CN111363704A

CN111363704A - 有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌x253、其分离纯化方法及应用

Info

Publication number: CN111363704A
Application number: CN202010258772.0A
Authority: CN
Inventors: 张栋; 冯丽莉; 朱宏; 王世杰; 薛玉玲; 荀一萍; 封肖颖; 康志远; 韩晓伟
Original assignee: Shijiazhuang Junlebao Dairy Co Ltd
Current assignee: Shijiazhuang Junlebao Dairy Co Ltd
Priority date: 2019-12-12
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2020-07-03
Also published as: EP4074817A4; EP4074817A1; WO2021114659A1

Abstract

本发明公开了一种有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253、其分离纯化方法及应用，该鼠李糖乳杆菌X253是从新疆发酵乳中分离筛选出来的，该菌菌株已于2019年8月20保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18404，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其拉丁文名称是Lactobacillus rhamnosus。本发明的菌株耐酸能力强，对胃液及肠液具有很好的耐受性，能够到达肠道，从而发挥益生作用；并且本发明的菌株具有抑制口腔内有害菌种的能力，有效改善口腔环境，防治口腔疾病；另外，本发明的菌株在保质期内活菌数保持能力强，能够使产品在货架期保持稳定。本发明适用于生物工程领域。

Description

有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253、其分离纯化方法及应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种乳杆菌，具体地说是一种有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253、其分离纯化方法及应用。

背景技术

口腔是人体健康的第一道关口，人体口腔环境是一个含有多种微生物的复杂的生态系统，口腔健康与这些微生物密切相关。正常情况下，口腔中各微生物之间、微生物与宿主之间存在着动态平衡，共同参与机体代谢、免疫、营养及维持口腔的健康；但在各方面因素影响下口腔微生态的动态平衡被打破，则会导致相关口腔疾病的发生，如龋齿、牙周病、口臭、口腔念珠菌病等。

益生菌在口腔疾病的防治方面具有显著功效，在口腔微环境中最常见的益生菌为乳杆菌类(Lactobacillus)，乳杆菌类大约占口腔内可培养微生物群的1% 左右。最常见的乳杆菌类有鼠李乳杆菌(L.rhamnosus)、罗伊乳杆菌(L.Reuteri)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、干酪乳杆菌(L. casei)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、发酵乳杆菌(L.fermentum)和植物乳杆菌(L.plantarllm)。因此，筛选一种能够抑制口腔内有害菌，并且耐酸能力强，货架期内活菌数保持稳定的菌种具有重要意义和应用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题，要提供一种有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253，它是从新疆发酵乳中分离筛选出来，并能够抑制口腔内有害菌，且具有强大的耐酸能力和活菌数保持能力，从而发挥益生作用，改善口腔环境；

本发明的另一目的是要提供上述有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253的一种分离纯化方法；

本发明还有一个目的，是要提供上述有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253的应用。

本发明为实现上述目的，所采用的技术方案如下：

一种有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253（Lactobacillus rhamnosus），它是从新疆发酵乳中分离筛选出来的，该菌菌株已于2019年8月20保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.18404，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，拉丁文名称是Lactobacillus rhamnosus。

作为限定，所述的有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253的16SrRNA序列如下：

CTTAGACGGCTCGCTCCCTAAAAGGGTTACGCCACCGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTCTCGCAACCTCGTTGTACCCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGGTCTTACTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAGTCATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTTTGCCCCCGAAGGGGAAACCTGATCTCTCAGGTGATCAAAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCATTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCAGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCCTCGGTTAAGCCGAGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCACGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACCATTCTTCTCCACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAAATGTGGCCGATCAACCTCTCAGTTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCAAAAGCGATAGCTTACGCCATCTTTCAGCCAAGAACCATGCGGTTCTTGGATTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCACTTAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCGCCACTCGTTCAAAATTAAATCAAGATGCAAGCACCTTTCAATAATCAGAACTCGTTCGACTTGCATGTAT。

作为另一种限定，所述的有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253的Phes基因序列如下：

GGGGGAAAAATAGCCGCACGCAAACATTCGGATGCACCATGCCGGCACCGAGAACTTCAATCCAGCCGGTATACTTGCAAACAGGGCAACCCTTGCCACCGCAGCGGAAGCAGGAAACGTCCACTTCTACAGACGGTTCTGTAAACGGAAAATAGCTCGGGCGCAGGCGAATCGTCCGATCAGCGCCAAACACATGCTGACACATGGCGAGTAACGTCCCCTTAAGATCAGCCATTGTAATATGCTTGTCGATCACCAGACCTTCCATCTGATGGAACTGGTGGCTATGTGTGGCATCATCATCATCACGCCGATAAACCACGCCCGGACTGATCATTTTCAGCGGGCCCTTAGTAAAATCATGTTTCTCCATCGTCCGTGCCTGCATCGGGCTGGTTTGGGAACGCATCAGCAACTCATTGGTAATATAAAAAGTTTCCTGCATATCACGAGCATGGATGACGCCGA。

本发明还提供了上述有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253的分离纯化方法，它按照以下步骤进行：

（一）样品采集

取25mL新疆的发酵乳制品，加入200~250mL生理盐水中，充分混匀，得到采集样品；

（二）样品富集

取2mL采集样品，加入到80~120 mL的MRS液体培养基中，32~42℃培养64~80h，得到培养液；

（三）菌株分离

取培养液1mL，用重量与体积百分比为0.9%的无菌生理盐水稀释10倍，继续用生理盐水分别做10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5倍的梯度稀释，得到菌悬液；

取MRS固体培养基，融化后，倒入灭菌的培养皿中制成无菌平板，待其冷却、完全凝固后，吸取0.1mL不同浓度的菌悬液分别涂布到无菌平板；

置32~42℃厌氧培养64~80h；

待平板出现典型菌落后，根据标准乳酸菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑选出相应的单菌落，进行下一步菌株纯化；

（四）菌株纯化

挑取选中的单菌落，将菌落培养物划线接种到无菌平板上，32~42℃有氧环境培养64~80h，然后挑取该无菌平板上的单菌落，继续划线接种到无菌平板上，32~42℃有氧环境培养64~80h，连续培养三次至培养基内菌落形态一致，显微镜观察菌株细胞形态单一后，即获得纯培养菌株，接种环挑取菌落接种至液体MRS培养基内，37℃培养24h。

作为限定，菌株保存是取800μL纯培养菌株和无菌的50%甘油，置于菌种保存管内，混匀后在-70℃保存，同时接种MRS固体培养基试管斜面用于临时保存。

作为限定，MRS液体培养基主要由以下原料组成：酪蛋白胨 8~12 g，牛肉膏8~12g，酵母膏4~6g，葡萄糖16~24 g，乙酸钠4~6 g，柠檬酸二胺1.5~2.5 g，吐温-80 0.8~1.2 g，K₂HPO₄ 1.5~2.5 g，MgSO₄·7H2O 0.1~0.3g，MnSO₄·7H₂O 0.04~0.06g，蒸馏水 1000mL。

作为限定，MRS固体培养基主要由以下原料组成：酪蛋白胨 8~12 g，牛肉膏8~12g，酵母膏4~6g，葡萄糖16~24 g，乙酸钠4~6 g，柠檬酸二胺1.5~2.5 g，吐温-80 0.8~1.2 g，K₂HPO₄ 1.5~2.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.1~0.3g，MnSO₄·7H₂O 0.04~0.06g，琼脂13~17 g，蒸馏水1000mL。

本发明也提供了上述有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253的应用，它能够抑制口腔内有害菌种，用于制备改善口腔健康的产品。

作为限定，改善口腔健康的产品为牙膏、漱口水、益生菌含片、乳酸菌饮料、益生菌发酵乳。

由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比所取得的技术进步在于：

本发明采用的菌株耐酸能力强，对胃液及肠液具有很好的耐受性，能够到达肠道，从而发挥益生作用；本发明采用的菌株具有抑制口腔内有害菌种的能力，有效改善口腔环境，防治口腔疾病；本发明采用的菌株在保质期内活菌数保持能力强，能够使产品在货架期保持稳定。

附图说明

图1为本发明实施例2中肠道上皮细胞体外粘附特性实验结果示意图；

图2为本发明实施例2中发酵特性实验的发酵曲线示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明。应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1 有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253及其分离纯化方法

一、菌种

有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253，是从新疆发酵乳中分离筛选出来的，该菌菌株已保藏于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO.18404。

二、上述有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253的分离纯化方法

它按照以下步骤顺序进行：

（一）样品采集

（二）样品富集

其中，MRS液体培养基主要由以下原料组成：酪蛋白胨 8~12 g，牛肉膏8~12 g，酵母膏4~6g，葡萄糖16~24 g，乙酸钠4~6 g，柠檬酸二胺1.5~2.5 g，吐温-80 0.8~1.2 g，K₂HPO₄ 1.5~2.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.1~0.3g，MnSO₄·7H₂O 0.04~0.06g，蒸馏水 1000mL。

（三）菌株分离

置32~42℃厌氧培养64~80h；

（四）菌株纯化

挑取选中的单菌落，将菌落培养物划线接种到无菌平板上，32~42℃有氧环境培养64~80h，然后挑取该无菌平板上的单菌落，继续划线接种到无菌平板上，32~42℃有氧环境培养64~80h，连续培养三次至培养基内菌落形态一致，显微镜观察菌株细胞形态单一后，即获得纯培养菌株，接种环挑取菌落接种至液体MRS培养基内，37℃培养24h，得到增殖后的纯培养菌株；

其中，MRS固体培养基主要由以下原料组成：酪蛋白胨 8~12 g，牛肉膏8~12 g，酵母膏4~6g，葡萄糖16~24 g，乙酸钠4~6 g，柠檬酸二胺1.5~2.5 g，吐温-80 0.8~1.2 g，K₂HPO₄ 1.5~2.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.1~0.3g，MnSO₄·7H₂O 0.04~0.06g，琼脂13~17 g，蒸馏水 1000mL；

（五）菌株保存

取800μL纯培养菌株和无菌的50%甘油，置于菌种保存管内，混匀后在-70℃保存，同时接种MRS固体培养基试管斜面用于临时保存；

其中，MRS固体培养基主要由以下原料组成：酪蛋白胨 8~12 g，牛肉膏8~12 g，酵母膏4~6g，葡萄糖16~24 g，乙酸钠4~6 g，柠檬酸二胺1.5~2.5 g，吐温-80 0.8~1.2 g，K₂HPO₄ 1.5~2.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.1~0.3g，MnSO₄·7H₂O 0.04~0.06g，琼脂13~17 g，蒸馏水 1000mL。

实施例2 有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253的细菌学特性

一．基本特征

X253的基本特征如表1所示：

表1. X253基本特征

由表1可见，X253为革兰氏阳性、杆状、无芽孢、接触酶和氧化酶试验的阴性菌株。

二．糖发酵特性实验

将分离纯化的菌株挑取单菌落进行平板划线，37℃培养48h，分别挑取一接种环菌株接入糖发酵管中，37℃培养48h，观察颜色变化。具体结果如表2所示：

表2. X253的鉴定结果

注：“+”表示发酵利用；“-”表示不发酵利用

三．分子生物学鉴定

将上述菌株进行分子生物学鉴定，X253的16SrRNA序列如下：

CTTAGACGGCTCGCTCCCTAAAAGGGTTACGCCACCGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTCTCGCAACCTCGTTGTACCCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGGTCTTACTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAGTCATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTTTGCCCCCGAAGGGGAAACCTGATCTCTCAGGTGATCAAAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCATTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCAGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCCTCGGTTAAGCCGAGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCACGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACCATTCTTCTCCACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAAATGTGGCCGATCAACCTCTCAGTTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCAAAAGCGATAGCTTACGCCATCTTTCAGCCAAGAACCATGCGGTTCTTGGATTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCACTTAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCGCCACTCGTTCAAAATTAAATCAAGATGCAAGCACCTTTCAATAATCAGAACTCGTTCGACTTGCATGTAT

X253的Phes基因序列如下：

GGGGGAAAAATAGCCGCACGCAAACATTCGGATGCACCATGCCGGCACCGAGAACTTCAATCCAGCCGGTATACTTGCAAACAGGGCAACCCTTGCCACCGCAGCGGAAGCAGGAAACGTCCACTTCTACAGACGGTTCTGTAAACGGAAAATAGCTCGGGCGCAGGCGAATCGTCCGATCAGCGCCAAACACATGCTGACACATGGCGAGTAACGTCCCCTTAAGATCAGCCATTGTAATATGCTTGTCGATCACCAGACCTTCCATCTGATGGAACTGGTGGCTATGTGTGGCATCATCATCATCACGCCGATAAACCACGCCCGGACTGATCATTTTCAGCGGGCCCTTAGTAAAATCATGTTTCTCCATCGTCCGTGCCTGCATCGGGCTGGTTTGGGAACGCATCAGCAACTCATTGGTAATATAAAAAGTTTCCTGCATATCACGAGCATGGATGACGCCGA

三、肠道上皮细胞体外粘附特性实验

（一）实验方法

1、取活化好的鼠李糖乳杆菌X253菌株1 ml以4000 rmp离心5 min，根据经验值，此时的菌悬液浓度在109CFU/ml，用PBS洗菌2次，后在5 ml离心管内用1 mlDMEM重悬。

2、将24孔板内的原有的细胞培养液吸出后，用PBS冲洗一遍。

3、加菌：每孔含1 ml菌悬液，每个菌悬液浓度做2个重复。

4、孵育：放至37℃二氧化碳培养箱，孵育3 h。

5、计本次粘附实验的初始菌悬液的菌落总数。

6、计数：孵育完成后，用PBS洗菌4次，用1 ml灭菌的1%（v/v）Triton×100裂解。裂解完成后按照下表的稀释梯度，倒平板（稀释方法：取300 μL至2.7 ml盐水中）。置于37℃培养3天，计结果。

（二）肠道上皮细胞体外粘附特性实验的实验结果如图1所示。

四、菌株发酵特性

（一）实验方法

将活化好的鼠李糖乳杆菌X253 菌株按1%接种量接种于MRS 液体培养基中，37 ℃ 48h 培养，将上述培养好的菌株经3 500 r/min（4 ℃）离心10 min，生理盐水清洗一次，用灭菌脱脂奶悬浮（灭菌条件115 ℃，15 min），作为种子液备用。将上述种子液按1%的接种量接入灭菌脱脂奶中（灭菌条件115 ℃，15 min），采用pH 值在线监测鼠李糖乳杆菌X253在灭菌乳中的pH 值变化情况。

（二）菌株发酵曲线如图2所示。

实施例3 胃酸及肠液耐受实验

一、实验方法

（一）实验菌株：X253

（二）人工消化液的配制

人工胃液：NaCl 0.2 g/100 mL、胃蛋白酶（pepsin）0.35 g/100 mL，用浓度为1 mol/L的HCl调整pH值为3.0后，过滤除菌备用。

人工肠液：将下述a液和b液以2∶1混合即为人工肠液。

a.胰腺液：重碳酸钠1.1 g/100 mL，NaCl 0.2 g/100 mL，胰蛋白酶（Trypsin）0.1g/100 mL ，调整pH值为8.0，过滤除菌备用。

b.胆汁液：Bile Salts （Difco）0.9 g/100 mL，调整pH值为8.0，过滤除菌备用。

（三）将待测菌株活化3代后取1mL，分别置于含9 mL过滤除菌处理的pH值为3.0的人工胃液中，震荡均匀并在37 ℃培养，在开始和培养2 h分别取样，测定其活菌数。然后取在pH值3.0的人工胃液中消化2 h后的培养液1 mL，分别接种于9 mL过滤除菌的pH值为8.0的人工肠液中，继续置37 ℃下培养，并分别在0，4 h测定活菌数。

存活率（%）= （ cfu N1/cfu N0）×100%

式中，N1—经人工消化液处理6 h的活菌数，N0—经人工消化液处理0 h的活菌数。

（四）实验结果如下表表3所示：

表3. X253胃液及肠液耐受实验结果

实施例4 抑制口腔内有害菌种实验

以变异链球菌、戈登链球菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、伴放线放线杆菌为指示菌，检测X253对5 株致病菌产生的抑菌圈大小，从而判断其抑菌能力。

一、X253对变异链球菌、戈登链球菌的抑菌实验

（一）种子活化及培养

变异链球菌、戈登链球菌分别按5%接种量接于BHI 液体培养基中，37℃厌氧培养20h，

一般采用连续活化三代的菌液进行抑菌试验。

（二）菌粉溶液制备

取X253菌粉2g与8g无菌纯化水混匀，制成20%浓度的菌粉溶液

（三）采用牛津杯双层平板法

（1）2.0%素琼脂培养基冷却至50℃左右，取10mL 倾倒于无菌平皿中混匀铺平，洁净工作台中晾干；

（2）无菌镊子取灭菌牛津杯放在倒有素琼脂的平皿中静置10min；

（3）将1mL 变异链球菌或2mL 戈登链球菌加入到100mL 冷却至50℃的BHI 半固体培养基中并充分混匀；

（4）在放好牛津杯的平板上倾倒10mL 上述BHI 半固体培养基，待凝固后，将牛津杯夹出，形成牛津杯孔；

（5）在孔中注入100 μL 的20%浓度的口腔益生菌菌粉溶液，于37℃厌氧培养18-20 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径大小，设置五组平行实验。

（6）以红霉素药敏纸片作为阳性对照，以无菌纯化水作为阴性对照。

二、X253对牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、伴放线放线杆菌的抑菌实验

（一）种子活化及培养

牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、伴放线放线杆菌分别按5%接种量接于改良TSB 液体培养基中，37℃厌氧培养5d，一般采用连续活化三代的菌液进行抑菌试验。

（二）菌粉溶液制备

取X253益生菌菌粉2g，与8g 无菌纯化水混匀，制成20%浓度的菌粉溶液

（三）采用牛津杯法

（1）改良TSA 培养基冷至50℃左右，取20mL 倾倒在无菌平皿中，洁净工作台中晾干；

（2）将0.1 mL 具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌分别加至倒有改良TSA的平皿中，并用灭菌涂布棒迅速涂布均匀；

（3）无菌镊子取灭菌牛津杯放在涂有不同致病菌的平皿中；

（4）在牛津杯中注入100 μL 浓度20%的口腔益生菌菌粉溶液，于37℃厌氧培养7d，用游标卡尺测量抑菌圈直径大小，设置三组平行实验。

（5）以红霉素药敏纸片作为阳性对照，以无菌纯化水作为阴性对照。

三、实验结果如表4所示：

表4. X253益生菌菌粉对口腔有害菌的抑菌能力

由上表可知，X253能够有效抑制口腔内有害菌，因此可以用于制备牙膏、漱口水、益生菌含片、乳酸菌饮料、益生菌发酵乳等改善口腔健康的产品。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 石家庄君乐宝乳业有限公司

<120> 有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253、其分离纯化方法及应用

<130> 20200402

<150> 201911275130.5

<151> 2019-12-12

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1451

<212> DNA

<213> 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)

<400> 1

cttagacggc tcgctcccta aaagggttac gccaccggct tcgggtgtta caaactctca 60

tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggcg tgctgatccg 120

cgattactag cgattccgac ttcgtgtagg cgagttgcag cctacagtcc gaactgagaa 180

tggctttaag agattagctt gacctcgcgg tctcgcaacc tcgttgtacc catccattgt 240

agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct 300

ccggtttgtc accggcaggt cttactagag tgcccaacta aatgctggca actagtcata 360

agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca 420

tgcaccacct gtcattttgc ccccgaaggg gaaacctgat ctctcaggtg atcaaaagat 480

gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg 540

tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc aaccttgcgg tcgtactccc aggcggaatg 600

cttaatgcgt tagctgcggc actgaagggc ggaaaccctc caacacctag cattcatcgt 660

ttacggcatt ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct acccatgctt tcgagcctca 720

gcgtcagtta cagaccagac agccgccttc gccactggtg ttcttccata tatctacgca 780

tttcaccagc tacacatgga gttccactgt cctcttctgc actcaagttt cccagtttcc 840

gatgcacttc ctcggttaag ccgagggctt tcacatcaga cttaaaaaac cgcctgcgct 900

cgctttacgc ccaataaatc cggataacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg 960

cacgtagtta gccgtggctt tctggttgga taccgtcacg ccgacaacag ttactctgcc 1020

gaccattctt ctccacaaca gagttttacg acccgaaagc cttcttcact cacgcggcgt 1080

tgctccatca gacttgcgtc cattgtggaa gattccctac tgctgcctcc cgtaggagtt 1140

tgggccgtgt ctcagtccca aatgtggccg atcaacctct cagttcggct acgtatcatt 1200

gccttggtga gccgttacct caccaactag ctaatacgcc gcgggtccat ccaaaagcga 1260

tagcttacgc catctttcag ccaagaacca tgcggttctt ggatttatgc ggtattagca 1320

tctgtttcca aatgttatcc cccacttaag ggcaggttac ccacgtgtta ctcacccgtc 1380

gccactcgtt caaaattaaa tcaagatgca agcacctttc aataatcaga actcgttcga 1440

cttgcatgta t 1451

<210> 2

<211> 468

<212> DNA

<213> 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)

<400> 2

gggggaaaaa tagccgcacg caaacattcg gatgcaccat gccggcaccg agaacttcaa 60

tccagccggt atacttgcaa acagggcaac ccttgccacc gcagcggaag caggaaacgt 120

ccacttctac agacggttct gtaaacggaa aatagctcgg gcgcaggcga atcgtccgat 180

cagcgccaaa cacatgctga cacatggcga gtaacgtccc cttaagatca gccattgtaa 240

tatgcttgtc gatcaccaga ccttccatct gatggaactg gtggctatgt gtggcatcat 300

catcatcacg ccgataaacc acgcccggac tgatcatttt cagcgggccc ttagtaaaat 360

catgtttctc catcgtccgt gcctgcatcg ggctggtttg ggaacgcatc agcaactcat 420

tggtaatata aaaagtttcc tgcatatcac gagcatggat gacgccga 468

Claims

1.一种有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253，它是从新疆发酵乳中分离筛选出来的，该菌菌株已于2019年8月20保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18404，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，拉丁文名称是Lactobacillus rhamnosus。

2.根据权利要求1所述的有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253，其特征在于其16SrRNA序列如下：

3.根据权利要求1所述的有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253，其特征在于其Phes基因序列如下：

4.根据权利要求1－3中任意一项所述的有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253的一种分离纯化方法，其特征在于它按照以下步骤进行：

（一）样品采集

取25mL新疆的发酵乳制品，加入200～250mL生理盐水中，充分混匀，得到采集样品；

（二）样品富集

取2mL采集样品，加入到80～120 mL的MRS液体培养基中，32～42℃培养64～80h，得到培养液；

（三）菌株分离

置32～42℃厌氧培养64～80h；

待平板出现典型菌落后，挑选出相应的单菌落，进行下一步菌株纯化；

（四）菌株纯化

挑取选中的单菌落，将菌落培养物划线接种到无菌平板上，32～42℃有氧环境培养64～80h，然后挑取该无菌平板上的单菌落，继续划线接种到无菌平板上，32～42℃有氧环境培养64～80h，连续培养三次至培养基内菌落形态一致，显微镜观察菌株细胞形态单一后，即获得纯培养菌株，接种环挑取菌落接种至液体MRS培养基内，37℃培养24h，得到增殖后的纯培养菌株。

5.根据权利要求4所述的有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253的分离纯化方法，其特征在于：所述分离纯化方法还包括步骤（五）取纯培养菌株和无菌的50%甘油，置于菌种保存管内，混匀后在-70℃保存，同时接种MRS固体培养基试管斜面用于临时保存。

6.根据权利要求4所述的有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253的分离纯化方法，其特征在于：

所述MRS液体培养基主要由以下原料组成：酪蛋白胨 8～12 g，牛肉膏8～12 g，酵母膏4～6g，葡萄糖16～24 g，乙酸钠4～6 g，柠檬酸二胺1.5～2.5 g，吐温-80 0.8～1.2 g，K₂HPO₄1.5～2.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.3g，MnSO₄·7H₂O 0.04～0.06g，蒸馏水 1000mL。

7.根据权利要求4所述的有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253的分离纯化方法，其特征在于：

所述MRS固体培养基主要由以下原料组成：酪蛋白胨 8～12 g，牛肉膏8～12 g，酵母膏4～6g，葡萄糖16～24 g，乙酸钠4～6 g，柠檬酸二胺1.5～2.5 g，吐温-80 0.8～1.2 g，K₂HPO₄ 1.5～2.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.3g，MnSO₄·7H₂O 0.04～0.06g，琼脂13～17 g，蒸馏水 1000mL。

8.根据权利要求5所述的有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253的分离纯化方法，其特征在于：

9.根据权利要求1－3中任意一项所述的有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253的应用，其特征在于：它能够抑制口腔内有害菌种，用于制备改善口腔健康的产品。

10.根据权利要求9所述的有益口腔健康的鼠李糖乳杆菌X253的应用，其特征在于：所述改善口腔健康的产品为牙膏、漱口水、益生菌含片、乳酸菌饮料、益生菌发酵乳。