CN111363664B - 一种基于三层微芯片检测的lamp检测芯片及其控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于三层微芯片的LAMP检测芯片，包括其主体包括三层微芯片，第一层注入层，第二层负载层和第三层反应层；其中，第二层负载层包括多个负载区，第三层反应层包括多个反应区，用于体系的形成和反应的进行。本发明公开了一种基于三层微芯片的LAMP检测芯片的控制方法。

Description

一种基于三层微芯片检测的LAMP检测芯片及其控制方法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种基于三层微芯片检测的LAMP检测芯片及其控制方法。

背景技术

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)能在等温(60-65℃)条件下，短时间(通常是一小时内)内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法；与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。环介导等温扩增法是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

微流控芯片技术(Microfluidics)是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。

但由于在现有技术中仍然存在着很大的问题，包括：(1)现有技术只能进行定性检测，无法进行定量检测，无法准确测定病原体含量；(2)现有方法反应容器密闭性不足，开启后易造成气溶胶污染，造成假阳性；(3)现有方法样品和试剂需分别加入，多次加样过程中易造成剂量误差；(4)结果判断复杂，通过沉淀变化判断反应结果易出现误差，大部分情况依然需要进行电泳检测。

发明内容

基于上述技术问题，本发明设计开发了一种基于三层微芯片检测的LAMP检测芯片，本发明的发明目的是能够在无需开启检测芯片的情况下，保持检测系统的气密性，无需多次加样能够进行快速定量检测。

本发明设计开发了一种基于三层微芯片检测的LAMP检测芯片的控制方法，本发明的发明目的是通过油封样品能够在保持检测系统的气密性的情况下，无需多次加样能够进行快速定量检测。

本发明提供的技术方案为：

一种基于三层微芯片检测的LAMP检测芯片，包括：

第一层注入层，其包括第一加样孔、第一加油孔和多个第一废液池排气孔；

第二层负载层，其包括与所述第一加样孔相连通的第二加样孔、与所述第一加油孔相连通的第二加油孔和与所述第一废液池排气孔对应设置的多个负载区；

其中，所述负载区包括与所述第二加油孔相连通的第一分油孔和与所述第一废液池排气孔相连通的第二废液池排气孔；

第三层反应层，其包括所述第二加样孔相连通的第三加样孔和与所述负载区对应设置的多个反应区；

其中，所述反应区包括：

试剂微室，其一端与所述第三加样孔连通；

混合室，其一端与所述试剂微室的另一端连通；

第二分油孔，其与所述混合室的一端连通，且与所述第一分油孔连通；

LAMP反应区，其一端与所述混合室的另一端连通；

废液池，其与所述LAMP反应区的另一端连通；

第三废液池排气孔，其设置在所述废液池上，且与所述第二废液池排气孔连通。

优选的是，所述负载区还包括：

多条分油通道，其一端均与所述第二加油孔连通，另一端与所述第一分油孔连通。

优选的是，还包括：

多个第一存气室，其分别对应设置在所述负载区中；

多个第二存气室，其分别对应设置在所述反应区中，且设置在连通所述混合室和所述LAMP反应区之间的通道上；

其中，所述第一存气室与所述第二存气室相连通。

优选的是，所述混合室呈螺旋排布。

优选的是，所述多个反应区中任意一个LAMP反应区均包括：

相连通的多个反应微室，其呈蛇形排布。

优选的是，所述反应微室为通过长方体结构的凸起分隔成的多个反应空间，所述长方体结构的长度为375～425μm，宽度为100～150μm，高度为69～79μm。

优选的是，所述长方体结构之间的间隔为80～120μm。

一种基于三层微芯片检测的LAMP检测芯片的控制方法，其特征在于，使用所述的基于三层微芯片检测的LAMP检测芯片，包括如下步骤：

步骤一、进行进油过程，油相通过所述第一加油孔进行注油，通过所述第二加油孔进入所述第二层负载层，由所述分油通道分成多条油道连接的所述第一分油孔，由所述第一分油孔进入所述第三层反应层中；

其中，所述第二分油孔用于接收所述第二层负载层的油相，并通过所述第二分油孔进入主通道，流经所述混合室进入所述LAMP反应区并充满整个反应微室，多余的油相流入所述废液池，且在油相充满反应微室后密封所述第一进油孔保证压强；

步骤二、进行进样过程，样品通过所述第一加样孔流经所述第二加样孔，直接进入位于所述第三加样孔，样品流经试剂微室冲走位于所述试剂微室的试剂干粉，并进入所述混合室进行充分混匀，此时，所述第一加油孔处于密封状态，样品继续进入所述LAMP反应区，并取代所述反应微室中的油相，多余的水相流入所述废液池；

步骤三、再次进行进油过程，通过所述第一加油孔注入油相，依次流经第二加油孔、分油通道、第一分油孔、进油通道、第二分油孔、混合室到达LAMP反应区切割水相，与残留在反应微室中的油层结合密封，包裹密封反应体系；

步骤四、进行LAMP反应检测。

本发明与现有技术相比较所具有的有益效果：

反应检测一体化，无需开启反应容器即可得到反应结果，避免气溶胶污染问题，试剂以干粉的形式内置于芯片，操作更加简便，极大地缩短了检测时间，无需多次加样，避免剂量误差。

附图说明

图1为本发明所述的三层微芯片检测的LAMP检测芯片的结构示意图。

图2为本发明所述的三层微芯片检测的LAMP检测芯片的第一层注入层的结构示意图。

图3为本发明所述的三层微芯片检测的LAMP检测芯片的第一层注入层的主视图。

图4为本发明所述的三层微芯片检测的LAMP检测芯片的第一层注入层的剖视图。

图5为本发明所述的三层微芯片检测的LAMP检测芯片的第二层负载层层的结构示意图。

图6为本发明所述的三层微芯片检测的LAMP检测芯片的第二层负载层的主视图。

图7为本发明所述的三层微芯片检测的LAMP检测芯片的第二层负载层的剖视图。

图8为本发明所述的三层微芯片检测的LAMP检测芯片的第三层反应层层的结构示意图。

图9为图8中“A”处的局部放大图。

图10为本发明所述的三层微芯片检测的LAMP检测芯片的第三层反应层的主视图。

图11为本发明所述的三层微芯片检测的LAMP检测芯片的第三层反应层中的反应区的结构示意图。

图12为本发明所述的三层微芯片检测的LAMP检测芯片的第三层反应层的剖视图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

如图1所示，本发明提供了一种基于三层微芯片检测的LAMP检测芯片，其主体包括三层微芯片，第一层注入层100，第二层负载层200和第三层反应层300；其中，第二层负载层200包括多个负载区，第三层反应层300包括多个反应区，用于体系的形成和反应的进行。

如图2～4所示，第一层注入层100含有第一加样孔110、第一加油孔120和多个第一废液池排气孔130；第一加样孔110同时连通至第二层负载层200的第二加样孔210和第三层反应层300的第三加样孔310，第一加油孔120同时连通第二层负载层200的第二加油孔220，第一加样孔110和第一加油孔120分别用于水相和油相的注入；

如图5～7所示，第二层负载层200含有第二加样孔210、第二加油孔220和多个负载区；其中，多个负载区包括逐渐分支为多条的分油通道250、多个第一分油孔240、多个第一存气室260和多个第二废液池排气孔230；第二层负载层200从一个第二加油孔220处逐渐分成多条分油通道250，分别连向多个进入第三层反应层300的第一分油孔240，另外设计多个第一存气室260，用于存储第三层反应层300的废气；其中，具体还包括第二加样孔210与第一加样孔110相连通，第二加油孔220与第一加油孔120相连通，多个第二废液池排气孔230与多个第一废液池排气孔130分别对应相连通；

如图8～12所示，第三层反应层300由第三加样孔310和多个反应区组成，反应区分别与负载区一一对应设置；其中，每个反应区均由试剂微室341、第二分油孔320、进油通道350、螺旋混合器342、第二存气室360、LAMP反应区343、废液池370和第三废液池排气孔330构成；其中，LAMP反应区343包含蛇形通道343a和多个反应微室343b，试剂微室341存贮用于反应所需要的引物，荧光检测试剂等干粉，第三层反应层300的第二分油孔320与第二层负载层200的第一分油孔240连通，螺旋混合器342用于混匀样品与反应试剂，第三层反应层300的第二存气室360与第二层负载层200的第一存气室260连通，用于储存注入油相之后加入样品之前的残留气体，蛇形通道343a连接多个反应微室343b，把反应体系均匀的分成多份，废液池370用于存储多余的废液，LAMP反应区343共含有多排蛇形通道343a，每排多个反应微室343b，把总反应体系分为多份，实现数字化。

在另一种实施例中，如图5～7所示，第二层负载层200含有1个第二加样孔210、1个第二加油孔220、逐渐分支为8条的分油通道250、8个第一分油孔240、8个第一存气室260和8个第二废液池排气孔230，第二层负载层200从一个第二加油孔220处逐渐分成8条分油通道250，第二加油孔220分别连向8个进入第三层反应层300的第一分油孔240，另外设计8个第一存气室260，用于存储第三层反应层300的废气。

在另一种实施例中，如图8所示，第三层反应层300由8个反应区组成，分别与第二层负载层200的分油通道250、第一分油孔240、第一存气室260和第二废液池排气孔230一一对应设置。

在另一种实施例中，如图11所示，蛇形通道343a连接360个反应微室343b，把反应体系均匀的分成360份，废液池370用于存储多余的废液，LAMP反应区343共含有12排蛇形通道343a，每排30个反应微室343b，共计360个反应微室343b，把总反应体系分为360份，检测试剂以干粉的形式存储于试剂微室341中，实现检测数字化。

在另一种实施例中，每一排蛇形通道343a之间的间隔为100～150μm；作为一种优选，每一排蛇形通道343a之间的间隔为125μm。

在另一种实施例中，反应微室343b为通过长方体结构的凸起分隔成的多个反应空间，长方体结构的长度为375～425μm，宽度为100～150μm，高度为69～79μm；作为一种优选，长方体结构的长度为400μm，宽度为120μm，高度为74μm。

在另一种实施例中，长方体结构之间的间隔为80～120μm；作为一种优选，长方体结构之间的间隔为100μm。

本发明提供的一种基于三层微芯片检测的LAMP检测芯片的流程分为四个步骤，第一步油相保护层的形成进油，第二步试剂与样本的进入，混合与数字化进样，第三步反应体系的密封再进油，第四步LAMP反应检测，具体包括如下步骤：

步骤一、进行进油过程：油相通过第一层注入层100的第一加油孔120与油源的连接，注入油相，通过第二加油孔220进入第二层负载层200，由分油通道250分成8条油道连接8个第一分油孔240，由第一分油孔240通过第二分油孔320进入到第三层反应层300；

其中，位于第三层反应层300的第二分油孔320用于接收第二层负载层200的油相，并通过第二分油孔320进入进油通道350，流经螺旋混合器342进入LAMP反应区343并通过蛇形通道343a充满整个反应微室343b，多余的油相流入废液池370，在油相充满反应微室后密封第一进油孔120保证压强；

步骤二、进行进样过程：样品通过第一层注入层100的第一加样孔110流经第二层负载层200的第二加样孔210，直接进入位于第三层反应层300的第三加样孔310，样品流经试剂微室341冲走位于试剂微室341的试剂干粉，并进入螺旋混合器342进行充分混匀，此时为了保证压强，第一加油孔120处于密封状态，因而导致第三加样孔310至进油通道350处的通道处存有部分废气，在流经第二存气室360的过程中，充分排除多余废气，存入第二层负载层200的第一存气室260，避免了气体对反应微室343b填充率的影响，样品继续通过第二存气室360后进入LAMP反应区343，并取代反应微室343b中的油相，由于PDMS经过亲油处理，水相并不能完全取代存在的油相，会留有一层油膜，用于包裹并防止水分的蒸发，多余的水相流入废液池370；

步骤三、再次进行进油过程：在步骤二完成后密封第一加样孔110，再次通过第一加油孔120注入油相，依次流经第二加油孔220、分油通道250、第一分油孔240、进油通道350、螺旋混合器342到达LAMP反应区343切割水相，与残留在反应微室343b中的油层结合密封，形成完整的油膜，包裹密封反应体系；

步骤四、进行LAMP反应：在每个反应区的试剂微室341中完整的含有反应所需要的样品模板、六条特异性引物、Mix试剂和荧光检测试剂等，将检测芯片在65℃的恒温条件下，反应1小时，便可通过荧光反应来判断此微室反应结果；通过CCD采集360个微室的荧光光斑，用计算机Image J软件分析不同微室的反应结果。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (5)

1.一种基于三层微芯片检测的LAMP检测芯片，其特征在于，包括：

第一层注入层，其包括第一加样孔、第一加油孔和多个第一废液池排气孔；

第二层负载层，其包括与所述第一加样孔相连通的第二加样孔、与所述第一加油孔相连通的第二加油孔和与所述第一废液池排气孔对应设置的多个负载区；

其中，所述负载区包括与所述第二加油孔相连通的第一分油孔和与所述第一废液池排气孔相连通的第二废液池排气孔；

第三层反应层，其包括所述第二加样孔相连通的第三加样孔和与所述负载区对应设置的多个反应区；

其中，所述反应区包括：

试剂微室，其一端与所述第三加样孔连通；

混合室，其一端与所述试剂微室的另一端连通；

第二分油孔，其与所述混合室的一端连通，且与所述第一分油孔连通；

LAMP反应区，其一端与所述混合室的另一端连通；

废液池，其与所述LAMP反应区的另一端连通；

第三废液池排气孔，其设置在所述废液池上，且与所述第二废液池排气孔连通；

所述负载区还包括：

多条分油通道，其一端均与所述第二加油孔连通，另一端与所述第一分油孔连通；

所述混合室呈螺旋排布；

所述多个反应区中任意一个LAMP反应区均包括：

相连通的多个反应微室，其呈蛇形排布。

2.根据权利要求1所述的基于三层微芯片检测的LAMP检测芯片，其特征在于，还包括：

多个第一存气室，其分别对应设置在所述负载区中；

多个第二存气室，其分别对应设置在所述反应区中，且设置在连通所述混合室和所述LAMP反应区之间的通道上；

其中，所述第一存气室与所述第二存气室相连通。

3.根据权利要求2所述的基于三层微芯片检测的LAMP检测芯片，其特征在于，所述反应微室为通过长方体结构的凸起分隔成的多个反应空间，所述长方体结构的长度为375～425μm，宽度为100～150μm，高度为69～79μm。

4.根据权利要求3所述的基于三层微芯片检测的LAMP检测芯片，其特征在于，所述长方体结构之间的间隔为80～120μm。

5.一种基于三层微芯片检测的LAMP检测芯片的控制方法，其特征在于，使用如权利要求1-4中任一项所述的基于三层微芯片检测的LAMP检测芯片，包括如下步骤：

步骤一、进行进油过程，油相通过所述第一加油孔进行注油，通过所述第二加油孔进入所述第二层负载层，由所述分油通道分成多条油道连接的所述第一分油孔，由所述第一分油孔进入所述第三层反应层中；

其中，所述第二分油孔用于接收所述第二层负载层的油相，并通过所述第二分油孔进入主通道，流经所述混合室进入所述LAMP反应区并充满整个反应微室，多余的油相流入所述废液池，且在油相充满反应微室后密封所述第一加油孔保证压强；

步骤二、进行进样过程，样品通过所述第一加样孔流经所述第二加样孔，直接进入位于所述第三加样孔，样品流经试剂微室冲走位于所述试剂微室的试剂干粉，并进入所述混合室进行充分混匀，此时，所述第一加油孔处于密封状态，样品继续进入所述LAMP反应区，并取代所述反应微室中的油相，多余的水相流入所述废液池；

步骤三、再次进行进油过程，通过所述第一加油孔注入油相，依次流经第二加油孔、分油通道、第一分油孔、进油通道、第二分油孔、混合室到达LAMP反应区切割水相，与残留在反应微室中的油层结合密封，包裹密封反应体系；

步骤四、进行LAMP反应检测。

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