[M+H]⁺； HRESIMS m/z545.3119[M+H]⁺，calcd for C₃₁H₄₅O₈，545.3114。化合物的HMBC相关信号见图23。该化合物的绝对构型通过ECD确定。该化合物的绝对构型通过运用TDDFT (时间密度泛函理论)方法进行ECD计算确定，将实验测出的ECD谱图与计算得到的对映异构体的ECD图谱进行比较，确定了该化合物的绝对构型为4S，5R，6R，8R，9S，10R， 13R，14S，15S，17R，20S，22R，24S，25S，26S，ECD图谱见图24。

化合物4的结构鉴定数据如下：

白色粉末；

ECD(CH₃CN)204(Δε-2.3)nm；IR(KBr)v_max3426，2957，2869，1732，1707，1647，1449，1390，1024，750cm^-1；¹H NMR(400MHz， CDCl₃)and¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)数据见表1和表2；ESIMS m/z 375[M+H]⁺； HRESIMS m/z375.2184[M+H]⁺(calcd for C₂₂H₃₁O₅，375.2171)。化合物的HMBC相关信号见图23。该化合物的绝对构型通过ECD确定。该化合物的绝对构型通过运用TDDFT (时间密度泛函理论)方法进行ECD计算确定，将实验测出的ECD谱图与计算得到的对映异构体的ECD图谱进行比较，确定了该化合物的绝对构型为5S，6R，8S，9S，10R，13S， 14S，17R，20S，22R，24S，and 25S，ECD图谱见图24。

化合物5的结构鉴定数据如下：

白色粉末；

CD(CH₃CN)242(Δε-0.03)，291(Δε-6.03)nm；IR(film)v_max3436，2941，1710，1247，1117，953，733cm^-1；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)and ¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)数据见表1和表2；ESIMS m/z 585[M+Na]⁺；HRESIMS m/z 585.3037[M+Na]⁺，calcd for C₃₁H₄₆NaO₉，585.3040。化合物的HMBC相关信号见图23。该化合物的绝对构型通过运用TDDFT(时间密度泛函理论)方法进行ECD计算确定，将实验测出的ECD谱图与计算得到的对映异构体的ECD图谱进行比较，确定了该化合物的绝对构型为3S，4S，5R，6R，8R，9S，10R，13R，14S，15S，17R，20S，22R，24S，25S，26R， ECD图谱见图24。

表1化合物1-5的¹³C NMR数据

表2化合物1-5的¹H NMR数据

实施例2

(1)灯笼果全株10.0kg用乙醇加热提取3次(用量3×48L)，减压回收提取液得粗提物；

(2)步骤(1)所得乙醇提取物，加水制成混悬液，用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物；

(3)步骤(2)经硅胶柱色谱法分离，依次以石油醚∶乙酸乙酯100∶0，100∶2，100∶4，100∶7，100∶10，100∶15，100∶22，100∶30洗脱；

(3)上述步骤(2)中所得的石油醚∶乙酸乙酯100∶2～100∶22流份经中压液相色谱(MPLC)分离，以甲醇/水6∶4～9∶1为流动相梯度洗脱；

(4)上述步骤(3)中所得甲醇/水(7∶3)流份经HPLC-RI分离，以甲醇/水60∶40～ 90∶10为流动相洗脱得到1(收率0.002％)，2(收率0.001％)，3(收率0.002％)，4(收率0.002％)，5(收率0.002％)，6(收率0.002％)，和7(收率0.007％)。

化合物1-7的结构鉴定方法见实施例1。

实施例3

(1)灯笼果全株10.0kg用丙酮提取3次(用量3×60L)，减压回收提取液得粗提物；

(2)步骤(1)所得丙酮提取物，加水制成混悬液，用二氯甲烷萃取，得二氯甲烷萃取物；

(3)步骤(2)经硅胶柱色谱法分离，依次以石油醚∶丙酮100∶0，100∶2，100∶3，100∶5， 100∶7，100∶10，100∶15，100∶25洗脱；

(3)上述步骤(2)中所得的石油醚∶丙酮100∶2～100∶25流份经中压液相色谱(MPLC)分离，以甲醇/水7∶3～9∶1为流动相梯度洗脱；

(4)上述步骤(3)中所得甲醇/水(8∶2)流份经HPLC-RI分离，以乙腈/水70∶30～ 90∶10为流动相洗脱得到新化合物1(收率0.001％)，2(收率0.001％)，3(收率0.001％)， 4(收率0.002％)，5(收率0.002％)，6(收率0.002％)，和7(收率0.007％)。

化合物1-7的结构鉴定方法见实施例1。

实施例4

灯笼果中化合物1-7的NO抑制活性测试。

(1)实验原理

NO与炎症、神经退行性疾病等密切相关，具有NO抑制活性的化合物，是潜在的治疗炎症、阿尔兹海默症、帕金森症等神经退行性疾病的药物。本实验通过建立BV-2细胞模型，此细胞在LPS的刺激下，产生NO；在LPS刺激的同时，加入受试化合物，评价化合物1-7的抑制NO活性，从而发现抗炎以及治疗神经退行性疾病的潜在药物。

(2)实验方法

①小鼠小胶质细胞BV-2的培养

以DMEM高糖培养基作为基础配制成内含10％胎牛血清及1％双抗(青霉素∶链霉素＝1∶1)细胞培养液，37℃，5％CO₂培养箱培养，2～3天换液一次，至细胞基本铺满培养瓶瓶底，传代或实验处理。

②化合物的配制方法

待测化合物用DMSO溶解，配成母液，浓度为30mM，储存于-20℃。临用时用 DMEM培养液将其进行稀释，依次稀释为10mM、5mM、3mM、1mM、0.1mM、 0.01mM。

③待测化合物的细胞毒性

将对数生长期的细胞，调细胞密度为1×10⁵个/mL，接种于96孔板，置于37℃， 5％的培养箱中，培养24小时后，加不同浓度的待测化合物，20h后，观察细胞的存活情况，并用MTT法定量检测化合物对细胞的毒性，以确定化合物的测试浓度。

④化合物的NO抑制活性

将处于对数生长期的BV-2细胞，调细胞密度接种于96孔板(5×10⁴细胞/孔)，培养24小时，待细胞完全贴壁后，加入不同浓度的待处理化合物，预处理30min后，加入LPS至终浓度为0.2μg/mL，继续培养24小时后，取50μL细胞培养上清液，分别加入50μL Griess试剂(A液∶B液＝1∶1，A液含有1％的磺胺，5％的磷酸，B液为0.1％的α-萘乙二胺二盐酸盐，A，B液需要避光保存)，按Griess法，于550nm波长下测吸光度值，根据吸光度值和标准曲线计算各化合物对NO的抑制率。

⑤统计方法

全部资料采用SPSS(13.0)统计软件包进行检验分析。结果用平均值±标准误表示，评价整体性差异，组间均数采用One-Way ANOVA分析法进行方差齐性分析，并结合Dunnett’s test分析方法进行组间比较。多样本方差齐性检验采用Levene检验，当 p＞0.05，方差是齐的，采用Dunnett’s双侧T检验多组间均数的差异，当p＜0.05，方差不齐，采用Dunnett T3检验多组间均数的差异。

⑥IC₅₀的计算方法

将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算化合物抑制NO的IC₅₀值。

(3)实验结果：化合物抑制NO的IC₅₀值见表2。

表2化合物1-7抑制NO的IC₅₀值

^a2-Methyl-2-thiopseudourea，sulfate(SMT)为阳性对照药物。

结果表明实施例1中所制备得到的化合物2-4，6，7具有NO抑制活性。

Claims (10)

1.灯笼果中五个新的(1-5)与两个已知(6-7)醉茄内酯类化合物，其特征在于：具有如下结构。

2.一种权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

(1)灯笼果(Physalis peruviana)用溶剂提取，回收提取液得粗提物；

(2)步骤(1)所得粗提物溶解于水中，采用与水不相混溶的有机溶剂萃取，减压回收溶剂得到萃取物；

(3)步骤(2)所得萃取物经硅胶柱色谱法分离，以石油醚/丙酮或石油醚/乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱；

(4)上述步骤(3)中所得流份经MPLC(中压液相色谱，色谱填料为ODS)分离，以甲醇/水，或乙腈/水混合溶剂为流动相梯度洗脱；

(5)上述步骤(4)中所得流份经HPLC-RI(高效液相-示差检测)色谱分离，以甲醇/水为流动相洗脱，或以乙腈/水为流动相梯度洗脱，得到化合物1-7。

3.按照权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：所述灯笼果为茄科(Solanaceae)酸浆属灯笼果(Physalis peruviana)全株的提取物。

4.按照权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的提取方法为加热回流提取或超声提取1～3次，所用溶剂为石油醚、环己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇中的至少一种，药材：溶剂的重量体积比为1∶5～1∶15。

5.按照权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的萃取方法，水溶液和有机溶剂体积比1∶1～1∶2，所用的萃取溶剂为石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯中的一种。

6.按照权利要求2所述的化合物制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述洗脱溶剂石油醚/丙酮或石油醚/乙酸乙酯混合溶剂的比例为100∶2～100∶33。

7.按照权利要求2所述的化合物制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述甲醇/水混合溶剂的比例为7∶3～9∶1，或乙腈/水混合溶剂比例为6∶4～9∶1。

8.按照权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述流动相甲醇/水或乙腈/水混合溶剂为流动相，流动相中混合溶剂的比例为7∶3～9∶1得化合物1；流动相中混合溶剂的比例为7∶3～9∶1得化合物2；流动相中混合溶剂的比例为7∶3～9∶1得化合物3；流动相中混合溶剂的比例为7∶3～9∶1得化合物4；流动相中混合溶剂的比例为3∶2～7∶3得化合物5；流动相中混合溶剂的比例为3∶2～7∶3得化合物6；流动相中混合溶剂的比例为3∶2～7∶3得化合物7。

9.一种药物制剂，其包含有如权利要求1中所述的化合物或药学上可接受的盐和药学上可接受的辅料、稀释剂和载体。

10.权利要求1所述的新化合物在制备预防和治疗炎症、神经退行性疾病药物中的应用。

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